СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНА Российский патент 2017 года по МПК C08B37/10 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных препаратов, а именно к способу получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней.

Гепарин представляет собой кислый мукополисахарид (гликозаминогликан) (Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с. 815).

Гепарин широко используется в медицине в качестве лекарственного препарата как прямой антикоагулянт. Применяется для профилактики и терапии тромбоэмболических заболеваний, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях.

Изобретение может использоваться при получении гепарина в промышленных масштабах.

Гепарин получают из разнообразных видов природного сырья - печень, легкие и т.д., но предпочтительно получают из слизистой оболочки тонкого кишечника свиней (мукозы). Известны способы получения гепарина, включающие стадии экстракции солевыми растворами, очистки экстракта с использованием органических растворителей и сильных анионитов, осаждением спиртом этиловым с последующим высушиванием (RU 1052234, RU 1028237, SU 1028237 A, WO 1999003893 А1). Известные способы получения гепарина не позволяют получать высокоактивный и очищенный целевой продукт, который может быть использован для приготовления лекарственных препаратов, а также являются слишком сложными и длительными.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней (WO 2010110654 А1). Способ получения гепарина заключается в следующем.

К свежей мукозе, которая хранится не более 72 часов, при pH 8,0-9,0 добавляют щелочную протеазу до концентрации 0,7%-0,8%. Ферментативный гидролиз при температуре 40-60°C в течение 4 часов, После окончания гидролиза щелочную протеазу инактивируют при 80°C-90°C в течение 10 минут. Гидролизат фильтруют и добавляют сильный анионит, соотношение гидролизат/анионит 133-266 или 0,75-0,38% анионита от объема гидролизата. Адсорбцию гепарина ведут в статическом режиме при перемешивании в течение 3-10 часов при температуре 40-60°С. После инкубации анионит переносят на фильтр и промывают водой. Примеси с анионита удаляют 0,1-0,5 М раствором натрия хлорида. Элюцию гепарина осуществляют 2,0 - 4,0 раствором натрия хлорида.

Выход гепарина составляет 40000 - 50000 Ед/кг мукозы.

В прототипе используют протеолитический фермент - щелочную протеазу Syder alkaline protease (Wuxi Syder Bio-proucts Co., Ltd.) или ферменты из группы щелочных протеаз - Maxatase, Alcalase, Maxapem, Purafect и сильный анионит Amberlite FPA98 CI (Rohm and Haas Ion Exchange Resins, Philadelphia USA) или аниониты под торговыми марками Dowex, Duolite и Lewatit, имеющие в качестве функциональных групп четвертичные аммониевые группы.

Приведенный выше способ-прототип, хотя и позволяет получать целевой продукт с хорошим выходом, пригодный для производства фармацевтических препаратов, однако в технологическом отношении является менее предпочтительным:

1. Не гарантирует непрерывность технологического процесса, возможного при использовании замороженной слизистой оболочки тонкого кишечника свиней (мукозы) с длительным сроком хранения (до 6 месяцев).

2. Является зависимым от текущего производственного плана мясоперерабатывающего завода, в частности сезонных колебаний, зависимости от эпизоотической и экономической ситуации, что создает предпосылки к неоднородности серий по объему загрузки и выходу и соответственно сложности при годовом планировании производства.

3. Является более длительным на первых стадиях технологического процесса, в частности вспомогательных работ по накоплению сырья.

4. Используется большая концентрация протеолитического фермента.

5. Является более длительным на стадии сорбции-десорбции и не позволяет в достаточной мере концентрировать целевой продукт. Это связано с тем, что выбранный процесс сорбции-десорбции целевого продукта осуществляется в статическом режиме (адсорбция в «объеме»). Статический процесс является процессом равновесным и при достижении равновесия скорость процесса сорбции-десорбции значительно снижается. Для полноты завершения процесса требуется значительно большее время, большое количество анионита и десорбирующего раствора (натрия хлорида).

