СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ПРЕГНАН Х РЕЦЕПТОРА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO Российский патент 2023 года по МПК C12N5/07 C12N5/09 

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования количества прегнан Х рецептора (PXR).

Прегнан Х рецептор (PXR, steroid and xenobiotic receptor - SXR, NR1I2 - Nuclear Receptor Subfamily 1, Group I, Member 2) является членом суперсемейства ядерных рецепторов и регулирует экспрессию ферментов I фазы биотрансформации (изоферментов цитохрома P450 CYP3A и CYP2B), экспрессию ферментов II фазы биотрансформации (UDP-глюкуронозилтрансферазы 1A1 и сульфотрансферазы), а также переносчиков лекарственных веществ белка множественной лекарственной устойчивости 1, Р-гликопротеина, и активность ряда ферментов углеводного и липидного обменов. Изменение количества PXR в эксперименте in vitro может применяться для изучения роли данного рецептора в фармакокинетике лекарственных веществ.

Известно, что индукторами PXR являются рифампицин, рифаксимин, ампренавир, литохолевая кислота, соломстерол A и B, дексаметазон, никардипин [Chai S.C., Lin W., Li Y., Chen T. 2019. Drug discovery technologies to identify and characterize modulators of the pregnane X receptor and the constitutive androstane receptor. Drug Discov Today. 24 (3), 906-915.], пероксид водорода [Абаленихина Ю.В., Судакова Е.А., Слепнев А.А., Сеидкулиева А.А., Ерохина П.Д., Щулькин А.В., Якушева Е.Н. (2022) Функционирование прегнан Х рецептора в условиях окислительного стресса. Биологические мембраны. 39 (2). 107-115.].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и эффективного способа повышения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vitro.

С данной целью было выполнено исследование на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия).

Клетки линии Caco-2 культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% эмбриональной бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина («SigmaAldrich», Германия) соответственно. После достижения 70-90% конфлюентности клетки снимали с флакона добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия) и высеивали в 6- луночные планшеты («Corning», США). После образования монослоя клетки использовали в экспериментах.

Для активации PXR в культуральную среду добавляли DL-бутионинсульфоксимин (БСО) («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации 1, 5, 10, 50, 100 и 500 мкМ и инкубировали 24 и 72 часов. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.

После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США). В супернатанте определяли относительное количество PXR с помощью метода вестерн-блот.

Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Результаты представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью теста Даннетта. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Установлено, что относительное количество PXR при инкубации в течение 24 ч и концентрациях БСО 100 и 500 мкМ статистически значимо возрастало на 33,6% (р<0,0001) и 40,5 (р<0,0001) соответственно (Фиг. 1), а при инкубации 72 ч и концентрациях БСО 50, 100 и 500 мкМ на 26,4% (р=0,047), 41,5% (р=0,002) и 36,5% (р=0,06) (Фиг. 1). Другие концентрации БСО не влияли на количество PXR в клетках.

Краткое описание чертежей.

Фиг.1. Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 в норме (1) и при индукции воздействии D,L-бутионинсульфоксимина в концентрациях 1-500 мкМ (2-7) в течение 24 (А) и 72ч (Б) (M±SD, n=3).

Примечание: * - р<0,05; ** - р≤0,01; **** - р≤0,0001 статистически значимые отличия от показателей контроля.

Таким образом, для повышения количества PXR в клетках аденокарциномы ободочной кишки человека необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 100 и 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 или 72 часов или 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ - субстратов MDR1 в трех экспериментах.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу повышения количества прегнан Х рецептора (PXR). Изобретение позволяет индуцировать количество PRX путем культивирования линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 21 суток с последующим добавлением в среду DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 100 и 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 или 72 часов или 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов. Изобретение позволяет разработать доступный и эффективный способ повышения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vivo. 1 ил.

Способ повышения количества прегнан Х рецептора, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 21 суток, отличающийся последующим добавлением в среду DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 100 или 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 или 72 часов или 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов.