СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНА Российский патент 2024 года по МПК C08B37/10 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных средств, а именно к способу получения нефракционированного гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) сельскохозяйственных парнокопытных животных.

Гепарин представляет собой кислый мукополисахарид (гликозаминогликан) (Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815.), который широко используется в медицине в качестве лекарственного средства. Механизм действия гепарина основан на связывании его с антитромбином III - ингибитором активированных факторов свертывания крови: тромбина, IXa, Ха, ХIа, ХIIа, особенно важной является способность ингибировать тромбин и активированный фактор X. Гепарин является прямым антикоагулянтом, который применяется для профилактики и терапии тромбоэмболических заболеваний, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях.

Изобретение может использоваться при получении гепарина в промышленных масштабах, в том числе в качестве исходного сырья для производства лекарственных средств из группы низкомолекулярных гепаринов - надропарин кальция, дальтепарин, эноксапринин.

Гепарин получают из разнообразных видов природного сырья - печень, легкие и т.д., но предпочтительно в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней или крупного рогатого скота - мукозу.

Известные способы получения гепарина, включающие стадии экстракции солевыми растворами, очистки экстракта с использованием органических растворителей и сильных анионитов, осаждением спиртом этиловым или метиловым с последующим высушиванием [авторское свидетельство СССР SU 1052234 A1 (МПК A61K 31/727), опубл. 07.11.1983; патент СССР SU 1028237 A3, опубл. 07.07.1983 (МПК A61K 31/727); международная публикация WO 1999003893 A, 28, 01, 1999 (МПК C08B 37/00; C08B 37/10; C08B37/10); российский патент RU 2612813 C1, опубл. 13.03.2017 (МПК C08B 37/10); российский патент RU 2749424 C1, опубл. 10.06.2021 (МПК C08B 37/10)]. Известные способы получения гепарина не позволяют получать высокоактивный продукт, который может быть использован для приготовления лекарственных препаратов, а также, являются слишком технологически сложными и длительными.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней (RU 2749424 C1, далее - прототип). Способ получения гепарина, заключается в следующем. Замороженную или жидкую слизистую оболочку тонкого кишечника сельскохозяйственных парнокопытных животных гомогенизируют и экстрагируют 0,5-0,6 М раствором натрия хлорида, с добавлением бактериального субтилизина до конечной концентрации 0,2-0,4% по объему. Ведут ферментативный гидролиз при температуре 50-70°С и рН 7,0-9,0 в течение 4-6 часов, после чего фермент инактивируют при температуре 90°С в течение 15-30 минут. Экстракт центрифугируют. Балластные примеси из осветленного экстракта удаляют осаждением при рН 2,5-4,0 и температуре 50-70°С в течение 30 минут. Образовавшийся осадок удаляют сепарацией. После этого ведут сорбцию целевого продукта из освобожденного от балластных примесей осветленного экстракта на анионообменном хроматографическом сорбенте. Сорбент предварительно уравновешивают 0,6 М раствором натрия хлорида. После завершения сорбции сорбент промывают 0,6 М раствором натрия хлорида, удаляют балластные вещества с сорбента 0,9 М раствором натрия хлорида, гепарин с сорбента десорбируют раствором натрия хлорида с концентрацией 1,4 М. Элюат диафильтруют водой для инъекций и концентрируют ультрафильтрацией с добавлением ацетата натрия до содержания последнего 3,0-6,0% по массе. Раствор полупродукта после ультрафильтрации подвергают стерилизующей фильтрации и осаждению метанолом до окончательной массовой доли последнего 35-38%. После чего смесь выдерживается при температуре 5 ± 3°С в течение 180,5 часов и центрифугируется. Полученный полупродукт высушивается в вакуум-сушильном шкафу. Выход гепарина составляет 0,212 –0,221 г/кг мукозы.

В прототипе используют протеолитический фермент – бактериальный субтилизин и сильные аниониты под торговыми марками TOSOH TOYOPEARL GigaCap Q-650, Bio Rad UNOsphere™ Q Media.

