Способ формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных Российский патент 2023 года по МПК A61B17/00 A61K35/13 A61K33/14 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения свойств митохондрий клеток опухоли легкого человека формировать опухолевые очаги в легких мышей.

Рак легкого, также известный как бронхогенная карцинома, представляет собой злокачественную опухоль легкого, возникающую в легочной паренхиме или внутри бронхов, на долю которой приходится примерно 22,7% злокачественных опухолей. Развитие рака легких связано со сложными и множественными факторами и генами. Существует более 50 подтипов рака легких, широко классифицируемых на мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), на долю которых приходится 15% и 85% случаев рака легких соответственно. Существует несколько типов NSCLC, включая аденокарциному легкого (LUAD) - 40-50% и плоскоклеточный рак легкого (LUSC) - 30% (см. Liu W., Cui Wu., Zheng C., Yu K., Song G. Application status and future perspectives of the PDX model in lung cancer. front oncol. 2023;13:1098581. doi: 10.3389/fonc.2023.1098581).

Начало рака легкого является коварным, и у большинства пациентов на момент постановки точного диагноза имеются отдаленные метастазы. К сожалению, общая пятилетняя выживаемость больных раком легкого составляет всего 17,8% (см. Zappa C., Mousa S.A. Non-small cell cancer: current treatment and future advances. Transl Lung Cancer Res. 2016;5(3):288-300. doi: 10.21037/tlcr.2016.06.07). Рак легких стал ведущей причиной смертности от рака во всем мире. Необходимы исследования для выявления ранних маркеров развития рака легкого, чтобы улучшить результаты лечения и снизить связанную с этим смертность. В целом, существует необходимость уменьшить неблагоприятный прогноз рака легкого посредством точной ранней диагностики и лечения. Таким образом, существует первоочередная потребность в разработке актуальных моделей рака легкого.

Доклинические модели для исследования рака легких.

На сегодняшний день разработано значительное количество доклинических моделей для исследования рака легкого, включая традиционные клеточные линии рака легкого (A549, SK-MES-1, HCC827) и генетически модифицированные модели мышей (GEMM), которые остаются основными инструментами для начальной разработки лекарств (см. Firestone B. The challenge of selecting the ‘right’ in vivo oncology pharmacology model. Curr Opin Pharmacol. 2010;10(4):391-6. doi: 10.1016/j.coph.2010.06.012). Модели клеточных линий быстры и эффективны в исследовании потенциальных эпигенетических механизмов и механизмов медикаментозного лечения рака легких, что объясняется их функционированием, низкой стоимостью, высокой вероятностью успеха и высокой воспроизводимостью. Однако при использовании традиционных моделей для исследования рака легкого возникают многочисленные проблемы, включая потерю клеточными линиями критических свойств после длительного культивирования in vitro и технологическую неспособность взаимодействовать с микроокружением опухоли.

Кроме того, в доклинических моделях могут наблюдаться изменения в генах, которые вызывают увеличение или потерю генетической информации, изменяют способность к посеву и инвазивность опухолевых клеток (см. Gillet J.P., Calcagno A.M., Varma S., Marino M., Green L.J., Vora M.I., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(46):18708-13. doi: 10.1073/pnas.1111840108).

Текущие исследования, основанные на моделях PDX, открыли новый путь для лечения рака, преодолев ограничения, присущие традиционным клеточным моделям (см. Ibarrola-Villava M., Cervantes A., Bardelli A. Preclinical models for precision oncology. Biochim Biophys Acta Rev Canc. 2018;1870(2):239-46. doi: 10.1016/j.bbcan.2018.06.004). Одной из поразительных особенностей PDX модели является ее способность преодолевать ограничения, связанные с клеточной линией. На клеточном уровне PDX модели сохраняют гетерогенность пациентов и гистопатологию. Более того, секвенирование всего экзома выявило высокое геномное и транскрипционное сходство между моделью PDX и развитием первичной опухоли (см. Misale S., Bozic I., Tong J., Peraza-Penton A., Lallo A., Baldi F., et al. Vertical suppression of the EGFR pathway prevents onset of resistance in colorectal cancers. Nat Commun. 2015;6:8305. doi: 10.1038/ncomms9305).

В сочетании с молекулярным анализом моделей PDX могут быть обнаружены пути, связанные с биогенезом и развитием опухоли пациента. Следовательно, в контексте персонализированной медицины модель PDX может идентифицировать биомаркеры, которые предсказывают ответ на лечение рака, подчеркивая ее полезность для доклинических исследований рака.

Таким образом, PDX модели могут облегчить идентификацию патофизиологии рака легкого и точных целей лечения. Кроме того, образцы опухолей из PDX предоставляют достаточный материал для исследований, связанных с раком. Необходимы исследования для выявления динамических изменений и генетических характеристик различных опухолей, чтобы способствовать развитию таргетной терапии и точной медицины.

