Способ оценки индивидуальной биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии (болезни мелких сосудов) Российский патент 2024 года по МПК G01N33/86 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии и может быть использовано для оценки индивидуальной биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии (болезни мелких сосудов).

Церебральная микроангиопатия (ЦМА), ассоциированная с возрастом и сосудистыми факторами риска, является основной причиной сосудистых когнитивных нарушений, смешанных вариантов болезни Альцгеймера, значительной причиной инсульта, инвалидности и смертности. [Iadecola C, Duering M, Hachinski V, Joutel A, Pendlebury ST, Schneider JA, Dichgans M. Vascular Cognitive Impairment and Dementia: JACC Scientific Expert Panel. J Am Coll Cardiol. 2019; 73(25): 3326-3344; Парфенов В.А., Кулеш А.А. Цереброваскулярное заболевание с когнитивными нарушениями. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2021; 121(9): 121-130].

Облигатным условием развития ЦМА является эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся снижением биодоступности/дефицитом оксида азота (NO) [Bai T, Yu S, Feng J. Advances in the Role of Endothelial Cells in Cerebral Small Vessel Disease. Front Neurol. 2022; 13: 861714], В этой связи оправдана разработка способов оценки основной функциональной системы синтеза NO-L-аргинин-eNOS-NO. Поддержание баланса данной функциональной системы может стать потенциальной мишенью терапии ЦМА.

В нормальных условиях NOS катализирует превращение аргинина, O₂ и перенос электрона никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) c образованием NO и цитруллина в присутствии тетрагидробиоптерина (BH4) и других кофакторов [Cyr AR, Huckaby LV, Shiva SS, Zuckerbraun BS. Nitric Oxide and Endothelial Dysfunction. Crit Care Clin. 2020; 36(2): 307-321]. Снижение биодоступности/дефицита NO наиболее часто упоминается в связи со снижением активности эндотелиальной NOS (eNOS, NOS3) при эндотелиальной дисфункции. Снижение биодоступности/дефицита NO приводит к формированию вазоспастического, протромботического, воспалительного статуса сосудистой стенки, сопряженного с основными механизмами ЦМА - гипоксией/ишемией и повышенной проницаемостью гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Cyr AR, Huckaby LV, Shiva SS, Zuckerbraun BS. Nitric Oxide and Endothelial Dysfunction. Crit Care Clin. 2020; 36(2): 307-321].

Нарушения в других звеньях функциональной системы синтеза NO - относительный недостаток аргинина или BH4 приводят к уменьшению синтеза NO через увеличение несвязанной NOS и ее разобщение - сдвиг окисления на молекулярный кислород с образованием O₂- [Caldwell RW, Rodriguez PC, Toque HA, Narayanan SP, Caldwell RB. Arginase: A Multifaceted Enzyme Important in Health and Disease. Physiol Rev. 2018; 98(2): 641-665]. Среди причин относительного недостатка аргинина - конкурентные взаимоотношения с аргиназой за NOS, ингибирование NOS аналогами аргинина, в первую очередь метиларгининами. Повышение уровня последних препятствует транспорту L-аргинина в эндотелиальную клетку, что приводит к развитию аргининового парадокса - зависимости клеточной продукции NO от экзогенного L-аргинина при насыщении NOS внутриклеточным L-аргинином [Zhao Y, Vanhoutte PM, Leung SW. Vascular nitric oxide: Beyond eNOS. J Pharmacol Sci. 2015; 129(2): 83-94].

Зависимость выработки NO от экзогенного L-аргинина стала основанием для проведения исследований по использованию последнего в качестве препарата, улучшающего функции эндотелия при ряде заболеваний и старении [Mone P, Pansini A, Jankauskas SS, Varzideh F, Kansakar U, Lombardi A, Trimarco V, Frullone S, Santulli G. L-Arginine Improves Cognitive Impairment in Hypertensive Frail Older Adults. Front Cardiovasc Med. 2022; 9: 868521; Wu G, Meininger CJ. Arginine nutrition and cardiovascular function. J Nutr. 2000; 130(11): 2626-2629]. Несмотря на многообещающие перспективы результатов большинства исследований, аргинин не нашел широкого применения в официальной медицине. Очевидной необходимостью является определение оптимальной целевой группы,на основе показателей, обосновывающих терапию L-аргинином для обеспечения биодоступности NO и предотвращения разобщения NOS. В связи с вышеизложенным, очевидна необходимость постановки и внедрения в практику адекватных лабораторных методов для количественной оценки NO-продуцирующей способности сосудистого эндотелия, как в физиологических условиях, так и при его дисфункции, а также ее мониторирования при проведении клинических испытаний различных фармакологических препаратов.

