Способ стимулирования регенерации нерва Российский патент 2022 года по МПК A61B17/00 A61B17/11 A61L31/04 A61P25/00 C07K14/47 

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и травматологии.

Травматические повреждения нервов достаточно часто встречаются в клинической практике. В тяжелых случаях травма вызывает полный анатомический разрыв с формированием дефекта между центральным и периферическим отрезками нерва.

На сегодняшний день одним из наиболее эффективных методов помощи при протяженных разрывах периферических нервов является использование кондуитов нерва, состоящих из трубки на основе биосовместимых и биорастворимых материалов, заполненных гидрогелевой средой (1). Перспективы этого подхода связывают с возможностью введения в кондуит нерва стимуляторов нейрорегенерации.

Наиболее близким по выполнению является способ стимулирования посттравматической регенерации периферического нерва, при котором в депонирующую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, которая заполняет силиконовую трубку, вводят L-аргинин и далее имплантируют кондуит в место протяженного разрыва периферического нерва (2).

Показатель восстановления двигательной функции нерва в случае использования L-аргинина динамично возрастает, начиная с 11 суток после операции, и к 28 суткам превышает показатель теста в группе с пустой трубкой на 46% (Р<0,05).

Однако известны сведения об оказываемом токсическом действии L-аргинина на нервные клетки и организм в целом (3-7).

Техническим результатом заявленного способа является использование в качестве ингредиентов активного препарата соединений, не оказывающих токсического действия при сохранении способности стимулирования восстановления двигательной функции нерва.

Технический результат достигается тем, что биосовместимую трубку имплантируют в место разрыва периферического нерва, фиксируют в ней один конец разорванного нерва, заполняют её водным раствором, включающим экзогенный белок теплового шока Hsp70 с концентрацией 500-900 нм/мл и коллаген I и/или III типа, и фиксируют в ней другой конец разорванного нерва.

Конец разорванного нерва фиксируют предпочтительно на 0,5-2 мм внутрь трубки двумя эпиневральными швами (при точном сопоставлении поперечных срезов концов нерва).

Соотношение коллагенов I и III типа может быть любым.

Концентрация коллагена составляет преимущественно 1-3 г/мл.

Белок теплового шока Hsp70 в организме проявляет противовирусное, антибактериальное (8) и противоопухолевое (9) действие. Известно, что Hsp70 снижает нейрональный апоптоз на временном отрезке от 24 до 48 часов после аксотомии (10). Исследование его влияния на регенерацию нервов не известно.

Коллаген I и III типа является основным структурным материалом в мягких и твердых соединительных тканях, таких как кожа, кости, хрящи, сухожилия и т. д. (11,12).

В каких-либо информационных источниках отсутствуют сведения о токсическом действии белка теплового шока Hsp70 и коллагена I и III.

Способ получения препарата заключается в том, что водный раствор белка Hsp70 смешивают с водным раствором коллагена I и/или III типа до конечной концентрации Hsp70  500-900 нм/мл (1 наномоль =10^-9 моль).

Пример 1. Получение белка Hsp70.

Рекомбинантный человеческий Hsp70 получен и очищен в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Для этого, после получения человеческого Hsp70, экспрессированного в культуре клеток E. coli, пробы белка наносятся на анионообменную смолу - DEAE-целлюлозу. Промывается колонка 2-х кратным объемом TEN0.1 буфера и затем элюируется белок используя градиент NaCl в TEN0.1 от 100мМ до 300мМ. Чистоту белка проверяют с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции с DEAE-целлюлозы для дальнейшей очистки наносят на колонку с ATP-агарозой. После выделения белок очищают от примесей ЛПС на колонке с полимиксин B-агарозой (Sigma). Диализ очищенного рекомбинантного белка проводят при 4°С против двух смен PBS. Концентрацию белка определяют по методу Брэдфорда с помощью Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (ThermoFisher Scientific). Качество очистки белков оценивали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Пример 2. Приготовление препарата.

Предварительно готовят раствор коллагена на воде для инъекций (фармакопейная статья ФС.2.2.0019.15 /ГФ XIII издания/), для чего насыпают 1,5 г коллагена I и III типов в соотношении 1:1 (гидролизованный бычий коллаген Doctor's Best Pure Collagen Types 1 & 3 Powder) в 1 мл воды для инъекций. Для разведения белка берут 1 мл воды для инъекций и добавляют туда 420 мг белка (получают 6000 нм [1наномоль = 10^-9молей]). Из этого раствора берут 100 мкл [1 миллилитр (мл) = 1000 микролитров (мкл)] и смешивают с 900 мкл коллагена, что даёт концентрацию белка в конечном растворе 600 нм или 42 мг/мл.