Модель PDX бесценна для разработки новых лекарств и персонализированной терапии и актуальна для доклинических исследований. Высококачественные модели PDX могут иметь прогностическую ценность и предсказывать эволюцию опухоли и вероятность рецидива. Они также могут выявить потенциальные диагностические и терапевтические мишени, способствуя развитию точной медицины (см. Ryan M.B., Fece de la Cruz F., Phat S., Myers D.T., Wong E., Shahzade H.A., et al. Vertical pathway inhibition overcomes adaptive feedback resistance to KRASG12C inhibition. Clin Canc Res. 2020;26(7):1633-43. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-352340-42).

Штаммы мышей, используемые для модели PDX.

Для разработки моделей PDX требуются мыши с иммунодефицитом, т.к. мыши с неповрежденной иммунной системой будут вырабатывать устойчивые иммунные реакции для уничтожения имплантированной опухолевой ткани. Мыши Nude CB17-SCID, мыши NOD-SCID, мыши NOG (с частичным дефицитом NOD/SCID/IL-2) и мыши NSG (с полным дефицитом NOD/SCID/IL-2Rycomplete) являются распространенными основными штаммами мышей для создания модели PDX. Среди них наиболее часто используются голые мыши. У этих мышей отсутствуют волосы на теле и тимус. Учитывая отсутствие тимуса, у данных мышей дефицит Т-клеток и, таким образом, они не могут индуцировать адаптивный иммунный ответ.

О модели nude mouse впервые сообщил в 1966 году Flanagan S.P. (см. Flanagan S.P. ‘Nude’, a new hairless gene with pleiotropic effects in the mouse. Genet Res. 1966;8(3):295-309. doi: 10.1017/S0016672300010168), который позволил выращивать раковые клетки человека у мышей.

Впоследствии последовательно появилось использование мышей CB17-SCID и мышей NOD-SCID. Однако из-за высокой частоты спонтанной лимфомы мыши CB17-SCID в основном погибают преждевременно (см. Custer R.P., Bosma G.C., Bosma M.J. Severe combined immunodeficiency (SCID) in the mouse. pathology, reconstitution, neoplasms. Am J Pathol. 1985;120(3):464-77). У мышей NOD-SCID в возрасте около 8,5 месяцев в большинстве случаев тоже возникает спонтанная лимфома (см. Chateau-Joubert S., Hopfe M., Richon S., Decaudin D., Roman-Roman S., Reyes-Gomez E., et al. Spontaneous mouse lymphoma in patient-derived tumor xenografts: The importance of systematic analysis of xenografted human tumor tissues in preclinical efficacy trials. Transl Oncol. 2021;14:101133. doi: 10.1016/j.tranon.2021.101133). Следовательно, ни одна из мышей не подходит для долгосрочных экспериментов.

К началу 2000-х годов Центральный институт экспериментальных животных (CIEA) культивировал мышь с сильно ослабленным иммунитетом NOG, что значительно улучшило выживаемость при трансплантации человеческих клеток и тканей мышам с ослабленным иммунитетом.

В 2005 году американская лаборатория Джексона культивировала мышь NOD/SCID/IL2R гамма (null), также известную как мышь NSG, с более высокой частотой трансплантации и меньшим отторжением опухолевого трансплантата (см. Shultz L.D., Lyons B.L., Burzenski L.M., Gott B., Chen X.H., Chaleff S., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 2005;174(10):6477-89. doi: 10.4049/jimmunol.174.10.6477).

У мышей NSG отсутствуют зрелые T, B и NK-клетки для генетических мутаций. Таким образом, мыши NSG в настоящее время являются наиболее идеальными объектами опухолевого трансплантата и менее склонны к развитию лимфомы, а также имеют большую продолжительность жизни, чем другие мыши (Nude, SCID-мыши, NOD-SCID-мыши). Таким образом, мыши-реципиенты NSG обладают рядом преимуществ при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток человека (см. McDermott S.P., Eppert K., Lechman E.R. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 2010;116(2):193-200. doi: 10.1182/blood-2010-02-271841). Мышь NSG также называют «гуманизированной мышью», или моделью иммунной системы человека (HIS), потому что она поддерживает рост человеческих гемопоэтических стволовых клеток, продуцируя человеческие Т-клетки (см. Shultz L.D., Brehm M.A., Garcia-Martinez J.V., Greiner D.L. Humanized mice for immune system investigation: Progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol. 2012; 12(11):786-98. doi: 10.1038/nri3311). Гуманизированная модель PDX с подобранными для пациента иммунными компонентами имеет ряд преимуществ перед альтернативными моделями для расшифровки биологии опухоли и разработки противоопухолевых препаратов.

Имплантируемыми тканями или клетками могут быть биоптаты пациента или опухолевые клетки, полученные из асцита или плевральной жидкости. Ткани для имплантации состоят из небольших сгустков размером 1-3 мм или суспензий отдельных клеток, полученных путем размельчения небольших фрагментов ткани. Совместная трансплантация с матригелем увеличивает показатели успеха приживления.