В литературе описано множество методов количественной оценки конечных метаболитов NO в различных биологических жидкостях. Для определения уровня метаболитов NO используют электрохимические, флуоресцентные и хемилюминесцентные методы, капиллярный электрофорез, газовую хроматографию и масс-спектрометрию. Однако все перечисленные методические подходы весьма сложны и трудоемки или требуют специального дорогостоящего лабораторного оснащения, поэтому наиболее приемлемым для клинической практики представляется колориметрическое измерение концентрации нитрит-иона с помощью реактива Грисса. Вместе с тем, как уже отмечалось, реактив Грисса не позволяет определять концентрацию нитрат-иона, поэтому предварительно необходимо восстановить нитрат до нитрита; для этого используют либо ферментативный метод с использованием бактериальной нитрат редуктазы из Aspergillus nidulans, либо ионы кадмия, или ванадия.

Известен способ суммарной оценки нитритов (после их восстановления до нитратов) и нитратов в плазме крови, который является общепринятым методом оценки общего синтеза N0 в биологических жидкостях [Moshage H., Kok B., Huzenga R., Jansen P. Nitrite and nitrate determination in plasma: A critical evaluation. Clin. Chem. 1995. - V41. - P.892-896].

Наиболее близким техническим решением к заявленному изобретению является способ оценки биодоступности оксида азота путем определения стабильных метаболитов NO, позволяющей после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяется спектрофотометрически при 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводится в 96-луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода составляет 1,7 мкМ. Содержание суммарных метаболитов NO, определенное с помощью предлагаемого метода в сыворотке крови добровольцев, колебалось от 37,2 до 87.2 мкМ. Данная модификация метода может использоваться в клинической практике для оценки уровня конечных метаболитов NO, как ранних маркеров нарушения NO-продуцирующей функции сосудистого эндотелия. (Метельская В. А., Гуманова Н. Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови человека, «Клиническая и лабораторная диагностика» 2005; № 6: 15-18).

Недостатком указанных методов является то, что до 50% нитратов и нитритов, содержащихся в плазме крови, может поступать в организм с пищей.

Технический результат заключается в повышении достоверности оценки биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией.

Технический результат достигается тем, что оценку биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией проводят путем исследования крови пациента, при этом в крови пациента определяют скорость дезагрегации эритроцитов (y-dis) до и после инкубации 2 мл крови с L-аргинином в конечной концентрации 10 - 6 ммоль/л при температуре 37°С в течение 30 минут с помощью лазерного оптического ротационного клеточного анализатора LORCA и при значении скорости дезагрегации эритроцитов равной и более 113 сек^-1 оценивают как снижение биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии.

Способ осуществляется следующим образом.

Лазерно-оптический ротационный анализатор эритроцитов LORCA снабжен полностью автоматизированным управлением и программным обеспечением.

В соответствии с инструкцией для анализатора LORCA, для исследования были использованы образцы цельной венозной крови (антикоагулянт - ЭДТА К3), полученные при кубетальной венепункции, которые до исследования хранили не более 60 мин. при комнатной температуре.

Исследование деформируемости эритроцитов: 250 мкл цельной крови (ЭДТА) аккуратно смешивали путем переворота пробирки около 30 раз с 5 мл поливинилпирролидонового буфера (Mechatronics, Hoorn, Нидерланды). Принцип метода: Тонкий слой суспензии эритроцитов распределяется между двумя концентрическими цилиндрами. Вращение внешнего цилиндра (стакана) вызывает деформацию (удлинение) эритроцитов. С помощью видеокамеры снимаются показатели дифракции лазерного луча, который фиксирует данную деформацию, с последующим компьютерным анализом полученных данных. Программа оценки индекса удлинения эритроцитов отображает количественные данные стресс зависимости (кривая деформируемости) и корреляцию от времени воздействия этого стресса (кривая стабильности). При одновременном анализе двух тестов получают данные на устойчивость (стабильность) мембран эритроцитов. Программное обеспечение выполняет полностью автоматизированный анализ деформируемости эритроцитов и осуществляет внутренний контроль стабильности параметров производимых измерений.

Исследование агрегации и дезагрегации эритроцитов: 1 мл цельной крови помещали в предварительно нагретую (37°C) систему Куэтта, состоящую из двух цилиндров. Фотодиод, встроенный в фиксированный внутренний цилиндр, определяет интенсивность обратно рассеянного света во время процессов агрегации и дезагрегации эритроцитов. Кривая селллектограммы выстраивается автоматически в конце анализа. Следующие параметры рассчитываются автоматически с помощью программного обеспечения: амплитуда (Amp), показывающая общую степень агрегации; индекс агрегации (AI), рассчитанный как интеграл от общей кривой селлектограммы (sylectogramma).

