Способ получения гепарина Российский патент 2023 года по МПК C12P19/28 C08B37/10 A61P7/02 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, к способу получения лекарственных препаратов, а именно гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней.

Известны способы получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней (например WO 2010110654 А1; и RU 1052234, A61K 31/727, 29.12.1981).

Известные способы получения гепарина не позволяют получать высокоактивный и очищенный целевой продукт, который может быть использован для приготовления лекарственных препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гепарина, включающие стадии экстракции солевыми растворами, очистки экстракта с использованием органических растворителей и сильных анионитов, осаждением спиртом этиловым с последующим высушиванием (смотри патент RU №2 612 813, С08В 37/10, 07.12.2015).

Указанный способ, хотя и позволяет получать целевой продукт с хорошим выходом, пригодный для производства фармацевтических препаратов, однако в технологическом отношении является менее предпочтительным, та как не гарантирует непрерывность технологического процесса, возможного при использовании замороженной слизистой оболочки тонкого кишечника свиней (мукозы) с длительным сроком хранения (до 6 месяцев). Более того, он является зависимым от текущего производственного плана мясоперерабатывающего завода, в частности сезонных колебаний, зависимости от эпизоотической и экономической ситуации, что создает предпосылки к неоднородности серий по объему загрузки и выходу и соответственно сложности при годовом планировании производства, является более длительным на первых стадиях технологического процесса, в частности вспомогательных работ по накоплению сырья. Также известному способу присущи следующие недостатки.

Используется большая концентрация протеолитического фермента.

Является более длительным на стадии сорбции-десорбции и не позволяет в достаточной мере концентрировать целевой продукт. Это связано с тем, что выбранный процесс сорбции-десорбции целевого продукта осуществляется в статическом режиме (адсорбция в «объеме»). Статический процесс является процессом равновесным и при достижении равновесия скорость процесса сорбции-десорбции значительно снижается. Для полноты завершения процесса требуется значительно большее время, большое количество анионита и десорбирующего раствора (натрия хлорида).

Отсутствие стадии концентрирования в динамическом режиме и концетрирования на стадии ультрафильтрации приводит к перерасходу органического растворителя на стадии осаждения целевого продукта, что неизбежно сказывается как на увеличении объемов технологического оборудования, так и площадей под их размещение. Вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса получения гепарина

Задачей изобретения является создание надежного и эффективного способа получения гепарина, лишенного (не зависящего от) указанных недостатков.

Технический результат изобретения - непрерывность технологического процесса получения гепарина.

Указанный технический результат достигается за счет двухэтапного процесса, при котором, во время первого этапа, получают сырец гепарина натрия, являющийся основой для получения конечного продукта - гепарина натрия, далее гепарина. Сырец гепарина натрия может накапливаться в необходимых объемах для дальнейшей его переработки на одном или нескольких предприятиях, а также для создания стратегических запасов.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гепарина, включающем подготовку сырья, разбавление сырья водой в емкости для расщепления белка, нагревание полученного раствора, добавление в него реагентов, выдержку при постоянной температуре, на первом этапе разбавление сырья водой в емкости для расщепления белка осуществляют в соотношении 1:4, нагревают полученный раствор до 25°С, и добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до показателя раствора РН 9.0 и 3.2° Боме. Нагревают полученный раствор до 55°С, повторно добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до показателя раствора РН 9.0 и 3.2° Боме. Затем добавляют 0,01% протеазы от массы сырья, выдерживают в режиме поддержания температуры 55°С и непрерывного перемешивания в течение 1.5 часов. После чего разогревают до 95°С в течение 30 мин., оставляют в режиме поддержания температуры 95°С на 15 минут, затем охлаждают раствор до температуры 58°С.