В 1990 году Fridman R. et al. сообщалось, что показатель успеха трансплантации был значительно выше, когда ткань рака легкого и матригель были переплетены и имплантированы голым мышам (см. Fridman R., Giaccone G., Kanemoto T., Martin G.R., Gazdar A.F., Mulshine J.L. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87(17):6698-702. doi: 10.1073/pnas.87.17.6698). С этой целью ассоциированные с опухолью фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки обеспечивают функциональную поддержку прогрессирования и развития опухоли. Кроме того, были оценены и сопоставлены различия, которые также могут влиять на способность трансплантата успешно расти, для взаимодействия лиганд-рецепторов между людьми и мышами. Было обнаружено, что некоторые мышиные лиганды не активируют соответствующие рецепторы человека.

Эктопическая или ортотопическая трансплантация традиционно выполняется с помощью подкожной и внутривенной инъекции и других форм введения. Модель подкожной трансплантации является наиболее широко используемой благодаря простоте выполнения и удобному измерению размера опухоли. Местом имплантации часто является спина или подмышка мышей, что является превосходной моделью для оценки лекарственного ответа. Тем не менее, учитывая ограниченное пространство опухоли, трансплантат не растет в правильном анатомическом месте. Следовательно, это не может быть оптимальным подходом для исследования метастазирования опухоли, поскольку опухоль не растет в правильном, не только анатомическом расположении, но и микроокружении.

Для сравнения биологии трансплантата и лекарственной реакции на модели in situ и эктопической модели требуется дифференциальный дисплейный анализ (см. Liu W., Cui Wu., Zheng C., Yu K., Song G. Application status and future perspectives of the PDX model in lung cancer. front oncol. 2023;13:1098581. doi: 10.3389/fonc.2023.1098581).

Приоритет следует отдать инъекции в хвостовую вену для построения ортотопической модели трансплантации для изучения метастазирования опухоли. Преимущество инъекции в хвостовую вену заключается в том, что внешняя среда опухоли in situ ближе к опухоли человека, обеспечивая экспериментальную основу для последующего исследования метастазирования опухоли. Эффективная трансплантация является зарождающейся основой эксперимента, и многие факторы могут повлиять на скорость имплантации. Большое сосудистое русло под почечной капсулой так же способствует росту трансплантата. Авторы имплантировали опухолевую ткань от пациентов с НМРЛ под капсулу почки для получения частоты имплантации до 90% и успешно оценили чувствительность режима химиотерапии пациентов с использованием моделей PDX. Показатель успеха подкожной трансплантации составляет всего около 23% (см. Fichtner I., Rolff J., Soong R., Hoffmann J., Hammer S., Sommer A., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 2008;14(20):6456-68. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0138).

Кроме того, Chen Y., et al. (см. Chen Y., Zhang R., Wang L., Correa A.M., Pataer A., Xu Y., et al. Tumor characteristics associated with engraftment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts in immunocompromised mice. Cancer. 2019;125(21):3738-48. doi: 10.1002/cncr.32366) сообщили, что PDX был выше при плоскоклеточном раке II, III стадии и в образцах малодифференцированных опухолей в ходе наблюдения за пациентами с клинически подтвержденными НМРЛ в течение 1,5-6 лет. Кроме того, некоторые исследования показали, что частота имплантации опухолей PDX после пассажа увеличивается с увеличением количества пассажей, а длительное пребывание ткани in vitro связано с низкой частотой имплантации.

Таким образом, модели PDX являются ценным инструментом в исследованиях биологии опухолей, разработке новых противораковых препаратов и доклиническом скрининге лекарств (см. Yoshida G. J. Applications of Patient-Derived Tumor Xenograft Models and Tumor Organoids. J. Hematol. Oncol. 2020;13:4. doi:10.1186/s13045-019-0829-z). Хотя модели PDX представляют собой очень сложные системы, которые точно копируют опухолевую ткань in vivo, у них также есть ряд недостатков, например, низкий процент успеха (30-40%), недостаточная эффективность и высокая стоимость их создания с точки зрения времени и денег, а также их ограниченный потенциал для применения в высоко производительных исследованиях (см. Kim J. H., An G. H., Kim J. Y., Rasaei R., Kim W. J., Jin X., et al. Human Pluripotent Stem-Cell-Derived Alveolar Organoids for Modeling Pulmonary Fibrosis and Drug Testing. Cell Death Discov. 2021;7:48. doi:10.1038/s41420-021-00439-7;см. Li Z., Qian Y., Li W., Liu L., Yu L., Liu X., et al.. Human Lung Adenocarcinoma-Derived Organoid Models for Drug Screening. iScience. 2020;23:101411. doi:10.1016/j.isci.2020.101411). Эти особенности делают модели PDX непригодными для использования в индустрии персонализированного лечения, и требуются другие модели, подходящие для высокопроизводительных исследований.

