СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АВСВ1-БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO Российский патент 2024 года по МПК C12N5/07 G01N33/68 B82Y5/00 A61K38/14 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для ингибирования белка-транспортера АВСВ1-белка (гликопротеина-Р, Pgp) в эксперименте in vitro.

АВСВ1-белок локализован в опухолевых клетках, энтероцитах кишечника, гепатоцитах, эпителиоцитах почечных канальцев, эндотелиальных клетках гистогематических барьеров и участвует в эффлюксе многих эндогенных и экзогенных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Изменение активности АВСВ1-белка в эксперименте in vitro может применяться для изучения роли данного транспортера в фармакокинетике лекарственных препаратов и прогнозирования межлекарственных фармакокинетических взаимодействий на уровне данного белка транспортера с участием веществ, принадлежащих к числу его субстратов.

Известно, что прогестерон в концентрации 100 мкМ оказывает ингибирующее влияние на Pgp на клетках линии Caco-2 [Изучение влияния прогестерона на активность гликопротеина-Р in vitro Ерохина П.Д., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Черных И.В., Попова Н.М., Слепнев А.А., Якушева Е.Н. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2020. Т. 28. №2. С. 135-142]. Известно, что полисахаридный комплекс, выделенный из цветков пижмы обыкновенной, уменьшает активность Pgp на клеточной линии Caco-2 в концентрациях 10 и 100 мкМ [Влияние полисахаридных комплексов растений средней полосы России на активность белка-транспортера гликопротеина-P in vitro Черных И.В., Щулькин А.В., Кириченко Е.Е., Правкин С.К., Якушева Е.Н. Химия растительного сырья. 2020. №4. С. 73-81]. Известно, что воздействие H₂O₂ в концентрациях 10 и 50 мкМ в течение 3 ч уменьшает активность Pgp на клетках линии Caco-2 [Влияние окислительного стресса на транспорт субстрата Р-гликопротеина через клеточный монослой Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В., Сеидкулиева А.А., Черных И.В., Якушева Е.Н. Биологические мембраны. 2021. Т. 38. №4. С. 292-305]. Известно, что воздействие DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 50, 100 или 500 мкМ и инкубации в течение 3 часов снижает активность АВСВ1-белка на клеточной линии Caco-2 [Функционирование белка мембранного транспорта P-гликопротеина в условиях ингибирования синтеза глутатиона. Абаленихина Ю.В., Ерохина П.Д., Мыльников П.Ю., Щулькин А.В., Якушева Е.Н. Прикладная биохимия и микробиология. 2022. Т.58. №3. С.232-243].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка простого и доступного способа ингибирования АВСВ1-белка в эксперименте in vitro.

С данной целью был выполнен следующий эксперимент. Исследование выполнено на линиях клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C («WorldScience», Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина («Sigma-Aldrich», Германия) соответственно. После достижения 70-90% конфлюентности клетки снимали с фласка добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия) и высеивали на 24-луночный планшет («Corning», США). Далее клетки культивировали в течение 48 часов после достижения монослоя. Смену питательной среды производили ежедневно.

В исследовании использовали следующие маточные водные коллоидные растворы модифицированных наночастиц золота с диаметром 18-21 нм:

1) Золото-L-Фукоза-Меркаптогексаноилгидразид (Au-MHH-Fuc) (1 мг/мл)

2) Золото-D-Лактоза-Меркаптопропаноилгидразид (Au-MPH-Lac) (2 мг/мл)

3) Золото-D-Галактоза-Меркаптопропаноилгидразид (Au-MPH-Gal) (1 мг/мл).

Функциональную активность АВСВ1-белка на клеточных мембранах исследовали путем оценки внутриклеточного накопления маркерного субстрата транспортера - фексофенадина (150 мкМ). Фексофенадин - блокатор H₁-гистаминовых рецепторов III поколения, внутриклеточное проникновение которого контролируется АВСВ1-белком. В этой связи интенсивность его проникновения внутрь клеток может характеризовать функциональную активность транспортера.

Клеточная культура преинкубировалась в 24-луночных планшетах в течение 8 часов с растворами гликонаночастиц в питательной среде в концентрациях 350 мкг/мл, 550 мкг/мл и 300 мкг/мл для Au-MHH-Fuc, Au-MPH-Lac и Au-MPH-Gal соответственно. В предварительном исследовании с помощью МТТ-теста выявлено, что в указанных концентрациях наночастицы не оказывают цитотоксическое действие на культуру клеток, используемую в данном эксперименте, что свидетельствует о сохранении их жизнеспособности и способности транспортера к активному функционированию.