После охлаждения раствор пропускают через трехфазный сепаратор, перекачивают в емкость для адсорбции иона гепарина натрия. Затем в раствор добавляют смолу AMBERLITE FPA98C1 в соотношении 3% на 1000 кг сырья и перемешивают 10 часов, сливают раствор через сетку в 80 меш. собирают и промывают собранную смолу проточной чистой водой до показатель РН 7.0. Затем помещают в емкость для выделения иона гепарина натрия. Смешивают смолу с раствором хлористого натрия и с 24° Боме объемом в соотношении 1:1. Необходимо, чтобы показатель концентрации соли раствора стал не менее 20° Боме. Нагревают полученный раствор до 50°С, затем повторно добавляют хлористый натрий, чтобы показатель концентрации соли раствора стал не менее 20° Боме (в соотношении с объемом смолы AMBERLITE FPA98CL 1:1). Оставляют в режиме поддержания температуры 50°С на 4 часа, непрерывно перемешивая в течение периода нагревания и поддержания температуры. Затем отделяют жидкость от смолы из раствора с помощью сетки в 80 меш. Полученную жидкость смешивают со спиртом не менее 90° в соотношении 1:1 и оставляют на 24 часа, в результате чего выпадет осадок гепарина-сырца, который отфильтровывают, а отфильтровывают раствор, собирают в емкость. Сырец гепарина натрия может накапливаться в необходимых объемах для дальнейшей его переработки.

Кроме того, что после охлаждения раствора до 58°С, его пропускают через трехфазный сепаратор при скорости вращения 6600 об./мин.

На втором этапе отфильтровывают раствор, полученный в ходе первого этапа, с помощью микрофильтра с задерживанием частиц 0.5 μm при давлении 0.25 МПа. После чего снова фильтруют раствор с помощью ультрафильтрующей мембраны с задерживанием частиц 30000 Да при давлении 1.0 МПа. Полученный раствор фильтруют через нанофильтр с задерживанием частиц 3000 Да при давлении 1.5 МПа, собирают неотфильтрованный раствор (нахождение до фильтрационной сетки), с помощью соляной кислоты (концентрация 6 моль/л.) доводят показатель РН раствора до 7.0. Затем добавляют 95° спирт в соотношении 1:3, перемешивают в течение 5 минут, дают отстояться 12 часов. После чего извлекают осадок на сублимационную сушилку, и, после сушки получают сухой гепарин (натрия) с удельной активностью не менее 180 МЕ/мг.

В указанную совокупность включены все существенные признаки, каждый из которых необходим, а все вместе достаточны для достижения указанного технического результата.

Способ осуществляется следующим образом.

Во время первого этапа, подготовленное сырье помещают в емкость для расщепления белка, и разбавляют водой в соотношении 1:4. Нагревают полученный раствор до 25°С, и добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до показателя раствора РН 9.0 и 3.2° Боме. Затем добавляют 0,1% протеазы, от массы сырья, выдерживают в режиме поддержания температуры 55°С и непрерывного перемешивания в течение 1.5 часов. В результате белки полностью расщеплены, и молекулы гепарина максимально освобождены для адсорбции. После чего раствор подогревают до 95°С в течение 30 мин. и оставляют в режиме поддержания температуры 95°С на 15 минут, затем охлаждают раствор до температуры 58°С.

Чтобы максимально удалить жир и шлак в растворе для повышения эффективности работы смолы, непосредственного улучшения качества и количества полученного гепарина, а также увеличения срока службы смолы, после охлаждения раствор пропускают через трехфазный сепаратор, перекачивают в емкость для адсорбции иона гепарина натрия. Затем в раствор добавляют смолу AMBERLITE FPA98C1 в соотношении 3% на 1000 кг сырья и перемешивают 10 часов, сливают раствор через сетку в 80 меш. собирают и промывают собранную смолу проточной чистой водой до показатель РН 7.0. Затем помещают в емкость для выделения иона гепарина натрия. Смешивают смолу с раствором хлористого натрия и с 24° Боме объемом в соотношении 1:1. Необходимо, чтобы показатель концентрации соли раствора стал не менее 20° Боме. Нагревают полученный раствор до 50°С, затем добавляют хлористый натрий в соотношении с объемом смолы AMBERLITE FPA98CL 1:1. Оставляют в режиме поддержания температуры 50°С на 4 часа, непрерывно перемешивая в течение периода нагревания и поддержания температуры. Затем отделяют жидкость от смолы из раствора с помощью сетки в 80 меш, полученную жидкость смешивают со спиртом 90° в соотношении 1:1 и оставляют на 24 часа, в результате чего выпадет осадок гепарина-сырца. Сырец гепарина натрия может накапливаться в необходимых объемах для дальнейшей его переработки.