Митохондрии - это важнейшие органеллы, отвечающие за выживание клеток и апоптоз. Здоровые митохондрии необходимы для поддержания нормального функционирования клеток. Вместе с тем накопленные данные исследований указывают на то, что митохондрии опухолей претерпевают адаптивные изменения для ускорения размножения опухолевых клеток в кислой и гипоксической микросреде (см. Jing X., Yang F., Shao C., Wei K., Xie M., Shen H., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Mol Cancer. 2019;18:157. doi:10.1186/s12943-019-1089-9)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8193273/ - B1.

Все больше данных свидетельствует о том, что метаболизм и функции митохондрий незаменимы при онкогенезе и прогрессировании рака, а это делает митохондрии и их функции вероятными мишенями для противоопухолевой терапии (см. Dong L., Gopalan V., Holland O., Neuzil J. Mitocans revisited: mitochondrial targeting as efficient anti-cancer therapy. International journal of molecular sciences. 2020;21(21):7941. doi:10.3390/ijms2121794). Хотя механизмы митохондриального перепрограммирования при раке в последнее время получили более пристальное внимание, роль приспособленности органелл в этом процессе широко не рассматривалась (см. Jia D., Park J.H., Jung K.H., Levine H., Kaipparettu B.A. Elucidating the metabolic plasticity of cancer: mitochondrial reprogramming and hybrid metabolic states. Cells. 2018;7(3):21. doi:10.3390/cells7030021; см. Li J., Agarwal E., Bertolini I., Seo J.H., Caino M.C., Ghosh J.C., et al. The mitophagy effector FUNDC1 controls mitochondrial reprogramming and cellular plasticity in cancer cells. Sci Signal. 2020;13(642):eaaz8240. doi:10.1126/scisignal.aaz8240). Фактически, микросреда в которой растет опухоль, крайне неблагоприятна для митохондрий, поскольку неустойчивые концентрации кислорода и окислительные радикалы могут нарушить целостность органелл, дезинтегрировать регулирование множества функций митохондрий и активировать гибель клеток (см. Damaghi M., West J., Robertson-Tessi M., Xu L., Ferrall-Fairbanks M.C., Stewart P.A., et al. The harsh microenvironment in early breast cancer selects for a Warburg phenotype. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118(3):e2011342118. doi:10.1073/pnas.2011342118). Поэтому то, как митохондрии «справляются» с потерей своей «функциональной формы» остается еще не понятным, и влияние некачественных или поврежденных митохондрий на признаки опухоли не изучено (см. Humpton T.J., Alagesan B., DeNicola G.M., Lu D., Yordanov G.N., Leonhardt C.S., et al. Oncogenic KRAS induces NIX-mediated mitophagy to promote pancreatic cancer. Cancer Discov. 2019;9(9):1268-87. doi:10.1158/2159-8290).

Митохондрии имеют первостепенное значение для управления метаболизмом и биоэнергетикой в злокачественных клетках. Они образуют высокоорганизованные сети, в которых структуры их внешней и внутренней мембран определяют их биоэнергетическую емкость (см. Cogliati S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 2013;155:160-171. doi: 10.1016/j.cell.2013.08.032). Однако исследования in vivo, определяющие взаимосвязь между структурной организацией митохондриальных сетей и их биоэнергетической активностью, практически не проводились.

Появляющиеся данные показывают, что митохондрии могут выходить за границы клеток, перемещаться между клетками млекопитающих, радикально бросая вызов известным до сих пор концепциям внутриклеточной сегрегации митохондрий и наследования митохондриальной ДНК - мтДНК. Их сигнальная роль может распространяться на межклеточную коммуникацию, показывая, что митохондриальный геном и даже целые митохондрии действительно мобильны и могут опосредовать передачу информации между клетками. Этот недавно открытый процесс мобильного переноса митохондрий и мтДНК был назван «момиомой», чтобы обозначить все «мобильные функции митохондрий и митохондриального генома» (см. Singh B., Modica-Napolitano J.S., Singh K.K. Defining the momiome: рromiscuous information transfer by mobile mitochondria and the mitochondrial genome. Semin. Cancer Biol. 2017;47:1-17. doi: 10.1016/j.semcancer.2017.05.004).

Митохондриальный межклеточный перенос способствует интеграции митохондрий в эндогенную митохондриальную сеть клеток-реципиентов, способствуя изменению их биоэнергетического статуса и других функциональных свойств клеток-реципиентов не только in vitro, но и in vivo. Более того, трансклеточный перенос митохондриальных генов может иметь серьезные последствия в патофизиологии митохондриальной дисфункции (см. Shanmughapriya S., Langford D., Natarajaseenivasan K. Inter and Intracellular mitochondrial trafficking in health and disease. Ageing Res. Rev. 2020;62:101128. doi:10.1016/j.arr.2020.101128).