Для изучения влияния донаторов NO на агрегацию, дезагрегацию и деформируемость эритроцитов образцы инкубировали с L-аргинином в конечной концентрации 10-6 М. Для приготовления раствора порошок L - аргинина растворяли в дистиллированной воде. Оценка влияния L-аргинина in vitro: образцы цельной крови разделили на две аликвоты: в одну добавили L-аргинин, а во вторую - контрольную пробу - дистиллированную воду в том же количестве (на 1 мл образца крови добавляли 20 мкл. раствора L-аргинина или дистилированной воды). Обе аликвоты инкубировали при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 30 минут, а затем повторно изучали свойства эритроцитов в обоих образцах для последующего сравнения.

При значении скорости дезагрегации эритроцитов равной и более 113 сек^-1 оценивают как снижение биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения IBM SPSS 23.0 (IBM SPSS Statistics, версия 23.0, IBM Corp., Армонк, штат Нью-Йорк, США) и R 3.4.3 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Данные представлены как n (%) для категориальных переменных или как среднее ± стандартное отклонение (SD) или медиана [межквартильный размах (IQR)] для количественных данных. Различия между группами определяли с использованием χ2, t-критерия независимых выборок, одномерного дисперсионного анализа или критерия Краскела-Уоллиса. Во всех случаях использовались двусторонние статистические критерии. Нулевая гипотеза отвергалась, если p<0,05. Для оценки предсказательной способности отдельных показателей в развитии ожидаемых исходов использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) с определением порогового значения, чувствительности, специфичности и площади под кривой.

В основную группу исследования были включены 73 пациента с ЦМА (48 женщин (65,8%), средний возраст - 60,1 ± 6,5 лет), удовлетворяющих критериям включения и не включения в данное исследование. Контрольную группу составили 19 добровольцев (14 женщин (73,7%), средний возраст - 56,9 ± 6,4 лет).

Оценивались реологические свойства эритроцитов до и после инкубации с L-аргинином (см. таблицу 1).

Таблица 1. Реологические свойства эритроцитов до (исходные) и после инкубации с L-аргинином (результирующие) у пациентов ЦМА и в контроле. Реологические показатели ЦМА
(n = 73) Контроль
(n = 19) р Amp (усл. ед.)
исходная
результирующая 11,2 [9,5; 13,6]
12,4 [10,6; 13,9] 12,0 [8,8; 13,9]
12,5 [10,0; 14,6] 0,496
0,636 Ts (сек)
исходная
результирующая 14,1 [12,0; 16,9]
15,6 [12,4; 22,4] 19,1 [14,0; 25,6]
19,8 [14,4; 25,9] 0,005
0,028 Tf (сек)
исходная
результирующая 2,0 [1,5; 2,3]
2,2 [1,6; 3,0] 2,7 [1,7; 3,9]
3,2 [2,2; 3,8] 0,023
0,006 AI (%)
исходная
результирующая 65,2 [61,2; 69,3]
61,0 [55,3; 67,4] 58,4 [52,0; 69,1]
55,3 [50,3; 61,3] 0,030
0,011 y-dis (сек^-1)
исходная
результирующая 195 [140; 250]
160 [100; 200] 125 [100; 180]
100 [100; 110] 0,003
0,002 DImax
исходная
результирующая 0,42 [0,38; 0,48]
0,34 [0,28; 0,38] 0,43 [0,36; 0,48]
0,35 [0,28; 0,38] 0,993
0,817

Обозначения: Amp - амплитуда агрегации, Ts - время первой фазы агрегации; Tf - время второй фазы агрегации; AI - индекс агрегации; y-dis - скорость дезагрегации; DImax - деформируемость эритроцитов.

Реологические свойства эритроцитов до и после инкубации с L-аргинином для большинства показателей имели значимые различия между пациентами с ЦМА и контролем, имея однонаправленные изменения параметров изучаемых показателей.

Значимость результирующих (после инкубации с аргинином) реологических показателей была оценена по площади под кривой, порогу с оптимальными показателями чувствительности и специфичности, отношению шансов (см. таблицу 2).

Таблица 2. Результирующие (после инкубации с L-аргинином) реологические показатели эритроцитов. Показатель Площадь под кривой
(ДИ) Порог Чувстви-тельность Специ-
фичность Отношение шансов (ДИ) Amp (усл. ед.) 0,535 (0,388 - 0,682) 12,45 53% 51% 1,07 (0,88 - 1,30) Ts (сек) 0,664 (0,537 - 0,823) 187 63% 66% 0,99 (0,88 - 1,10) Tf (сек) 0,703 (0,584 - 0,823) 2,7 63% 63% 1,65 (0,47 - 5,79) AI (%) 0,690 (0,562 - 0,818) 59,3 60% 74% 1,03 (0,84 - 1,26) y-di (сек^-1) 0,733 (0,609 - 0,856) 112,5 67% 79% 0,98 (0,97 - 1,00) DImax 0,517 (0,375 - 0,660) 0,345 53% 52% 0,15 (0,00 - 97,28)

