ШТАММ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦЫ И РЫБ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения кормовой добавки, повышающей продуктивность сельскохозяйственных животных, птицы и рыб.

Известны штаммы Bacillus subtilis DSM 5750 и Bacillus licheniformis DSM 5749, которые составляют основу кормовой добавки Bioplus 2В [Alexopoulos С. еt al., Field Evaluation of the Efficacy of Probiotic Containing Bacillus Licheniformis and Bacillus Subtilis Spores. Conference Proceedings New Perspectives of Probiotics. Kosice, Slovakia 15-19th September 2004]. Известны штаммы Bacillus subtilis ВКМ B-2250 (RU №2184774, кл. A61K 35/74, 10.07.02) и Bacillus licheniformis ВКМ B-2252 (RU №2203947, кл. A61K 35174, 26.09.2001 г), которые являются основой кормовой добавки Субтилис.

Известны штаммы Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31, которые являются основой Биоспорина [Смирнов В.В. И др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus. Мiкробioлогiчний журнал. 1993. том 55, №4, с. 92-112].

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление новых эффективных штаммов из рода Bacillus для кормовой добавки, повышающей продуктивность сельскохозяйственных животных, птицы и рыб. Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы, рыб за счет использования кормовой добавки на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168. Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20 выделен из почв экологически чистого Приокско-Террасного заповедника, идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика и внесен в депозитарий этой коллекции под номером: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В 12168 [Научный отчет «Идентификация штамма В-20 до вида с помощью анализа 16S РНК» 20/01/2015 г. Москва].

Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 6 месяцев на эту же среду.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168, характеризуется следующими признаками.

Паспорт штамма микроорганизма.

Номер В 12168. Дата депонирования в ВКПМ 05.02.2015.

1. Родовое и видовое название культуры: Bacillus amyloliquefaciens.

2. Номер или наименование штамма: В-20.

4. Способ получения штамма: найден в естественных условиях, изолят, Московская область, Приокско-Террасный заповедник, Кулаков Г.В.

5. Культура идентифицирована до вида с помощью анализа 16S РНК Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика и внесена в депозитарий этой коллекции под номером: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В 12168 [Научный отчет «Идентификация штамма В-20 до вида с помощью анализа 16S РНК» 20/01/2015 г. Москва].

6. Культурально-морфологические особенности штамма. Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5-4,0×0,5-0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0-1,2×0,6-0,7 мкм. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, матовые, желтовато-серые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации - интенсивную мутность.

7. Область применения штамма: пробиотик.

8. Продукт, синтезируемый штаммом: пробиотик.

9. Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Не растет в анаэробных условиях, не образует ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес - Проскауэра, ферментирует с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизует крахмал, мочевину и эскулин. Обладает лецитиназной, каталазной активностью. Толерантен к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне 1-9%.

Штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.

Штамм продуцирует биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры. Для длительного хранения штамма споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерии используют мясопептонный бульон. Культивирование проводят при температуре 37°С.

10. Способ определения активности штамма с указанием метода: МПА, МПБ.

11. Способ, условия и состав сред для длительного хранения: Культуру поддерживают на МПА с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА с добавлением 50 мкг/мл канамицина.

12. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: Оптимальная температура роста +37°C, рН - 7,0. Состав среды - пептон 5 г/л; дрожжевой экстракт 3 г/л; NaCl 5 г/л; (K₂HPO₄)×3H₂O - 18,3 г/л; KH₂PO₄ - 6,0 г/л; (NH₄)×2SO₄ - 2,0 г/л; Na₃C₆H₅O₇×5,5H₂O - 1,2 г/л, вода водопроводная - до 1 л.

13. Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Оптимальная температура роста +37°C, рН 7,2. Состав среды: пептон мясной ферментативный - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 5,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; дистиллированная вода - до общего объема 1 дм³.

14. Литературные ссылки: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. (1984-1989). Vol. 1-4 Baltimore. Williams and Wilkins. Handbook of new bacterial Systematics. 1994. Goodfelow M. and A.G. O'Donnel (Ed). London. Acad. Press.