Сообщалось, что межклеточный перенос митохондрий естественным образом происходит у людей как нормальный механизм восстановления поврежденных клеток (см. Walters H.E., Cox L.S. Intercellular transfer of mitochondria between senescent cells through cytoskeleton-supported intercellular bridges requires mTOR and CDC42 signalling. Oxid. Med. Cell Longev. 2021; 6697861. doi:10.1155/2021/6697861). Обнаруженное физиологическое явление вдохновило исследователей на создание современной формы трансплантации митохондрий, включая аутологичную (изогенную), аллогенную и даже ксеногенную трансплантацию (см. Doulamis I.P., Guariento A., Duignan T., Kido T., Orfany A., Saeed M.Y., et al. Mitochondrial transplantation by intra-arterial injection for acute kidney injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2020a;319(3):F403-F413. doi:10.1152/ajprenal.00255.2020; см. Ali Pour P., Hosseinian S., Kheradvar A. Mitochondrial transplantation in cardiomyocytes: foundation, methods, and outcomes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2021;321(3):489-503. doi:10.1152/ajpcell.00152.2021).

Учитывая тот факт, что митохондриальная дисфункция может быть в центре разрушительных патологических состояний, перенос митохондрий, называемый трансплантацией митохондрий, обладает высоким терапевтическим потенциалом в современной медицине. Митохондриальная трансплантация - это инновационная стратегия лечения митохондриальной дисфункции, позволяющая преодолеть ограничения терапии с использованием агентов.

Замена, трансплантация или перенос митохондрий - это новое вмешательство и лечение для пациентов с диагнозом митохондриальное заболевание (см. Park A., Oh M., Lee S.J., Oh K.J., Lee E.W., Lee S.C., et al. Mitochondrial transplantation as a novel therapeutic strategy for mitochondrial diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4793. doi:10.3390/ijms22094793). Митохондриальный перенос основан на концепции таргетной терапии тРНК. Стратегии лечения митохондриальной дисфункции обычно делятся на следующие категории: усиление митохондриального биогенеза; уменьшение дисфункциональных митохондрий и замена их активными; доставка или замена дисфункциональных компонентов; вмешательство в последствия митохондриальной дисфункции и перепрограммирование митохондриального генома (см. Russell O.M., Gorman G.S., Lightowlers R.N., Turnbull D.M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168 -188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051; см. Sidarala V., Pearson G.L., Parekh V.S., Thompson B., Christen L., Gingerich M.A., et al. Mitophagy protects beta cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 2020;5(24):e141138. doi:10.1172/jci.insight.141138).

Считается, что митохондрии сохраняются в клетках на протяжении всей их жизни. Предпосылкой для митохондриального переноса является то, что клетка может воспринимать множество различных сигналов окружающей среды и впоследствии осуществлять поглощение, перенос, обработки и интеграцию чужеродного материала. Какие сигналы запускают митохондриальный перенос, имеет большое значение для дальнейшей теории и лечения. Существующие научные данные доказали, что митохондриальный перенос между клетками часто запускается множественными внутриклеточными и внеклеточными событиями клетки-реципиента. Эти события могут действовать как сигналы «найди меня» или «спаси меня», рекрутируя соответствующие донорские митохондрии для предоставления их клеткам-реципиентам (см. Liu Z., Sun Y., Qi Z., Cao L., Ding S. Mitochondrial transfer/transplantation: a new therapeutic approach in multiple diseases. Cellular biography. 2022;12(1):66. doi:10.1186/s13578-022-00805-7).

Таким образом, искусственный митохондриальный перенос может быть инструментом для выявления новых возможностей этих уникальных органелл.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа формирования опухолевых очагов рака легкого в организме мышей Balb/c Nude путем внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных их злокачественной опухоли человека.

Технический результат достигается тем, что самцам мышей линии Balb/c Nude однократно в хвостовую вену трансплантируют митохондрии, изолированные из клеток опухоли легкого человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора, через 4 месяца регистрируют морфологически подтвержденный опухолевый рост в легких мышей.

Для понимания способа приводим фигуры.

Фигура 1. Легкие мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого у человека. Крупные очаговые кровоизлияния, тромбоз, участки гнойно-воспалительных процессов, поверхностная бугристость правого и левого легкого.

Фигура 2. Фрагменты легкого мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого пациента Ч. Крупные и мелкие очаги (а,б) опухолевого поражения с участками лимфоидной инфильтрации и кровоизлияния. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об.х 5, х10.

Фигура 3. Фрагменты плоскоклеточной неороговевающей карциномы легкого пациента Ч. с очаговой лимфоидной инфильтрацией, инвазией стенки долевого бронха, без признаков прорастания висцеральной плевры. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об.х 5, х10.

Фигура 4. Фрагменты легкого мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого у человека: а), б) - значительное расширение сосудов с кровенаполнением; в), г) - кровоизлияние в бронхе и альвеолах. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об. х10,х40,х100.

Фмигура 5. Фрагменты препарата легкого пациента Ч.: а) - вне опухоли крупноочаговые кровоизлияния; б) -г) - наполнение элементами крови бронхо - альвеолярных структур, гемолиз. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об. х10,х40,х100.