Аналогично получают препарат с концентрацией белка 800 нм/мл, исходя из 2 г/мл коллагенов I и III типов. Аналогично получают препарат с концентрацией коллагена 1 г/мл, 3 г/мл и белка 500 нм/мл и 900 нм/мл.

Пример 3. Формирование кондуита

Удаляется фрагмент седалищного нерва длиной 5 мм. На место удаленного участка помещается силиконовая трубка длиной 7 мм  с внутренним диаметром 2 мм и толщиной стенки 0,5 мм (АО "НИИРП"). Конец нерва погружается в силиконовую трубку на 1 мм в глубину и фиксируется двумя эпневральными швами при помощи шовного материала W1718 ЭТИЛОН 10/0, 30 см, черный (Шпат. МП 6,5 мм х 2, 3/8). Трубка заполняется препаратом из коллеганового геля и Hsp70 в объёме 30 мкл, после чего в нее помещается на 1 мм в глубину и фиксируется аналогичным образом другой конец нерва.

Аналогично проводят формирование кондуита с погружением обоих концов нерва в силиконовую трубку на 0,5 мм и на 2 мм.

Исследование нейропротекторной активности

Исследования нейропротекторной активности гелевого препарата на основе Нsp70 проведены на белых беспородных крысах-самцах весом 150-200 г в соответствии с требованиями локального этического комитета при ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет». Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°С со свободным доступом к воде и пище.

В процессе исследований было показано влияние препарата на восстановление функционирования конечности, снижение атрофии мышц, снижение гибели (апоптоза) нервных клеток.

1. Исследование регенерации периферического нерва и восстановления функционирования конечности.

Дорзальные ганглии крысы (DRG) содержат тела сенсорных нейронов. Аксоны этих нейронов включены в седалищный нерв, ответственный за иннервацию задней конечности. Исследование эффективности восстановления функционирования конечности проводилось по оценке эффективности регенерации седалищного нерва.

Использовали модель сдавливания седалищного нерва (для оценки носителя) и модель его перерезки (аксотомии). Крыс анестезировали внутримышечной инъекцией 0,75 мл смеси 2:1 Xyla (2% раствор ксилазин гидрохлорида; производства Interchemie Werken "de Adelaar" BV, Нидерланды) и телазола (смесь гидрохлорида тилетамина и гидрохлорида золазепама; производства Zoetis, США). Операция по аксотомии седалищного нерва и выделению DRG выполнялась в соответствии с протоколом, описанным Savastano и соавторами (13). Неповрежденные контралатеральные DRG и участки нерва выступали в качестве контроля.

Операции были проведены следующим образом:

Перерезка: Наркотизированному животному на уровне середины бедра удаляется фрагмент седалищного нерва длиной 5 мм. На место удаленного участка помещается силиконовая трубка длиной 7 мм и внутренним диаметром 2 мм. В трубку помещается проксимальный конец нерва на 1 мм в глубину и фиксируется двумя эпиневральными швами (этилон 10/0). Трубка заполняется коллагеновым гелем с белком Hsp70 после чего в нее помещается на 1 мм в глубину и фиксируется аналогичным образом дистальный конец нерва.

Сдавливание: Наркотизированному животному на уровне середины бедра обнажают участок седалищного нерва и затем при помощи пинцета с усилием сжимают его в течение 10 секунд, вследствие чего он становится прозрачным, так как оболочка нерва остается непрерывной, а аксоны на этом участке разрываются. Вокруг сформированной травмы на нерв наносится коллагеновый гель, содержащий в себе препарат Hsp70.

Далее спустя 15 и 30 суток после удаления фрагмента нерва и спустя 3 и 15 суток в группе с раздавливающей травмой под наркозом производится декапитация животных с последующим забором материала, а именно: 4 и 5 спинномозговые ганглии, поврежденный участок седалищного нерва, участок икроножной мышцы.

Оценка носителя.

Проведена оценка носителя коллагена.

Для исследования динамики высвобождения и распределения препарата Hsp70 при иммобилизации в носителе белок был помечен флуорохромами Cy3 или Cy5 (Amersham).

