[001] Группа изобретений относится к области биотехнологии и генетической инженерии. В частности, изобретение относится к ферментам биолюминесцентной системы грибов.

Уровень техники

[002] Люциферазами называют ферменты, которые катализируют окисление низкомолекулярных соединений люциферинов, сопровождающееся испусканием света - биолюминесценцией. В результате окисления из люциферина образуется оксилюциферин, который высвобождается из комплекса с ферментом – люциферазой.

[003] Люциферазы широко используются в качестве репортерных генов в ряде биомедицинских приложений и в биотехнологии. Например, люциферазы используются для определения жизнеспособности клеток, активности промоторов и других компонентов живых систем, в исследованиях канцерогенеза на животных моделях, в способах выявления в среде микроорганизмов, токсических агентов, в качестве индикаторов для определения концентрации различных веществ, для визуализации прохождения сигнальных каскадов и т.д. [Scott et al., Annu Rev Anal Chem, 2011, 4: 297-319; Badr and Tannous, Trends Biotechnol. 2011, 29: 624-33; Andreu et al., FEMS Microbiol Rev. 2011, 35: 360-94]. Многие способы применения люцифераз описаны в обзорах [Kaskova et al., Chem Soc Rev., 2016, 45: 6048-6077; Scott et al., Annu Rev Anal Chem, 2011, 4: 297-319; Widder and Falls, IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 2014, 20: 232-241]. Все основные способы применения люцифераз включают детекцию света, испускаемого в зависимости от исследуемого явления или сигнала. В большинстве случаев детекция осуществляется с помощью люминометра или модифицированного оптического микроскопа.

[004] Известны тысячи способных к биолюминесценции видов, для которых описано около десятка различных по строению люциферинов и несколько десятков соответствующих им ферментов-люцифераз. Показано, что у различных организмов системы биолюминесценции возникали в эволюции независимо более сорока раз [Herring, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 1987, 1: 147-63; Haddock et al., Annual Review of Marine Science, 2010; 2: 443-93].

[005] Описана группа люцифераз насекомых, катализирующих окисление D-люциферина [de Wet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 7870-3; de Wet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 7: 725-37]. Описана группа люцифераз, катализирующих окисление целентеразина [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapore, 2006, 470 p.]. Известны биолюминесцентные системы остракод рода Cypridina, которые характеризуются химически высокоактивным люциферином и высокостабильной люциферазой [Shimomura et al., Science, 1969, 164: 1299-300]. Также известны биолюминесцентные системы динофлагеллят и эвфаузиид. В настоящее время клонированы гены, кодирующие три люциферазы из этой группы [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapore, 2006]. Существенным недостатком данной системы является ее неполная изученность: полные люциферазные последовательности еще не установлены.

[006] Недавно были описаны группа люцифераз и люциферин биолюминесцентной системы грибов. Биолюминесценция грибов была известна на протяжении сотен лет, однако люциферин грибов был идентифицирован только в 2015 году: им оказался 3-гидроксигиспидин - способный проникать через мембраны клеток метаболит [Purtov et al., Angewandte Chemie, 2015, 54: 8124-28]. В этой же работе было подтверждено наличие в лизатах грибов фермента, осуществляющего гидроксилирование гиспидина с получением люциферина, однако фермент идентифицирован не был. В патентной заявке №2017102986 от 30.01.2017 были описаны гены люцифераз из нескольких грибов, использующие в качестве люциферина 3-гидроксигиспидин, имеющий структуру:

[007] Было показано, что люциферазы грибов могут катализировать сопровождающееся выделением света окисление и других химических соединений, структуры которых показаны в Таблице 1 [Kaskova et al., Sci. Adv. 2017;3: e1602847]. Все эти соединения, являющиеся люциферинами грибов, включая 3-гидроксигиспидин, относятся к группе 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-онов и имеют общую формулу:

где R - арил или гетероарил.

[008] Для подавляющего большинства люциферинов неизвестны ферменты, обеспечивающие их синтез в живом организме, а также восстановление оксилюциферина обратно в люциферин. Таким образом, большинство применений биолюминесценции предполагает добавление экзогенного люциферина в систему (например, культуру клеток или организм), содержащую люциферазу. Использование биолюминесцентных систем, таким образом, оказывается ограниченным из-за ряда причин: многие люциферины плохо проникают через клеточную мембрану, сами люциферины химически неустойчивы, и их химический синтез является сложным многостадийным и дорогостоящим процессом.

[009] Единственная биолюминесцентная система, для которой определены ферменты синтеза люциферина, описана у морских бактерий. Эта система значительно отличается от других биолюминесцентных систем. Бактериальный люциферин (миристиновый альдегид), окисляется в процессе реакции, но не является эмиттером биолюминесценции [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapore, 2006, 470 p.]. Помимо люциферина в качестве ключевых компонентов люминесцентной реакции выступают НАДН (никотинамидадениндинуклеотид) и ФМН-H2 (флавинмононуклеотид), окисленное производное которого и выступает в качестве истинного источника света. Биолюминесцентная система морских бактерий - единственная на сегодня может быть полностью закодирована в гетерологичной системе экспрессии и может рассматриваться как наиболее близкий аналог настоящего изобретения. Однако данная система применима преимущественно для прокариотических организмов. Для получения автономной биолюминесценции используется оперон luxCDABE, кодирующий люциферазы (гетеродимеры luxA и luxB) и белки биосинтеза субстрата биолюминесценции - люциферина luxCDE (Meighen 1991). В 2010 году удалось добиться автономной люминесценции с помощью этой системы в клетках человека - однако низкая интенсивность биолюминесценции, лишь в 12 раз превосходящая сигнал, исходящий от небиолюминесцентных клеток, не позволила использовать разработанную систему для решения большинства прикладных задач [Close et al. PloS One, 2010, 5 (8):e12441]. Работы по увеличению интенсивности испускаемого света не увенчались успехом из-за токсичности компонентов бактериальной системы для эукариотических клеток [Hollis et al. FEBS Letters, 2001, 506 (2):140-42].

[010] Идентификация ферментов, обеспечивающих синтез люциферина из устойчивых и/или широко распространенных в клетках соединений-предшественников и восстановление оксилюциферина обратно в люциферин, представляется актуальной задачей. Выявление таких ферментов позволяет обеспечить более простой и дешевый способ синтеза люциферина и открывает путь к созданию автономных биолюминесцентных систем. Особый интерес представляют нетоксичные для эукариотических клеток биолюминесцентные системы.

Сущность изобретения

[011] Заявители расшифровали стадии биосинтеза люциферина в биолюминесцентной системе грибов и идентифицировали ферменты, вовлеченные в циклическое обращение люциферина грибов и кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот.

[012] Стадии оборота люциферина грибов показаны на схеме:

[013] Таким образом, настоящее изобретение прежде всего обеспечивает изолированные белки биосинтеза люциферина грибов, а также кодирующие их нуклеиновые кислоты.

[014] В преимущественных воплощениях настоящее изобретение обеспечивает гиспидин-гидроксилазы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, а также белки по существу сходные, гомологи, мутанты и производные указанных гиспидин-гидроксилаз.

[015] В некоторых воплощениях гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения характеризуются аминокислотной последовательностью, которая на протяжении по крайней мере 350 аминокислот имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.

[016] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения характеризуется наличием нескольких разделенных неконсервативными аминокислотными вставками консенсусных последовательностей, показанных в SEQ ID NOs: 29-33.

[017] Гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения катализируют реакцию превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[018] Также обеспечиваются гиспидин-синтазы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, а также белки по существу сходные, мутанты, гомологи и производные указанных гиспидин-синтаз.

[019] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность гиспидин-синтазы настоящего изобретения характеризуется наличием нескольких разделенных неконсервативными аминокислотными вставками консенсусных последовательностей, показанных в SEQ ID NOs: 56-63.

[020] В некоторых воплощениях гиспидин-синтазы настоящего изобретения характеризуются аминокислотной последовательностью, которая имеет не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55.

[021] Гиспидин-синтазы настоящего изобретения катализируют реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

,

где R выбран из группы арил или гетероарил в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[022] Также обеспечиваются кофеилпируват-гидролазы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, а также белки по существу сходные, мутанты, гомологи и производные указанных кофеилпируват-гидролаз.

[023] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения характеризуется наличием нескольких разделенных неконсервативными аминокислотными вставками консенсусных последовательностей, показанных в SEQ ID NOs: 76-78.

[024] В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

[025] Кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения катализируют реакцию превращения 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоты, имеющей структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

.

[026] В преимущественных воплощениях гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения катализируют реакцию превращения предлюциферина в люциферин грибов, например, гиспидина в 3-гидроксигиспидин.

[027] В преимущественных воплощениях гиспидин-синтазы настоящего изобретения катализируют превращение предшественника предлюциферина в предлюциферин, например, превращение кофейной кислоты в гиспидин.

[028] В преимущественных воплощениях кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения катализируют превращение оксилюциферина грибов в предшественник предлюциферина, например, превращение кофеилпирувата в кофейную кислоту.

[029] Также обеспечивается применение белка, аминокислотная последовательность которого на протяжении по крайней мере 350 аминокислот имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, и/или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 29-33, в системах in vitro или in vivo как гиспидин-гидроксилазы, катализирующей реакцию превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил.

[030] Также обеспечивается применение белка, аминокислотная последовательность которого имеет не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, и\или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 56-63, в системах in vitro или in vivo как гиспидин-синтазы, катализирующей реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил.

[031] Также обеспечивается применение белка, аминокислотная последовательность которого имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, и/или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 76-78, в системах in vitro или in vivo как кофеилпируват-гидролазы, катализирующей реакцию превращения 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоты, имеющей структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой .

[032] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие вышеозначенные гиспидин-гидроксилазы, гиспидин-синтазы и кофеилпируват-гидролазы.

[033] В некоторых воплощениях обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-гидроксилазы, аминокислотная последовательность которых выбрана из группы:

(а) аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28;

(б) аминокислотная последовательность имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, на протяжении по крайней мере 350 аминокислот;

(в) аминокислотная последовательность содержит консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 29-33.

[034] В некоторых воплощениях обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы, аминокислотная последовательность которых выбрана из группы:

(а) аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55;

(б) аминокислотная последовательность имеет не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55;

(в) аминокислотная последовательность содержит консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 56-63.

[035] В некоторых воплощениях обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие кофеилпируват-гидролазы, аминокислотная последовательность которых выбрана из группы:

(а) аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75;

(б) аминокислотная последовательность имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75;

(в) аминокислотная последовательность содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 76-78.

[036] Также обеспечивается применение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, аминокислотная последовательность которого на протяжении по крайней мере 350 аминокислот имеет не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, или не менее 80% идентичности, или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности, (например, по крайней мере 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 29-33, для получения в системах in vitro или in vivo гиспидин-гидроксилазы, катализирующей реакцию превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[037] Также обеспечивается применение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, аминокислотная последовательность которого имеет не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, ли не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, или не менее 80% идентичности, или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности, (например, по крайней мере 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 56-63, для получения в системах in vitro или in vivo гиспидин-синтазы, катализирующей реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил.

[038] Также обеспечивается применение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, аминокислотная последовательность которого имеет не менее 60% идентичности или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, или не менее 80% идентичности, или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности, (например, по крайней мере 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, или аминокислотная последовательность которого содержит разделенные неконсервативными аминокислотными вставками консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 76-78, для получения в системах in vitro или in vivo кофеилпируват-гидролазы, катализирующей реакцию превращения 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоты, имеющей структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой .

[039] Также обеспечивается белок слияния, включающий оперативно сшитые непосредственно или через аминокислотные линкеры по крайней мере одну гиспидин-гидроксилазу по изобретению, и/или по крайней мере одну гиспидин-синтазу по изобретению, и/или по крайней мере одну кофеилпируват-гидролазу по изобретению, и сигнал внутриклеточной локализации и/или сигнальный пептид и/или люциферазу, способную окислять с выделением света люциферин грибов.

[040] Люцифераза, способная окислять с выделением света люциферин грибов, известна из уровня техники. В преимущественных воплощениях она имеет аминокислотную последовательность по существу сходную или идентичную с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Например, она может иметь аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 40% идентична, например, по крайней мере на 45% идентична, или по крайней мере на 50% идентична, или по крайней мере на 55% идентична, или по крайней мере на 60% идентична, или по крайней мере на 70% идентична, или по крайней мере на 75% идентична, или по крайней мере на 80% идентична, или по крайней мере на 85% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Во многих воплощениях аминокислотная последовательность указанной люциферазы имеет не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности, (например, по крайней мере 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.

[041] В некоторых воплощениях белок слияния имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 101.

[042] Также обеспечивается нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный белок слияния.

[043] Также обеспечивается кассета экспрессии, включающая (а) регион инициации транскрипции функциональный в клетке-хозяине; (б) нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент биосинтеза люциферина грибов, то есть гиспидин-синтазу, гиспидин-гидроксилазу или кофеилпируват-гидролазу или белок слияния по изобретению (в) регион терминации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине.

[044] Также обеспечивается вектор для переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент биосинтеза люциферина грибов по изобретению, то есть гиспидин-синтазу, гиспидин-гидроксилазу или кофеилпируват-гидролазу или белок слияния по изобретению.

[045] Также обеспечивается клетка-хозяин, содержащая как часть экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки как результат внедрения указанной кассеты в указанную клетку кассету экспрессии, в состав которой входит нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-синтазу и/или гиспидин-гидроксилазу и/или кофеилпируват-гидролазу настоящего изобретения. Такая клетка продуцирует по крайней мере один из вышеперечисленных ферментов биосинтеза люциферина грибов за счет экспрессии введенной в нее нуклеиновой кислоты.

[046] Также обеспечивается антитело, полученное с помощью белка по изобретению.

[047] Также обеспечивается способ получения люциферина грибов, представляющего собой 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющего структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, в системе in vitro или in vivo, включающий объединение в физиологических условиях с по крайней мере одной молекулы гиспидин-гидроксилазы по изобретению с по крайней мере одной молекулой 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она со структурной формулой ,

с по крайней мере одной молекулой НАД(Ф)Н и с по крайней мере одной молекулы молекулярного кислорода.

[048] Также обеспечивается способ получения предлюциферина грибов, представляющего собой 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил, в системе in vitro или in vivo, включающий объединение в физиологических условиях по крайней мере одной молекулы 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

с по крайней мере одной молекулой гиспидин-синтазы по изобретению, с по крайней мере одной молекулой кофермента А, с по крайней мере одной молекулы АТФ и с по крайней мере с двумя молекулами малонил-КоА.

