СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОНСТИТУТИВНОГО АНДРОСТАНОВОГО РЕЦЕПТОРА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO Российский патент 2024 года по МПК C12N5/09 C07K14/705 

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования количества конститутивного андростанового рецептора (CAR).

Конститутивный андростановый рецептор (СAR) - представляет собой ядерный рецептор, который регулирует экспрессию ряда ферментов цитохромов Р450 (изоформы CYP 3A4, CYC 2A6, CYP2Cs, CYP 2B), ферментов II фазы биотрансформации (глутатион-S-трансферазы, сульфотрансферазы, уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы) и белков-транспортеров (белок множественной лекарственной устойчивости 1, Р-гликопротеин, полипетид 1, транспортирующий органические анионы).

Изменение количества СAR в эксперименте in vitro может применяться для изучения роли данного рецептора в фармакокинетике лекарственных веществ.

Известно, что 2,4,6-трифенилдиоксан-1,3 (TPD) активирует CAR и его ген-мишень СYР2В у крыс [Pustylnyak, V., Pivovarova, E., Slynko, N., Gulyaeva, L., and Lyakhovich, V. (2009) Life Sciences, 85, 815-821]. Показано, что при воздействии фенобарбитала происходит увеличение количества мРНК гена Cyp2b10 у мышей и повышается связывание рецептора CAR в составе гетеродимера с RXR с последовательностью в промоторной области гена, кодирующего Cyp2b10 [Honkakoski, P., Zelko, I., Sueyoshi, T., and Negishi, M. (1998) Mol. Cell. Biol., 18, 5652-5658]. Выявлено, что ацетаминофен, билирубин, трифенилфосфат, фенитоин, 17β-эстрадиол, триp-метилфенилфосфат, трифенилфосфат являются активаторами CAR [Е.М. Качайло, В.О. Пустыльняк, В.В. Ляхович, Л.Ф. Гуляева Конститутивный андростановый рецептор (CAR): ксеносенсор и терапевтическая мишень. Биохимия, 2011, Т. 76, № 10, С. 1335 - 1347]. Известно, что S-нитрозоглутатион и пероксид водорода повышают количество CAR в клетках линии Сасо-2 [Абаленихина Ю.В., Судакова Е.А., Сеидкулиева А.А., Щулькин А.В., Якушева Е.Н. (2022) Влияние донора оксида азота S-нитрозоглутатиона на экспрессию конститутивного андростанового рецептора. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 58(5), 1341-1352;] Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Сеидкулиева А.А., Правкин С.К., Якушева Е.Н. (2022) Регуляция конститутивного андростанового рецептора в клетках линии Сасо-2 при моделировании окислительного стресса in vitro. Биомедицинская химия. 68(4). 297-301].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и эффективного способа повышения количества конститутивного андростанового рецептора в эксперименте in vitro.

Для этого был проведен эксперимент на клеточной линии аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия).

Клетки линии Caco-2 культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% эмбриональной бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина («SigmaAldrich», Германия) соответственно. После достижения 70-90% конфлюентности клетки снимали с флакона добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия) и высеивали в 6-планшеты («Corning», США). После образования монослоя клетки использовали в экспериментах.

Для активации CAR в культуральную среду добавляли DL-бутионинсульфоксимин (БСО) («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентраций в среде 1, 5, 10, 50, 100 и 500 мкМ соответственно и инкубировали 24 и 72 часов. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.

После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США). В супернатанте определяли относительное количество CAR с помощью метода вестерн-блот.

Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Результаты представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью теста Даннетта. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Установлено, что при влиянии БСО в течение 24 ч и концентрациях 50 и 100 мкМ относительное количество CAR статистически значимо возрастало на 32,7% (р=0,0006) и на 39,6% (р=0,0001) соответственно (фиг. 1) по сравнению с контролем. Инкубация клеток с БСО в течение 72 ч и концентрациях 10 и 50 мкМ приводила к увеличению относительного количества CAR на 24,9% (р=0,45) и 43,3% (р=0,0007) соответственно (фиг. 1). Другие концентрации БСО не влияли на количество CAR в клетках.

Краткое описание чертежей.

Фиг.1. Относительное количество CAR в клетках линии Сасо-2 в норме (1) и при индукции воздействии D,L-бутионинсульфоксимина в концентрациях 1-500 мкМ (2-7) в течение 24 (А) и 72ч (Б) (M±SD, n=3).

Примечание: ** - р≤0,01; **** - р≤0,0001 статистически значимые отличия от показателей контроля.

Таким образом, для повышения количества CAR в клетках аденокарциномы ободочной кишки человека необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 10 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов, 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов или 72 часов, 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ - субстратов MDR1 в трех экспериментах.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу повышения количества конститутивного андростанового рецептора (CAR). Способ позволяет индуцировать количество CAR путем культивирования линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, отличающийся последующим добавлением в среду DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 10 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов, 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов или 72 часов, 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов. Изобретение позволяет разработать доступный и эффективный способ повышения количества конститутивного андростанового рецептора в эксперименте in vitro. 1 ил.

Способ повышения количества конститутивного андростанового рецептора, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, отличающийся последующим добавлением в среду DL-бутионинсульфоксимина до достижения его концентрации в среде 10 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов, 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов или 72 часов, 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.