Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Описание патента на изобретение RU2812351C1

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к генотипу Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер.

Патобиология штамма (устойчивость к антибиотикам, вирулентность, выживаемость, иммуногенность) является ключевым фактором формирования структуры популяции Mycobacterium tuberculosis т.е. эпидемической ситуации по туберкулезу. Клиническая значимость структуры популяции М. tuberculosis состоит в том, что отдельные генетические варианты имеют большее клиническое и/или эпидемиологическое значение, чем другие.

Вид М. tuberculosis подразделяется на несколько филогенетических линий, и генотип Beijing является одним из наиболее изученных (Gagneux, 2018; Luo et al., 2005; Mokrousov et al., 2005). Он подразделяется на две ветви или сублинии - более гетерогенную предковую/древнюю и эволюционно более молодую современную (Mokrousov et al., 2002; Kremer et al., 2004; Maeda et al., 2014). Предыдущие исследования продемонстрировали связь различных сублиний генотипа Beijing с различными патологическими и клиническими проявлениями, которые влияют на трансмиссивность конкретных штаммов в человеческих популяциях. В рамках генотипа Beijing его древние и современные штаммы различаются по вирулентности, что также частично зависит от происхождения штамма.

Современная сублиния распространена по всему миру и включает несколько хорошо известных эпидемических или эндемических генетических кластеров штаммов. Напротив, штаммы древней сублинии генотипа Beijing редко встречаются за пределами Восточной Азии. Недавно два генетических кластера этой сублинии были обнаружены в азиатской части России (типы 1071-32 и 14717-15, определенные согласно VNTR-типированию и номенклатуре онлайн-ресурса MIRU-VNTRplus.org), и оба были ассоциированы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (Mokrousov et al., 2019). Положение данных кластеров в рамках глобальной филогении генотипа Beijing показано на Фиг. 1. Кластер 1071-32 относительно распространен в Омске, Сибирь (7%), и спорадически встречается в разных частях России с середины 1990-х годов. Второй кластер 14717-15 был обнаружен только в азиатской части России, где он показал нарастающий градиент от 2,6% в Омске до 16% в Бурятии (Mokrousov et al., 2020).

В мышиной модели штаммы этих кластеров продемонстрировали противоположные свойства (Vinogradova et al., 2021). Штамм 396 (Beijing 14717-15-кластер) приводил к очень высокой смертности, большей потере веса, более высокой бактериальной нагрузке и более тяжелой патологии легких. Сравнение с опубликованными данными по другим российским эпидемическим штаммах генотипа Beijing (B0/W148, CAO, Central Asian/Russian (Беспятых и соавт., 2019), показало, что штамм 396 продемонстрировал наивысшую летальность, таким образом являясь наиболее летальным российским штаммом М. tuberculosis.

Таким образом, выявление штаммов М. tuberculosis высоколетального, гипервирулентного и мультирезистентного генотипа Beijing 14717-15-кластер является актуальной задачей как молекулярной-эпидемиологического надзора за туберкулезом в России в целом, так и при лечении конкретных больных.

Известно определение штаммов данного кластера с использованием полногеномного секвенирования (Mokrousov et al., 2020) или генотипирования по 24 локусам VNTR с последующим сравнением с ресурсом www.MIRU-VNTRplus.org (Mokrousov et al., 2019). В первом случае необходим сложный биоинформационный анализ, в обоих методах необходим филогененетический анализ, делая их крайне трудоемкими или длительными в реализации (до нескольких недель). Генотипирование по 24 локусам VNTR ограничено трудоемкостью выполнения анализа, требующего проведения 24 реакций ПЦР с последующим гель-электрофорезом или, при использовании капиллярного секвенатора, метод ограничен стоимостью оборудования и также достаточно трудоемкий, как и любой подход на основании мультилокусного VNTR-типирования.