[049] Также обеспечивается способ получения люциферина грибов, в системе in vitro или in vivo, включающий объединение в физиологических условиях с по крайней мере одной молекулы гиспидин-гидроксилазы по изобретению с по крайней мере одной молекулой 3-арилакриловой кислоты, с по крайней мере одной молекулой гиспидин-синтазы по изобретению, с по крайней мере одной молекулой кофермента А, с по крайней мере одной молекулы АТФ, с по крайней мере с двумя молекулами малонил-КоА, с по крайней мере одной молекулой НАД(Ф)Н и с по крайней мере одной молекулы молекулярного кислорода.

[050] Способы получения люциферина и предлюциферина грибов могут быть реализованы в клетке или организме, в этом случае способы включают введение в клетку нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие ферменты биосинтеза люциферина (гиспидин-синтазы и/или гиспидин-гидроксилазы), способные к экспрессии указанных ферментов в клетке или организме. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты вводят в клетку или организм в составе кассеты-экспрессии или вектора по изобретению.

[051] В некоторых воплощениях в клетку или организм дополнительно вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу, способную осуществлять перенос 4-фосфопантетеинила от кофермента А на серин в ацилпереносящем домене поликетидсинтаз. В некоторых воплощениях 4'-фосфопантотеинил трансфераза имеет аминокислотную последовательность по существу сходную или идентичную с SEQ ID NO: 105.

[052] Также обеспечивается применение поликетидсинтазы (PKS) аминокислотная последовательность которой идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 по крайней мере на 40%, или по крайней мере на 45%, или по крайней мере на 50%, или по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%, для получение гиспидина в системе in vitro или in vivo.

[053] В некоторых воплощениях способ получения гиспидина включает объединение в физиологических условиях по крайней мере одной молекулы PKS с по крайней мере двумя молекулами малонил-КоА и по крайней мере одной молекулой кофеил-КоА. В некоторых воплощениях способ включает объединение в физиологических условиях по крайней мере одной молекулы PKS с по крайней мере двумя молекулами малонил-КоА, по крайней мере одну молекулу кофейной кислоты, по крайней мере одну молекулу кофермента А, по крайней мере одну молекулу кумарат-КоА-лигазы и по крайней мере одну молекулу АТФ.

[054] Для нужд настоящего изобретения может быть использована любая кумарат-КоА-лигаза, катализирующая реакцию превращения кофейной кислоты в кофеил-КоА. Например, кумарат-КоА-лигаза имеет аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности, показанной в SEQ ID NO:141 по крайней мере на 40%, или по крайней мере на 45%, или по крайней мере на 50%, или по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%.

[055] Реакция может быть использована в любых способах вместо реакции получения предлюциферина грибов из предшественников предлюциферина с помощью гиспидин-синтазы настоящего изобретения. Например, реакция может осуществляться в клетке или организме и включать введение в клетку или организм кассеты экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую PKS. При необходимости в клетку или организм также вводится нуклеиновая кислота, кодирующая кумарат-КоА-лигазу.

[056] В некоторых воплощениях в клетку или организм дополнительно вводят нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу, аминокислотная последовательность которой по существу сходная или идентичная аминокислотной последовательности тирозин-аммоний-лиазы Rhodobacter capsulatus, показанной в SEQ ID NO: 107, и нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы, аминокислотные последовательности которых по существу сходны с последовательностями компонентов HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E.coli, показанными в SEQ ID NOs: 109 и 111. В некоторых воплощениях используется нуклеиновая кислота, кодирующая фенилаланин-аммоний-лиазу, аминокислотная последовательность которой по существу сходна с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NOs:117.

[057] Также обеспечиваются способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов, в том числе клеток или организмов растений, или животных, или бактерий, или грибов.

[058] В преимущественных воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают введение в клетку или организм по крайней мере одной нуклеиновой кислоты по изобретению, а также нуклеиновой кислоты, кодирующей люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света. Нуклеиновые кислоты вводятся в клетку или организм в форме, которая обеспечивает их экспрессию и продукцию функциональных белковых продуктов. Например, нуклеиновые кислоты находятся в составе кассеты экспрессии. Нуклеиновые кислоты присутствуют в клетках как части экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки как результат внедрения в указанную клетку кассеты экспрессии.

[059] В преимущественных воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают введение в клетку или организм нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-гидроксилазу по изобретению и нуклеиновой кислоты, кодирующей люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света. Указанная клетка или организм приобретает способность к биолюминесценции в присутствии предлюциферина грибов, представляющего собой 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил.

[060] В некоторых воплощениях вместо нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-синтазу и люциферазу, в клетку вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую белок слияния гиспидин-гидроксилазы и люциферазы.

[061] В некоторых воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают также введение в клетку или организм нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-синтазу по изобретению. Указанная клетка или организм приобретает способность к биолюминесценции в присутствии предшественника предлюциферина грибов, представляющего собой 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил.

[062] В некоторых воплощениях в клетку вместо нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-синтазу, вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую PKS.

[063] В некоторых воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают также введение в клетку или организм нуклеиновой кислоты, кодирующей кофеилпируват-гидролазу по изобретению, что приводит к увеличению интенсивности биолюминесценции.

[064] В некоторых воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают также введение в клетку или организм нуклеиновой кислоты, кодирующей 4'-фосфопантотеинил трансферазу.

[065] В некоторых воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают также введение в клетку или организм нуклеиновой кислоты, кодирующей кумарат-КоА-лигазу.

[066] В некоторых воплощениях способы получения трансгенных биолюминесцентных клеток или организмов включают также введение в клетку или организм нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты.

[067] Также обеспечиваются трансгенные биолюминесцентные клетки и организмы, полученные с помощью вышеописанных методов, и содержащие одну или несколько нуклеиновых кислот по изобретению как части экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки.

[068] В некоторых воплощениях трансгенные биолюминесцентные клетки и организмы по изобретению способны к автономной биолюминесценции без экзогенного добавления люциферина, предлюциферина и предшественника предлюциферина.

[069] Также обеспечиваются комбинации белков и нуклеиновых кислот по изобретению, изделия и наборы, содержащие белки и нуклеиновые кислоты по изобретению. Например, обеспечиваются комбинации нуклеиновых кислот для получения автономно светящихся клеток, клеточных линий или трансгенных организмов, комбинации для анализа активности промоторов, или комбинации для мечения клеток.

[070] В некоторых воплощениях обеспечиваются наборы для получения люциферина грибов и/или предлюциферина грибов, включающие вышеописанную гиспидин-гидроксилазу и/или гиспидин-синтазу и/или PKS или кодирующие их нуклеиновые кислоты.

[071] В некоторых воплощениях обеспечиваются наборы для получения биолюминесцентной клетки или биолюминесцентного трансгенного организма, включающие нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу и нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света. Набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу. Набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу или PKS. Набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты. Набор может также содержать дополнительные компоненты: буферные растворы, антитела, люциферин грибов, предлюциферин грибов, предшественник предлюциферина грибов и тд. Набор может также содержать инструкцию по применению набора. В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты находятся в составе кассеты экспрессии или вектора для внедрения в клетки или организмы.

[072] В преимущественных воплощениях клетки и трансгенные организмы по изобретению способны производить люциферин грибов из предшественников. В некоторых воплощениях клетки и трансгенные организмы по изобретению способны к биолюминесценции в присутствии предшественника люциферина грибов. В некоторых воплощениях клетки и трансгенные организмы по изобртению способны к автономной биолюминесценции.

[073] В перечисленных выше способах и применениях в преимущественных воплощениях используется предлюциферин - 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, выбранный из группы:

(Е)-6-(3,4-дигидроксистирил)-4-гидрокси-2Н-пиран-2-он (гиспидин),

(Е)-4-гидрокси-6-стирил-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2Н-пиран-2-он (бисноръянгонин),

(Е)-4-гидрокси-6-(2-гидроксистирил)-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(2,4-дигидроксистирил)-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(4-гидрокси-3,5-диметоксистирил)-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(4-гидрокси-3-метоксистирил)-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2Н-пиран-2-он,

(Е)-6-(4-аминостирил)-4-гидрокси-2Н-пиран-2-он,

(Е)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-4-гидрокси-2Н-пиран-2-он,

(Е)-6-(2-(1Н-индол-3-ил)винил)-4-гидрокси-2Н-пиран-2-он,

(Е)-4-гидрокси-6-(2,3,6,7-тетрагидро-1Н,5Н-пиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-2Н-пиран-2-он.

[074] В преимущественных воплощениях для нужд настоящего изобретения применима 3-арилакриловая кислота, выбранная из группы: кофейная кислота, коричная кислота, паракумаровая кислота, кумаровая кислота, умбеллиновая кислота, синаповая кислота, феруловая кислота.

[075] В преимущественных воплощениях в качестве люциферина используется 3-гидроксигиспидин, в качестве предлюциферина - гиспидин, в качестве предшественника предлюциферина - кофейная кислота.

[076] Технический результат состоит в создании эффективного способа получения автономных биолюминесцентных систем, обладающих видимым свечением, в том числе на основе эукариотических несветящихся клеток и организмов.

[077] Также технический результат состоит в разработке нового эффективного способа синтеза гиспидина и его функциональных аналогов.

[078] Также технический результат состоит в разработке нового эффективного способа синтеза люциферина грибов и его функциональных аналогов.

[079] Также технический результат состоит в получении автономно светящихся клеток и организмов.

[080] Технический результат достигается за счет идентификации стадий превращения люциферина в биолюминесцентных грибах и выявлении аминокислотных и нуклеотидных последовательностей белков, вовлеченных в биосинтез люциферина. Функция всех белков была продемонстрирована впервые.

Краткое описание чертежей

[081] Фиг. 1 показывает множественное выравнивание аминокислотных последовательностей гиспидин-гидроксилаз. FAD/NAD(P)-связывающий домен отмечен подчеркиванием. Консенсусные последовательности показаны под выравниванием.

[082] Фиг. 2 показывает множественное выравнивание аминокислотных последовательностей гиспидин-синтаз. Консенсусные последовательности показаны под выравниванием.

[083] Фиг. 3 показывает множественное выравнивание аминокислотных последовательностей кофеилпируват-гидролаз. Консенсусные последовательности показаны под выравниванием.

[084] Фиг. 4 показывает интенсивности свечения клеток Pichia pastoris, экспрессирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу (А) или только люциферазу (Б), или дрожжи дикого типа (И), при опрыскивании колоний 3-гидроксигиспидином (люциферин, левый график) и гиспидином (предлюциферин, правый график).

[085] Фиг. 5 показывает сравнение интенсивности свечения клеток HEK293NT, экспрессирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу, и клеток HEK293NT, экспрессирующих только люциферазу, при добавлении гиспидина.

[086] Фиг. 6 показывает кривую люминесценции клеток HEK293T, экспрессирующих (1) гены гиспидин-гидроксилазы и люциферазы по отдельности при добавлении гиспидина; (2) ген химерного белка гиспидин-гидроксилазы и люциферазы при добавлении гиспидина; (3) ген химерного белка гиспидин-гидроксилазы и люциферазы при добавлении 3-гидроксигиспидина.

[087] Фиг. 7 иллюстрирует способность трансфицированных клеток Pichia pastoris к автономной биолюминесценции в отличие от клеток дикого типа: на чашке Петри слева клетки под дневным освещением, справа - клетки в темноте.

[088] Фиг. 8 показывает свечение культуры трансфицированных клеток Pichia pastoris в темноте.

[089] Рис. 9 показывает автономно биолюминесцентные трансгенные растения Nicotiana benthamiana. Фотография слева снята при внешнем освещении, фотография справа снята в темноте.

Осуществление изобретения

Определения

[090] Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

[091] Термины «люминесценция» и «биолюминесценция» для нужд настоящего изобретения являются взаимозаменяемыми и обозначают явление выделения света в ходе химической реакции, катализируемой ферментом - люциферазой.

[092] Термины «способен к реакции», «осуществляет реакцию» и им подобные по отношению к активности белка означают, что указанной белок является ферментом, катализирующим означенную реакцию.

[093] Как здесь используется, термин «люцифераза» означает белок, который обладает способностью катализировать окисление молекулярным кислородом химического соединения (люциферина), где реакция окисления сопровождается выделением света (люминесценцией или биолюминесценцией) и происходит освобождение окисленного люциферина.

[094] Как здесь используется, термин «люциферин грибов» означает химическое соединение, выбранное из группы 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-онов, имеющих структурную формулу

[095] ,

где R арил или гетероарил.

[096] Люциферин грибов окисляется группой люцифераз, далее обозначаемых термином «люциферазы, способные окислять люциферин грибов с выделением света» или ему подобным. Указанные люциферазы найдены у биолюминесцентных грибов, например, они описаны в заявке RU №2017102986/10(005203) от 30.01.2017. Аминокислотные последовательности люцифераз применимых в рамках способов и комбинаций настоящего изобретения по существу сходны или идентичны аминокислотным последовательностям, выбранным из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения применимые для нужд настоящего изобретения люциферазы характеризуются аминокислотными последовательностями, которые по крайней мере на 40% идентичны, например, по крайней мере на 45% идентичны, или по крайней мере на 50% идентичны, или по крайней мере на 55% идентичны, или по крайней мере на 60% идентичны, или по крайней мере на 70% идентичны, или по крайней мере на 75% идентичны, или по крайней мере на 80% идентичны, или по крайней мере на 85% идентичны аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Часто люциферазы характеризуются аминокислотными последовательностями, которые имеют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94, 96, 98, не менее 90% идентичности (например, не менее 91%, не менее 92%, не менее 93%, не менее 94%, не менее 95%, не менее не менее 96%, не менее 97%, не менее 98%, не менее 99% идентичности или 100% идентичности).

[097] При окислении люциферина грибов образуется «оксилюциферин грибов», который представляет собой 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновую кислоту со структурной формулой

[098] .

[099] Термины «предлюциферин грибов» или просто «предлюциферин» используется здесь для обозначения соединений, относящихся к группе 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-онов, имеющих структурную формулу, где R - арил или гетероарил. В ходе химической реакции, катализируемой ферментом настоящего изобретения, предлюциферин превращается в люциферин грибов.

[0100] Термин «предшественник предлюциферина» используется здесь для обозначения соединений, относящихся к группе 3-арилакриловых кислот со структурной формулой

[0101] ,

где R - арил или гетероарил. Из 3-арилакриловых кислот в ходе химической реакции, катализируемой ферментом настоящего изобретения, образуются предлюциферины.

[0102] Примеры люциферинов гриба показаны в Таблице 1. Связанные с люциферинами грибов примеры предлюциферинов, оксилюциферинов и предшественников предлюциферинов показаны в Таблице 2.