6. Отсутствие стадии концентрирования в динамическом режиме и концетрирования на стадии ультрафильтрации приводит к перерасходу органического растворителя на стадии осаждения целевого продукта, что неизбежно сказывается как на увеличении объемов технологического оборудования, так и площадей под их размещение. Вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса получения гепарина.

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения гепарина из слизистой оболочки тонкого кишечника свиней с использованием протеолитического фермента при небольшой его концентрации, анионита нового поколения и ультрафильтрации, обеспечивающих высокую активность и выход целевого продукта, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение выхода, активности гепарина, сокращение и оптимизация технологического процесса.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения гепарина с использованием протеолитического фермента - алкалазы (Alcalase^® 2,5L, активность 2,5 AU-A/g, «Novozymes») и сильного анионита нового поколения YMC-BioPro Q75 («YMC Co., Ltd»), содержащий в качестве функциональных групп четвертичные аммониевые группы. На заключительных стадиях получения для концентрирования гепарина и удаления натрия хлорида применяют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа, с последующим осаждением целевого продукта этиловым спиртом и высушиванием в вакуум-сушильном шкафу.

Для достижения указанного технического результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии.

Замороженную слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, которая хранится не более 6 месяцев при температуре -20°C, размораживают, гомогенизируют, заливают 0,6 М раствором натрия хлорида и добавляют протеолитический фермент - алкалазу до конечной концентрации 0,1-0,4%. Ведут ферментативный гидролиз при оптимальном значении активности фермента - температуре 65°C и pH 8,5-8,6 в течение 6 часов. По истечении ферментативного гидролиза проводят инактивацию фермента при температуре 90°C в течение 15 минут. Гидролизат охлаждают до температуры 15-20°C, для лучшего отделения жидкой и твердой фазы и центрифугируют. Для дополнительной очистки гидролизата от балластных веществ белковой природы к надосадочной жидкости добавляют концентрированную соляную кислоту до pH 3,0, нагревают до температуры 70°С. Выдерживают в течение 30 минут. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. После этого ведут сорбцию целевого продукта из надосадочной жидкости на анионите YMC-BioPro Q75, анионит предварительно уравновешивают 0,6 М раствором натрия хлорида.

После завершения сорбции анионит промывают 0,6 М раствором натрия хлорида. Удаление балластных веществ с анионита проводят 0,9 М раствором натрия хлорида, гепарин с анионита элюируют раствором натрия хлорида с концентрацией 1,4 М.

Для уравновешивания и промывки колонки наиболее оптимальным является раствор натрия хлорида с концентрацией 0,6 М. Данная концентрация соли не препятствует сорбции гепарина, но в то же время препятствует сорбции на анионите белков, пептидов и других полисахаридов.

Для удаления балластных веществ с анионита оптимальным является 0,9 М натрия хлорида, при более низких концентрациях раствора натрия хлорида неполностью вымываются балластные вещества, более высокие концентрации не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных веществ. Для элюции гепарина с анионита наиболее оптимальным является раствор натрия хлорида с концентрацией 1,4 М, низкие концентрации соли не полностью элюируют целевой продукт, при более высоких концентрациях с анионита частично элюируются примесные вещества, что существенно отражается на активности гепарина и его чистоте.

Применение протеолитического фермента алкалазы, обладающего широкой субстрат-специфичностью, при высокой ионной силе (повышенное содержание натрия хлорида) способствует более полному высвобождению гепарина из сырья. Согласно литературным данным гепарин в нативном состоянии связан с белком посредством ксилозильного остатка полисахаридной цепи с серином полипептидной цепи (Б.Н. Степаненко. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М.: Высшая школа, 1978, с. 255). Концентрация фермента при ферментативном гидролизе составляет 0,1-0,5%.