Фигура 6. Фрагменты опухолевого поражения легкого у мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого у человека. Формирование опухолевых узлов и тяжей на фоне кровоизлияния: а) у мышей линии Balb/c Nude с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией, б) у пациента Ч. - донора митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого для трансплантации мыши. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об. х100.

Фигура 7. Фрагменты опухолевого поражения легкого:а) - у мыши-самца линии Balb/c Nude после парентеральной трансплантации митохондрий злокачественной опухоли легкого; (б) - у пациента Ч. с плотным расположением атипичных полиморфных клеток сквамозного эпителия. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об. х100.

Фигура 8. Фрагменты опухолевого поражения легкого у мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого: а), б) - проявление признаков аденокарциномы в виде образования железисто- и сосочкоподобные структуры у у мыши-самца линии Balb/c Nude; в), г) - сходные признаки строения аденокарциномы легкого у пациента Ч. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об.х40, х100.

Фигура 9. Фрагменты ткани легкого, пораженного опухолью, со сходными признаками клеточного полиморфизма, крупными ядрами неправильной формы или многоядерными клетками, грубым глыбчатым или сетчатым хроматином, наличием перемычек между глыбками хроматина с образованием пигментной «пыли», множеством фигур патологического митоза: а) - г) - при плоскоклеточном неороговевающем раке у пациента Ч. и д)-з) - мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого. Ок.гематоксилин-эозин, ув.об. х100.

Изобретение «Способ формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о свойствах митохондрий, изолированных из клеток злокачественной опухоли легких человека, вызывать при внутривенной трансплантации развитие опухолевых очагов в организме животных.

Новизна изобретения заключается в использовании митохондрий, изолированных из клеток злокачественной опухоли легких человека, для воспроизведения в организме мышей линии Balb/c Nude вновь образованных опухолевых очагов рака легкого. Проведение экспериментальной внутривенной митохондриальной трансплантации приводило к росту в организме животных очагов роста злокачественной опухоли, доказанных при морфологическом исследовании.

Изобретение «Способ формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной трансплантации митохондрий, изолированных из опухоли, изучения новых свойств митохондрий клеток рака легкого человека вызывать при внутривенной митохондриальной трансплантации в организм животных рост и развитие опухолевых очагов.

«Способ формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных» выполняется следующим образом.

Во время операции торакотомии производят удаление у больного злокачественной опухоли. Часть опухоли быстро помещают в стерильный холодный раствор, содержащий 0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4.

Митохондрии выделяют с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А. (см. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: Современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал. 2011;26(1-1):22-28; см. Гуреев А.П., Кокина А.В., Сыромятникова М.Ю., Попов В.Н. Оптимизация методов выделения митохондрий из разных тканей мыши. Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация. 2015; 4: 61-65).

Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани добавляют по 10 мл стерильной среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизируют и центрифугируют первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2°С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2°С. Между центрифугированием проводят процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищают от лизосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте фикола. Суспензию субклеточных структур наслаивают на градиент фикола, центрифугируют 15 мин при 21000 g, после этого наблюдается разделение на 3 фазы, оставляют нижний слой митохондрий и ресуспендируют средой выделения. Следующую промывку митохондрий осуществляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2°С. Митохондриальные образцы разводят 0,9% раствором NaCl до концентрация белка 3 мг белка в 0,4 мл физиологического раствора.

Мышам линии Balb/c Nude в хвостовую вену одноразово трансплантируют свежеизолированные митохондрии клеток злокачественной опухоли легких человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора.

Контролем служат мыши-самцы линии Balb/c Nude, которым одноразово в хвостовую вену соответственно вводят 0,4 мл физиологического раствора.

Всех животных умерщвляли путем декапитации на гильотине через 4 месяца после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легких человека, когда у животных появлялись следующие симптомы: потеря массы тела ≥25%, вялость, отказ от еды.

Приводим пример применения способа.

Больной Ч, 14.10.1966 года рождения, поступил в отделение торакальной хирургии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России 25.11.2022 г.

Диагноз при поступлении: периферический рак средней доли правого легкого cN3N2V0 st III, кл. группа 2.

Сопутствующие заболевания: артериальная гипертония I стадии, степень АГ I. риск 2, ХСН I ст., ФК 2.

Особенности течения заболевания: при профилактическом осмотре по месту жительства выполнил ФЛО от 14.10.2022 - образование правого легкого. Самостоятельно выполнил СРКТ ОГК от 02.11.2022 - периферическое образование средней доли правого легкого. ВТБС от 08.11.2022 - рак средней доли правого легкого.

Цитологический анализ: аденосквамозный рак.

Обратился в отделение торакальной хирургии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России.

Проведенное лечение: оперативное, инфузионное, симптоматическое, антикоагулянтное, антибактериальное.

Название и дата операции: 28.11.2022 расширенная средняя лобэктомия справа.

Гистологический анализ послеоперационного материала: в ткани легкого - плоскоклеточная неороговевающая карцинома (6 см в диаметре) с очаговой лимфоидной инфильтрацией, инвазией стенки долевого бронха, без признаков прорастания висцеральной плевры.