[0103] Термин «арил» или «арильный заместитель» обозначает ароматический радикал в одинарной или конденсированной карбоциклической кольцевой системе, содержащий от пяти до четырнадцати кольцевых членов. В предпочтительном осуществлении кольцевая система содержит от шести до десяти членов кольца. Один или несколько атомов водорода могут также быть заменены на заместитель, выбранный из ацила, ациламино, ацилокси, алкенила, алкокси, алкила, алкинила, амино, арила, арилокси, азидо, карбамоила, карбоалкокси, карбокси, карбоксиамидо, карбоксиамино, циано, дизамещенного амино, формила, гуанидино, галогена, гетероарила, гетероциклила, гидрокси, иминоамино, монозамещенного амино, нитро, оксо, фосфонамино, сульфинила, сульфонамино, сульфонила, тио, тиоациламино, тиоуреидо или уреидо. Примеры арильных групп включают без ограничения фенил, нафтил, бифенил, терфенил. Кроме того, в значение термина «арил», так, как оно используется здесь, входят группы, в которых ароматический цикл соединен с одним или более неароматическими циклами.

[0104] Термин «гетероциклический ароматический заместитель», «гетероарильный заместитель» или «гетероарил» обозначает ароматический радикал, который содержит от одного до четырех гетероатомов или гетерогрупп, выбранных из O, N, S или SO, в одинарной или конденсированной гетероциклической кольцевой системе, содержащей от пяти до пятнадцати кольцевых членов. В предпочтительном осуществлении гетероарильная кольцевая система содержит от шести до десяти кольцевых членов. Один или несколько атомов водорода могут также быть заменены на заместитель, выбранный из ацила, ациламино, ацилокси, алкенила, алкокси, алкила, алкинила, амино, арила, арилокси, карбамоила, карбоалкокси, карбокси, карбоксиамидо, карбоксиамино, циано, дизамещенного амино, формила, гуанидино, галогена, гетероарила, гетероциклила, гидрокси, иминоамино, монозамещенного амино, нитро, оксо, фосфонамино, сульфинила, сульфонамино, сульфонила, тио, тиоациламино, тиоуреидо или уреидо. Примеры гетероарильных групп включают без ограничения пиридинильную, тиазолильную, тиадиазолильную, изохинолинильную, пиразолильную, оксазолильную, оксадиазоильную, триазолильную и пирролильную группы. Кроме того, в значение термина «гетероарил», так, как оно используется здесь, входят группы, в которых гетероароматический цикл соединен с одним или более неароматическими циклами.

[0105] В настоящем изобретении для обозначения химических соединений кроме традиционных названий (при наличии) используются названия в соответствии с международной номенклатурой ИЮПАК.

[0106] Термин «фермент биосинтеза люциферина» или «фермент, вовлеченный в циклический оборот превращений люциферина» или ему подобный используется для обозначения фермента, катализирующего реакции превращения предшественника предлюциферина в предлюциферин, и/или предлюциферина в люциферин грибов и/или оксилюциферина в предшественник предлюциферина в системах in vitro и/или in vivo. Если не указано иное, люциферазы не включены в понятие «ферменты биосинтеза люциферина грибов».

[0107] Термин «гиспидин-гидроксилаза» используется здесь для описания фермента, катализирующего реакцию превращения предлюциферина в люциферин грибов, например, синтез 3-гидроксигиспидина из гиспидина.

[0108] Термин «гиспидин-синтаза» используется здесь для описания фермента, способного катализировать синтез предлюциферина грибов из предшественника предлюциферина, например, синтез гиспидина из кофейной кислоты.

[0109] Термин «PKS» используется здесь для описания фермента, принадлежащего к группе поликетидсинтаз III типа, способного катализировать синтез гиспидина из кофеил-КоА.

[0110] Термин «кофеилпируват-гидролаза» используется здесь для описания фермента, способного катализировать расщепление оксилюциферина грибов на более простые соединения, например, с образованием предшественника предлюциферина. Примером такой реакции является превращение кофеилпирувата в кофейную кислоту.

[0111] Термин «функциональный аналог» используется в настоящем изобретении для описания химических соединений или белков, которые выполняют одну и ту же функцию и/или могут быть использованы для одного и того же назначения. Например, все люциферины грибов, перечисленные в Таблице 1, являются функциональными аналогами друг друга.

[0112] Термин «АТФ» относится к аденозинтрифосфату, который является основным переносчиком энергии в клетке и имеет структурную формулу:

.

[0113] Термин «НАД(Ф)Н» используется здесь для обозначения молекулы восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) или никотинамидадениндинуклеотида (НАДН). Термин «НАД(Ф)» используется для обозначения окисленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДН) или никотинамидадениндинуклеотида (НАДН). Никотинамидадениндинуклеотид:

и никотинамидадениндинуклеотидфосфат:

представляют собой динуклеотиды, построенные из амида никотиновой кислоты и аденина, соединенных между собой цепочкой, состоящей из двух остатков D-рибозы и двух остатков фосфорной кислоты. НАДФ отличается от НАД содержанием еще одного остатка фосфорной кислоты, присоединенного к гидроксилу одного из остатков D-рибозы. Оба соединения широко распространены в природе и участвуют во множестве окислительно-восстановительные реакций, выполняя функцию переносчиков электронов и водорода, которые принимает от окисляемых веществ. Восстановленные формы переносят полученные электроны и водород на другие вещества.

[0114] Термины «кофермент А» или «КоА» относится к хорошо известному из уровня техники коферменту, вовлеченному в процессы окисления и синтеза жирных кислот, биосинтеза жиров, окислительных превращений продуктов распада углеводов, со структурной формулой:

[0115] Термин «малонил-КоА» относится к производному кофермента А, образующемуся при синтезе жирных кислот и содержащему остаток малоновой кислоты:

.

[0116] Термин «кумарил-КоА» относится к тиоэфиру кофермента А и кумаровой кислоты:

[0117] Термин «кофеил-КоА» относится к тиоэфиру кофермента А и кофейной кислоты:

[0118] Используемый здесь термин «мутант» или «производное» относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин «мутант» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант» здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты, раскрытых в настоящем изобретении.

[0119] Термин «гомология» используется для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

[0120] Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу идентичны» или «по существу такие же» как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 40% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 40% идентичности, или по крайней мере, 50% идентичности, или по крайней мере, 55% идентичности, или по крайней мере, 60% идентичности, или по крайней мере, 62% идентичности, или по крайней мере 65% идентичности, или по крайней мере 70% идентичности, или по крайней мере, 75% идентичности, например, по крайней мере, 80% идентичности, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности). Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны. Для целей настоящего изобретения длина сравниваемых последовательностей составляет по крайней мере 100 или более аминокислот, предпочтительно, по крайней мере, 200 аминокислот, например, 300 аминокислот или более аминокислот. В частности, возможно сравнение аминокислотных последовательностей полноразмерных белков. Для нуклеиновых кислот длина сравниваемых последовательностей в основном составляет, по крайней мере, 300 или более нуклеотидов; предпочтительно, по крайней мере, 600 нуклеотидов, в том числе 900 или более нуклеотидов.

[0121] Одним из примеров алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательности и подобности последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный в работе Altschul и др., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для выполнения анализов по BLAST можно получить через национальный центр информации по биотехнологии (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает в себя прежде всего нахождение пар с наиболее высокой степенью идентичности (ПВИ) путем идентификации коротких слов длиной W в тестируемой последовательности, которые либо полностью совпадают, либо удовлетворяют некоторому пороговому положительному значению Т при совмещении со словом такой же длины из последовательности, полученной в базе. Т - это пороговое значение близости слова (Altschul и др., 1990). Эти первоначальные нахождения близости слов (совпадений) служат затравкой для инициации поиска более длинных ПВИ, содержащих эти слова. Затем эти совпадения слов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько далеко, насколько может увеличиваться совокупное значение баллов за совпадения. Совокупные значения вычисляются при помощи (для нуклеотидных последовательностей) параметров М (премиальный балл, начисляемый за пару совпадающих остатков; он всегда>0) и N (штрафной балл за несовпадение остатков; он всегда<0). Для вычисления совокупного значения по последовательностям аминокислот применяется матрица начисления баллов. Расширение совпадений слов в каждом направлении останавливается тогда, когда совокупное значение баллов за совпадения падает от максимального достигнутого значения на величину X, когда совокупное значение счета падает до нуля или ниже нуля вследствие накопления одного или нескольких отрицательных результатов совпадения, или же при достижении конца любой из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость совмещения. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию длина слова (W) принимается равной 11, ожидаемое значение (Е) равным 10, падение (отсечка) равным 100, М=5, N=-4, и сравнение выполняется по обеим цепочкам. Для последовательностей аминокислот программа BLASTP по умолчанию принимает длину слова (W) равной 3, ожидаемое значение (Е) равным 10, а также использует матрицу начисления баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[0122] Кроме вычисления процента идентичности последовательности алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ подобности между двумя последовательностями (см., например, Karlin и Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одной из величин определения подобности, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), показывающая вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, тестируемая последовательность нуклеиновых кислот считается подобной ссылочной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестовой последовательности нуклеиновых кислот со ссылочной последовательностью нуклеиновых кислот меньше 0,1, более предпочтительно меньше чем 0,01, а наиболее предпочтительно меньше чем 0,001.

[0123] Термин «консенсусная последовательность» относится к архетипичной аминокислотной последовательности, с которой сравнивают все варианты конкретных представляющих интерес белков или последовательностей. Консенсусные последовательности и методы их определения хорошо известны специалистам в данной области. Например, консенсусная последовательность определяется с помощью множественного сравнения известных гомологичных белков путем выявления аминокислот, наиболее часто встречающихся в данном положении во всей совокупности родственных последовательностей.

[0124] Термин «консервативная последовательность» используется для обозначения нуклеотидной последовательности в нуклеиновых кислотах или последовательности аминокислот в полипептидной цепи, которые совсем не изменяются или незначительно изменяются у разных организмов в ходе эволюции. Соответственно «неконсервативная последовательность» - это последовательность, которая значительно варьирует у сравниваемых организмов.

[0125] Термин «аминокислотная вставка» означает одну или несколько аминокислот внутри полипептидной цепи, которые находятся между обсуждаемыми фрагментами белка (белковыми доменами, линкерами, консенсусными последовательностями). Специалистам в данной области очевидно, что обсуждаемые фрагменты и аминокислотные вставки оперативно связаны и образуют единую полипептидную цепь.

[0126] Для определения доменной структуры белка может быть использован любое программное обеспечение, известное из уровня техники. Например, может быть использовано программное обеспечение SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), доступное в сети Интернет по адресу http://smart.embl-heidelberg.de [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P Nucleic Acids Res 2014; doi:10.1093/nar/gku949].

[0127] Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании белков слияния относиться к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, гиспидин-гидроксилаза настоящего изобретения может быть оперативно сшита с представляющим интерес партнером слияния, например, люциферазой. В этом случае белок слияния сохраняет свойства гиспидин-гидроксилазы, а представляющий интерес полипептид сохраняет его оригинальную биологическую активность - например, способность окислять люциферин с выделением света. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, активности партнеров слияния могут быть снижены по сравнению с активностями изолированных белков. Такие белки слияния также находят применение в рамках настоящего изобретения.

[0128] Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании нуклеиновых кислот означает, что нуклеиновые кислоты ковалентно связаны таким образом, что в местах их соединения отсутствуют «сбои» рамки считывания и стоп-кодоны. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок слияния, включающий «оперативно связанные» компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, аминокислотные вставки, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе транскрипции и трансляции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный белок слияния.

[0129] При описании связи нуклеиновой кислоты с регуляторными кодирующими последовательностями (промоторами, энхансерами, терминаторами транскрипции) термин «оперативно связаны» означает, что последовательности расположены и сшиты таким образом, регуляторная последовательность будет воздействовать на уровень экспрессии кодирующей или последовательности нуклеиновой кислоты.

[0130] В контексте настоящего изобретения «связывание» нуклеиновых кислот означает, что две или несколько нуклеиновых кислот соединяют вместе при помощи любых способов, известных в данной отрасли. Для примера, не являющегося ограничивающим, скажем, что нуклеиновые кислоты можно лигировать вместе при помощи, например, ДНК-лигазы или соединять отжигом при помощи ПЦР. Нуклеиновые кислоты также можно соединять путем химического синтеза нуклеиновой кислоты, используя последовательность из двух или нескольких отдельных нуклеиновых кислот.

[0131] Термины «регуляторные элементы» или «регуляторные последовательности» относятся к последовательностям, включенным в управление экспрессией кодирующей нуклеиновой кислоты. Регуляторные элементы включают в себя промотор, терминирующие сигналы и другие последовательности, влияющие на экспрессию нуклеиновой кислоты. В типичном случае они также охватывают последовательности, требуемые для надлежащей трансляции нуклеотидной последовательности.

[0132] Термин «промотор» используется для описания нетранслируемой и нетранскрибируемой последовательности ДНК, находящейся до кодирующей области и содержащей участок связывания РНК-полимеразы, а также инициирующей транскрипцию ДНК. Область промотора может также включать в себя другие элементы, работающие регуляторами экспрессии генов.

[0133] Как здесь используется, термин «функциональный» означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин «функциональный», используемый для описания люцифераз, означает, что белок обладает способностью производить сопровождающуюся люминесценцией реакцию окисления люциферина. При описании гиспидин-гидроксилаз термин «функциональный» означает, что белок обладает способностью катализировать реакцию превращения по крайней мере одного из предлюциферинов, показанных в Таблице 2 в соответствующий люциферин. При описании гиспидин-синтаз термин «функциональный» означает, что белок обладает способностью катализировать реакцию превращения по крайней мере одного из предшественников предлюциферинов в предлюциферин, например, превращение кофейной кислоты в гиспидин. При описании кофеилпируват-гидролаз термин «функциональный» означает, что белок обладает способностью катализировать реакцию превращения по крайней мере одного из оксилюциферинов в предшественник предлюциферина (например, превращение кофеилпирувата в кофейную кислоту).

[0134] Как здесь используется, термин «ферментативные свойства» относятся к способности белка катализировать ту или иную химическую реакцию.

[0135] Как здесь используется, термин «биохимические свойства» относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, времени полужизни, скорости катализа, pH и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.

[0136] Как здесь используется, «спектральные свойства» относятся к спектрам, квантовому выходу и интенсивности люминесценции и другим подобным свойствам.

[0137] Ссылка на нуклеотидную последовательность, «кодирующую» полипептид, означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе транскрипции мРНК и трансляции продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.

[0138] Термины «экспрессионная кассета» или «кассета экспрессии» используются здесь в значении последовательности нуклеиновых кислот, способной направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине. Как правило «кассета экспрессии» содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или его функциональный фрагмент, оперативно связанную с промотором и сигналами терминации. В типичном случае она также содержит последовательности, требуемые для надлежащей трансляции значимой нуклеотидной последовательности. Экспрессионная кассета может быть такой, которая встречается в природе (в том числе и в клетках хозяина), но была получена в рекомбинантной форме, полезной для экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты. Часто «кассета экспрессии» является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. конкретная последовательность нуклеиновых кислот этой экспрессионной кассеты не встречается в природе в клетке-хозяине, и должна вводиться в клетку-хозяин или в предшественник клетки-хозяина путем трансформации. Экспрессия нуклеотидной последовательности может находиться под управлением конститутивного промотора или индуцируемого промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клетка-хозяин открыта для определенного внешнего стимула. В случае многоклеточного организма промотор может также обладать специфичностью к конкретной ткани, или органу, или к стадии развития.