В качестве вещества сравнения с известной способностью снижать функциональную активность АВСВ1-белка был использован хинидин в концентрации 200 мкМ [Роль гликопротеина-P в рациональной фармакотерапии в кардиологии. Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Рациональная фармакотерапия в кардиологии. 2013. Т.9. №6. С.701-707] и сроком преинкубации, соответствующим таковому для гликонаночастиц золота - 8 ч.

Клетки снимались со дна лунок с помощью раствора трипсин-ЭДТА, промывались трижды 1 мл фосфатного буферного раствора (pH 7,2) с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут. Далее разводились в 350 мкл фосфатного буферного раствора и лизировались трехкратным циклом заморозки-разморозки.

Непосредственно перед хроматографическим анализом пробы размораживались при комнатной температуре, к каждой пробе добавлялись 300 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт - амантадин (амантадин гидрохлорид, United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard, США) в концентрации 10 нг/мл, перемешивали на встряхивателе Vortex (Heidolph, Германия) и центрифугировались при 25000 g в течение 10 минут при t=4°С. В дальнейшем 20 мкл пробы вводилось в автосемплер хроматографа для количественного анализа фексофенадина.

Количественный анализ фексофенадина в клеточном лизате проводился методом ВЭЖХ-МС/МС.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Statistica 13.0. Распределение данных анализировали, используя критерий Шапиро-Уилка. Различия концентраций фексофенадина в клеточном лизате оценивали с помощью критерия Даннета, т.к. распределение данных не отличалось от нормального. Приемлемым уровнем значимости считали 0,05.

Оценка накопления фексофенадина внутри клеток Caco-2 при их инкубации с наночастицами золота показала, что частицы с лактозой и галактозой увеличивали внутриклеточное содержание вещества через 8 ч инкубации в 3,5 (p=0,0025) и в 5,3 (p<0,0001) раза соответственно.

Таблица 1
Количество фексофенадина в лизате клеток Caco-2 на фоне их 8-часовой инкубации с гликонаночастицами золота, хинидином (эталонный ингибитор АВСВ1-белка) Содержание фексофенадина в лизате клеток Caco-2, нг/мг белка Контроль Хинидин Au-MHH-Fuc Au-MPH-Lac Au-MPH-Gal 8 ч 132,7±36,5 141,8±16,4 270,4±106,6 543,7±106,4* 343,6±223,2 393,4±188,3* 346,4±108,7 459,9±188,2* 706,8±245,6* Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контрольным значением (p<0,05)

Накопление маркерного субстрата АВСВ1-белка - фексофенадина внутри клеток свидетельствует об ингибировании белка-транспортера.

Таким образом, при добавлении в Дульбекко модифицированную среду Игла растворов модифицированных наночастиц золота - золото-D-Лактоза-Меркаптопропаноилгидразид (Au-MPH-Lac), золото-D-Галактоза-Меркаптопропаноилгидразид (Au-MPH-Gal) до достижения их концентрации в среде 550 мкг/мл и 300 мкг/мл с последующей инкубацией в течение 8 ч отмечалось их ингибирующее действие на АВСВ1-белок.

Изобретение относится к медицине и клинической фармакологии. Предложен способ ингибирования АВСВ1-белка in vitro, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, L-глутамина 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; после достижения 70-90% конфлюентности, клетки снимают с фласка добавлением раствора 0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, высевают на 24-луночный планшет, культивируют 48 ч; по достижении монослоя в среду добавляют маточные водные коллоидные растворы модифицированных наночастиц золото-D-Лактоза-Меркаптопропаноилгидразида, золото-D-Галактоза-Меркаптопропаноилгидразида с диаметром 18-21 нм до достижения их концентрации в среде 550 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно, с последующей инкубацией в течение 8 ч. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов ингибирования белка-транспортера для прогнозирования межлекарственных фармакокинетических взаимодействий. 1 табл.

Способ ингибирования АВСВ1-белка в эксперименте in vitro, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, L-глутамина 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, после достижения 70-90% конфлюентности, клетки снимают с фласка добавлением раствора трипсин-ЭДТА - 0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, высевают на 24-луночный планшет и культивируют в течение 48 ч; после достижения монослоя в среду культивирования добавляют маточные водные коллоидные растворы модифицированных наночастиц золота с диаметром 18-21 нм: золото-D-Лактоза-Меркаптопропаноилгидразида, золото-D-Галактоза-Меркаптопропаноилгидразида до достижения их концентрации в среде 550 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно, с последующей инкубацией в течение 8 ч.