Флуоресценция Нsp70 в коллагене наблюдалась уже через 1сутки после раздавливания нерва в самом нерве и в меньшей степени в DRG. Через 3 суток флуоресценция Нsp70 сохранялась, хотя её уровень снижался на 47% (р≤0,05) в поврежденном нерве и на 74% (р≤0,05) в DRG по сравнению с уровнем спустя 1 сутки.

Таким образом, иммобилизация Нsp70 в коллагеновом геле способствует пролонгированному высвобождения белка или его олигопептидов и его накапливанию в аксонах и даже удаленных от места повреждения DRG.

Оценка эффективности регенерации седалищного нерва.

Оценка проведена с помощью физиологических тестов «Реакция разгибателя» и «Нога-ошибка».

Тест «Реакция разгибателя» проведен на 15 и 30 сутки для группы с удалением фрагмента нерва. Тест создан для изучения восстановления нервной функции у крыс при перерезке седалищного нерва и основан на измерении силы, приложенной к поверхности весов, выражаемой в граммах (14). Инстинктивное разгибание лапы при приближении крысы к поверхности весов происходит за счет работы камбаловидной и икроножной мышц. Тело крысы заматывают в полотенце, оставляя свободными только попеременно здоровую и опытную конечности и держат животное вертикально. По мере опускания крысы к платформе она вытягивает заднюю лапу, ожидая контакта с поверхностью весов. Замеряется сила давления повреждённой лапы на весы. Контролем выступает сила давления на весы здоровой задней лапы. Рассчитывается также процент функционального дефицита по формуле: [(значение опыта – значение контроля) / значение контроля] х 100%.

В таблице 1 представлены результаты исследований в соответствии с тестом. В качестве Контроля 1 использовались интактные животные. Группу 1 составили животные с аксотомией и с имплантированным пустым кондуитом. Контролем 2 служили животные с аксотомией и введённым в кондуит коллагеном в концентрации 1,5 г/мл. В группу 2 вошли животные с аксотомией и введённым в кондуит коллагеном и белком Hsp70 в концентрации 600 нм/мл.

Таблица 1

Группы Сила давления задней лапы на весы
г функциональный дефицит по сравнению с контролем 1
% 15 суток 30 суток 15 суток 30 суток Контроль 1 31±4 31±4 Группа 1 9±2 16±3 -71* -48* Контроль 2 11±4 18±3 -65* -42* Группа 2 18,5±2 23±4 -40* -26

*изменения статистически достоверны (р≤0,05) по сравнению с контролем 1.

Аналогичные результаты получены при введении коллагена в концентрации 1 г/мл и 3 г/мл и препарата в концентрации 500 нм/мл и 900 нм/мл.

Как видно, введение препарата после аксотомии способствует улучшению регенерации на 15 и 30 сутки, как по отношению к животным без введения препарата, так и с введением только коллагена.

Тест «Нога-ошибка» проведен на 15 и 30 сутки для группы с удалением фрагмента нерва. Тест «Нога-ошибка» позволяет оценить асимметрию в использовании конечностей на приподнятой сетке. Неточное расположение конечностей ведет к проскальзыванию через отверстия в сетке, т.е. к ошибкам. Все животные проходят от одного конца клетки до другого конца пять раз (15). Движения записываются с помощью видеокамеры и потом анализируются в замедленной съёмке отдельно для каждой конечности.

Количество ошибок рассчитывается по формуле: [(количество проскальзываний в отверстия сетки поврежденной задней конечности /количество шагов, сделанных этой конечностью] х 100%. Рассчитывается также процент функционального дефицита по формуле: [(значение опыта – значение контроля) / значение контроля] х 100%.

В таблице 2 приведены результаты исследований. Группы аналогичны группам в таблице 1

Таблица 2

Группы количество ошибок
%. функциональный дефицит по сравнению с контролем 1
% 15 суток 30 суток 15 суток 30 суток Контроль 1 49±6 49±6 Группа 1 79±6 59±3 61* 20* Контроль 2 70±7 60±3 43* 23* Группа 2 60±4 41±3 23 -16

*изменения статистически достоверны (р≤0,05) по сравнению с контролем 1.

Аналогичные результаты получены при введении коллагена в концентрации 1 г/мл и 3 г/мл и препарата в концентрации 500 нм/мл и 900 нм/мл.

Как видно, результаты теста показали снижение ошибок при введении препарата на 15 и 30 сутки, как по сравнению с животными без введения им лекарственных средств после аксотомии, так и по сравнению с животными с введенным им коллагеном после аксотомии.

2. Исследование снижения атрофии мышц.