[0139] «Гетерологичная» или «экзогенная» нуклеиновая кислота означает нуклеиновую кислоту, не имеющуюся в клетке-хозяине дикого типа.

[0140] Термин «эндогенный» относится к нативному белку или нуклеиновой кислоте в их природном положении в геноме организма.

[0141] Как здесь используется, термин «специфически гибридизуется» относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующихся в данной области (иногда используется термин «по существу комплементарный»).

[0142] «Изолированная» молекула нуклеиновой кислоты или изолированный белок представляют собой молекулу нуклеиновой кислоты или белок, которые вследствие действий человека существуют отдельно от своей естественной среды, а поэтому не являются продуктом природы. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты или изолированный белок могут существовать в очищенной форме или могут существовать в неестественной среде, например, (что не означает ограничений) такой, как рекомбинантная прокариотическая клетка, растительная клетка, животная клетка, клетка небиолюминесцентного гриба, трансгенный организм (гриб, растение, животное) и т.д.

[0143] «Трансформация» - это процесс для введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин или в организм. В частности, «трансформация» означает устойчивую интеграцию молекулы ДНК в геном интересующего организма.

[0144] «Трансформированный / трансгенный / рекомбинантный» относится к организму-хозяину, такому как бактерия, или растение, или гриб, или животное, в который ввели гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты. Эта молекула нуклеиновой кислоты может быть устойчиво интегрирована в геном хозяина, или же эта молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать как внехромосомная молекула. Такая внехромосомная молекула может быть способна к саморепликации. Следует понимать, что к трансгенным или устойчиво-трансформированным клеткам, тканям или организмам относятся не только конечные продукты процесса трансформации, но также и их трансгенное потомство. Термины «не трансформированный», «не трансгенный» или «не рекомбинантный», или «дикого типа» относятся к природному организму-хозяину или клетке-хозяину, например, к бактерии или растению, который не содержит гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.

[0145] Термин «автономно светящийся» или «автономно биолюминесцентный» относятся к трансгенным организмам и клеткам-хозяевам, которые обладают способностью к биолюминесценции без экзогенного добавления люциферинов, предлюциферинов или предшественников предлюциферинов.

[0146] Термин «4'-фосфопантотеинил трансфераза» используется здесь для обозначения фермента, осуществляющего перенос 4-фосфопантетеинила от кофермента А на серин в ацилпереносящем домене поликетидсинтазы. 4'-фосфопантотеинил трансферазы экпсрессируются в природе многими растениями и грибами и известны из уровня техники [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. Специалисту в данной области очевидно, что для нужд настоящего изобретения может быть использован любой функциональный вариант 4'-фосфопантотеинил трансферазы. Например, может быть использована 4'-фосфопантотеинил трансфераза NpgA из Aspergillus nidulans (SEQ ID NO 104, 105), описанная в [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77], или ее гомолог или мутант, то есть белок, аминокислотная последовательность которого по существу сходная или идентичная с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 105. Например, может быть использована 4'-фосфопантотеинил трансфераза, имеющая по крайней мере 40% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 105, в том числе, по крайней мере, 50% идентичности, или по крайней мере, 55% идентичности, или по крайней мере, 60% идентичности, или по крайней мере, 62% идентичности, или по крайней мере 65% идентичности, или по крайней мере 70% идентичности, или по крайней мере, 75% идентичности, например, или по крайней мере, 80% идентичности, или по крайней мере, 85% идентичности, или по крайней мере, 90% идентичности (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности).

[0147] Нуклеотиды обозначаются по их основаниям следующими стандартными сокращенными обозначениями: аденин (А), цитозин (С), тимин (Т) и гуанин (G). Аналогичным образом аминокислоты обозначаются следующими стандартными сокращенными обозначениями: аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (Не; 1), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; К), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; Р), серин (Ser; S), треонин (Thr; Т), триптофан (Trp; W), тирозин (Туг; Y) и валин (Val; V).

[0148] Настоящее изобретение направлено на новые ферменты биосинтеза люциферина грибов, кодирующие их нуклеиновые кислоты, применение белков в качестве ферментов, катализирующих стадии биосинтеза люциферина грибов. Также изобретение обеспечивает применение нуклеиновых кислот для получения указанных ферментов в клетке или организме. Также обеспечиваются способы получения химических соединений, являющихся люциферинами и предлюциферинами грибов, в системах in vitro и in vivo. Также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные организмы (например, растения, животные, грибы, микроорганизмы), включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. Также обеспечиваются комбинации нуклеиновых кислот для получения автономно светящихся клеток, клеточных линий или трансгенных организмов. В преимущественных воплощениях клетки и трансгенные организмы способны производить люциферин грибов из предшественников. В некоторых воплощениях клетки и трансгенные организмы способны производить предлюциферин грибов из предшественников. В некоторых воплощениях клетки и трансгенные организмы способны к биолюминесценции в присутствии предшественника люциферина грибов. В некоторых воплощениях клетки и трансгенные организмы способны к автономной биолюминесценции. Также обеспечиваются комбинации белков для получения люциферина и его предшественников из более простых химических соединений. Также обеспечивается набор, содержащий нуклеиновые кислоты или векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения, предназначенный для получения светящихся клеток, клеточных линий или трансгенных организмов.

Белки

[0149] Как было указано выше, настоящее изобретение обеспечивает белки, вовлеченные в качестве ферментов в биосинтез (циклическую систему превращений) люциферина грибов.

[0150] Белки по изобретению могут быть получены из природных источников или получены с помощью рекомбинантных технологий. Например, белки дикого типа могут быть выделены из биолюминесцентных грибов, например, из грибов, относящихся к типу Basidiomycota, преимущественно к классу Basidiomycetes, в частности, к отряду Agaricales. Например, белки дикого типа могут быть выделены из грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos и т.д. Белки настоящего изобретения могут также быть получены экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка в соответствующем хозяине или в бесклеточной системе экспрессии, как описано в разделе «Нуклеиновые кислоты». В некоторых воплощениях белки применяются внутри клеток-хозяев, в которые введены способные к экспрессии нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки.

[0151] В преимущественных воплощениях заявленные белки укладываются быстро после экспрессии в клетке-хозяине. Под быстрым укладыванием понимается то, что белки достигают своей третичной структуры, которая обеспечивает их ферментативное свойство, через короткий период времени. В этих воплощениях, белки укладываются в течение периода времени, который в общем случае не превышает приблизительно 3 дня, обычно не превышает приблизительно 2 дня и чаще не превышает приблизительно 12-24 часа.

[0152] В некоторых воплощениях белки используются в изолированной форме. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п.

[0153] Если белки согласно настоящему изобретению находятся в изолированной форме, то это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу. В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную по меньшей мере 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.

[0154] Белки настоящего изобретения сохраняют активность при температурах ниже 50°С, чаще при температурах до 45°С, то есть они сохраняют активность при температурах 20-42°С и могут быть использованы в системах гетерологической экспрессии in vitro и in vivo.

[0155] Заявленные белки обладают рН стабильностью в диапазоне от 4 до 10, чаще в диапазоне от 6.5 до 9.5. Оптимум рН стабильности заявленных белков лежит в диапазоне между 6.8 и 8.5, например, между 7.3-8.3.

[0156] Заявленные белки активны в физиологических условиях. Термин «физиологические условия» в данном изобретении подразумевает среду, имеющую температуру в диапазоне от 20 до 42°С, pH в диапазоне от 6.8 до 8.5, солевой и осмолярностью 300-400 мосмоль/л. В частности, термин «физиологические условия» включает внутриклеточную среду, клеточный экстракт и жидкости, экстрагированные из живых организмов, такие как плазма крови. «Физиологические условия» могут быть созданы искусственно. Например, комбинируя известные химические соединения могут быть созданы реакционные смеси, обеспечивающие «физиологические условия». Способы создания таких сред хорошо известны из уровня техники. Неограничивающие примеры включают:

[0157] 1) Раствор Рингера, изотоничный плазме крови млекопитающих.

[0158] Раствор Рингера состоит из 6,5 г NaCl, 0,42 г KCl и 0,25 г CaCl₂, растворенных в 1 литре бидистиллированной воды. При приготовлении раствора соли добавляются последовательно, каждую последующую соль прибавляют только после растворения предыдущей. Для предотвращения выпадения осадка углекислого кальция рекомендуется через раствор бикарбоната натрия пропускать углекислый газ. Раствор готовят на свежей дистиллированной воде.

[0159] 2) Раствор Версена

[0160] Раствор Версена представляет собой смесь ЭДТА и неорганических солей, растворенную в воде дистиллированной или в воде для инъекций, стерилизованную методом мембранной фильтрации с использованием фильтров с конечным размером пор 0,22 мкм. 1 л раствора Версена содержит NaCl 8.0 г, KCl 0.2 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 1,45 г, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2 г, натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,2 г, бидистиллированная вода - до 1 л. Раствор Версена должен иметь буферную емкость не менее 1,4 мл. Содержание иона хлора - от 4,4 до 5,4 г/л, ЭДТА - не менее 0,6 ммоль/л.

[0161] 3) фосфатно-солевой буфер (PBS, Na-фосфатный буфер)

[0162] Na-фосфатный буфер состоит из 137 мМ NaCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄. Буфер может также содержать KCl в концентрации до 2.7 мМ. Для приготовления 1 литра однократного натрий-фосфатного буфера используют: 8,00 г NaCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, 0,20 г KCl (опционно). Растворяют в 800 мл дистиллированной воды. Требуемый pH доводят соляной кислотой или гидроксидом натрия. Далее доводят объем до 1 л дистиллированной водой.

[0163] Специфические белки, представляющие интерес, являются ферментами, вовлеченными в циклический биосинтез люциферина грибов, их мутантами, гомологами и производными. Каждый из этих специфических типов полипептидных структур, представляющих интерес, далее будет рассмотрен индивидуально более подробно.

[0164] Гиспидин-гидроксилазы

[0165] Гиспидин-гидрокислазами настоящего изобретения являются белки, которые обладают способностью катализировать синтез люциферина из предлюциферина. Иными словами, это ферменты, катализирующие реакцию превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[0166] Реакция осуществляется в физиологических условиях в системах in vitro и in vivo в присутствии по крайней мере одной молекулы НАД(Ф)Н и по крайней мере одной молекулы молекулярного кислорода (О2) на одну молекулу 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она:

[0167] Гиспидин-гидроксилазы, представляющие интерес, включают белки из биолюминесцентных грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, а также их функциональные мутанты, гомологи и производные.

[0168] В преимущественных воплощениях гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения характеризуются наличием ФАД/НАД-связывающего домена (FAD/NAD(P) binding domain, IPR002938 - код по публичной базе данных InterPro, доступной в сети Интернет по адресу http://www.ebi.ac.uk/interpro). Указанный домен участвует в связывании флавинадениндинуклеотида (FAD) и никотинамидадениндинуклеотиида (NAD) у множества ферментов, добавляющих гидроксильную группу к субстрату и найденных в метаболических путях множества организмов. Гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения содержат указанный домен длиной 350-385 аминокислот, чаще 360-380 аминокислот, например, 364-377 аминокислоты, фланкированный N- и C-концевые неконсервативными аминокислотными последовательностями, обладающими более низким процентом идентичности друг с другом. Положение ФАД/НАД-связывающего домена у заявленных гиспидин-гидроксилаз указано на множественном выравнивании аминокислотных последовательностей индивидуальных белков на фиг.1.

[0169] Также обеспечиваются гомологи или мутанты гиспидин-гидроксилаз, последовательность которых отличаются от описанных выше указанных специфических аминокислотных последовательностей, заявленных в изобретении, то есть SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28. Представляющие интерес гомологи или мутанты имеют по меньшей мере не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с белком, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, на протяжении по крайней мере 350 аминокислот. В особенности это относится к последовательностям аминокислот, которые обеспечивают функциональные участки белка, то есть к последовательности входящего в состав гиспидин-гидроксилаз ФАД/НАД-связывающего домена.

[0170] В преимущественных воплощениях аминокислотная последовательность гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения характеризуется наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), характерных только для данной группы ферментов. Эти консенсусные последовательности показаны в SEQ ID NOs: 29-33. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей гиспидин-гидроксилаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью.

[0171] Гиспидин-синтазы

[0172] Гиспидин-синтазы настоящего изобретения представляют собой белки, которые обладают способностью катализировать синтез предлюциферина из его предшественников. Иными словами, это ферменты, катализирующие реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[0173] Примеры 3-арилакриловых кислот, служащих предшественниками предлюциферинов, показаны в Таблице 2.

[0174] Реакция осуществляется в физиологических условиях в системах in vitro и in vivo в присутствии по крайней мере одной молекулы кофермента А, по крайней мере одной молекулы АТФ и по крайней мере двух молекул малонил-КоА:

[0175] Гиспидин-синтазы, представляющие интерес, включают белки из биолюминесцентных грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, а также их функциональные мутанты, гомологи и производные.

[0176] В преимущественных воплощениях аминокислотная последовательность гиспидин-синтазы настоящего изобретения характеризуется наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), характерных только для данной группы ферментов. Эти консенсусные последовательности показаны в SEQ ID NOs: 56-63. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей гиспидин-синтаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью.

[0177] Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения представляющие интерес аминокислотные последовательности гомологов и мутантов специфических гиспидин-синтаз характеризуются значительной идентичностью с последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, которая составляет, например, не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) на протяжении всей аминокислотной последовательности белка.

[0178] В преимущественных воплощениях гиспидин-синтазы настоящего изобретения являются полидоменными белками, относящимися к суперсемейству поликетидсинтаз. В преимущественных воплощениях гиспидин-синтазы настоящего изобретения подвергаются посттрансляционной модификации, а именно для их созревания требуется перенос 4-фосфопантетеинила от кофермента А на серин в ацилпереносящем домене поликетидсинтазы. Из уровня техники известны ферменты - 4'-фосфопантотеинил трансферазы, осуществляющие такую модификацию [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. 4'-фосфопантотеинил трансферазы экпсрессируются в природе многими растениями и грибами, в клетках которых созревание функциональной гиспидин-синтазы настоящего изобретения происходит без введения дополнительных ферментов или кодирующих их нуклеиновых кислот. В тоже время для созревания гиспидин-синтазы в клетках ряда низших грибов (например, дрожжей) и животных требуется введение в клетки-хозяева кодирующей последовательности 4'-фосфопантотеинил трансферазы. Специалисту в данной области очевидно, что для нужд настоящего изобретения может быть использован любой функциональный вариант 4'-фосфопантотеинил трансферазы, известный из уровня техники. Например, может быть использована 4'-фосфопантотеинил трансфераза NpgA из Aspergillus nidulans (SEQ ID NO 104, 105), описанная в [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77], любой ее гомолог или мутант с подтвержденной активностью.