15. Является ли штамм: зоопатогенным: нет; представляет ли опасность по каким-либо другим причинам: нет.

16. Форма депонирования: национальное патентное депонирование. Культивирование штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 проводят в ферментере на промышленных ферментационных средах, приготовленных на деминерализованной воде и содержащих, мас.%: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, - 10, кукурузный экстракт - 2,4, белково-витаминный концентрат или пивные дрожжи - 0,3, лактоза - 0,28, (NH₄)×2SO₄ - 0,8, K₂SO₄ - 0,3, MgSO₄×7H₂O - 0,014, CuSO₄ - 0,00038, NaCl - 0,03, вода - остальное, рН 7,2. Инокулят штамма выращивают в 750-мл колбах, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%: триптон - 1, дрожжевой экстракт - 1, хлористый натрий - 0,25, глюкоза - 1, деминерализованная вода - остальное, рН 7,2. Колбы инкубируют на качалке (280 об/ мин) при 37°C в течение 8 часов. Выращенную культуру в количестве 5% от объема среды в ферментере стерильно засевают в ферментер. Процесс ферментации ведут при 37°C и интенсивном перемешивании (800 об/мин), рН поддерживают в пределах 7.0-7.4 с помощью 12.5% NH×4 ОН и 6% H₂SO₄. Наработка биомассы осуществлялась в ферментере в течение 48±2 ч. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10⁺¹⁰ КОЕ/см³.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Испытания предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 в виде кормовой добавки, повышающей продуктивность новорожденных поросят.

Эффективность кормовой добавки была испытана на новорожденных поросятах с диагнозом диарея, протекавшей на фоне сложной эпизоотической обстановки в хозяйстве. Контрольные группы поросят получали кормление в соответствии со штатной методикой для этого хозяйства. Поросятам опытных групп (5 групп по 10 голов в каждой группе) задавали кормовую добавку на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 перорально с водой за 20 мин до кормления в разовой даче на голову по 20 мл три раза в день в течение трех суток. Испытания показали, что состояние поросят в контрольных группах (также 5 групп по 10 голов) характеризовалось продолжением диареи, развитием гипотрофии, в результате чего отход поросят составил 18%. В опытных же группах через сутки после дачи кормовой добавки общее состояние поросят стало улучшаться, диарея прекратилась, падежа поросят не было, а через двое суток все животные уже практически были здоровы.

Пример 2.

Сохранность цыплят в первые недели. Проведены испытания на цыплятах бройлерной птицефабрики (по 25 тыс. цыплят в опытной и в контрольной группах). Отход цыплят в контрольной группе, не получавших кормовую добавку, составил 4%, в опытных - 1,8%. В опытных группах цыплята также более интенсивно набирали вес. После первых трех дней средний вес цыпленка в контрольной группе равнялся 58 г, в опытной - 69 г.

Пример 3.

Кормовая добавка аквариумным рыбам. Проводилось кормление подрощенной молоди золотых рыб (оранда) экструдированным кормом с добавлением кормовой добавки на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168. Количество корма составляло 100 г, кормовой добавки - 2 мл. Количество рыб в опытной и контрольной группах составляло по 50 экз. Кормление осуществляли 3 раза в сутки. Корм поедался охотно. Темп роста молоди в опытной группе по сравнению с контрольной составил 18%. Выход рыб в опытной группе - 95%, в контрольной - 76%. Вода в аквариумах не портилась, мутность отсутствовала.

Проведенные испытания показали повышение продуктивности животных, птицы и рыб при использовании кормовой добавки на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии. Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12168. Штамм может быть использован для получения кормовой добавки, повышающей продуктивность сельскохозяйственных животных, птицы и рыб. Изобретение позволяет нормализовать микрофлору желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, птицы, рыбы и повысить их продуктивность. 1 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens В-20 ВКПМ В-12168, используемый для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы и рыб.