Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной эмульсионной.
Ящур - острое вирусное заболевание из группы зоонозов, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа [1].
Существует семь серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа SAT-2 являются распространенными на территории Африки, Ближнего Востока и с 2023 года в странах Азиатского континента, что определяет высокую актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.
Каждый из серотипов разделен на более чем 60 генотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP1 [2].
После переболевания животных, зараженных каким-либо одним генотипом, не обеспечивает иммунную защиту против другого [3-5].
Поскольку вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля в эндемичных районах, анализ каждого района и генотипов в нем поможет подобрать наиболее специфичные вакцины, с содержание соответствующих топотипов, присутствующим в этой местности, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время распространенные вакцины.
Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I - XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы [1, 3]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV, представители которого активно распространяются на территории Африканского континента и теперь за ее пределами, в том числе в Азиатских странах. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа SAT-2/XIV.
С целью недопущения возникновения ящура на территории Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.
Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].
Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [12, 13].
Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14 - 17].
На территории Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Монголии, Китая, Индии и др., а также Африки. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.
На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV в странах Африки, однако в 2023 г. представители данного варианта вируса были обнаружены на территории Азиатского континента и Ближнего Востока, в частности, изоляты вируса ящура указанного генотипа были выделены в Иордании 03.02.2023, в Ираке 15.02.2023, Грузии 08.03.2023, Турции 16.03.2023, Омане 28.04.2023, Бахрейне 25.05.2023. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/XIV.
Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SАT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:
- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),
- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),
- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),
- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),
- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),
- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),
- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),
- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),
- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),
- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),
- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),
- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),
- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),
- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).
Изолят вируса ящура генотипа SAT-2/XIV был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Иорданского Хашимитского Королевства в августе 2023 г. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-2/XIV/2023».
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/XIV вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 (Фиг. 1).
По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африки, Ближнего Востока и Азии, в которых стабильно регистрируют вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV, возникает опасность случаев возникновения ящура данного генотипа в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина эмульсионная против ящура типа SAT-2 инактивированная (штамм «SAT-2/SAU/6/2000», генотип SAT-2/VII) [18], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-2/SAU/6/2000», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см3, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см3 (прототип). В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого. При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция).
Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.
Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.
Разработанная вакцина в 1,0 см3 препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» (генотип SAT-2/XIV) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 5,0 мкг; 2) масляный адъювант DMIXVAC 76 V («Дмитриевский химический завод», РФ), обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 70% по массе, 3) поддерживающая среда - до 1,0 см3.
Штамм вируса ящура «SAT-2/XIV/2023» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,030% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,035% от общего объема.
Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» (генотип SAT-2/XIV) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [19, 20].
Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см3 не менее 5,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.
Вакцину против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта DMIXVAC 76 V в соотношении 30% и 70% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную простую обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивают формирование специфического иммунитета.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:
1. Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.
2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 5,0 мкг в 1,0 см3 готового вакцинного препарата.
3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 76 V.
4. Вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 76 V в количестве 70% (по массе) в 1,0 см3 готового препарата.
5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант DMIXVAC 76 V, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:
Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.
Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.
Сущность изобретения отражена на графическом изображении:
Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР1.
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.
Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/XIV. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP4, VP2, VP3, VP1.
Антигенные свойства
По антигенным свойствам штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP1 штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/XIV (Фиг. 1).
Антигенное родство (r1) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:
- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),
- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),
- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),
- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),
- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),
- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),
- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),
- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),
- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),
- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),
- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),
- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),
- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),
- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV).
Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 102 ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9, 21].
Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом: при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными; при<0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма. Максимальное родство отмечается при значении r1 в РМН, стремящимся к 1,0.
Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/XIV/2023» составили r1 от 0,01 до 0,27, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.
Гено- и хемотаксономическая характеристики
Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,079×106 Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,84×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,44×10-18 г. Плавучая плотность 1,47 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,7°С).
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - антиген реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - антиген не патогенен для парнокопытных животных.
Вирулентность - антиген не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.
Биотехнологические характеристики
Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).
При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.
Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-2/XIV, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.
Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP1) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определение положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP1) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (19 представителей) вируса ящура серотипа SAT-2.
Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура вакцинного штамма «SAT-2/XIV/2023» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VР1 штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР1 штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.
Осуществлен филогенетический анализ для штамма «SAT-2/XIV/2023». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт.Этот анализ включал 11 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].