[0179] Кофеилпируват-гидролазы

[0180] Кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения представляют собой белки, которые обладают способностью катализировать превращение оксилюциферина, представляющего собой 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоту, имеющую структурную формулу

[0181] ,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

[0182] ,

где R - арил или гетероарил.

[0183] Примеры оксилюциферинов показаны в Таблице 2.

[0184] Реакция осуществляется в физиологических условиях в системах in vitro и in vivo:

[0185] В преимущественных воплощениях кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения осуществляют превращение кофеилпирувата в кофейную кислоту. В преимущественных воплощениях они осуществляют превращение оксилюциферина, показанного в Таблице 2 в предшественник предлюциферина.

[0186] Кофеилпируват-гидролазы, представляющие интерес, включают белки из биолюминесцентных грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, а также их функциональные мутанты, гомологи и производные.

[0187] В преимущественных воплощениях аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролаз настоящего изобретения (включая представляющие интерес гомологи и мутанты) характеризуется наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), характерных только для данной группы ферментов. Эти консенсусные последовательности показаны в SEQ ID NOs: 76-78. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей кофеилпируват-гидролаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью.

[0188] Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения представляющие интерес аминокислотные последовательности кофеилпируват-гидролаз характеризуются значительной идентичностью с последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, которая составляет, например, не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) на протяжении всей аминокислотной последовательности белка.

[0189] Гомологи вышеописанных специфических белков (то есть белков с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, 65, 67, 69, 71, 73, 75) могут быть выделены из природных источников. Гомологи могут быть обнаружены во многих организмах (грибах, растениях, микроорганизмах, животных). В частности, гомологи могут быть обнаружены у различных видов биолюминесцентных грибов в частности из грибов, относящихся к типу Basidiomycota, преимущественно к классу Basidiomycetes, в частности, к отряду Agaricales. Также особый интерес в качестве источника гомологов белков настоящего изобретения представляют небиолюминесцентные грибы и растения, производящие гиспидин, такие как Pteris ensiformis [Yung-Husan Chen et al., «Identification of phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)», Food Chemistry, Volume 105, Issue 1, 2007, pp.48-56], Inonotus xeranticus [In-Kyoung Lee et al., «Hispidin Derivatives from the Mushroom Inonotus xeranticus and Their Antioxidant Activity», J. Nat. Prod., 2006, 69 (2), pp.299-301], Phellinus sp.[In-Kyoung Lee et al., «Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus». Bioorganic & Medicinal Chemistry. 15 (10): 3309-14.], Equisetum arvense [Markus Herderich et al., «Establishing styrylpyrone synthase activity in cell free extracts obtained from gametophytes of Equisetum arvense L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry». Phytochem. Anal., 8: 194-197.].

[0190] Также обеспечиваются белки, которые являются производными или мутантами вышеописанных белков, встречающихся в природе. Мутанты и производные могут сохранять биологические свойства белков дикого типа (например, встречающихся в природе), или могут иметь биологические свойства, которые отличаются от белков дикого типа. Мутации включают замены одной или более аминокислот, делецию или инсерцию одной или более аминокислот, замены или усечения, или удлинения N-конца, замены или усечения, или удлинения C-конца и т.п. Мутанты и производные могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе «Нуклеиновые кислоты». Мутанты по существу идентичны белкам дикого типа, то есть имеют с ними по крайней мере 40% идентичности внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 40% идентичности, или по крайней мере, 50% идентичности, или по крайней мере, 55% идентичности, или по крайней мере, 60% идентичности, или по крайней мере, 62% идентичности, или по крайней мере 65% идентичности, или по крайней мере 70% идентичности, или по крайней мере, 75% идентичности, например, по крайней мере, 80% идентичности, или по крайней мере, 85% идентичности, или по крайней мере, 90% идентичности (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) внутри выбранного для сравнения региона. Во многих воплощениях гомологи, представляющие интерес, имеют намного более высокую идентичность последовательности, например, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% (например, 92%, 93%, 94%) или выше, например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, особенно для последовательности аминокислот, которые обеспечивают функциональные области белка.

[0191] Производные могут быть также получены с использованием стандартных методов и включают изменение при помощи РНК, химические модификации, модификации после трансляции и после транскрипции и т.п.Например, производные могут быть получены методами, такими как измененное фосфорилирование или гликозилирование, или ацетилирование, или липидирование, или различными типами расщепления при созревании и т.п.

[0192] Для поиска функциональных мутантов, гомологов и производных используются способы хорошо известные специалистам в данной области. Например, может быть использован функциональный скрининг экспрессионной библиотеки, содержащей варианты (например, мутантные формы белков, или гомологичные белки или производные белков). Экспрессионная библиотека получается путем клонирования нуклеиновых кислот, кодирующих тестируемые варианты белков в экспрессионный вектор и их введение в подходящие клетки-хозяина. Способы работы с нуклеиновыми кислотами описаны более подробно в разделе «Нуклеиновые кислоты». Для выявления функциональных ферментов настоящего изобретения к клеткам, экспрессирующим тестируемые нуклеиновые кислоты, добавляют подходящий субстрат.Появление ожидаемого продукта реакции, катализируемой функциональным ферментом, можно обнаружить с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя синтетические варианты ожидаемых продуктов реакции в качестве стандартов. Например, для выявления функциональных гиспидин-гидроксилаз в качестве субстрата может быть использован гиспидин или иной предлюциферин, показанный в таблице 2. Ожидаемым продуктом реакции является люциферин грибов. Для выявления гиспидин-синтаз в качестве субстрата может быть использован предшественник предлюциферина (например, кофейная кислота), а продуктом реакции является соответствующий предлюциферин грибов. Следует учитывать, что для скрининга функциональных гиспидин-синтаз клетки-хозяева должны экспрессировать 4'-фосфопантотеинил трансферазу, обеспечивающую посттрансляционную модификацию белка.

[0193] Для поиска функциональных кофеилпируват-гидролаз в качестве субстрата реакции используется оксилюциферин (Таблица 2), а тестируемым продуктом реакции является предшественник предлюциферина - 3-арилакриловая кислота.

[0194] Во многих воплощениях настоящего изобретения для поиска функциональных ферментов настоящего изобретения может использоваться биолюминесцентная реакция. В этом случае для приготовления экспрессионной библиотеки используются клетки, продуцирующие люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света, и функциональные ферменты, обеспечивающие производство люциферина грибов из продукта ферментативной реакции, осуществляемой анализируемым белком.

[0195] Так для скрининга функциональных гиспидин-гидроксилаз используются клетки-хозяева, продуцирующие функциональную люциферазу, субтратом которой является люциферин грибов. При добавлении предлюциферина к клеткам, содержащим функциональный вариант гиспидин-гидроксилазы, происходит образование люциферина грибов и возникновение свечения за счет реакции окисления люциферина грибов люциферазой.

[0196] Для скрининга функциональных гиспидин-синтаз используются клетки-хозяева, дополнительно продуцирующие функциональную люциферазу, субстратом которой является люциферин грибов, и функциональную гиспидин-гидроксилазу. При добавлении предшественника люциферина к таким клеткам происходит образование люциферина грибов и возникновение свечения за счет реакции окисления люциферина грибов люциферазой.

[0197] Для скрининга функциональных кофеилпируват-гидролаз используются клетки-хозяева, продуцирующие функциональную люциферазу, субстратом которой является люциферин грибов, функциональную гиспидин-гидроксилазу и функциональную гиспидин-синтазу. При добавлении оксилюциферина к таким клеткам происходит образование люциферина грибов и возникновение свечения за счет реакции окисления люциферина грибов люциферазой.

[0198] Для скринига могут быть использованы любые люциферазы способные окислять с выделением света люциферин, выбранный из группы 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-онов с общей формулой ,

где R - арил или гетероарил. Неограничивающие примеры люциферинов приведены в таблице 1. Неограничивающие примеры подходящих люцифераз описаны в разделе «Применение, комбинации и способы использования» ниже.

[0199] Реакция окисления люциферинов люциферазой сопровождается выделением детектируемого света. Выделяемый в процессе реакции свет может быть выявлен обычными методами (например, при визуальном осмотре, осмотре с помощью приборов ночного видения, спектрофотометрией, спектрофлуориметрией, с использованием фотографической регистрации изображения, с использованием специализированного оборудования для детекции люминесценции и флуоресценции, такого, как, например, IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer) и т.п.). Регистрируемый свет может испускаться в диапазоне интенсивностей от одного фотона до легко заметного глазу света, например, с интенсивностью 1 кд, и яркого света с интенсивностью, например, 100 кд, и более. Испускаемый при окислении 3-гидроксигиспидина свет находится в диапазоне от 400 до 700 нм, чаще в диапазоне от 450 до 650 нм, с максимумом эмиссии при 520-590 нм. Свет, испускаемый при окислении других 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-онов, может иметь сдвиг максимума эмиссии (Таблица 3).

Таблица 3. Максимумы эмиссии для ряда люциферинов грибов Вещество Максимум эмиссии, нм 3-гидроксигиспидин 538 (E)-3,4-дигидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-он 520 (E)-6-(2-(1H-индол-3-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, 480 (E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он 504 (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(2,3,6,7-тетрагидро-1H,5H-пиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-2H-пиран-2-он, 534 (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он 564

[0200] Примеры осуществления функционального скрининга с использованием биолюминесценции описаны в экспериментальной части ниже.

[0201] Также изобретение охватывает белки слияния, включающие белок настоящего изобретения. Его гомолог, мутант, в том числе укороченную или удлиненную форму. Белок по изобретению может быть оперативно слит с сигналом внутриклеточной локализации (например, сигналом локализации в ядре, сигналом локализации в митохондриях, или пероксисомах, или лизосомах, или аппарате Гольджи, или в других клеточных органеллах), сигнальным пептидом, обеспечивающим выделение белка в межклеточное пространство, трансмембранным доменом или с любым белком или полипептидом (партнером слияния), представляющим интерес. Белки слияния могут включать оперативно сшитые, например, гиспидин-гидроксилазу, и/или гиспидин-синтазу, и/или кофеилпируват-гидролазу, заявленную в изобретении, с присоединенным на C- или N-конец партнером слияния. Неограничивающие примеры партнеров слияния могут включать белки настоящего изобретения, имеющие иную ферментативную функцию, антитела или их связывающие фрагменты, лиганды или рецепторы, люциферазы, способные использовать люциферины грибов в качестве субстратов в биолюминесцентной реакции. В некоторых воплощениях партнер слияния и белок по изобретению оперативно сшиты через линкерную последовательность (пептидный линкер), обеспечивающую независимый фолдинг и функционирование белка слияния. Способы изготовления белков слияния хорошо известны специалистам в данной области.

[0202] В некоторых воплощениях белки слияния включают оперативно сшитые через короткий пептидный линкер гиспидин-гидроксилазу по изобретению и люциферазу, способную осуществлять реакцию окисления люциферина гриба с выделением света. Подобный белок слияния может быть использован для получения биолюминесценции в системах in vitro и in vivo в присутствии предлюциферина (например, в присутствии гиспидина). Специалисту в области техники очевидно, что любая функциональная гиспидин-гидроксилаза, описанная выше, может быть использована с любой функциональной люциферазой для создания белка слияния. Специфические примеры белков слияния описаны ниже в Экспериментальной части. Примеры люцифераз, которые могут быть использованы при создании белков слияния, описаны в разделе «Применение, комбинации и способы использования» ниже.

Нуклеиновые кислоты

[0203] Настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза люциферина грибов, гомологи и мутанты этих белков, в том числе укороченные и удлиненные формы.

[0204] Нуклеиновая кислота, как здесь используется, представляет собой изолированную молекулу ДНК, такую как геномная молекула ДНК или молекула кДНК, или молекулу РНК, такую как молекула мРНК. В частности, указанные нуклеиновые кислоты представляют собой молекулы кДНК, имеющие открытую рамку считывания, которая кодирует фермент биосинтеза люциферина изобретения, и способна, при подходящих условиях, обеспечивать экспрессию фермента по изобретению.

[0205] Термин «кДНК» предназначен для описания нуклеиновых кислот, которые отражают расположение элементов последовательности, находящихся в нативной зрелой мРНК, где элементы последовательности представляют собой экзоны и 5-' и 3'-некодирующие области. Незрелая мРНК может иметь экзоны, разделенные промежуточными интронами, которые, если присутствуют, удаляются в ходе посттрансляционного РНК сплайсинга, с образованием зрелой мРНК, имеющей открытую рамку считывания.

[0206] Геномная последовательность, представляющая интерес, может включать нуклеиновую кислоту, присутствующую между инициирующим кодоном и терминирующим кодоном, как определено в перечисленных последовательностях, включая все интроны, которые обычно присутствуют в нативной хромосоме. Геномная последовательность, представляющая интерес, дополнительно может включать 5'- и 3'-нетранслируемые области, находящиеся в зрелой мРНК, так же как специфические транскрипционные и трансляционные регулирующие последовательности, такие как промоторы, энхансеры, и т.д., включающие фланкирующую геномную ДНК размером приблизительно 1 т.п.н., но возможно и больше, у 5'- или 3'-конца транскрибированной области.

[0207] Изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые являются гомологичными, по существу сходными, идентичными, производными или миметиками нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения.

[0208] Заявленные нуклеиновые кислоты присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они выделены, присутствуют в обогащенных количествах, или присутствуют или экспрессированы in vitro или в клетке, или в организме, другом чем их естественно встречающаяся среда окружения.

[0209] Специфические нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют гиспидин-гидроксилазу, или гиспидин-синтазу, или кофеилпируват-гидролазу, описанную в разделе «Белки» выше. Каждый из этих специфических типов нуклеиновых кислот, представляющих интерес, индивидуально раскрывается более детально.

[0210] Нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-гидроксилазы.

[0211] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, способные катализировать реакцию превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она (предлюциферина), имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он (люциферин грибов), имеющий структурную формулу

,

[0212] где R - арил или гетероарил.

[0213] В преимущественных воплощениях, нуклеиновые кислоты кодируют гиспидин-гидроксилазы, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NO: 29-33.

[0214] Специфические примеры нуклеиновых кислот включают нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-гидроксилазы, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих указанные белки, приведены в SEQ ID NOs: 1, 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27. Также интерес представляют функциональные мутанты, гомологи и производные вышеуказанных специфических нуклеиновых кислот.

[0215] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, на протяжении по крайней мере 350 аминокислот.

[0216] Нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы

[0217] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, способные катализировать реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

[0218] ,

где R - арил илигетероарил в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

[0219] ,

где R - арил или гетероарил.