Проведенными нами исследованиями по кинетике высвобождения гепарина из сырья при ферментативном гидролизе установлено, что максимальное количество гепарина накапливается в гидролизате в течение 5-6 часов. В течение данного времени интенсивно протекает протеолиз и происходит максимальное накопление продуктов промежуточного гидролиза белковых субстратов. Образующие пептиды в значительной степени осаждаются при значении pH 3,0 и нагревании до 70°C. Осаждение продуктов ферментативного гидролиза позволяет избавиться от примесей белковой природы (количество белка в гидролизате уменьшается более чем на 50%), а также снизить вероятность сорбции примесей на стадии хроматографической очистки гепарина.

Использование анионита YMC-BioPro Q75, в силу своей большой емкости по целевому продукту и улучшенным кинетическим характеристикам (скорость проведения процесса сорбции достигает 9 мл/см² × мин), позволяет использовать небольшой объем анионита (соотношение гидролизат/анионит 400 или 0,25% анионита от объема гидролизата), что значительно повышает эффективность и экономичность технологического процесса как за счет уменьшения расхода химических реактивов, так и за счет сокращения времени проведения процесса. Использование анионита в динамических условиях на стадии десорбции позволяет сконцентрировать гепарин более чем в 50 раз.

Дальнейшее концентрирование гепарина и очистку от натрия хлорида проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Данная операция позволяет не только удалить натрия хлорид и сконцентрировать целевой продукт, но и на последующей стадии значительно сократить расход органического растворителя - спирта этилового.

Из концентрата гепарин осаждают 1,5 объемами спирта этилового при температуре +4°C и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом.

Способ позволяет получать очищенный гепарин с высокой удельной активностью по АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время). Выход гепарина на 10% выше, чем по известному способу.

Сопоставимый анализ предлагаемого способа и прототипа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что целевой продукт выделяют из размороженной мукозы при ферментативном гидролизе, очищают от белковых примесей при нагревании и пониженном значении pH, дальнейшее выделение и очистку проводят в динамических условиях (хроматографический метод) на анионите с последующим удалением натрия хлорида и концентрированием ультрафильтрацией.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней размораживают, заливают 3000 мл 0,6 М раствора натрия хлорида с pH 8,5, гомогенизируют и добавляют раствор алкалазы до конечной концентрации 0,1%. Ферментативный гидролиз ведут 6 ч при при температуре 65°С. Гидролизат охлаждают до температуры 15-20°С и отделяют от исходного сырья путем центрифугирования при n=14000 об/мин в течение 15 мин. Получают около 4000 мл надосадочной жидкости. К надосадочной жидкости добавляют концентрированную соляную кислоту и устанавливают pH 3,0, нагревают до 70°C, выдерживают при этой температуре 30 минут. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при n=10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант пропускают через анионит YMC-BioPro Q75 уравновешенным 0,6 М раствором натрия хлорида. Объем колонки 15 мл (количество сорбента 10 мл). Время сорбции 2,0 часа. Затем анионит промывают 0,6 М раствором натрия хлорида. Для удаление балластных веществ анионит промывают 0,9 М раствором натрия хлорида.

Элюцию гепарина проводят раствором натрия хлорида с концентрацией 1,4 М. Элюат отбирают фракциями. Фракции, содержащие гепарин, объединяют. Получают 50 мл элюата. Время десорбции 0,5 часа.

Элюат очищают от натрия хлорида и концентрируют в режиме ультрафильтрации на ультрафильтрационной установке фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) в тангенциальном потоке с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.

Из концентрата гепарин осаждают 1,5 объемами 96° спирта этилового при температуре +4°C. Спиртовой осадок гепарина дважды промывают 1,5 объемами спирта этилового, высушивают в сушильном шкафу под вакуумом при температуре 60°C.

Получают 175 мг гепарина с удельной активностью 165 МЕ/мг. Выход гепарина 28875 МЕ/кг мукозы.

Пример 2

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней размораживают, заливают 3000 мл 0,6 М раствора натрия хлорида с pH 8,5, гомогенизируют и добавляют раствор алкалазы до конечной концентрации 0,2%. Остальные операции выполняются в условиях примера 1.