Проведенный нами биоинформационный и филогенетический анализ данных полногеномного секвенирования 205 штаммов ранней древней сублинии генотипа М. tuberculosis показал, что штаммы с профилем VNTR 14717-15 и близких ему также группировались в один кластер родственных штаммов на полногеномном дереве (Фиг. 2). Анализ позволил выявить однонуклеотидный синонимичный полиморфизм (SNP) в гене Rv1293 303G>T, ко дон 101-GCG/GCT (Ala/Ala (что соответствует позиции 1448330 G>T в полном геноме референтного штамма H37Rv NC_000962.3) характерный и уникальный для филогенетической ветви, содержащей только штаммы Beijing 14717-15-кластера. Эта мутация была выявлена только в геномах изолятов этого кластера и для ее детекции нами были сконструированы праймеры и разработан способ детекции с использованием полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией и разделение продуктов рестрикции в агарозном геле. Анализ генного участка, в котором расположена данная мутация выявил, что ее перекрывает сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции HhaI GCGC, который существует в случае аллеля дикого типа и исчезает в результате мутации (Фиг. 3). Это создает возможность выявления данной мутации на основе ПЦР-амплификации фрагмента гена с последующей обработкой рестриктазой HhaI и разделением продуктов рестрикции в агарозном геле (метод ПЦР-ПДРФ [полимеразная цепная реакция - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов]). В случае аллеля дикого типа получается два фрагмента рестрикции длиной 120 и 85 пн, а при мутации Rv1293 303G>T (специфической для генетического кластера Beijing 14717-15) продукт ПЦР остается неизменным (205 пн). Таким образом два варианта рестриктов легко различимы при электрофорезе в агарозном геле даже при небольшом времени электрофореза и малой длине геля, что удобно практически (Фиг. 4).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер.

Поставленная задача достигается выявлением наличия нуклеотидной замены в гене Rv1293 в позиции 303G>T с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров (5'-TGGAAGTGGGGCGAACGTGC и 5'-TTGACCGCAGCGGTCAACTCTGA) с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции HhaI и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле, при этом в случае мутации Rv1293 303G>T, специфической для генетического кластера Beijing 14717-15, продукт ПЦР остается неизменным (205 пн), а при наличии двух фрагментов рестрикции длиной 120 и 85 пн судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis.

Техническим результатом от использования заявленного изобретения является: 1. быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК); 2. простая и однозначная интерпретация результатов; 3. возможность анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к кластеру Beijing 14717-15 с диагностической целью и при популяционных исследованиях; 4. возможность выявления контаминации и микс-инфекции.

Изобретение поясняется чертежами, где Фиг. 1. Схема эволюции генотипа Beijing Mycobacterium tuberculosis. Фиг. 2. Фрагмент глобальной дендрограммы штаммов древней сублинии генотипа Beijing, построенной на основе полногеномых SNP: показана ветвь, включающая штаммы Beijing 14717-15-кластера из различных регионов России (показаны синим контуром). Фиг. 3 - Схема ПЦР (не в масштабе), где тонкие стрелки - позиции праймеров в геноме референс-штамма H37Rv; широкая вертикальная стрелка обозначает позицию нуклеотидной замены в гене Rv1293 в позиции 303G>T (кодон 101), которая приводит к нарушению сайта рестрикции HhaI (GCGC). Wt - алелль дикого типа, MUT - мутантный аллель. Фиг. 4 - Электрофорез в агарозном геле. ПЦР-ПДРФ детекция замены в геномной позиции 1448330 G>T (Rv1293 позиция 303G>T). Дорожки 1-5 - штаммы с мутацией в данной позиции (кластер Beijing 14717-15), дорожки 6-7 - штаммы с аллелем дикого типа. М - маркер молекулярных весов "ДНК маркер Step 100" (Биолабмикс).

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. (1993): суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмоний бромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ x1.

Были использованы следующие сконструированные нами праймеры для проведения реакции ПЦР: 1448330F TGGAAGTGGGGCGAACGTGC и обратный 1448330R TTGACCGCAGCGGTCAACTCTGA (Фиг. 4). Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCl2, 1 U Taq ДНК полимеразы, 200 μM каждого из дНТФ, праймеры (по 10 пмоль каждый). ПЦР проводят в термоциклере при следующем температурном режиме: 95°С, 4 мин, 40 циклов 95°С, 40 с, 66°С, 30 с, 72°С, 20 с и финальная элонгация 72°С, 5 мин. Наличие продукта ПЦР длиной 205 пн оценивают электрофорезом в 1,3% агарозном геле, окрашивают этидиумбромидом и визуализируют на УФ-трансиллюминаторе. Маркер молекулярный весов - 100 bp ladder (GE Healthcare).