В ткани легкого вне опухоли - очаговые кровоизлияния, полнокровие сосудов.

В линии резекции бронха и сосудов опухолевого рооста не обнаружено.

В перибронхиальных лимфатических узлах - метастазы плоскоклеточной карциномы с образованием конгломерата.

В лимфатических узлах корня легкого (3) - реактивная гиперплазия, отложение пылевого пигмента.

В бифуркационных лимфатических узлах - метастазы плоскоклеточной карциномы с образованием конгломерата.

В лимфатическом узле паратрахеальной зоны - отложение пылевого пигмента.

В жировой клетчатке легочной связки ткани лимфатического узла не обнаружено.

Получение опухолевого материала. После удаления опухоли, часть материала сразу помещали в холодную стерильную среду выделения - 0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4.

Митохондрии выделяют с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А. (см. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: Современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал. 2011;26(1-1):22-28; см. Гуреев А.П., Кокина А.В., Сыромятникова М.Ю., Попов В.Н. Оптимизация методов выделения митохондрий из разных тканей мыши. Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация. 2015; 4: 61-65). Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма).

На каждый грамм ткани добавляют по 10 мл стерильной среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизируют и центрифугируют первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2°С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2 °С.

Между центрифугированием проводят процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищают от лизосом, пероксисом, и т.п., центрифугируя в 23% градиенте фикола. Суспензию субклеточных структур наслаивают на градиент фикола, центрифугируют 15 мин при 21000 g, после этого наблюдается разделение на 3 фазы, оставляют нижний слой митохондрий и ресуспендируют средой выделения.

Следующую промывку митохондрий осуществляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2°С. Митохондриальные образцы разводили 0,9% раствором NaCl до концентрация белка 3 мг белка в 0,4 мл физиологического раствора.

Характеристика животных-реципиентов.

Мышам линии Balb/c Nude (n=6) в хвостовую вену одноразово трансплантировали свежеизолированные митохондрии клеток злокачественной опухоли легкого человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора.

Контролем служили мыши-самцы линии Balb/c Nude, которым одноразово в хвостовую вену соответственно вводили 0,4 мл физиологического раствора.

Всех животных умерщвляли путем декапитации на гильотине через 4 месяца после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли человека, когда у животных появлялись следующие симптомы: потеря массы тела ≥25%, вялость, отказ от еды.

Морфологическое исследование.

При вскрытии экспериментальных животных на макропрепарате легких четко просматривались крупные очаговые кровоизлияния, тромбоз, участки гнойно-воспалительных процессов, поверхностная бугристость, что отражало активную динамику комплексных патологических процессов онкологической и неонкологической направленности, переноса метаболитов, продуктов распада и факторов, детерминирующих пролиферацию или гибель клеточных систем (см. Фиг. 1).

При световой микроскопии препаратов ткани легкого мышей-самцов линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого у человека, были отмечены крупные слитые и мелкие разрозненные очаги патологического поражения пульмональной ткани опухолью с участками лимфоцитарной инфильтрации и кровоизлияния (см. Фиг. 2 а,б). Эта морфологическая картина была подобна структуре опухоли у пациента - донора митохондрий из клеток плоскоклеточной неороговевающей карциномы легкого (см. Фиг. 3 а,б).

На значительных полях зрения препаратов обоих объектов морфологического исследования отмечалось существенное расширение крупных сосудов, плотно заполненных элементами крови, со сдавлением альвеолярных структур и деструкцией стенок бронхов. На представленных микрофотографиях (см. Фиг. 4 а-г) продемонстрирован геморрагический эффект, наступающий в легких у экспериментальных животных, отмеченный также и у пациента Ч. (см. Фиг. 5 а-г) в ткани легкого вне опухоли при развитии плоскоклеточной неороговевающей карциномы.

На препаратах легкого мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий (см. Фиг. 6а) из легкого пациента Ч. с развитием плоскоклеточной неороговевающей карциномы (см. Фиг. 6б) четко просматривалось единообразие формирования опухолевых узлов на фоне активного наполнения кровью легочного пространства как наиболее благоприятной биохимической среды с высоким содержанием необходимых опухолевым клеткам метаболитов.

Сходные черты роста опухоли в легочной паренхиме у пациента Ч. и мышей линии Balb/c Nude как прямых реципиентов митохондрий, изолированных из опухоли пациента Ч., и внутривенно трансплантированных в организм животного, заключались в том, что в обоих случаях были представлены солидные структуры, состоящие из полей, ячеек и тяжей из плотно прилегающих атипичных полиморфных клеток сквамозного эпителия со слабо развитой цитоплазмой (см. Фиг. 7 а,б). Кроме того, признаками аденокарциномы служили железисто- и сосочкоподобные структуры и комплексы клеток с крупными ярышками (см. Фиг. 8 а-г). Клетки сквамозного эпителия характеризовались выраженной атипией и полиморфизмом. Форма ядер у большинства клеток была неправильная, достигающая больших размеров, окраска неоднородная, ядрышки укрупнены. С достаточно высокой частотой встречались многоядерные клетки, а также патологические митозы с четко обозначенными фигурами деления, чтот свидетельствовало об их пролиферативной активности (см. Фиг. 9 а-з).