[0220] В преимущественных воплощениях, нуклеиновые кислоты кодируют гиспидин-синтазы, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 56-63.

[0221] Специфические примеры нуклеиновых кислот включают нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы по изобретению, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих указанные белки, приведены в SEQ ID NOs: 34, 36,38,40,42, 44, 46, 48, 50, 52, 54.

[0222] Также интерес представляют функциональные мутанты, гомологи и производные вышеуказанных специфических нуклеиновых кислот.

[0223] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, на протяжении всей полипептидной цепи белка.

[0224] Нуклеиновые кислоты, кодирующие кофеилпируват-гидролазы

[0225] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, способные катализировать реакцию превращения оксилюциферина, имеющего структурную формулу

[0226] ,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

[0227] ,

где R выбран из группы арил, гетероарил.

[0228] В преимущественных воплощениях, нуклеиновые кислоты кодируют кофеилпируват-гидролазы, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 76-78. Специфические примеры нуклеиновых кислот включают нуклеиновые кислоты, кодирующие кофеилпируват-гидролазы, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих указанные белки, приведены в SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70,72, 74.

[0229] Также интерес представляют нуклеиновые кислоты, кодирующие функциональные мутанты, гомологи и производные вышеуказанных белков.

[0230] В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты по изобретению кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, на протяжении всей полипептидной цепи.

[0231] Нуклеиновые кислоты, представляющие интерес (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие гомологи белков, характеризующихся аминокислотными последовательностями показанными в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53,55, 65, 67, 69, 71, 73, 75), могут быть выделены из любых организмов (грибов, растений, микроорганизмов, животных), в частности из различных видов биолюминесцентных грибов, например, из грибов, относящихся к типу Basidiomycota, преимущественно к классу Basidiomycetes, в частности, к отряду Agaricales, например, из биолюминесцентных грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos и т.д. Также особый интерес в качестве источника нуклеиновых кислот, кодирующих гомологи белков настоящего изобретения, представляют небиолюминесцентные грибы и растения, производящие гиспидин, такие как Pteris ensiformis [Yung-Husan Chen et al., «Identification of phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)», Food Chemistry, Volume 105, Issue 1, 2007, pp.48-56], Inonotus xeranticus [In-Kyoung Lee et al., «Hispidin Derivatives from the Mushroom Inonotus xeranticus and Their Antioxidant Activity», J. Nat. Prod., 2006, 69 (2), pp.299-301], Phellinus sp.[In-Kyoung Lee et al., «Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus». Bioorganic & Medicinal Chemistry. 15 (10): 3309-14.], Equisetum arvense [Markus Herderich et al., «Establishing styrylpyrone synthase activity in cell free extracts obtained from gametophytes of Equisetum arvense L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry». Phytochem. Anal., 8: 194-197.].

[0232] Гомологи идентифицируются любыми из множества способов. Фрагмент кДНК настоящего изобретения может использоваться как гибридизационный зонд против библиотеки кДНК от целевого организма, с использованием условий низкой жесткости. Зонд может быть большим фрагментом или одним или более коротким вырожденным праймером. Нуклеиновые кислоты, имеющие сходство последовательности, детектируются гибридизацией в условиях низкой жесткости, например, при 50°С и 6×SSC (0,9М хлористого натрия /0,09М цитрата натрия) с последующей промывкой при 55×С в 1×SSC (01,15М хлористого натрия/0,015 М цитрата натрия). Идентичность последовательности может быть определена гибридизацией в условиях высокой жесткости, например, при 50°С или выше и 0,1×SSC (15 мМ хлористого натрия/ 1,5 мМ цитрата натрия). Нуклеиновые кислоты, имеющие область, по существу идентичную представленным последовательностям, например, аллельным вариантам, генетически-измененным вариантам нуклеиновой кислоты, и т.д., связываются с представленными последовательностями в условиях высокой жесткости гибридизации. С использованием зондов, в частности меченых зондов последовательностей ДНК, можно выделить гомологичные или схожие гены.

[0233] Гомологи могут быть идентифицированы с помощью полимеразной цепной реакции из геномной или кДНК библиотеки. Олигонуклеотидные праймеры, представляющие фрагменты известных последовательностей специфических нуклеиновых кислот, можно использовать в качестве праймеров для ПЦР. В предпочтительном аспекте олигонуклеотидные праймеры имеют вырожденную структуру и соответствуют фрагментам нуклеиновой кислоты, кодирующим консервативные участки аминокислотной последовательности белка, например,. консенсусные последовательности, показанные в SEQ ID NOs: 29-33, 56-63, 76-78. Полноразмерные кодирующие последовательности могут быть затем выявлены с помощью методов 3'- и 5'-RACE, хорошо известных из уровня техники.

[0234] Гомологи могут быть также идентифицированы в результатах полногеномного секвенирования организмов с помощью сравнения аминокислотных последовательностей, предсказанных на основе полученной в ходе секвенирования с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53,55, 65, 67, 69, 71, 73, 75. Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp.403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами.

[0235] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с вышеописанными нуклеиновыми кислотами в жестких условиях, предпочтительно в условиях высокой жесткости (то есть, комплементарные предварительно описанным нуклеиновым кислотам). Примером гибридизации в жестких условиях является при 50°С или выше и 0,1×SSC (15 мМ хлористого натрия/ 1,5 мМ цитрата натрия). Другим примером гибридизации в условиях высокой жесткости является инкубация в течение ночи при 42°С в 50% растворе формамида, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрий цитрат), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 × раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана, и 20 мкг/мл денатурированной, разрезанной ДНК семенной жидкости лосося, с предварительной промывкой в 0,1×SSC при приблизительно 65°С. Другие условия высокой жесткости гибридизации известны в данной области и могут также использоваться для определения нуклеиновых кислот изобретения.

[0236] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты, мутанты или производные белков изобретения. Мутанты или производные могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР, перестановку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный ensemble мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, неспецифический мутагенез, генное реассемблирование, генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное реассемблирование с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делеционный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез с искусственными генами, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации. Нуклеиновые кислоты, кодирующие укороченные и удлиненные варианты указанных люцифераз, также входят в рамки настоящего изобретения. Как здесь используется, эти варианты белков содержат аминокислотные последовательности с измененными C-, N-, или обоими концами полипептидной цепи.

[0237] В преимущественных воплощениях обсуждаемые гомологи и мутанты являются функциональными ферментами, способными осуществлять реакции биосинтеза люциферина гриба, например, люциферина грибов. Гомологи и мутанты, представляющие интерес, могут иметь измененные свойства, такие как скорость созревания в клетке-хозяине, способность к агрегации или димеризации, период полураспада или иные биохимические свойства, в том числе константу связывания с субстратом, термостабильность, pH-стабильность, температурный оптимум активности, pH-оптимум активности, константу Михаэлиса-Ментен, субстратную специфичность, диапазон побочных продуктов. В некоторых воплощениях, гомологи и мутанты имеют такие же свойства как заявленные белки.

[0238] Нуклеиновые кислоты, кодирующие функциональные гомологи и мутанты настоящего изобретения, могут быть определены в ходе функциональных тестов, например, при функциональном скрининге экспрессионной библиотеки, описанном выше в разделе «Белки».

[0239] Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах в клетке-хозяине, заменены кодонами, которые излишне представлены в кодирующих последовательностях в генах в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. В частности, интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин «гуманизированный» относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой. Особый интерес представляют варианты нуклеиновых кислот.Оптимизированные для экспрессии в растительных клетках. Примеры таких нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения показаны в SEQ ID NOs: 103, 113 и 114.

[0240] Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу, очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и являются обычно «рекомбинантными», то есть фланкированы одним или более нуклеотидов, с которыми она обычно не связывается в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.

[0241] Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы искусственно. Способы получения нуклеиновых кислот хорошо известны из области техники. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот, может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.

[0242] Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы следующим образом: могут быть синтезированы несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы, методов, основанных на рекомбинации, или метода, основанного на ПЦР.

[0243] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие белки слияния, включающие белки настоящего изобретения. Примеры подобных белков приведены выше в разделе «Белки». Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки слияния, могут быть синтезированы искусственно как описано выше.

[0244] Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных белков (то есть гиспидин-гидроксилаз, гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз) или белков слияния на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. При введении кассеты экспрессии в клетку происходит образование белкового продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой изобретения; в этом случае говорят, что белок «продуцируется» или «экспрессируется» клеткой. Применима любая система экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, растения, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В кассете экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторными последовательностями, которые могут включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы. Как правило, кассета экспрессии содержит по крайней мере (а) регион инициации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине; (б) нуклеиновую кислоту по изобретению; и (в) регион терминации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.

[0245] Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области. Полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности. Вектор, как правило, имеет ориджин репликации, обеспечивающий его размножение в клетках-хозяевах в результате его введения в клетку как внехромосомного элемента. Вектор также может содержать регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине и получение рекомбинантного функционального белка. В экспрессионном векторе, указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры, сайленсеры, инсуляторы и индукторы. Для экспрессии функциональных белков или их укороченных форм кодирующие их нуклеиновые кислоты оперативно сшивают с нуклеиновыми кислотами, содержащими, по крайней мере, регуляторные последовательности и сайт начала транскрипции. Также эти нуклеиновые кислоты могут содержать последовательности, кодирующие гистидиновую метку (6 His tag), сигнальный пептид или функциональные белковые домены. Во многих воплощениях векторы обеспечивают интеграцию нуклеиновой кислоты, оперативно связанной с регуляторными элементами, в геном клетки-хозяина. Вектор может содержать кассету экспрессии для селектируемого маркера, такого как флуоресцентный белок (например, gfp), ген устойчивости к антибиотику (например, ген устойчивости к амфициллину, или канамицину, или неомицину или гигромицину и т.д.), гены, обусловливающие устойчивость к гербицидам, такие как гены, обусловливающие устойчивость к фосфинотрицину и гербицидам на основе сульфонамида, или иной селектируемый маркер, известный из уровня техники.

[0246] Вектор может содержать дополнительные кассеты экспрессии, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие 4'-фосфопантотеинил трансферазу, белки синтеза 3-арилакриловых кислот (например, описанные в разделе «Применение, комбинации и способы использования»), люциферазы и т.д.

[0247] Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого, или клетки высшего организма, не являющиеся эмбриональными клетками человека, такие как дрожжи, растения (например, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Physcomitrella patens), позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.

[0248] Клеточные линии, которые устойчиво продуцируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, генами устойчивости к антибиотику (ампициллину, или канамицину, или неомицину или гигромицину и т.д.), что делает возможным выявление и выделение трансфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном или существующий в составе экстрахромосомного элемента.

[0249] Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения клетки-хозяева или организмы, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.

[0250] Во многих воплощениях настоящего изобретения в клетку ко-трансфецируют несколькими кассетами экспрессии, содержащими нуклеиновые кислоты по изобретению, кодирующие различные ферменты биосинтеза люциферина грибов. В некоторых воплощениях в клетку дополнительно вводят кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света. В ряде случаев кассеты экспрессии объединяют в составе одного вектора, который используют для трансформации клеток. В некоторых воплощениях в клетку дополнительно вводят нуклеиновые кислоты, кодирующие 4'-фосфопантотеинил трансферазу и/или белки синтеза 3-арилакриловых кислот.

[0251] Также обеспечиваются короткие фрагменты ДНК заявленных нуклеиновых кислот, которые применяются как праймеры для ПЦР, амплификации rolling circle, гибридизационные скрининговые пробы и т.д. Длинные фрагменты ДНК применяются для получения кодируемых полипептидов, как ранее описано. Однако, для использования в геометрических реакциях амплификации, таких как ПЦР, используется пара коротких фрагментов ДНК, то есть праймеров. Точная последовательность праймера не является критической для изобретения, но для большинства применений праймеры будут гибридизоваться с заявленной последовательностью в условиях строгости, как известно в данной области. Предпочтительно выбрать пару праймеров, которые дадут продукт амплификации по меньшей мере приблизительно из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 100 нуклеотидов и могут простираться на полную последовательность нуклеиновой кислоты. Алгоритмы отбора последовательностей праймеров обычно известны и доступны в коммерческих пакетах программ. Праймеры для амплификации гибридизуются с комплементарными цепочками ДНК и будут затравлять встречные реакции амплификации.

[0252] Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована с помощью ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип.Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью указывает на экспрессию гена в образце.

Трансгенные организмы

[0253] Также обеспечиваются трансгенные организмы, трансгенные клетки и трансгенные клеточные линии, экспрессирующие нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению. Трансгенные клетки согласно настоящему изобретению включают одну или несколько нуклеиновых кислот, рассматриваемых в настоящем изобретении, которые присутствуют в качестве трансгена. Для целей настоящего изобретения может использоваться любая подходящая клетка-хозяин, включающая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus и т.п.) или эукариотические клетки-хозяева, не являющиеся эмбриональными клетками человека. Трансгенные организмы согласно настоящему изобретению могут представлять прокариотические или эукариотические организмы, включающие бактерии, цианобактерии, грибы, растения и животные, в которые вводится одна или большее число клеток организма, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, путем встраивания ее за счет манипуляции человеком, например, в рамках трансгенных методик, известных в данной области.

[0254] В одном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенный организм может представлять собой прокариотический организм. Способы трансформации прокариотических хозяйских клеток хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).

[0255] В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный трансгенный организм может представлять собой гриб, например, дрожжи. Дрожжи широко используются в качестве носителя для гетерологичной генной экспрессии (см., например, Goodey et al., Yeast biotechnology, D R Berry et al., eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp.401-429, и Kong et al., Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton and G. T. Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp.107-133). Доступно несколько типов дрожжевых векторов, включающих интегрирующиеся векторы, которые требуют рекомбинации с геномом-хозяином для своего поддержания, а также автономно реплицирующиеся плазмидные векторы.

[0256] Другим организмом-хозяином является организм животного. Трансгенные животные могут быть получены с использованием трансгенных методик, известных в данной области и описанных в стандартных руководствах (таких как: Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 2nd edition (2003) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vinterstein, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Ptactical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000)). Например, трансгенные животные могут быть получены посредством гомологичной рекомбинации, в рамках которой меняется эндогенный локус.Альтернативно, конструкцию нуклеиновой кислоты интегрируют в случайном режиме в геном. Векторы для стабильной интеграции включают плазмиды, ретровирусы и другие вирусы животных, YAC и т.п.

[0257] Нуклеиновая кислота может быть введена в клетку, непосредственно или опосредованно, за счет введения в предшественник клетки, с помощью осторожной генетической манипуляции, такой как микроинъекция, или с помощью инфекции рекомбинантным вирусом или с использованием рекомбинантного вирусного вектора, трансфекции, трансформации, доставки с помощью генной пушки или трансконъюгации. Методики переноса молекул нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в такие организмы хорошо известны и описаны в стандартных руководствах таких, как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

[0258] Термин «генетическая манипуляция» не включает классический кроссбридинг или оплодотворение in vitro, но, скорее, обозначает введение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК.