Приведенный выше способ-прототип хотя и позволяет получать целевой продукт с хорошим выходом, пригодным для производства фармацевтической субстанции, однако в технологическом отношении является менее предпочтительным. Недостатками указанного способа получения гепарина являются:

1. Длительность технологического процесса, особенно на стадии экстракции.

2. Использование в технологическом процессе дорогостоящего протеолитического фермента.

3. Использование длительных дополнительных технологических операций – инактивация протеолитического фермента (субтилизин), удаление балластных примесей из осветленного экстракта путем осаждения при рН 2,5-4,0 и температуре 50-70°С.

4. На стадии десорбции, из-за более низкой концентрации соли, не удается в достаточной мере сконцентрировать целевой продукт. Для полноты завершения процесса требуется значительно большее время.

Вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса получения гепарина.

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы расширить арсенал технических средств получения гепарина и предложить новый способ получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника сельскохозяйственных парнокопытных животных, характеризующийся сокращенным временем экстракции (в 5 - 6 раз по сравнению с известными способами), который позволяет обойтись без использования протеолитических ферментов.

Техническими результатами настоящего изобретения являются реализация изобретением своего назначения, а сокращение технологического процесса в 5 - 6 раз по сравнению с известными способами, неиспользование протеолитических ферментов, увеличение выхода и активности целевого продукта.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника сельскохозяйственных парнокопытных животных с использованием сильных макропористых анионитов (макропористых сорбентов), содержащих в качестве функциональных групп - четвертичные аммониевые группы. Под макропористыми анионитами (сорбентами) понимают ионообменные смолы с диаметром пор во влажном состоянии не менее 1000 Å. На заключительных стадиях получения, для концентрирования гепарина и удаления примесей белковой и небелковой природы, применяют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах c пределом исключения по молекулярной массе 5000 Да, с последующим осаждением целевого продукта метиловым спиртом в присутствии ацетата натрия, и высушиванием его под вакуумом в сушильном шкафу.

Для достижения указанных технических результатов предложен способ, который включает в себя следующие стадии:

Замороженную слизистой оболочку тонкого кишечника сельскохозяйственных парнокопытных животных (мукозы), размораживают, гомогенизируют, заливают 1,2 М раствором натрия хлорида, экстрагируют при температуре 80 ± 5°С в течение 1,0 ± 0,1 часа. Затем экстракт центрифугируют и образовавшийся осадок удаляют сепарацией. Для осветления экстракт фильтруют. Разводят водой и ведут сорбцию целевого продукта на макропористых анионитах. Аниониты предварительно уравновешивают водой очищенной.

После завершения сорбции анионит промывают 0,60 М раствором натрия хлорида, а затем 0,65 М - все при рН 2,5 ± 0,1. Гепарин с анионитов элюируют раствором натрия хлорида с концентрацией 1,6 М рН 2,5 ± 0,1. Для уравновешивания анионита оптимальным является вода очищенная, для промывки раствор натрия хлорида с концентрацией 0,60 М рН 2,5 ± 0,1. Авторами было неожиданно обнаружено, что данная концентрация соли не препятствует сорбции гепарина, но в тоже время препятствует сорбции на анионите белковых примесей, сахаров и полисахаридов.

Для удаления балластных веществ с анионита оптимальным является 0,65 М натрия хлорида рН 2,5 ± 0,1, при более низких концентрациях раствора натрия хлорида не полностью удаляются балластные вещества, более высокие концентрации не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных веществ. Для элюции гепарина с анионита оптимальным является раствор натрия хлорида с концентрацией 1,6 М рН 2,5 ± 0,1. Авторами было неожиданно обнаружено, что низкие концентрации соли не полностью десорбируют целевой продукт, а при более высоких концентрациях с анионита частично десорбируются примеси, что существенно отражается на качестве гепарина.