Обозначения: Amp - амплитуда агрегации, Ts - время первой фазы агрегации; Tf - время второй фазы агрегации; AI - индекс агрегации; y-dis - скорость дезагрегации; DImax - деформируемость эритроцитов

Согласно критерию Йодена, y-dis имел пороговое значение с наибольшей суммой чувствительности и специфичности. Его пороговое значение было использовано для распределения обследуемых на две группы со значениями y-dis <112 сек^-1 и >113 сек^-1

Полученные группы различались по наличию сосудистых факторов риска, выраженности когнитивного дефицита и основного МРТ-признака ЦМА - ГИБВ (см. таблицу 3). ГИБВ оценивалась по шкале Фазекас по T2 FLAIR (оценка 0-3) [27]. МРТ-исследование головного мозга проводилось на магнитно-резонансном томографе Siemens MAGNETOM Verio с величиной магнитной индукции 3 Тл с использованием 12-канальной головной катушки (Siemens AG, Erlangen, Германия)

Таблица 3. Клиническая характеристика групп с y-dis <112 сек ^-1 и >113 сек ^-1 Характеристика y-dis <112 сек ^-1
(n=39) y-dis >113 сек ^-1
(n=53) p Пол, женщин (n, %) 26 (66,6%) 36 (67,9%) 0,951 Возраст, лет (mean ± SD) 59,1±6,0 59,7±7,0 0,626 Артериальная гипертензия (АГ) (n, %) 25 (64,1%) 45 (84,9%) 0,001 Степень АГ (n, %)
1 степень
2 степень
3 степень 11 (44,0%)
7 (27,0%)
7 (27,0%) 8 (17,8%)
8 (17,8%)
29 (64,4%) 0,011 Сахарный диабет 2 типа (n, %) 1 (2,3%) 14 (26,4%) 0,002 Гиперхолестеринемия (общий холестерин >6,2 ммоль/л или прием статинов) (n, %) 21 (58,5%) 27 (50,9%) 0,154 Ожирение (индекс массы тела >30 кг/м²)
(n, %) 11 (28,2%) 28 (52,8%) 0,021 Курение (n, %) 13 (33,3%) 14 (26,4%) 0,643 ГИБВ, шкала Fazekas (n, %)
контроль
1 стадия
2 стадия
3 стадия 15 (38,5%)
9 (23,1%)
7 (17,9%)
8 (20,5%) 4 (7,6%)
9 (16,9%)
18 (33,9%)
22 (41,6%) 0,001 MoCA, балл 28 [25; 29] 25 [22; 26] <0,001

В группе y-dis выше (>113 сек ^-1) пороговой величины преобладали пациенты с тяжелой АГ, сахарным диабетом 2 типа, ожирением, ГИБВ стадии Fazekas 2-3 и большей выраженностью КР.

Группы были сравнены по показателям проницаемости ГЭБ (таблица 4). Для оценки проницаемости ГЭБ была выполнена Т1-ДК МРТ: после двух Т1 объемных интерполированных исследований задержки дыхания (T1-VIBE) (углы поворота 2 и 15) для предконтрастных Т1-карт вводился гадодиамид (Omniscan; GE Healthcare) 0,2 мл/кг. (т. е. 0,1 ммоль/кг массы тела) со скоростью 3 мл/сек внутривенно с помощью инъекционного насоса, а затем последовательно повторяли 3D Т1-взвешенную последовательность 100 раз в течение 15 мин 33 сек. Параметры сканирования составили: TR - 8,6 мсек, TE - 4 мсек, поле обзора 250 мм, матрица 256x230 откликов, угол переворота 15 градусов, толщина среза - 3,6 мм.

Весь массив полученных данных проходил предварительную обработку в программном обеспечении NordicNeuroLab (NordicICE, Norway). Она включала в себя: автоматическую коррекцию двигательных артефактов, корегистрацию пре- и постконтрастных данных динамических серий, автоматическое выделение областей оценки содержания контрастного вещества. В качестве данных областей служили синусы твердой мозговой оболочки [28]. Для каждого пациента индивидуально задавался гематокрит, доза и релаксивность контрастного вещества. Для оценки низкой проницаемости ГЭБ при ЦМА использовалась армакокинетическая модель Patlak, включающая карты Ktrans (volume transfer coefficient / коэффициент переноса контрастного вещества через сосудистую стенку), Vp (fractional blood plasma volume / частичный объем плазмы), и AUC (area under curve / площадь под кривой динамического контрастирования), соответствующая задержке контрастного вещества в веществе головного мозга.