[0259] Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации включают по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, где нуклеиновая кислота по изобретению оперативно присоединена к участкам гомологии к целевому локусу. В конструкции ДНК для проведения случайной интеграции нет необходимости включать участки гомологии для облегчения рекомбинации. Могут быть также включены маркеры позитивной и негативной селекции. Способы получения клеток, содержащих целевые генные модификации, посредством гомологической рекомбинации, известны в данной области. Различные методики трансфекции клеток млекопитающих описаны, например, в работе Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537).

[0260] В случае эмбриональных стволовых клеток (ES), может быть использована клеточная линия ES или эмбриональные клетки могут быть получены в свежем виде от организма-хозяина, такого как мышь, крыса, морская свинка и т.п.Такие клетки выращивают на соответствующем питательном слое для фибробластов или выращивают в присутствии фактора ингибирования лейкозных клеток (LIF). Трансформированные ES или эмбриональные клетки могут быть использованы для создания трансгенных животных с использованием соответствующей методики, известной в данной области.

[0261] Трансгенные животные могут представлять собой любых животных, отличных от человека, включая млекопитающее, отличное от человека (например, мышь, крыса), птицу или земноводное и т.п., и используются в функциональных исследованиях, при скрининге лекарственных препаратов и т.п.

[0262] Могут быть также получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах №№US 5767367, US5750870, US5739409, US5689049, US5689045, US5674731, US5656466, US5633155, US5629470, US5595896, US5576198, US5538879 и US5484956, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылок. Способы получения трансгенных растений обобщены также в следующих обзорах: Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons (1993) pp.275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz) (2002) 719 p.

[0263] Для получения трансгенного организма-хозяина могут использоваться, например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки. После сбора клеток или тканей интересующую экзогенную ДНК вводят в растительные клетки, и для такого введения доступно множество различных методик. При наличии выделенных протопластов возникает возможность введения с использованием ДНК-опосредованных протоколов генного переноса, включающих инкубирование протопластов с депротеинезированной ДНК, такой как плазмида, включающей экзогенную кодирующую последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, ПЭГ или поли-L-орнитин); или по методу электропорации протопластов в присутствии оголенной ДНК, включающей интересующую экзогенную последовательность. Далее отбирают протопласты, которые успешно захватили экзогенную ДНК, растят их до образования каллуса и в итоге получают трансгенные растения посредством контакта с соответствующими количествами и взятыми в соответствующих соотношениях стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокинины.

[0264] Могут использоваться другие подходящие методы получения растений, такие как подход, основанный на использовании «генной пушки» или трансформация, опосредованная использованием Agrobacterium, известные специалистам в данной области.

Антитела

[0265] Термин «антитело» используется здесь для обозначения полипептида или группы полипептидов, включающих по крайней мере один активный центр антитела (антиген-связывающий сайт). Термин «антиген-связывающий сайт» обозначает пространственную структуру, параметры поверхности и распределение заряда у которой комплементарны параметрам эпитопа антигена: это обеспечивает связывание антитела с соответствующим антигеном. Понятие «антитело» охватывает, например, антитела позвоночных животных, химерные антитела, гибридные антитела, гуманизованные антитела, измененные антитела, моновалентные антитела, фрагменты Fab и монодоменные антитела.

[0266] Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, применимы в аффинной хроматографии, иммунологических тестах и в выявлении и идентификации белков по изобретению (гиспидин-гидроксилаз, гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз). Антитела, представляющие интерес, связываются с антигенными полипептидами или белками, или белковыми фрагментами, которые описаны выше в разделе «Белки». Антитела по настоящему изобретению могут быть иммобилизованы на носитель и использованы в иммунологическом тесте или на аффинной хроматографической колонке с целью выявления и/или разделения полипептидов, белков или белковых фрагментов, или клеток, включающих такие полипептиды, белки или белковые фрагменты. Как альтернатива, такие полипептиды, белки или белковые фрагменты могут быть иммобилизованы так, чтобы выявлять антитела, способные связываться специфически с ними.

[0267] Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены с применением стандартных методов. В целом, вначале белок используют для иммунизации подходящего млекопитающего, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными объектами для получения поликлональных сывороток благодаря получению значительного объема сыворотки крови, а также доступности помеченных антикроличьих и антикозьих антител. Иммунизацию обычно проводят путем перемешивания или эмульгирования конкретного белка в физиологическом растворе, предпочтительно с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда, с последующим введением полученной смеси или эмульсии парентеральным путем (обычно путем подкожной или внутримышечной инъекции). Обычно достаточными дозами являются по 50-200 мкг за одну инъекцию.

[0268] В различных воплощениях изобретения для иммунизации используют рекомбинантные или природные белки в нативной или денатурированной форме. Для иммунизации могут быть использованы также белковые фрагменты или синтетические полипептиды, содержащие часть аминокислотной последовательности белка по изобретению.

[0269] Иммунизацию обычно бустируют через 2-6 недель путем одной или нескольких дополнительных инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно с включением неполного адъюванта Фрейнда. Также антитела могут быть получены альтернативным путем с помощью иммунизации in vitro с применением известных в данной области техники методов, которые с точки зрения целей настоящего изобретения эквивалентны иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем отбора крови у иммунизованных животных в стеклянную или пластиковую емкость с последующей инкубацией крови при 25 С в течение 1 часа и затем инкубацией при 4 С в течение 2-18 часов. Сыворотку выделяют центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). У кроликов за один раз можно получить 20-50 мл крови.

[0270] Моноклональные антитела получают с использованием стандартного метода Келера-Мильштейна (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256, 495-496) или его модификаций. Обычно в соответствии с описанным выше иммунизуют мышь или крысу. Однако, в отличие от взятия крови у животных с целью получения сыворотки, в данном методе удаляют селезенку (и, что необязательно, некоторые крупные лимфатические узлы) и мацерируют ткань с целью разделения отдельных клеток. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления не специфически адгезировавшихся клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или в отдельную планшетную лунку, покрытые белком-антигеном. В-лимфоциты, экспрессирующие связанный с мембраной иммуноглобулин, специфичный в отношении тестируемого антигена, связываются на планшете таким образом, что с остатком суспензии не смываются с него. Затем проводят слияние полученных в результате В-лимфоцитов или же всех мацерированных спленоцитов с миеломными клетками, в результате чего образуются гибридомы: их затем культивируют в селективной среде (например, в среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Полученные в результате гибридомы высевают в ограничивающем разведении и тестируют на выработку антител, которые специфическим образом связываются с использовавшимся для иммунизации антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Отобранные гибридомы, секретирующие моноклональные антитела (mAb), затем культивируют либо in vitro (например, в ферментерах в виде пучка полых волокон или стеклянных емкостях для тканевых культур), либо in vivo (в асцитной жидкости у мышей).

[0271] Антитела (как поликлональные, так и моноклональные) могут быть помечены с применением стандартных методов. Подходящими метками являются флуорофоры, хромофоры, радионуклиды (в частности, 32P и 125I), электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, для которых известны специфичные партнеры по связыванию. Ферменты обычно выявляют по их каталитической активности. Например, пероксидазу хрена обычно выявляют по ее способности конвертировать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно оцениваемый на спектрофотометре. Термин «специфичный партнер по связыванию» обозначает белок, способный связывать молекулу-лиганд, проявляя при этом высокий уровень специфичности, как, например, в случае с антигеном и специфичным в отношении него моноклональным антителом. Другими примерами специфичных партнеров по связыванию являются биотин и авидин (или стрептавидин), иммуноглобулин-G и белок-А, а также многочисленные пары рецепторов и их лигандов, известные в данной области техники. Другие варианты и возможности будут очевидны специалистам в данной области техники и в объеме настоящего изобретения рассматриваются как эквивалентные.

[0272] Антигены, иммуногены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению вызывают образование специфических партнеров по связыванию - антител. Указанные антигены, иммуногены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению включают иммуногенные композиции по настоящему изобретению. Такие иммуногенные композиции могут дополнительно содержать или включать адъюванты, носители или другие композиции, которые стимулируют или усиливают, или стабилизируют антигены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению. Такие адъюванты и носители будут очевидны для специалистов в данной области техники.

Применение, комбинации и способы использования

[0273] Настоящее изобретение обеспечивает применение белков биосинтеза люциферина грибов в качестве ферментов, катализирующих реакции (1) синтеза люциферина (а именно 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она), имеющего структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, из предлюциферина (а именно 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она), имеющего структурную формулу

;

или синтеза предлюциферина из 3-арилакриловой кислоты (предшественника предлюциферина) со структурной формулой

,

где R выбран из группы арил или гетероарил; или синтеза 3-арилакриловой кислоты из 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновую кислоты (оксилюциферина) со структурной формулой .

[0274] Белки биосинтеза люциферина грибов находят применение во многих способах реализации настоящего изобретения, неограничивающие примеры которых приведены в этой главе ниже.

[0275] Белки биосинтеза люциферина грибов, применение которых обеспечивается настоящим изобретением, могут быть получены из различных природных источников или получены с помощью рекомбинантных технологий. Например, белки дикого типа могут быть выделены из биолюминесцентных грибов, например, из грибов, относящихся к типу Basidiomycota, преимущественно к классу Basidiomycetes, в частности, к отряду Agaricales. Например, белки дикого типа могут быть выделены из биолюминесцентных грибов Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos и т.д. Они могут также быть получены экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка в соответствующем хозяине или в бесклеточной системе экспрессии.

[0276] В некоторых воплощениях белки применяются внутри клеток-хозяев, где они экспрессируются и осуществляют реакции циклического превращения люциферина грибов. В других воплощениях используются изолированные рекомбинантные или природные белки или экстракты, содержащие белки по применению.

[0277] Белки биосинтеза люциферина грибов активны в физиологических условиях.

[0278] В некоторых воплощениях обеспечивается применение белков - гиспидин-гидроксилаз в системах in vitro и in vivo для получения люциферина, который окисляется люциферазами биолюминесцентных грибов, их гомологами и мутантами с выделением света. Таким образом, настоящим изобретением обеспечивается применение гиспидин-гидроксилаз настоящего изобретения для катализа реакции превращения 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она (предлюциферина), имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он (люциферин грибов), имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[0279] Способ получения люциферина грибов из предлюциферина включает объединение по крайней мере одной молекулы гиспидин-гидроксилазы с по крайней мере одной молекулой 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, с по крайней мере одной молекулой НАД(Ф)Н и по крайней мере с одной молекулы молекулярного кислорода (О2). Реакция осуществляется в физиологических условиях в системах in vitro и in vivo при температуре от 20 до 42 градусов Цельсия, в том числе реакция может осуществляться в клетках, тканях и организмах-хозяевах, экспрессирующих гиспидин-гидроксилазу. В преимущественных воплощениях указанные клетки, ткани и организмы содержат достаточное количество НАД(Ф)Н и молекулярного кислорода для осуществления реакции. В реакции может быть использован экзогенно добавляемый 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, или эндогенный 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, производимый в клетках, тканях или организмах.

[0280] В преимущественных воплощениях гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения осуществляют синтез 3-гидроксигиспидина из гиспидина. В преимущественных воплощениях они осуществляют синтез по крайней мере одного функционального аналога 3-гидроксигиспидина из соответствующего предлюциферина, показанного в Таблице 2. В некоторых воплощениях гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения осуществляют синтез 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она из любого соответствующего 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил.

[0281] Получаемый 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он находит применение для получения свечения в системах in vitro и in vivo, содержащих функциональную люциферазу, опознающую люциферин грибов в качестве субстрата.

[0282] Применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве гиспидин-гидроксилаз являются белки, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, а также их мутанты, гомологи и производные. Например, могут быть использованы функциональные гиспидин-гидроксилазы 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% на протяжении по крайней мере 350 аминокислот. Например, они могут быть идентичны на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% на протяжении всей полипептидной цепи белка.

[0283] В преимущественных воплощениях, применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве гиспидин-гидроксилазы являются белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 29-33. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей гиспидин-гидроксилаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью (Фиг. 1).

[0284] В некоторых воплощениях обеспечивается применение белков гиспидин-синтаз в системах in vitro и in vivo для получения предлюциферина грибов из его предшественника, то есть применение для катализа реакции превращения 3-арилакриловых кислот со структурной формулой

,

где R выбран из группы арил, гетероарил, в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[0285] Способ получения предлюциферина включает объединение по крайней мере одной молекулы гиспидин-синтазы с по крайней мере одной молекулой 3-арилакриловой кислоты с по крайней мере одной молекулы кофермента А, с по крайней мере одной молекулы АТФ и по крайней мере с двумя молекулами малонил-КоА.

[0286] Реакция осуществляется в физиологических условиях при температуре от 20 до 42 градусов Цельсия, в том числе реакция может осуществляться в клетках, тканях и организмах - хозяевах, экспрессирующих функциональную гиспидин-синтазу. В преимущественных воплощениях указанные клетки, ткани и организмы содержат достаточное количество кофермента А, малонил-КоА и АТФ для осуществления реакции.

[0287] В реакции может быть использована экзогенно добавляемая 3-арилакриловая кислота или 3-арилакриловая кислота, производимая в клетках, тканях или организмах.

[0288] Например, гиспидин-синтазы настоящего изобретения могут быть использованы для получения гиспидина из кофейной кислоты. В преимущественных воплощениях они осуществляют синтез функционального аналога гиспидина (6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она) из соответствующей 3-арилакриловой кислоты, показанной в Таблице 2.

[0289] Получаемый 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он находит применение для получения люциферина грибов в присутствии гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения. Гиспидин и его функциональные аналоги также находят применение в медицине, так как проявляют антиоксидантные и противоопухолевые свойства; по некоторым данным гиспидин способен предотвращать ожирение [Be Tu et al., Drug Discov Ther. 2015 Jun; 9 (3): 197-204; Nguyen et al., Drug Discov Ther. 2014 Dec; 8 (6): 238-44; Yousfi et al., Phytother Res. 2009 Sep; 23 (9): 1237-42].

[0290] Применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве гиспидин-синтаз являются белки, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, а также их мутанты, гомологи и производные. Например, могут быть использованы функциональные гиспидин-синтазы, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, по крайней мере на 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%.

[0291] В преимущественных воплощениях, применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве гиспидин-синтаз являются белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 56-63. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей гиспидин-синтаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью (Фиг. 2).

[0292] В некоторых воплощениях обеспечивается применение белков кофеилпируват-гидролаз в системах in vitro и in vivo для получения 3-арилакриловых кислот со структурной формулой

[0293] ,

где R выбран из группы арил, гетероарил, из 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновой кислоты со структурной формулой

где R - арил или гетероарил. Реакция осуществляется в физиологических условиях в системах in vitro и in vivo. Кофеилпируват-гидролазы настоящего изобретения находят применение в системах автономной биолюминесценции, детально описанных ниже.