В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1) штамма «SAT-2/XIV/2023» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг.1). Таким образом, исследуемый штамм «SAT-2/XIV/2023» относится к генотипу SAT-2/XIV, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.
Пример 2. Адаптация штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.
Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД50/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 13 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,05±0,10 до 7,31±0,10 lg ТЦД50/см3.
Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,4±0,10 lg ТЦД50/см3). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,30±0,02 до 0,88±0,02 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,88±0,02 мкг/см3). Степень достоверности (R2) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,21 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.
Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV в промышленных масштабах.
В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.
На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.
Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 13-14 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,95±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.
На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 13-28 ч (табл.1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 13-14 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,95±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3.
Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-2/XIV/2023» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД50/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-26 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД50/кл. и составило 0,95±0,02 мкг/см3 с титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3.
Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД50/кл.
Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в промышленных масштабах.
При промышленном культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.
На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см3. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-20 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.
Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см3 составило 1,02±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,0 млн кл./см3 - 1,15±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,5 млн кл./см3 - 1,23±0,02 мкг/см3, и с концентрацией 4,0 млн кл./см3 - 1,29±0,02 мкг/см3. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см3 (при концентрации 4,0 млн кл./см3 концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см3). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 12-20 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 12-13 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,23±0,02 мкг/см3) и титром инфекционной активности вируса 8,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-22 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД50/кл. (1,23±0,02 мкг/см3) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см3; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл.
Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV.
По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,030%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.
Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», репродуцированного в культиваторах, произошла через 5 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.
Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,20±0,02 мкг/см3, а 146S+75S компонента - 1,68±0,02 мкг/см3.
Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV.
Суспензию вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,030, 0,035 и 0,040%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» с помощью ПГМГ в концентрации 0,030% отмечали снижение концентрации балластного белка на 5%, иммуногенных компонентов - на 0,4%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,035% наблюдали снижение количества балластного белка на 20%, 146S компонента - на 1,5%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,040% содержание балластного белка уменьшалось на 29%, а иммуногенных компонентов - на 8%.
Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-2/XIV/2023», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,035%.
Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.
Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-2/XIV/2023», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 10 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 4 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.
До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 8,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 9,0 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии в 9,9 раз. Таким образом, технология танценциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «SAT-2/XIV» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.
Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.
Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» в качестве адъюванта использовали масляный адъювант DMIXVAC 76 V в количестве 70% по массе.
Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной.
Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральную инактивированную эмульсионную с применением масляного адъюванта DMIXVAC 76 V. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см3 антигена составило 11,68±0,02 мкг/см3 (табл.5).
Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной.
Из полученной вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см3. Первую группу животных (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.
Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.
Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (ВОЗЖ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней <50%).
Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).
Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см3. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.
Контроль безвредности продукта на животных проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см3 (тройная доза по 2,0 см3). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,3°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.
По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.
На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,40±0,14 log2 SN50, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,05±0,11 log2 SN50, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,00±0,31 log2 SN50 (табл.7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2 SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [3].
Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных.
Свиньи в количестве 15 голов, иммунизированные вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.
Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см3) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).
По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,52 ПД50 и 0,05 ИмД50 для свиней.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-2/XIV/2023 » генотипа SAT-2/XIV в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа SAT-2/XIV. Кроме того, вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта DMIXVAC 76 V отечественного производства («Дмитриевский химический завод», РФ, г. Кинешма).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная»:
1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 22.09.2023).
2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 19.10.2023).
3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p.13-21.
8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.
9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_ reports.htm (Дата обращения 11.10.2023).
12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.
13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина, 2013. - С.37-38.
14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol.4(10). - P. 475-479.
15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.
16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.
17. Mouton L, Dekker A, Bleijenberg M, Blanchet M, Coco-Martin J, Hudelet P, Goutebroze S. A foot-and-mouth disease SAT2 vaccine protects swine against experimental challenge with a homologous virus strain, irrespective of mild pathogenicity in this species. Vaccine. 2018 Apr 5;36(15):2020-2024. doi: 10.1016/j.vaccine.2018.02.096. Epub 2018 Mar 3. PMID: 29510916.
18. Патент RU 2804875С1, 11.05.2023. «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма "SAT-2/Eritrea/1998" культуральная инактивированная сорбированная».
19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.
20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.
21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.
22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.
23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.
25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.
Таблица 1
Результаты адаптации штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях
(n=3, M±m, p<0,01)
Примечание: SКРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,
ГБК - гидролизат белков крови,
DМЕМ - название среды Игла,
RPMI-1640 - название культуральной среды,
ЦПД - цитопатическое действие.