Проведенными нами исследованиями, по кинетике высвобождения гепарина из сырья, при экстракции, температуре 855°С, было неожиданно установлено, что максимальное количество гепарина экстрагируется в течение 1,0 ± 0,1 часа. В течение данного времени и при указанной температуре, параллельно интенсивно протекает процесс денатурации белковых и пептидных субстратов, которые на стадии сепарирования и фильтрации удаляются, что значительно снижает вероятность сорбции белковых и других примесей на стадии хроматографической очистки гепарина.

Использование анионитов в силу свой макропористой структуры и большой емкости по целевому продукту, позволяют проводить сорбцию при высоких скоростях потока (10-18 мл/см²), что значительно повышает эффективность и экономичность технологического процесса, как за счет уменьшения расхода химических реактивов, так и за счет сокращения времени проведения процесса. Использование макропористых анионитов, в динамических условиях, на стадии десорбции позволяет сконцентрировать раствор гепарина более чем в 50 - 60 раз. Под динамическими условиями понимают непрерывную подачу экстракта в верхнюю часть хроматографической колонны.

Дальнейшее концентрирование гепарина, очистку от посторонних примесей в том числе от ионов соли натрия хлорида проводят методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны c пределом исключения по молекулярной массе 5000 Да. Из концентрата гепарин осаждают спиртом метиловым с добавлением ацетата натрия до концентрации более 7% и осаждение метанолом до конечной концентрации 371%. Осаждение проводят при температуре 41°С в течение 182 часов. Осадок гепарина высушивают в сушильном шкафу под вакуумом при температуре 60 ± 3°С до постоянного веса.

Заявленный способ позволяет получать очищенный гепарин с высокой удельной активностью, определяемой по активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ).

Сопоставимый анализ предлагаемого способа и прототипа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что целевой продукт выделяют из мукозы без применения дорогостоящих протеаз типа субтилизинов. Процесс экстракции значительно сокращен, до 1 часа, вместо 6 часов. Сокращены стадии технологического процесса, например отсутствуют стадии денатурации протеаз, подведение рН раствора до кислых значений, с целью удаления балластных белков. Дальнейшее выделение и очистку проводят в динамических условиях на макропористых анионитах нового поколения.

Краткое описание чертежей

Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фиг. 1-3.

На Фиг. 1 представлена типичная хроматограмма экстракта слизистой оболочки кишечника (мукозы) свиньи. Пик гепарина выделен кружком.

На Фиг. 2 представлена хроматограмма стандартного образца гепарина натрия (А) и гепарина натрия, полученного согласно примеру 1 (B).

На Фиг. 3 представлен ¹H ЯМР-спектр гепарина натрия, полученного согласно примеру 1.

Осуществление изобретения

Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение гепарина натрия

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиньи размораживают, заливают 3000 мл 1,2 М раствора натрия хлорида и гомогенизируют. Экстракцию ведут 1,0 ± 0,1 ч при температуре 805°С. По завершению экстракции, экстракт охлаждают до температуры 20 ± 2°С и отделяют от исходного сырья центрифугированием при n около 10000 об/мин в течение 10 мин. Получают около 4000 мл надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость фильтруют через несколько слоев фильтровальной бумаги и разбавляют водой очищенной. Прозрачный раствор разбавленного фильтрата пропускают через колонку, заполненную анионитом марки YMC-BioPro Q75, предварительно уравновешенным водой очищенной. После завершения сорбции анионит промывают 0,60 М раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1, а затем 0,65 М раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1. Элюцию гепарина проводят раствором натрия хлорида с концентрацией 1,6 М при рН 2,5 ± 0,1. Получают элюат, содержащий гепарин, в количестве 0,045 л. Элюат концентрируют и очищают от примесей, в том числе солей, на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке c пределом исключения по молекулярной массе 5000 Да. В концентрат гепарина добавляют расчётное количество безводного ацетата натрия до концентрации более 7 масс-%, и осаждают спиртом метиловым, конечная концентрация спирта 37 ± 1% при температуре +41°С в течение 182 ч. Спиртовой осадок дважды промывают 1,5 объемами спирта метилового, отделяют центрифугированием и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом при температуре 60 ± 3°С. Высушенный порошок гепарина натрия измельчают на мельнице, расфасовывают в двойные полиэтиленовые пакеты и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 25°С. Получают 0,235 г гепарина натрия с удельной активностью 285 МЕ/мг.