После перерезания (аксотомии) седалищного нерва, инервация икроножной мышцы нарушается, она атрофируется, диаметр её мышечных волокон снижается. Если происходит регенерация и восстановление инервации мышцы, диаметр мышечных волокон растет.

Для гистологического исследования икроножную мышцу фиксировали в 10% формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 80, 96 и 100%, по 10 мин) и ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 6-8 мкм изготовляли с помощью ротационного микротома HM 325 Thermo Scientific (Германия), монтировали на предметные стекла, депарафинировали ксилолом и этанолом (100 и 96%) и окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под микроскопом Nikon Eclipse FN1 (Nikon, Япония). Проведена оценка диаметра мышечных волокон.

В таблице 3 приведены результаты исследований. Группы аналогичны группам в таблицы 1. Диаметр волокон мышц выражен в микронах/микрометрах (1мкм=0,001мм).

Таблица 3

Группы Диаметр мышечных волокон
мкм Изменения диаметра мышечных волокон по сравнению с контролем 1
% 15 суток 30 суток 15 суток 30 суток Контроль 1 6,1±0,4 6,1±0,4 Группа 1 4,7±0,4 4,0±0,4 23* 34* Контроль 2 4,6±0,5 4,5±0,3 25* 26* Группа 2 5,6±0,2 5,3±0,4 8 16

*изменения статистически достоверны (р≤0,05) по сравнению с контролем 1.

Аналогичные результаты получены при введении коллагена в концентрации 1 г/мл и 3 г/мл и препарата в концентрации 500 нм/мл и 900 нм/мл.

Как видно, отмечается увеличение диаметра мышечных волокон в группах животных, получавших препарат Нsp70 в коллагеновом геле как по сравнению с животными после аксотомии, так и по сравнению с животными, получившими коллаген после аксотомии.

3. Исследование снижения гибели (апоптоза) нервных клеток

Для исследования влияния гелевых препаратов Hsp70 на выживание или гибели нейронов и глиальных клеток в моделях нейротравмы использовали метод визуализации апоптоза на срезах ганглиев DRG методом TUNEL с помощью набора In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red (12156792910, Roche). Метод TUNEL основан на маркировании разрывов цепи ДНК. Зафиксированные в 4% параформальдегиде срезы переносили на предметное стекло и после 3-кратной отмывки в PBS подвергали пермеабилизации. Для этого срезы инкубировали 2 минуты при +4°С в 0,1% цитрате натрия с добавлением 0,1% Triton X-100 (SigmaAldrich). После пермеабилизации срезы промывали 2 раза в PBS, подсушивали, добавляли 50 мкл реакционной смеси TUNEL на каждый образец и инкубировали 60 мин во влажной камере в темноте при +37°С. Далее препараты промывали 3 раза в PBS, подсушивали и заключали в глицерин под покровное стекло. Препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе Olympus BX51WI (Япония), снабженном цифровой камерой ORCA-Flash4.0 V3, при возбуждении в диапазоне 570-620 нм. TUNEL–позитивные клетки подсчитывали в срезах ганглиев 5-го дорсального корешка с ипсилатеральной (правой) стороны, где нейроны подвергались аксотомии (аксотомированный ганглий), а также с интактной контралатеральной стороны (контрольный ганглий) трех животных.

В таблице 4 представлены результаты исследований по оценке % апоптотических (умирающих) клеток к общему количеству клеток в спинномозговых ганглиях крыс. В качестве групп использованы группы, аналогичные группам таблицы 1.

Таблица 4

Группы Количество апоптотических клеток к общему количеству клеток
% Изменения количества апоптотических клеток по сравнению с контролем 1
% 15 суток 30 суток 15 суток 30 суток Контроль 1 15±3 15±3 Группа 1 58±7 55±8 287* 267* Контроль 2 57±5 66±5 280* 340* Группа 2 31±5 35±4 107* 133*

*изменения статистически достоверны (р≤0,05) по сравнению с контролем 1.

Аналогичные результаты получены при введении коллагена в концентрации 1 г/мл и 3 г/мл и препарата в концентрации 500 нм/мл и 900 нм/мл.

Как видно из данных таблицы, отмечается уменьшение количества апоптотических клеток по отношению к общему количеству клеток в группах животных, получавших препарат Нsp70 в коллагеновом геле как по сравнению с животными после аксотомии, так и по сравнению с животными, получившими коллаген после аксотомии.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет стимулировать восстановление функционирования нерва и снизить дегенерацию нейронов после его протяженного разрыва при использовании в качестве ингредиентов препарата соединений, не проявляющих токсического действия.