После охлаждения раствора до 58°С, его пропускают через трехфазный сепаратор при скорости вращения 6600 об./мин.

На втором этапе отфильтровывают раствор, полученный в ходе первого этапа, с помощью микрофильтра с задерживанием частиц 0.5 μm при давлении 0.25 МПа. После чего снова фильтруют раствор с помощью ультрафильтрующей мембраны с задерживанием частиц 30000 Да при давлении 1.0 МПа. Полученный раствор фильтруют через нанофильтр с задерживанием частиц 3000 Да при давлении 1.5 МПа, собирают неотфильтрованный раствор (нахождение до фильтрационной сетки), с помощью соляной кислоты (концентрация 6 моль/л.) доводят показатель РН раствора до 7.0. Затем добавляют 95° спирт в соотношении 1:3, перемешивают в течение 5 минут, дают отстояться 12 часов. После чего извлекают осадок на сублимационную сушилку, и, после сушки получают сухой гепарин натрия с удельной активностью не менее 180 МЕ/мг.

Предложенный способ гарантирует непрерывность технологического процесса, возможного при использовании замороженной слизистой оболочки тонкого кишечника свиней (мукозы) с длительным сроком хранения (до 6 месяцев). Кроме того, разделение на два этапа позволяет получить сырец гепарина натрия. Сырец гепарина натрия может накапливаться в необходимых объемах для дальнейшей его переработки.