После получения карт параметров проницаемости дальнейшая обработка данных проводилась в SPM12 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm). Она включала последовательные этапы: корегистрацию каждой из карт параметров проницаемости с Т1-изображениями; сегментацию Т1-изображений на серое и белое вещество головного мозга с последующей коррекцией полученных изображений с учетом ранее полученных масок в этой же программедля визуально неизменённого белового вещества (НИБВ) и ГИБВ и выделением бинарных изображений скорректированного серого вещества с помощью скрипта на базе MatLab (https://matlab.ru/). Расчет показателей проницаемости проводился в программе ITK-SNAP (http://itksnap.org) в сером веществе, НИБВ и ГИБВ путем наложения соответствующих масок на индивидуальные карты проницаемости.

Таблица 4. Проницаемость ГЭБ по Т1-ДК МРТ в группах с y-dis <112 сек ^-1 и >113 сек ^-1 Параметр y-dis <112 сек ^-1
(n=39) y-dis >113 сек ^-1
(n=53) p Ktrans СВ 0,0002 [0,0001; 0,0004] 0,0002 [0,0001; 0,0003] 0,695 Vp СВ 1,1267 [0,8214; 1,3489] 1,2837 [1,0199; 1,5810] 0,090 AUC СВ 0,0026 [0,0020; 0,0031] 0,0033 [0,0026; 0,0037] 0,019 Ktrans НИБВ 0,0001 [0,0000; 0,0001] 0,0000 [0,0000; 0,0001] 0,421 Vp НИБВ 0,4395 [0,3835; 0,5937] 0,5531 [0,4167; 0,6281] 0,121 AUC НИБВ 0,0011 [0,0009; 0,0012] 0,0013 [0,0011; 0,0015] 0,007 Ktrans ГИБВ 0,0001 [0,0000; 0,0002] 0,0001 [0,0000; 0,0002] 0,688 Vp ГИБВ 0,4541 [0,3118; 0,6081] 0,4758 [0,3320; 0,7470] 0,695 AUC ГИБВ 0,0010 [0,0008; 0,0016] 0,0012 [0,0010; 0,0015] 0,334

Пояснения: Ktrans - коэффициент проницаемости ГЭБ, Vp - частичный объем плазмы, AUC - площадь под кривой, соответствующая увеличению времени прохождения контраста через ГЭБ, ГИБВ - гиперинтенсивность белого вещества, НИБВ - визуально неизмененное белое вещество, СВ - серое вещество.

Проницаемость ГЭБ по AUC в группе с y-dis >113 сек^-1 по сравнению с группой с y-dis <112 сек-1 была выше в сером веществе и НИБВ.

Группы были сравнены по циркулирующим показателям сосудистого повреждения, оксида азота и его метаболитов (таблица 5).

Среди них определение TGF-β1 (transforming growth factor beta - трансформирующий фактор роста бета), FGFs (fibroblast growth factors - факторы роста фибробластов), VEGF-A (vascular endothelial growth factor A - сосудистый эндотелиальный фактор роста A), в сыворотке крови проводили с использованием наборов реагентов BCM Diagnostics, HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha - фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа) - Cusabio, TNF-α (tumour necrosis factor alpha - фактор некроза опухоли-альфа) - Invitrogen, t-PA (Tissue-type plasminogen activator - тка́невой актива́тор плазмноге́на) и PAI-1 (plasminogen Activator Inhibitor-1 - ингибитор активации плазминогена первого типа) - Technoclone. При всех исследованиях использовались калибраторы фирм производителей реагентов. Контроль исполнения анализов иммуноферментным методом проводился в дублях на плашечном ридере VICTOR 2 Perken Elmer (США) с использованием лиофилизированных контрольных сывороток/плазм с низким и высоким содержанием исследуемых параметров.

Таблица 5. Сравнение показателей сосудистого повреждения, оксида азота и его метаболитов в группах с y-dis <112 сек ^-1 и >113 сек ^-1 Параметр y-dis <112 сек ^-1
(n=39) y-dis >113 сек ^-1
(n=53) p TNF-α, пг/мл 25,0 [18,3; 44,0] 26,0 [18,5; 41,0] 0,937 TGF-β,1 нг/мл 2,70 [ 2,25; 4,80] 3,15 [2,46; 5,85] 0,200 VEGF-А, пг/мл 212 [160; 411] 248 [109; 400] 0,928 HIF-1α, нг/мл 0,5 [0,36; 0,65] 0,48 [0,38; 0,68] 0,861 FGF, пг/мл 300 [250; 420] 340 [255; 438] 0,730 PAI-1, нг/мл 25,5 [16,4; 34,2] 25,2 [17,1; 35,9] 0,983 t-PA, нг/мл 3,20 [0,93; 8,80] 6,5 [2,75; 10,40] 0,021

Пояснения : TNF-α - tumour necrosis factor alpha (фактор некроза опухоли-альфа); TGF-β1 - transforming growth factor beta (трансформирующий фактор роста бета); VEGF-A - vascular endothelial growth factor A (сосудистый эндотелиальный фактор роста A); HIF-1α - hypoxia-inducible factor 1-alpha (фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа); FGFs - fibroblast Growth Factors (факторы роста фибробластов); PAI-1 - plasminogen Activator Inhibitor-1 (ингибитор активации плазминогена первого типа); t-PA - tissue-type plasminogen activator (тка́невой актива́тор плазминоге́на).