Далее продукт ПЦР обрабатывают рестриктазой HhaI следующим образом. Рестрикцию проводят в микропробирке, помещенной в термоциклер или на водяную баню течение 3 часов при температуре 37°С в объеме 10 микролитров (5 мкл продукта ПЦР, 0,2 мкл рестриктазы HhaI [10 ед/мкл], и 1 мкл 10х буфера для данной рестриктазы). Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в 1,3% агарозном геле, окрашивают этидиумбромидом и визуализируют на УФ-трансиллюминаторе. Маркер молекулярный весов - "ДНК маркер Step 100" (Биолабмикс) или аналогичный.

Оценка результатов. В случае аллеля дикого типа получается два фрагмента рестрикции длиной 120 и 85 пн, а при мутации Rv1293 303G>T (специфической для генетического кластера Beijing 14717-15) продукт ПЦР остается неизменным (205 пн).

Способ апробирован на коллекциях ДНК клинических изолятов М. tuberculosis из коллекции ДНК лаборатории молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики ФБУН НИИЭМ им. Пастера, представляющих страны с различными популяциями возбудителя и различной долей штаммов Beijing и Beijing 14717-15-кластер, что показано на примерах ниже. Все изоляты были ранее генотипированы методом мультилокусного VNTR-анализа, позволяющим точно определить принадлежность штамма к тому или иному VNTR-кластеру в том числе к кластеру 14717-15.

Пример 1. Выявление кластера Beijing 14717-15 в региональных коллекциях ДНК микобактерий туберкулеза из Восточной Сибири и Дальнего Востока разработанным методом ПЦР-ПДРФ.

В исследование были включены образцы ДНК микобактерий из Иркутской области (393), Бурятии (499), Забайкальского края (62), Якутии (377) и Приморского края (97). ДНК были генотипированы по локусам RD105 и RD181 для выявления штаммов генотипа Beijing и его древней суб линии с интактным л оку сом RD181. Также штаммы были генотипированы по 24 локусам MIRU-VNTR с последующим сравнением с онлайн-базой данных MIRU-VNTRplus.org для отнесения штаммов к VNTR-генотипам. Большинство штаммов Beijing с интактным локусом RD181 имели профили MIRU-VNTR преимущественно 14717-15, но были выявлены и другие родственные ему профили.

Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР-ПДРФ для выявления штаммов Beijing 14717-15-кластера. В качестве контрольных использовали ДНК штамма H37Rv (аллель дикого типа, т.е. штамм иного генотипа чем Beijing 14717-15-кластер) и ДНК штамма 396 (генотип Beijing 14717-15-кластер) (Vinogradova et al., 2021). Всего было выявлено 106 штаммов с интактным локусом RD181 и все они, на основании разработанного нами метода ПЦР-ПДРФ, были отнесены к Beijing 14717-15-кластеру.

Пример 2. Выявление кластера Beijing 14717-15-кластер в коллекции ДНК из Омской области Западной Сибири - регион с небольшим, но постоянным присутствием этих штаммов в локальной популяции.

Всего было проверено 370 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных туберкулезным спондилитом или туберкулезом легких, наблюдавшихся в Омском клиническом противотуберкулезном диспансере в 2014-2020 гг. Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР-ПДРФ для выявления штаммов Beijing 14717-15-кластера. В качестве контрольных использовали ДНК штамма H37Rv (аллель дикого типа, т.е. штамм иного генотипа чем Beijing 14717-15-кластер) и ДНК штамма 396 (генотип Beijing 14717-15-кластер) (Vinogradova et al., 2021).

В результате было установлено, что 12 изолятов относились к Beijing 14717-15-кластеру, что соответствовало результатам филогенетического анализа данных 24-MIRU-VNTR типирования.

Пример 3. Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis из Китая, Вьетнама и Японии - стран с достаточно высокой долей штаммов древних сублиний генотипа Beijing (Shamputa et al., 2010, Wada et al., 2009; Yin et al., 2016).

Изучено 123 изолята M. tuberculosis генотипа Beijing от больных туберкулезом легких из северного Китая (Пекин и соседние провинции, 23 изолята), Вьетнама (Ханой и Хошимин, 35 изолятов) и Японии (Окинава, 65 изолятов), ранее охарактеризованных нами методами сполиготипирования и MIRU-VNTR типирования по 24 локусам.

Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1997) и 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР-ПДРФ для выявления штаммов Beijing 14717-15-кластера. В качестве контрольного использовали ДНК штамма H37Rv (аддель дикого типа, т.е. штамм иного генотипа чем Beijing 14717-15) и ДНК штамма 396 (генотип Beijing 14717-15).

В результате, изоляты Beijing 14717-15-кластера обнаружены не были, что совпадало с результатами типирования по 24 локусам MIRU-VNTR.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Беспятых Ю.А., Виноградова Т.И., Маничева О.А., Заболотных Н.В., Догонадзе М.З., Витовская М.Л., Гуляев А.С., Журавлев В.Ю., Шитиков Е.А., Ильина Е.Н. Вирулентность Mycobacterium tuberculosis генотипа Beijing в условиях in vivo. Инфекция и иммунитет. 2019, 9 (1): 177-86. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-l-173-182

Gagneux S. Ecology and evolution of Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 2018; 16 (4): 202-213.

Kremer K, Glynn JR, Lillebaek T, et al. Definition of the Beijing/W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers. J Clin Microbiol. 2004; 42: 4040-9.

Luo T, Comas I, Luo D, Lu B, Wu J, Wei L, et al. Southern East Asian origin and coexpansion of Mycobacterium tuberculosis Beijing family with Han Chinese. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 8136-41.

Maeda S, Hang NT, Lien LT, Thuong PH, Hung NV, Hoang NP, et al. Mycobacterium tuberculosis strains spreading in Hanoi, Vietnam: Beijing sublineages, genotypes, drug susceptibility patterns, and host factors. Tuberculosis (Edinb). 2014; 94: 649-56.

Mokrousov I, Vyazovaya A, Pasechnik O, Gerasimova A, Dymova M, Chernyaeva E, et al. Early ancient sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: unexpected clues from phylogenomics of the pathogen and human history. Clin Microbiol Infect. 2019; 25: 1039.e1-1039.e6.

Mokrousov I, Ly HM, Otten T, Lan NN, Vyshnevskyi B, Hoffher S, et al. Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: clues from human phylogeography. Genome Res. 2005; 15: 1357-64.

Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T, Vyazovaya A, Limeschenko E, Steklova L, et al. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia. Res. Microbiol. 2002; 153: 629-37

Mokrousov I, Sinkov V, Vyazovaya A, Pasechnik O, Solovieva N, Khromova P, Zhuravlev V, Ogarkov O. Genomic signatures of drug resistance in highly resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the early ancient sublineage of Beijing genotype in Russia. Int J Antimicrob Agents. 2020 Aug; 56 (2): 106036. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.106036.

Shamputa IC, Lee J, Allix-Beguec C, et al. Genetic diversity of M. tuberculosis isolates from a tertiary care tuberculosis hospital in South Korea. J Clin Microbiol. 2010; 48: 387-94.

Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M, Rtisch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006; 44: 4498-510.

van Embden J, Cave M, Crawford J, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-409.

Vinogradova Т., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. // Emerging Microbes & Infections. 2021: 1-36.

Wada Т., Iwamoto Т., Maeda S. Genetic diversity of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family in East Asia revealed through refined population structure analysis. FEMS Microbiol Lett, 2009, 291: 35-43.

Yin QQ, Liu HC, Jiao WW, Li QJ, Han R, Tian JL, et al. Evolutionary History and Ongoing Transmission of Phylogenetic Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in China. Sci Rep. 2016; 6: 34353.