Пример 2. Получение гепарина натрия

Все операции выполняются в условиях примера 1. В качестве анионита используют Monomix Mab60-Q. Получают элюат, содержащим гепарин, в количестве 0,052 л. Получают 0,220 мг гепарина, с удельной активностью 280 МЕ/мг. ¹H ЯМР спектр и хроматографическая чистота продукта аналогичны спектру гепарина натрия по примеру 1.

Пример 3. Получение гепарина натрия

Все операции выполняются в условиях примера 1. В качестве анионита используют UniGel-80Q. Получают элюат, содержащим гепарин, в количестве 0,048 л. Получают 0,215 мг гепарина, с удельной активностью 283 МЕ/мг.¹H ЯМР спектр и хроматографическая чистота продукта аналогичны спектру гепарина натрия по примеру 1.

Выход гепарина 46200 МЕ/кг мукозы.

Пример 4. Анализ гепарина натрия, полученного согласно примерам 1-3

Чистоту и подлинность получаемого согласно примерам 1-3 гепарина натрия определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе, снабженном диодно-матричным детектором «Agilent 1260 Infinity II LC» («Agilent Technologies», США) c использованием колонки «Dionex IonPac AS11-HC» («Thermo Scientific», США), путем сопоставления времени удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора (Фиг. 2B) и времени удерживания пика гепарина на хроматограмме раствора стандартного образца гепарина для физико-химического анализа EP CRS (Фиг. 2А). Растворителями подвижной фазы являются фосфатный буферный раствор с pH 3 (А) и фосфатный буферный раствор с добавлением натрия перхлората (В). Гепарин натрия элюируют, используя программу градиента: В; 0-10 мин 25% В; 10-35 мин 25-100% В; 35-40 мин 100% В при постоянной скорости потока 0,22 мл/мин¹. Температуру колонки поддерживают на уровне 40°С. Объем вводимой пробы 20 мкл. Детектирование проводят при длине волны 202 нм.

Подтверждение молекулярной структуры проводили методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса. ¹H ЯМР-спектр регистрировали на спектрометре ЯМР JEOL JNM ECA 600 с использованием дейтерия оксида, содержащего 0,02 мг/мл натрия тетрадейтеродиметилсилапентаноата в качестве растворителя, и сравнивали с ¹H ЯМР-спектром стандартного образца (СО) гепарина натрия для ЯМР идентификации EP CRS. ¹H ЯМР-спектр гепарина натрия (таблица 1.), полученного, согласно изобретенному нами способу, соответствовал ¹H ЯМР-спектру стандартного гепарина натрия для ЯМР идентификации EP CRS (серия № 2.1). В спектрах (Фиг.3) присутствовали основные сигналы гепарина натрия (м.д.): 2,04 0,03, 3,27 0,03 (дублет), 4,34 0,03, 5,22 0,03, 5,42 0,03. В диапазоне 1,5 - 3,0 м.д. отсутствует сигнал при 2,16 ± 0,03 м.д., характерный при наличии примеси гиперсульфатированного хондроитина сульфата. В спектрах не наблюдалось неидентифицированных сигналов в областях от 0,10 до 2,00 м.д., от 2,10 до 3,10 м.д. и от 5,70 до 8,00 м.д. высотой более 4% от высоты сигнала при 5,42 м.д.