Среди всех исследованных показателей только повышение t-PA в группе с y-dis>113 (сек^-1) значимо отличалось от группы с y-dis<112 (сек^-1). t-PA, наряду с его хорошо известной ролью в фибринолизе, обладает плейотропной активностью в ЦНС - нейропластичностью, эксайтотоксичностью, влиянием на проницаемость ГЭБ [Fredriksson L, Lawrence DA, Medcalf RL. tPA Modulation of the Blood-Brain Barrier: A Unifying Explanation for the Pleiotropic Effects of tPA in the CNS. Semin Thromb Hemost. 2017; 43(2): 154-168]. Ранее нами была установлена связь повышения уровня t-PA c МРТ-изменениями, связанными с высокой проницаемостью ГЭБ [Dobrynina LA, Shabalina AA, Zabitova MR, Kremneva EI, Gadzhieva ZS, Krotenkova MV, Gnedovskaya EV, Berdalin AB, Kalashnikova LA. Tissue Plasminogen Activator and MRI Signs of Cerebral Small Vessel Disease. Brain Sci. 2019; 9(10): 266]. Однако имеются основания полагать, что совместное действие t-PA, NO и его продуктов окисления обеспечивает континуум сосудистого и церебрального повреждения, ассоциированного с нейродегенерацией и развитием смешанных сосудисто-дегенеративных форм заболевания. Так в эксперименте на t-PA-дефицитарных мышах было установлено, что повреждения ГЭБ самого по себе недостаточно, чтобы вызвать нейродегенерацию; требуется последующее событие, опосредованное ONOO [Parathath SR, Parathath S, Tsirka SE. Nitric oxide mediates neurodegeneration and breakdown of the blood-brain barrier in tPA-dependent excitotoxic injury in mice. J Cell Sci. 2006; 119(Pt 2): 339-49]. Результаты указывают, что повреждение ГЭБ, сопряженное с развитием нейродегенерации, происходит при условии, если NO и ONOO-эксайтотоксичность опосредуются t-PA [Parathath SR, Parathath S, Tsirka SE. Nitric oxide mediates neurodegeneration and breakdown of the blood-brain barrier in tPA-dependent excitotoxic injury in mice. J Cell Sci. 2006; 119(Pt 2): 339-49].

Обоснованность исследования определяется приоритетным значением в инициировании и прогрессировании ЦМА эндотелиальной дисфункции, сопряженной со снижением биодоступности NO.

Наличие показателей, свидетельствующих об индивидуальных нарушениях в системы L-аргинин-eNOS-NO со снижением биодоступности/дефицитом NO, является крайне ценным, учитывая отсутствие лечения модифицирующего течение ЦМА.

Ценность полученных показателей уточнялась по их связи с выраженностью КР, макроструктурных МРТ-признаков ЦМА и проницаемостью ГЭБ по данным МРТ Т1-динамического контрастирования.

Вероятно, что функциональная система L-аргинин-eNOS-NO эритроцитов является даже более уязвимой и нестабильной, чем эндотелия. Это обусловлено тем, что эритроциты являются наиболее ранней и легко доступной мишенью для активных форм кислорода. Многократное участие эритроцитов в окислительно-восстановительном цикле при оксигенации и деоксигенации гемоглобина поддерживает их окислительное повреждение и воспалительные реакции [Maruyama T, Hieda M, Mawatari S, Fujino T. Rheological Abnormalities in Human Erythrocytes Subjected to Oxidative Inflammation. Front Physiol. 2022; 13: 837926]. Это сопряжено с поддержанием разобщения eNOS и дефицита NO, снижением текучести мембран с повышением ее жесткости, лежащих в основе нарушений микроциркуляции [Maruyama T, Hieda M, Mawatari S, Fujino T. Rheological Abnormalities in Human Erythrocytes Subjected to Oxidative Inflammation. Front Physiol. 2022; 13: 837926].

Выбор из свойств эритроцитов деформируемости, агрегации и дезагрегации для выявления лиц с дефицитом NO был обоснован высокой значимостью данных изменений свойств эритроцитов в развитии ЦМА. В эксперименте на релевантной модели ЦМА спонтанных гипертензивных крысах склонных к инсульту установлено, что скопления эритроцитов (erythrocyte accumulation) в капиллярах и артериолах являются первым проявлением патологии, выраженность которой нарастает по мере старения животных.

Примеры выполнения способа.

Пример 1.

Пациент Ш., мужчина 63 лет, обратился в ФГБНУ НЦН с жалобами на снижение памяти и МРТ-признаками возраст-зависимой церебральной микроангиопатии.