Таблица 2
Результаты репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток
(n=3, M±m, p<0,01)
Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,
ТЦД - тканевая цитопатическая доза,
ЦПД - цитопатическое действие.
Таблица 3
Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV
(n=3, M±m, p<0,05)
Таблица 4
Содержание компонентов штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в суспензиях до и после очистки
(n=3, M±m, p<0,005)
0,040%
Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:
С=1,45 × А280-0,74 × А260,
где А280 - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,
А260 - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,
ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).
Таблица 5
Содержание компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования
(n=3, M±m, p<0,01)
(в 9 раз)
4 ч
12 ч
4 ч
Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,
ОВБ - общий вирусный белок.
Таблица 6
Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV
Примечание: СПК - слабоположительный контроль,
ПК - положительный контроль,
ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%
Таблица 7
Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной эмульсионной на свиньях
(n=5, p<0,01, M±m)
Примечание: «-» - отсутствие генерализации процесса ящура,
«+» - наличие генерализации процесса ящура,
РМН - реакция микронейтрализации,
ИмД50 - иммуногенная доза,
ПД50 - протективная доза.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV SAT2 XIV
vaccine_1698055515784.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-10-23">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-10-23</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>548</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-10-23</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Михалишин Дмитрий
Валерьевич</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа
SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная
эмульсионная</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accacttcggccggtgagggcgctgacgtcgtgaccattgaccccacca
cacaaggcgggtccgtgacaccggccaggcgcatccacaccgatgtggcattccttctggaccgcagcac
gcacgtccacaccaacaagaccaccttcaacatcgacctcatggacacaaaggagaaggcactggtaggg
gccatactgcgctcagccacgtactacttctgtgacctggagatcgcgtgtgttggtgaacacaagaggg
tgttttggcaaccgaatggggcgcccagaacaacaacgctgggtgacaaccccatggtgtactcgcacaa
cggagtcactagatttgccattccgtacacggcaccgcaccggttgctttccactgtatacaacggtgag
tgcgactacaagaaagcctctaccgccatccgcggtgacagggccgtccttgcggccaagtacgctaaca
ccaagcacactctcccaagcactttcaactttggtcatgtgacggctgacgcacccgtcgacgtgtacta
taggatgaaacgtgctgagttgtactgtccacgcgctcttcttcccgcgtacgaccacgtgggacgtgac
agatttgacgcgccaattggagtggagagacaactc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTIDPTTQGGSVTPARRIHTDVAFLLDRSTHVHTNKTTF
NIDLMDTKEKALVGAILRSATYYFCDLEIACVGEHKRVFWQPNGAPRTTTLGDNPMVYSHNGVTRFAIPY
TAPHRLLSTVYNGECDYKKASTAIRGDRAVLAAKYANTKHTLPSTFNFGHVTADAPVDVYYRMKRAELYC
PRALLPAYDHVGRDRFDAPIGVERQL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма "SAT-2/Eritrea/1998" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2804875C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2815541C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма "SAT-1/Танзания/2012" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2815534C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-1/NWZ культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2809219C1 |
Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X из штамма "SAT-1/Нигерия/2015" культуральная инактивированная сорбированная | 2023 |
|
RU2810132C1 |
Вакцина против ящура генотипа О/ЕА-3 из штамма "О N2241/Эфиопия/2011" культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2816264C1 |
Вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2816944C1 |
Штамм "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | 2023 |
|
RU2817257C1 |
Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма "О N2620/Оренбургский/2021" культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2815537C1 |
Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма "О N2383/Приморский/2019" культуральная инактивированная эмульсионная | 2023 |
|
RU2804803C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант. Она содержит в качестве активного вещества авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителя инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.
1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного вещества авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителя инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 5,0 мкг; в качестве адъюванта отечественный масляный адъювант DMIXVAC 76 V с содержанием 70% по массе и поддерживающую среду до 1,0 см3 готового препарата.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.
3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителя инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура и масляный адъювант DMIXVAC 76 V, в эффективном соотношении: 30% и 70% по объему, соответственно.
Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная | 2020 |
|
RU2741639C1 |
DE 60233127 D1, 10.09.2009 | |||
Mouton L et al | |||
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
Vaccine | |||
Способ получения цианистых соединений | 1924 |
|
SU2018A1 |
Авторы
Даты
2024-08-12—Публикация
2024-04-03—Подача