Таблица 1. Описание ¹H ЯМР-спектров гепарина натрия

№ п/п Отнесение характеристичных сигналов СО гепарина натрия
δ_H,м.д. Гепарин натрия, полученный по примеру 1, δ_H м.д. 1 -COCH₃ 2,05 2,05 2 GlcNS6S H2 3,29 3,27 3 IdoA2S H2 4,34 4,34 4 IdoA2S H1 5,22 5,22 5 GlcNS, GlcNS6S H1 5,42 5,41

Удельное вращение образцов гепарина определяли на автоматическом поляриметре Rudolph Autopol III. Для всех анализируемых образцов гепарина натрия, величина удельного вращения в воде при 20°C соответствовала требованию Государственной Фармакопеи Российской Федерации - не менее +35 в пересчете на сухое вещество. Для всех образцов, получаемых по описанному выше способу, величина удельного вращения соответствовала заданному критерию приемлемости, и была выше +50.

Таблица 2. Удельное вращение образцов гепарина

Гепарин натрия, полученный по примеру Измеренный угол вращения, градусы Масса навески, г Потеря в массе при высушивании, % Величина удельного вращения 1 2,191 2,0009 2,7 +56 2 2,204 2,0295 2,6 +56 3 2,226 2,0163 3,5 +57

Изобретение относится к способу получения нефракционированного гепарина. Предложенный способ предусматривает использование в качестве сырья замороженной слизистой оболочки тонкого кишечника свиньи и включает размораживание сырья; его гомогенизацию и экстракцию 1,2 М водным раствором натрия хлорида при температуре 80 ± 5°С в течение 1,0 ± 0,1 часа. Затем проводят охлаждение до температуры 20 ± 2°С; отделение экстракта центрифугированием; фильтрование экстракта и разбавление его водой. Пропускают водный раствор через колонку с макропористым анионитом, предварительно уравновешенным водой; промывают анионит 0,60 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1, затем 0,65 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1. Проводят элюцию гепарина 1,6 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1; концентрируют и очищают элюат на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке c пределом исключения по молекулярной массе 5000 Да. После чего добавляют в концентрат безводный ацетат натрия до концентрации более 7 мас.% и осаждают метанолом до конечной концентрации метанола 37 ± 1% при температуре +4 ± 1°С в течение 18 ± 2 ч. Промывают осадок метанолом и отделяют осадок центрифугированием. Затем высушивают гепарин натрия под вакуумом при температуре 60 ± 3°С. Изобретение позволяет увеличить выход гепарина, его удельную активность, сократить время и упростить способ получения. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Способ получения нефракционированного гепарина натрия с использованием в качестве сырья замороженной слизистой оболочки тонкого кишечника свиньи, включающий следующие стадии:

a) размораживание сырья;

b) его гомогенизация;

c) экстракция 1,2 М водным раствором натрия хлорида при температуре 80 ± 5°С в течение 1,0 ± 0,1 часа;

d) охлаждение до температуры 20 ± 2°С;

e) отделение экстракта центрифугированием;

f) фильтрование экстракта;

g) разбавление его водой;

h) пропускание водного раствора через колонку с макропористым анионитом, предварительно уравновешенным водой;

i) промывание анионита 0,60 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1, затем 0,65 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1;

j) элюция гепарина 1,6 М водным раствором натрия хлорида при рН 2,5 ± 0,1;

k) концентрирование и очистка элюата на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке c пределом исключения по молекулярной массе 5000 Да;

l) добавление в концентрат безводного ацетата натрия до концентрации более 7 мас.% и осаждение метанолом до конечной концентрации метанола 37 ± 1% при температуре +4 ± 1°С в течение 18 ± 2 ч;

m) промывание осадка метанолом;

n) отделение осадка центрифугированием;

o) высушивание гепарина натрия под вакуумом при температуре 60 ± 3°С.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемый гепарин натрия обладает удельной активностью более 280 МЕ/мг.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемый гепарин натрия имеет удельное вращение более +50 при 20°C в воде.