Изобретение относится к области биотехнологии протеогликанов, конкретно к методу синтеза антикоагулянта гепарина. Способ получения гепарина характеризуется тем, что он разделен на два этапа. На первом этапе осуществляют разбавление мукозы водой в емкости для расщепления белка в соотношении 1:4, нагревают полученный раствор до 25°С и добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до рН 9,0 и 3,2° по Боме (°Be), нагревают полученный раствор до 55°С, повторно добавляют NaOH и NaCl до показателя раствора рН 9,0 и 3,2°Be, затем добавляют 0,01% протеазы от массы сырья, выдерживают в режиме поддержания температуры 55°С и непрерывного перемешивания в течение 1,5 ч, после чего разогревают до 95°С в течение 30 мин, оставляют в режиме поддержания температуры 95°С на 15 мин, затем охлаждают раствор до температуры 58°С, после охлаждения раствор пропускают через трехфазный сепаратор, перекачивают в емкость для адсорбции иона гепарина натрия, затем в раствор добавляют смолу AMBERLITE FPA98C1 в количестве 3 мас.% от сырья и перемешивают 10 ч, сливают раствор через сетку в 80 меш, собирают и промывают собранную смолу проточной чистой водой до показателя рН 7,0, затем помещают в емкость для выделения иона гепарина натрия, смешивают смолу с раствором хлористого натрия с плотностью 24°Be в объемном соотношении 1:1 до показателя концентрации соли в растворе не менее 20°Ве, нагревают полученный раствор до 50°С, затем повторно добавляют хлористый натрий, чтобы показатель концентрации соли раствора стал не менее 20°Be в соотношении с объемом смолы AMBERLITE FPA98CL 1:1, оставляют в режиме поддержания температуры 50°С на 4 ч, непрерывно перемешивая в течение периода нагревания и поддержания температуры, затем отделяют жидкость от смолы из раствора с помощью сетки в 80 меш. Полученную жидкость смешивают со спиртом крепостью не менее 90% в соотношении 1:1 и оставляют на 24 ч, в результате чего выпадет осадок гепарина-сырца, который отфильтровывают и фильтрат собирают в емкость. На втором этапе отфильтровывают раствор, полученный в ходе первого этапа, с помощью микрофильтра с задерживанием частиц 0,5 мкм при давлении 0,25 МПа, после чего снова фильтруют раствор с помощью ультрафильтрующей мембраны с задерживанием частиц 30000 Дa при давлении 1,0 МПа. Полученный раствор фильтруют через нанофильтр с задерживанием частиц 3000 Дa при давлении 1,5 МПа, собирают неотфильтрованный раствор, с помощью 6 М соляной кислоты, доводят показатель рН раствора до 7,0, затем добавляют 95% спирт в соотношении 1:3, перемешивают в течение 5 мин, дают отстояться 12 ч, после чего извлекают осадок на сублимационную сушилку и, после сушки, получают сухой гепарин с удельной активностью не менее 180 МЕ/мг. Техническим результатом изобретения является обеспечение непрерывности технологического процесса получения гепарина. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения гепарина, включающий подготовку сырья-мукозы, разбавление мукозы водой в емкости для расщепления белка, нагревание полученного раствора, добавление в него реагентов, выдержку при постоянной температуре, отличающийся тем, что он разделен на два этапа: на первом этапе разбавление мукозы водой в емкости для расщепления белка осуществляют в соотношении 1:4, нагревают полученный раствор до 25°С и добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до показателя раствора рН 9,0 и 3,2°Be, нагревают полученный раствор до 55°С, повторно добавляют гидроксид натрия и хлористый натрий до показателя раствора рН 9,0 и 3,2°Be, затем добавляют 0,01% протеазы от массы сырья, выдерживают в режиме поддержания температуры 55°С и непрерывного перемешивания в течение 1,5 ч, после чего разогревают до 95°С в течение 30 мин, оставляют в режиме поддержания температуры 95°С на 15 мин, затем охлаждают раствор до температуры 58°С, после охлаждения раствор пропускают через трехфазный сепаратор, перекачивают в емкость для адсорбции иона гепарина натрия, затем в раствор добавляют смолу AMBERLITE FPA98C1 в соотношении 3% на 1000 кг сырья и перемешивают 10 ч, сливают раствор через сетку в 80 меш, собирают и промывают собранную смолу проточной чистой водой до показателя рН 7,0, затем помещают в емкость для выделения иона гепарина натрия, смешивают смолу с раствором хлористого натрия и с 24°Be объемом в соотношении 1:1 для получения показателя концентрации соли в растворе не менее 20°Be, нагревают полученный раствор до 50°С, затем повторно добавляют хлористый натрий, чтобы показатель концентрации соли раствора стал не менее 20°Be в соотношении с объемом смолы AMBERLITE FPA98CL 1:1, оставляют в режиме поддержания температуры 50°С на 4 ч, непрерывно перемешивая в течение периода нагревания и поддержания температуры, затем отделяют жидкость от смолы из раствора с помощью сетки в 80 меш, полученную жидкость смешивают со спиртом не менее 90° в соотношении 1:1 и оставляют на 24 ч, в результате чего выпадет осадок гепарина-сырца, который отфильтровывают, а отфильтрованный раствор собирают в емкость; на втором этапе отфильтровывают раствор, полученный в ходе первого этапа, с помощью микрофильтра с задерживанием частиц 0,5 мкм при давлении 0,25 МПа, после чего снова фильтруют раствор с помощью ультрафильтрующей мембраны с задерживанием частиц 30000 Дa при давлении 1,0 МПа, полученный раствор фильтруют через нанофильтр с задерживанием частиц 3000 Дa при давлении 1,5 МПа, собирают неотфильтрованный раствор, с помощью 6 М соляной кислоты, доводят показатель рН раствора до 7,0, затем добавляют 95° спирт в соотношении 1:3, перемешивают в течение 5 мин, дают отстояться 12 ч, после чего извлекают осадок на сублимационную сушилку, и после сушки получают сухой гепарин с удельной активностью не менее 180 МЕ/мг.

2. Способ получения гепарина по п. 1, отличающийся тем, что после охлаждения раствора до 58°С его пропускают через трехфазный сепаратор при скорости вращения 6600 об/мин.