Литература

1. Челышев Ю.А. Богов А.А. Экспериментальное обоснование применения кондуитов нерва / Неврологический вестник (журнал им. В.М. Бехтерева). - 2008. - Т.40. - №4. - С.101-109

2. Патент РФ № 2 464 020, МПК А61К31/198, 2011 г.

3. Harston GW, Sutherland BA, Kennedy J, Buchan AM. The contribution of L-arginine to the neurotoxicity of recombinant tissue plasminogen activator following cerebral ischemia: a review of rtPA neurotoxicity. J Cereb Blood Flow Metab. 2010;30(11):1804-16. doi: 10.1038/jcbfm.2010.149.

4. Dawson VL, Dawson TM. Nitric oxide neurotoxicity. J Chem Neuroanat. 1996;10(3-4):179-90. doi: 10.1016/0891-0618(96)00148-2. PMID: 8811421.

5. Mohan S, Wu CC, Shin S, Fung HL. Continuous exposure to L-arginine induces oxidative stress and physiological tolerance in cultured human endothelial cells. Amino Acids. 2012;43(3):1179-88. doi: 10.1007/s00726-011-1173-y.

6. Xia Z, Luo T, Liu HM, Wang F, Xia ZY, Irwin MG, Vanhoutte PM. L-arginine enhances nitrative stress and exacerbates tumor necrosis factor-alpha toxicity to human endothelial cells in culture: prevention by propofol. J Cardiovasc Pharmacol. 2010;55(4):358-67. doi: 10.1097/FJC.0b013e3181d265a3.

7. Степанов Ю.М., Твердохлеб И.В., Сиренко О.Ю. L-аргинин: свойства, применение в медицине, токсичность и аргинининдуцированное поражение поджелудочной железы // СУЧАСНА ГАСТРОЕНТЕРОЛОГIЯ – 2012. - № 3 - №65. – С. 63-70.

8. Патент РФ № 2 229 307, МПК А61К 39/385, 2002г.

9. Патент РФ № 2 333 767, МПК А61К 38/17, 2006г.

10. Tidwell JL, Houenou LJ, Tytell M. Administration of Hsp70 in vivo inhibits motor and sensory neuron degeneration. Cell Stress Chaperones. 2004;9(1):88-98. doi: 10.1379/csc-9r.1.

11. ByAbul K. Mallik, Md Shahruzzaman, Md Sazedul Islam, Papia Haque, Mohammed Mizanur Rahman Biodegradability and Biocompatibility of Natural Polymers / Natural Polymers for Pharmaceutical Applications 1st Edition. 2019. Academic Press. – 36 с.

12. https://collagen-store.ru/tip-i-vid-collagen

13. Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., & Patterson, S. I. (2014). Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of neuroscience methods, 227, 166–180 doi.org/10.1016/j.jneumeth.2014.01.020.

14. Varejão AS, Melo-Pinto P, Meek MF, Filipe VM, Bulas-Cruz J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurol Res. 2004;26(2):186-94. doi: 10.1179/016164104225013833.

15. Barth TM, Jones TA, Schallert T. Functional subdivisions of the rat somatic sensorimotor cortex. Behav Brain Res. 1990;39(1):73-95. doi: 10.1016/0166-4328(90)90122-u.

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и травматологии. Биосовместимую трубку имплантируют в место разрыва периферического нерва. Фиксируют в ней один конец разорванного нерва. Заполняют трубку водным раствором, включающим экзогенный белок теплового шока Hsp70 с концентрацией 500-900 нм/мл и коллаген I и/или III типа. Фиксируют в ней другой конец разорванного нерва. Способ позволяет стимулировать восстановление функционирования нерва и снизить дегенерацию нейронов после его протяженного разрыва при использовании в качестве ингредиентов препарата соединений, не проявляющих токсического действия. 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Способ стимулирования регенерации нерва, характеризующийся тем, что биосовместимую трубку имплантируют в место разрыва периферического нерва, фиксируют в ней один конец разорванного нерва, заполняют её водным раствором, включающим экзогенный белок теплового шока Hsp70 с концентрацией 500-900 нм/мл и коллаген I и/или III типа, и фиксируют в ней другой конец разорванного нерва.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что конец разорванного нерва фиксируют на 0,5-2 мм внутрь трубки двумя эпиневральными швами.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что соотношение коллагенов I и III типа любое.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что концентрация коллагена составляет 1-3 г/мл.