Похожие патенты RU2812351C1

название год авторы номер документа
Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-кластер в формате реального времени 2021
  • Вязовая Анна Александровна
  • Синьков Вячеслав Владимирович
  • Пасечник Оксана Александровна
  • Бадлеева Мария Владимировна
  • Хромова Полина Андреевна
  • Ярусова Ирина Владимировна
  • Жданова Светлана Николаевна
  • Герасимова Алена Андреевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
  • Огарков Олег Борисович
  • Мокроусов Игорь Владиславович
RU2768021C1
Способ детекции филогенетических сублиний генотипа Beijing Mycobacterium tuberculosis в формате реального времени 2020
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Герасимова Алена Андреевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
RU2743365C1
Способ детекции изолятов Mycobacterium tuberculosis Beijing 94-32-кластера в формате реального времени 2017
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Черняева Екатерина Николаевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Нарвская Ольга Викторовна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
RU2689800C1
Способ выявления микобактерий туберкулеза Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing 2019
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Шитиков Егор Александрович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Скиба Юрий Александрович
  • Малахова Майя Владимировна
  • Беспятых Юлия Андреевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
RU2735415C1
Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер в формате реального времени 2017
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Вишневский Борис Израилевич
  • Нарвская Ольга Викторовна
RU2684314C2
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ГЕНОТИПА BEIJING 2008
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Оттен Татьяна Фердинановна
  • Вязовая Анна Александровна
  • Вишневский Борис Израилевич
  • Нарвская Ольга Викторовна
RU2405836C2
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ГЕНОТИПА ВЕIJING В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2011
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Оттен Татьяна Фердинандовна
  • Вишневский Борис Израилевич
  • Растоги Налин
  • Нарвская Ольга Викторовна
RU2528866C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБЛИНИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛИНИИ L2 Beijing НА БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПАХ 2022
  • Зименков Данила Вадимович
  • Уштанит Анастасия Игоревна
RU2790296C1
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КЛАСТЕРА Beijing B0/W148 2013
  • Ильина Елена Николаевна
  • Шитиков Егор Александрович
  • Беспятых Юлия Андреевна
RU2551764C2
(4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения 2021
  • Добриков Георги
  • Догонадзе Марине Зауриевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Вязовая Анна Александровна
  • Вълчева Виолета
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
RU2784399C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 812 351 C1

Реферат патента 2024 года Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер

Изобретение относится к молекулярной биологии. Описан способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер, отличающийся тем, что выявляют наличие нуклеотидной замены в гене Rv1293 в позиции 303G>T с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции HhaI и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле. В случае мутации Rv1293 303G>T, специфической для генетического кластера Beijing 14717-15-кластер, продукт ПЦР остается неизменным (205 пн), а при наличии двух фрагментов рестрикции длиной 120 и 85 пн судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis. Техническим результатом является быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК), простая и однозначная интерпретация результатов, возможность анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к кластеру Beijing 14717-15 с диагностической целью и при популяционных исследованиях, а также возможность выявления контаминации и микс-инфекции. 4 ил. 3 пр.

Формула изобретения RU 2 812 351 C1

Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15-кластер, отличающийся тем, что выявляют наличие нуклеотидной замены в гене Rv1293 в позиции 303G>T с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 5'-TGGAAGTGGGGCGAACGTGC и 5'-TTGACCGCAGCGGTCAACTCTGA с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции HhaI и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле, при этом в случае мутации Rv1293 303G>T, специфической для генетического кластера Beijing 14717-15-кластер, продукт ПЦР остается неизменным 205 пн, а при наличии двух фрагментов рестрикции длиной 120 и 85 пн судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2812351C1

Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-кластер в формате реального времени 2021
  • Вязовая Анна Александровна
  • Синьков Вячеслав Владимирович
  • Пасечник Оксана Александровна
  • Бадлеева Мария Владимировна
  • Хромова Полина Андреевна
  • Ярусова Ирина Владимировна
  • Жданова Светлана Николаевна
  • Герасимова Алена Андреевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
  • Огарков Олег Борисович
  • Мокроусов Игорь Владиславович
RU2768021C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ГЕНОТИПА ВЕIJING В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2011
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Оттен Татьяна Фердинандовна
  • Вишневский Борис Израилевич
  • Растоги Налин
  • Нарвская Ольга Викторовна
RU2528866C2
CN 1966721 A 23.05.2007
Mokrousov I, Vyazovaya A, Pasechnik O, Gerasimova A, Dymova M, Chernyaeva E, et al
Early ancient sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: unexpected clues from phylogenomics of the pathogen and human history
Clin Microbiol Infect
Станок для придания концам круглых радиаторных трубок шестигранного сечения 1924
  • Гаркин В.А.
SU2019A1

RU 2 812 351 C1

Авторы

Мокроусов Игорь Владиславович

Вязовая Анна Александровна

Бадлеева Мария Владимировна

Ярусова Ирина Владимировна

Хромова Полина Андреевна

Синьков Вячеслав Владимирович

Жданова Светлана Николаевна

Герасимова Алена Андреевна

Соловьева Наталья Сергеевна

Татаринцева Марина Петровна

Журавлев Вячеслав Юрьевич

Пасечник Оксана Александровна

Огарков Олег Борисович

Даты

2024-01-30Публикация

2022-08-19Подача