Обращала особое внимание сходная структура ядерного хроматина, которая была грубой и неоднородной с глыбчатым или сетчатым строением. Зачастую хроматин скапливался у внутренней поверхности мембраны ядра, образуя единую цепочку, однако наибольшее внимание привлекали крупные глыбки хроматина, соединенные мостиками или перемычками, отдаленно напоминающими самосборку «колеса со спицами». Такого рода конструкции из соединенных перемычками глыбок ядерного хроматина выявлялись в обоих случаях, как в спонтанной опухоли пациента Ч., так и индуцированных митохондриями опухолевых узлах в легких у мышей линии Balb/c Nude.

Таким образом, морфологический контроль образцов ткани легкого, полученных для сопоставительного анализа структуры опухоли, взятой от пациента Ч. и мыши-самца линии Balb/c Nude после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из клеток злокачественной опухоли легкого данного пациента, позволил установить следующие общие черты:

1. В ткани легкого пациента Ч. - плоскоклеточная неороговевающая карцинома с очаговой лимфоидной инфильтрацией, инвазией стенки долевого бронха путем изоляции из опухолевых клеток митохондрий и их внутривенной трансплантации мышам-самцам линии Balb/c Nude способна воспроизводить опухолевый рост в виде крупных слитых и мелких разрозненных очагов патологического поражения пульмональной ткани опухолью с участками лимфоцитарной инфильтрации и кровоизлияния.

2. Характер кровоизлияний в легком у пациента Ч. и мыши-самца линии Balb/c Nude носит сходный обширный характер с крупными очаговым наполнением бронхо-альвеолярных структур, расширением просвета и полнокровием сосудов, геморрагическими проявлениями. Такая биохимическая среда способствует поддержанию метаболического и пролиферативного статуса опухоли, возникающей после внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из клеток злокачественной опухоли легкого данного пациента

3. Идентификация структуры опухоли легкого у мыши-самца линии Balb/c Nude и пациента Ч. показала общность таких морфологических признаков, как солидный тип новообразования, выраженная атипия и полиморфизм клеток сквамозного эпителия с неправильной формой ядер, достигающих больших размеров, неоднородной окраской, укрупненными ядрышками, наличием многоядерных клеткок, множеством патологических митозов. Выявлена сходная структура ядерного хроматина, которая была одинаково грубой и неоднородной с глыбчатым или сетчатым строением, образовывала перемычки между глыками хроматина, что было представлено на микрофото.

Проведенные исследования выявили ранее неизвестные свойства митохондрий, изолированных из рака легкого человека, вызывать при внутривенной трансплантации развитие опухолевых очагов в организме животных, доказанных при морфологическом исследовании. Это ранее не известный факт в экспериментальной онкологии, позволяющий проводить изучение новых свойств митохондрий клеток рака человека.

Технико-экономическая эффективность «Способа формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных» заключается в том, что применение внутривенной трансплантации митохондрий, изолированных из клеток злокачественной опухоли легкого человека, у мышей-самцов линии Balb/c Nude вызывает рост и развитие злокачественных очагов в легких. Это дает возможность изучать патогенез злокачественного роста под влиянием трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого человека, и механизм митохондриального воздействия, вызывающего развитие злокачественных опухолевых очагов рака легкого человека, что важно для клиники, так как доказывает новый ранее не известный механизм воспроизведения опухолевых очагов рака легкого. Способ экономичен, доступен для исполнения.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения свойств митохондрий клеток опухоли легкого человека формировать опухолевые очаги в легких мышей. Для формирования опухолевых очагов рака легкого в организме мышей Balb/c Nude, самцам мышей линии Balb/c Nude однократно в хвостовую вену трансплантируют митохондрии, изолированные из клеток опухоли легкого человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора. Через 4 месяца регистрируют морфологически подтвержденный опухолевый рост в легких мышей. Способа позволяет вызвать рост и развитие злокачественных очагов в легких у мышей-самцов линии Balb/c Nude, что в свою очередь позволяет изучать патогенез злокачественного роста под влиянием трансплантации митохондрий, изолированных из злокачественной опухоли легкого человека, и механизм митохондриального воздействия, вызывающего развитие злокачественных опухолевых очагов рака легкого человека. 9 ил., 1 пр.

Способ формирования опухолевого роста в легких экспериментальных животных, заключающийся в том, что самцам мышей линии Balb/c Nude однократно в хвостовую вену трансплантируют митохондрии, изолированные из клеток опухоли легкого человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора, через 4 месяца регистрируют морфологически подтвержденный опухолевый рост в легких мышей.