Была направлена на обследование в 3 неврологическое отделение ФГБНУ НЦН с диагнозом «Прогрессирующая сосудистая лейкоэнцефалопатия. Последствия множественных лакунарных инфарктов и микрокровоизлияний в обоих полушариях головного мозга различной степени давности. Когнитивные нарушения. Лобная диспраксия ходьбы. Вестибуло-мозжечковый синдром. Тазовые нарушения. Артериальная гипертензия 3 степени».

Жалобы при поступлении: на неустойчивость и шаткость при ходьбе, головокружение, головные боли, снижение памяти и внимания, повышенную утомляемость, учащенное мочеиспускание, боли в шее и пояснице, судороги в ногах.

Также пациент страдает артериальной гипертензией 3 степени, сахарным диабетом 2 типа и курит.

В неврологическом статусе: сознание ясное, ориентирована правильно.

Менингеальных знаков нет. Глазные щели, зрачки OD=OS. Движение глазных яблок в полном объеме. Мелкоразмашистый горизонтальный нистагм при взгляде в стороны. Чувствительность на лице не изменена. Лицо симметрично. Мягкое небо симметричное, при фонации сокращается удовлетворительно. Речь, фонация, глотание не нарушены. Язык по средней линии. Симптом Маринеску-Радовичи с двух сторон. Мышечная сила в руках и ногах не снижена. Мышечный тонус без значимых изменений. Глубокие рефлексы с рук и ног повышены, с акцентов слева. Кистевой аналог рефлекса Россолимо с двух сторон. Патологических стопных знаков нет. Расстройств чувствительности не выявлено. Координаторные пробы выполняет с легкой дисметрией с двух сторон. В пробе Ромберга пошатывается. Походка атаксическая. Лобная диспраксия ходьбы (ходит мелкими шажками на широкой базе). Функции тазовых органов нарушены по типу учащенного мочеиспускания.

Монреальская шкала оценки когнитивных нарушений (МоСА) - 20 баллов, умеренные когнитивные нарушения.

При МРТ головного мозга: в субкортикальном и глубоком белом веществе обоих полушарий большого мозга, подкорковых структурах, варолиевом мост определяются диффузно-очаговые изменения сосудистого генеза с наличием множественных лакунарных инфарктов, микрокровоизлияний, расширенных периваскулярных пространств, а также отмечается диффузное повышение МР-сигнала от перивентрикулярного белого вещества - лейкоареоз, слабое расширение субарахноидального пространства лобных и теменных долей обоих полушарий большого мозга. Согласно данным МРТ у пациента имеется большая выраженность изменений вещества головного мозга.

При проведении лабораторной оценки биодоступности оксида азота, значение y-dis составило 350 сек^-1.

Заключение: полученное значение y-dis выше порога 113 сек^-1, что говорит о сниженной биодоступности оксида азота и высокой вероятности когнитивных расстройств у пациентки.

Заключение подтверждается психологическим тестированием, согласно которому у пациентки выявлены умеренные когнитивные нарушения (МоСА - 20/30 баллов), а также проведенным нейровизуализационным обследованием, в рамках которого установлены изменения вещества головного мозга стадии Fazekas 3.

Пример 2

Пациентка К., женщина 59 лет, обратилась в ФГБНУ НЦН с жалобами на снижение памяти, шаткостью при ходьбе и МРТ-признаками возраст-зависимой церебральной микроангиопатии. Была направлена на обследование в 3 неврологическое отделение ФГБНУ НЦН с диагнозом «Дисциркуляторная лейкоэнцефалопатия. Когнитивные нарушения. Вестибуло-мозжечковый синдром».

Жалобы при поступлении: на неустойчивость при ходьбе, замедленность движений, снижение памяти и внимания, трудности при засыпании. Также пациентка страдает ожирением.

В неврологическом статусе замедлен темп речи и мышления, на вопросы отвечает с задержкой, снижены память на текущие события и концентрация внимания. Со стороны черепных нервов - легкая сглаженность левой носогубной складки, легкая дизартрия, периодически поперхивается при приеме пищи, язык слегка девиирует влево, симптом Маринеску-Радовичи с двух сторон. Сила мышц конечностей достаточная. Сухожильные рефлексы повышены, без значимой асимметрии сторон. Симптомы Россолимо-Вендеровича, Бабинского с двух сторон. Мышечный тонус изменен по экстрапирамидному типу в руках, по смешанному типу в ногах. Нарушений поверхностной и глубокой чувствительности нет. В пробе Ромберга неустойчив. Динамические координаторные пробы выполняет с легким интенционным тремором, больше слева. Походка замедленная, снижены высота и длина шага.

Монреальская шкала оценки когнитивных нарушений (МоСА) - 23 баллов, умеренные когнитивные нарушения.