Получают 190 мг гепарина с удельной активностью 187 МЕ/мг. Выход гепарина 35530 МЕ/кг мукозы.

Пример 3

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней размораживают, заливают 3000 мл 0,6 М раствора натрия хлорида с pH 8,5, гомогенизируют и добавляют раствор алкалазы до конечной концентрации 0,3%. Остальные операции выполняются в условиях примера 1.

Получают 210 мг гепарина с удельной активностью 220 МЕ/мг. Выход гепарина 46200 МЕ/кг мукозы.

Пример 4

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней размораживают, заливают 3000 мл 0,6 М раствора натрия хлорида с pH 8,6, гомогенизируют и добавляют раствор алкалазы до конечной концентрации 0,4%. Остальные операции выполняются в условиях примера 1.

Получают 220 мг гепарина с удельной активностью 240 МЕ/мг. Выход гепарина 52800 МЕ/кг мукозы.

Пример 5

1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней размораживают, заливают 3000 мл 0,6 М раствора натрия хлорида с pH 8,6, гомогенизируют и добавляют раствор алкалазы до конечной концентрации 0,5%. Остальные операции выполняются в условиях примера 1.

Получают 230 мг гепарина с удельной активностью 241 МЕ/мг. Выход гепарина 55565 МЕ/кг мукозы.

Способ получения гепарина предусматривает размораживание и гомогенизацию сырья, заливку 0,6 М раствором натрия хлорида, добавление алкалазы до конечной концентрации 0,1-0,5%. В качестве сырья используют замороженную слизистую оболочку тонкого кишечника (мукозу) свиней со сроком хранения не более 6 месяцев при -20ºС. Ведут ферментативный гидролиз при температуре 65°С и рН 8,5-8,6 в течение 6 часов, затем фермент инактивируют при температуре 90°С в течение 15 минут. Полученный гидролизат охлаждают до температуры 15-20°С и центрифугируют. Для дополнительной очистки гидролизата от балластных веществ белковой природы к надосадочной жидкости добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 3,0, нагревают до температуры 70°С и выдерживают в течение 30 минут. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. После этого ведут сорбцию целевого продукта в динамическом режиме из надосадочной жидкости на анионите YMC-BioPro Q75. Анионит предварительно уравновешивают 0,6 М раствором натрия хлорида. После завершения сорбции анионит промывают 0,6 М раствором натрия хлорида, удаляют балластные вещества с анионита 0,9 М раствором натрия хлорида, гепарин с анионита десорбируют раствором натрия хлорида с концентрацией 1,4 М. Изобретение позволяет увеличить выход гепарина, его удельную активность, сократить технологический процесс. 1 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения гепарина, отличающийся тем, что замороженную слизистую оболочку тонкого кишечника свиней (мукозу), которая хранится не более 6 месяцев при температуре -20°С, размораживают, гомогенизируют, заливают 0,6 М раствором натрия хлорида, добавляют протеолитический фермент - алкалазу до конечной концентрации 0,1-0,5% и ведут ферментативный гидролиз при температуре 65°С и рН 8,5-8,6 в течение 6 часов, по истечении ферментативного гидролиза проводят инактивацию фермента при температуре 90°С в течение 15 минут, гидролизат охлаждают до температуры 15-20°С и центрифугируют, для дополнительной очистки гидролизата от балластных веществ белковой природы к надосадочной жидкости добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 3,0, нагревают до температуры 70°С и выдерживают в течение 30 минут, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, после этого ведут сорбцию целевого продукта в динамическом режиме из надосадочной жидкости на анионите YMC-BioPro Q75, анионит предварительно уравновешивают 0,6 М раствором натрия хлорида, после завершения сорбции анионит промывают 0,6 М раствором натрия хлорида, удаление балластных веществ с анионита проводят 0,9 М раствором натрия хлорида, гепарин с анионита десорбируют раствором натрия хлорида с концентрацией 1,4 М.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очистку от натрия хлорида и концентрирование гепарина проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.