При МРТ головного мозга в перивентрикулярных и глубоких отделах белого вещества обоих полушарий большого мозга определяются диффузные симметричные зоны повышенной интенсивности МР-сигнала в режимах Т2 и FLAIR (ГИБВ 3 стадии по шкале Fazecas). В глубоком белом веществе полушарий большого мозга определяются множественные небольшие полости (до 15 мм), заполненные ликвором, окруженные гиперинтенсивным ободком в режиме FLAIR (лакуны). В проекции подкорковых структурах и субкортикальных отделах белого вещества полушарий головного мозга определяются множественные небольшие очаги пониженной интенсивности МР-сигнала в режиме SWI (микрокровоизлияния). В семиовальных центрах и подкорковых структурах визуализируются расширенные периваскулярные пространства максимально до 3 мм в диаметре. Боковые желудочки мозга симметрично расширены. Остальные отделы ликворосодержащего пространства в пределах возрастной нормы. Согласно данным МРТ у пациентки имеется большая выраженность изменений вещества головного мозга.

При проведении лабораторной оценки биодоступности оксида азота, значение y-dis составило 225 сек^-1.

Заключение: полученное значение y-dis выше порога 113 сек^-1, что говорит о снижении биодоступности оксида азота и высокой вероятности когнитивных расстройств у пациента.

Заключение подтверждается психологическим тестированием, согласно которому у пациента выявлены умеренные когнитивные нарушения (МоСА - 23/30 баллов), а также проведенным нейровизуализационным обследованием, в рамках которого установлены изменения вещества головного мозга стадии Fazekas 3.

Пример 3

Пациентка Р., женщина 63 лет, обратилась в ФГБНУ НЦН с жалобами на снижение памяти, головную боль и с МРТ-признаками возраст-зависимой церебральной микроангиопатии.

Была направлена на обследование в 3 неврологическое отделение ФГБНУ НЦН с диагнозом «Церебральная микроангиопатия, цефалгический синдром, субъективные когнитивные нарушения».

Жалобы при поступлении: на головную боль давящего характера, нарушение памяти, снижение концентрации внимания.

Пациентка страдает артериальной гипертензией 1 степени, при этом у нее отсутствует сахарный диабет 2-го типа, гиперхолестеринемия, ожирение, не курит. В неврологическом статусе без очаговой неврологической симптоматики.

Монреальская шкала оценки когнитивных нарушений (МоСА) - 29 баллов, норма.

При МРТ головного мозга выявлены единичные очаги сосудистого генеза, что говорит о меньшей выраженности изменений вещества головного мозга согласно данным МРТ.

При проведении лабораторной оценки биодоступности оксида азота, значение y-dis составило 100 сек^-1.

Заключение: полученное значение y-dis ниже порога 113 сек^-1, что говорит о хорошей биодоступности оксида азота и низкой вероятности выраженных когнитивных расстройств.

Заключение подтверждается психологическим тестированием, согласно которому пациентка набрала достаточное количество баллов по шкале МоСА - 29/30 баллов, что говорит о наличии у нее субъективных когнитивных нарушений, а также проведенным нейровизуализационным обследованием, в рамках которого установлены изменения вещества головная мозга стадии Fazekas 1.

Таким образом, заявленный способ оценки биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией обеспечивает высокую достоверность в выявлении нарушений в функциональной системе L-аргинин-eNOS-NO, которое сопряжено с нарушением дезагрегационных свойств эритроцитов, повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, развитием ГИБВ и КР. Превышение пороговых значений скорости дезагрегации эритроцитов после инкубации в L-аргинине может использоваться для оценки функционального состояния системы L-аргинин-eNOS-NO и выявления лиц с нарушением биодоступности NO. L-аргинин может стать частью терапевтической стратегии ЦМА с КР.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии и может быть использовано для оценки индивидуальной биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии (болезни мелких сосудов). Оценку биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией проводят путем исследования крови пациента. При этом в крови пациента определяют скорость дезагрегации эритроцитов (y-dis) до и после инкубации 2 мл крови с L-аргинином в конечной концентрации 10 - 6 ммоль/л при температуре 370С в течение 30 минут с помощью лазерного оптического ротационного клеточного анализатора LORCA. При значении скорости дезагрегации эритроцитов равной и более 113 сек^-1 оценивают как снижение биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии. Технический результат заключается в повышении достоверности оценки биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией.

Способ оценки биодоступности оксида азота у пациентов с церебральной микроангиопатией, включающий исследование крови пациента, отличающийся тем, что в крови пациента определяют скорость дезагрегации эритроцитов (y-dis) до и после инкубации 2 мл крови с L-аргинином в конечной концентрации 10^-6 ммоль/л при температуре 37°С в течение 30 минут с помощью лазерного оптического ротационного клеточного анализатора LORCA и при значении скорости дезагрегации эритроцитов, равной и более 113 с^-1, оценивают как снижение биодоступности оксида азота при церебральной микроангиопатии.