[0294] Применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве кофеилпируват-гидролаз являются белки, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, а также их мутанты, гомологи и производные. Например, могут быть использованы функциональные кофеилпируват-гидролазы, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, по крайней мере на 60%, по крайней мере на 65%, по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 85%, по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%.

[0295] В преимущественных воплощениях, применимыми для нужд настоящего изобретения в качестве кофеилпируват-гидролаз являются белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 76-78. Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей кофеилпируват-гидролаз оперативно связаны через аминокислотные вставки с меньшей консервативностью (Фиг. 3).

[0296] Также обеспечиваются комбинации белков, применимые в способах настоящего изобретения. В преимущественных воплощениях комбинации включают функциональную гиспидин-гидроксилазу и функциональную гиспидин-синтазу. Комбинация находит применение для получения 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она из 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил. Например, комбинация может быть использована для получения гидроксигиспидина кофейной кислоты. Реакция осуществляется в физиологических условиях в присутствии по крайней мере одной молекулы гиспидин-гидроксилазы, по крайней мере одной молекулы гиспидин-синтазы, по крайней мере одной молекулы 3-арилакриловой кислоты, по крайней мере одной молекулы кофермента А, по крайней мере одной молекулы АТФ, по крайней мере двух молекул малонил-КоА, по крайней мере одной молекулы НАД(Ф)Н и по крайней мере одной молекулы молекулярного кислорода (О₂).

[0297] В некоторых воплощениях комбинация включает также люциферазу, способную использовать 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил, в качестве люциферина. Окисление указанного 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она такой люциферазой сопровождается биолюминесценцией и образованием оксилюциферина (6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновой кислоты).

[0298] В качестве люциферазы может быть использован любой белок, характеризующихся вышеуказанной активностью. Например, могут быть использованы известные люциферазы из биолюминесцентных грибов, в том числе описанные в заявке RU №2017102986/10(005203) от 30.01.2017, а также их гомологи, мутанты и химерные белки, обладающие люциферазной активностью.

[0299] Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения применимые для нужд настоящего изобретения люциферазы характеризуются аминокислотными последовательностями, которые по крайней мере на 40% идентичны, например, по крайней мере на 45% идентичны, или по крайней мере на 50% идентичны, или по крайней мере на 55% идентичны, или по крайней мере на 60% идентичны, или по крайней мере на 70% идентичны, или по крайней мере на 75% идентичны, или по крайней мере на 80% идентичны, или по крайней мере на 85% идентичны аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Часто люциферазы характеризуются аминокислотными последовательностями, которые имеют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94, 96, 98, не менее 90% идентичности (например, не менее 91%, не менее 92%, не менее 93%, не менее 94%, не менее 95%, не менее не менее 96%, не менее 97%, не менее 98%, не менее 99% идентичности или 100% идентичности).

[0300] Мутанты могут сохранять биологические свойства люциферазы дикого типа, из которого они были получены, или могут обладать биологическим свойствами, которые отличаются от свойств белков дикого типа. Термин «биологическое свойство» люцифераз согласно настоящему изобретению относится, без ограничения, к способности окислять различные люциферины; биохимическим свойствам, таким, как стабильность in vivo и/или in vitro (например, период полувыведения); скорость созревания; тенденция к агрегации или олигомеризации, а также другие подобные свойства. Мутации включают изменения одной или нескольких аминокислот, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот; N-концевые усечения или расширения, С-концевые усечения или расширения и т.п.

[0301] В некоторых воплощениях настоящего изобретения люциферазы используются в изолированной форме, то есть это означает, что данный они по существу свободны от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу. В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную по меньшей мере 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.

[0302] В некоторых воплощениях люциферазы используются в составе экстрактов, полученных из биолюминесцентных грибов или из клеток-хозяев, содержащих кодирующие рекомбинантные люциферазы нуклеиновые кислоты.

[0303] В многих воплощениях люциферазы находятся гетерологических системах экспрессии (в клетках или организмах настоящего изобретения), которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантные люциферазы.

[0304] Способы получения рекомбинантных белков, в частности люцифераз, как в выделенном виде, или в составе экстрактов, или в гетерологических системах экспрессии хорошо известны из уровня техники и описаны в разделе «Нуклеиновые кислоты». Способы очистки белков описаны в разделе «Белки».

[0305] В преимущественных воплощениях люциферазы сохраняют активность при температурах ниже 50°С, чаще при температурах до 45°С, то есть они сохраняют активность при температурах 20-42°С и могут быть использованы в системах гетерологической экспрессии in vitro и in vivo. Как правило, описываемые люциферазы обладают рН стабильностью в диапазоне от 4 до 10, чаще в диапазоне от 6.5 до 9.5. Оптимум рН стабильности заявленных белков лежит в диапазоне между 7.0 и 8.5, например, между 7.3-8.0. В преимущественных воплощениях, указанные люциферазы активны в физиологических условиях.

[0306] Комбинация гиспидин-гидроксилазы и люциферазы, окисляющей люциферин грибов с выделением света, находит применение в способах выявления гиспидина и его функциональных аналогов в биологических объектах: клетках, тканях, или организмах. Способ включает контакт исследуемого биологического объекта или полученного из него экстракта с комбинацией выделенных гиспидин-гидроксилазы и указанной люциферазы в подходящем реакционном буфере, создающим физиологические условия и содержащим необходимые компоненты для осуществления реакций. Специалист в области может составить множество реакционных буферов, удовлетворяющих данному условию. Неограничивающим примером реакционного буфера может служить 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 7.0-8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозида (DDM), 1 мМ НАДФН.

[0307] Наличие гиспидина или его функционального аналога определяется по появлению детектируемого света - биолюминесценции. Способы детекции детектируемого света описаны выше в разделе «Белки» при описании способов функционального скрининга.

[0308] Комбинация гиспидин-гидроксилазы, гиспидин-синтазы и люциферазы, окисляющей люциферин грибов с выделением света, находит применение в способах выявления 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил, в биологических объектах. Способ включает контакт исследуемого биологического объекта или полученного из него экстракта с комбинацией выделенных гиспидин-гидроксилазы, гиспидин-синтазы и люциферазы, создающим физиологические условия и содержащим необходимые компоненты для осуществления реакций. Специалист в области может составить множество реакционных буферов, удовлетворяющих данному условию. Неограничивающим примером реакционного буфера может служить 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 7.0-8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO₄, 0.1% додецилмальтозид (DDM), 1 мМ НАДФН, 10 мМ АТФ, 1 мМ КоА, 1 мМ Малонил-КоА.

[0309] Наличие 3-арилакриловой кислоты определяется по появлению детектируемого света - биолюминесценции. Способы детекции детектируемого света описаны выше в разделе «Белки» при описании способов функционального скрининга.

[0310] В некоторых воплощениях вместо комбинации гиспидин-гидроксилазы и люциферазы, окисляющей люциферин грибов с выделением света, может быть использован белок слияния, описанный в разделе «Белки» выше. Белок слияния одновременно проявляет активность гиспидин-гидроксилазы и активность люциферазы и может быть использован в любых способах вместо комбинации двух указанных ферментов.

[0311] В некоторых воплощениях вместо вышеописанной гиспидин-синтазы используется поликетидсинтаза III типа, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, по существу сходной с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139. Применимыми для нужд настоящего изобретения являются поликетидсинтазы III типа, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 по крайней мере на 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, или по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%.

[0312] Представители указанных поликетидсинтаз (PKS) выявлены во многих растительных организмах, из уровня техники известна их способность и/или способность их мутантов катализировать синтез бисноръянгонина из кумарила-КоА [Lim et al., Molecules, 2016 Jun 22;21(6)]. Заявители продемонстрировали, что указанные ферменты также способны катализировать синтез гиспидин из кофеил-КоА в системах in vitro и in vivo:

[0313] Таким образом применение указанных белков для синтеза гиспидина также находится в рамках настоящего изобретения.

[0314] В некоторых воплощениях настоящего изобретения PKS используются в изолированной форме, то есть это означает, что они по существу свободны от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу. В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную по меньшей мере 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.

[0315] В многих воплощениях PKS находятся в гетерологических системах экспрессии (в клетках или организмах настоящего изобретения), которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантные ферменты.

[0316] Способы получения рекомбинантных белков как в выделенном виде, или в составе экстрактов, или в гетерологических системах экспрессии хорошо известны из уровня техники и описаны в разделе «Нуклеиновые кислоты». Способы очистки белков описаны в разделе «Белки».

[0317] В преимущественных воплощениях PKS сохраняют активность при температурах ниже 50°С, чаще при температурах до 45°С, то есть они сохраняют активность при температурах 20-42°С и могут быть использованы в системах гетерологической экспрессии in vitro и in vivo. Как правило описываемые PKS обладают рН стабильностью в диапазоне от 4 до 10, чаще в диапазоне от 6.0 до 9.0 Оптимум рН стабильности заявленных белков лежит в диапазоне между 6.5 и 8.5, например, между 7.0-7.5. В преимущественных воплощениях, указанные PKS активны в физиологических условиях.

[0318] Способ получения гиспидина включает объединение по крайней мере одной молекулы описанной выше поликетидсинтазы III типа с по крайней мере двумя молекулами малонил-КоА и по крайней мере одной молекулой кофеил-КоА.

[0319] В некоторых воплощениях способ включает получение кофеил-КоА из кофейной кислоты в ходе ферментативной реакции, катализируемой кумарат-КоА-лигазой. В этом случае способ включает объединение по крайней мере одной молекулы описанной выше поликетидсинтазы III типа с по крайней мере одной молекулой кофейной кислоты, с по крайней мере одной молекулой кофермента А, с по крайней мере одной молекулой кумарат-КоА-лигазы, с по крайней мере одной молекулой АТФ и по крайней мере двумя молекулами малонил-КоА.

[0320] Для нужд настоящего изобретения могут быть использованы любые известные из уровня техники ферменты кумарат-КоА-лигазы, осуществляющие реакцию присоединения кофермента А к кофейной кислоте с образованием кофеил-КоА:

[0321] В частности, может быть использована кумарат-КоА-лигаза 1 из Arabidopsis thaliana, имеющая аминокислотную и нуклеотидную последовательности, показанные в SEQ ID NO: 141, а также ее функциональные мутанты и гомологи. Например, пригодной для нужд настоящего изобретения является функциональная кумарат-КоА-лигаза, аминокислотная последовательность которой имеет не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 141.

[0322] Все указанные реакции осуществляются в физиологических условиях при температуре от 20 до 50 градусов Цельсия, в том числе реакция может осуществляться в клетках, тканях и организмах - хозяевах, экспрессирующих функциональные ферменты.

[0323] В комбинации с гиспидин-гидроксилазой настоящего изобретения PKS и кумарат-КоА-лигаза могут быть использованы для получения 3-гидроксигиспидина из кофейной кислоты. Реакция осуществляется в физиологических условиях в присутствии по крайней мере одной молекулы гиспидин-гидроксилазы, по крайней мере одной молекулы PKS, по крайней мере одной молекулы кумарат-КоА-лигазы, по крайней мере одной молекулы кофейной кислоты или кофеил-КоА, по крайней мере одной молекулы кофермента А, с по крайней мере одной молекулой АТФ, с по крайней мере одной молекулой НАД(Ф)H, с по крайней мере одной молекулой кислорода и по крайней мере двумя молекулами малонил-КоА.

[0324] Также настоящее изобретение обеспечивает применение нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты биосинтеза люциферина грибов, гомологи и мутанты этих белков, в том числе укороченные и удлиненные формы и белки слияния, для получения ферментов, вовлеченных в биосинтез люциферина грибов, в системах in vitro и\или in vivo.

[0325] В преимущественных воплощениях обеспечивается применение нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-гидроксилазы по изобретению, а именно белки, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, а также их функциональные гомологи, мутанты и производные. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, по крайней мере на 60%, по крайней мере на 65%, по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 85%, по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, на протяжении по крайней мере 350 аминокислот.В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NO: 29-33.

[0326] Также обеспечивается применение нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-синтазы, а именно белки, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, а также их функциональные гомологи, мутанты и производные. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на на 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, на протяжении всей полипептидной цепи белка. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 56-63.

[0327] Также обеспечивается применение нуклеиновых кислот, кодирующих кофеилпируват-гидролазы, а именно белки, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, а также их функциональные гомологи, мутанты и производные. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых по крайней мере 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99% идентичны последовательностям, показанным в SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, на протяжении всей полипептидной цепи. В преимущественных воплощениях нуклеиновые кислоты кодируют белки, аминокислотные последовательности которых характеризуются наличием нескольких консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), показанных в SEQ ID NOs: 76-78.

[0328] Вышеперечисленные группы нуклеиновых кислот находят применение для получения рекомбинантных белков гиспидин-гидроксилаз, гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз, а также для экспрессии этих белков в гетерологических системах экспрессии.

[0329] В частности, нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-гидроксилазы находят применение для получения клеток-продуцентов 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

[0330] из экзогенного или эндогенного 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

[0331] Нуклеиновые кислоты, кодирующие кофеилпируват-гидролазы, находят применение для получения клеток и организмов, способных осуществлять реакцию превращения оксилюциферина в предшественник предлюциферинов.

[0332] Нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы, находят применение для получения клеток-продуцентов вышеуказанного 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она из соответствующей 3-арилакриловой кислоты. Например, клетки, экспрессирующие гиспидин-синтазу, находят применение для получения гиспидина из кофейной кислоты.

[0333] В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы, находят применение для получения гиспидина из тирозина. В указанных воплощениях в клетки дополнительно вводят нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, обеспечивающие синтез кофейной кислоты из тирозина. Такие ферменты известны из уровня техники. Например, может быть использована комбинация нуклеиновых кислот, кодирующих тирозин-аммоний-лиазу Rhodobacter capsulatus, и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E.coli как описано в [Lin и Yan. Microb Cell Fact. 2012, 4;11:42]. Специалисту в данной области очевидно, что альтернативно могут быть использованы любые иные известные из уровня техники ферменты, осуществляющие реакции превращения тирозина в кофейную кислоту, например, ферменты, аминокислотные последовательности которых по существу сходны аминокислотным последовательностям тирозин-аммоний-лиазы Rhodobacter capsulatus и компонентам HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E. сoli, показанным в SEQ ID NOs: 107, 109 и 111. Например, указанные ферменты могут иметь аминокислотные последовательности, которые имеют не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, или не менее 80% идентичности, или или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности) с последовательностями, показанными в SEQ ID NOs: 107, 109 и 111 соответственно.

[0334] В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазы, находят применение для получения клеток-продуцентов функциональных аналогов гиспидина из ароматических соединений, в том числе ароматических аминокислот и их производных. В указанных воплощениях в клетки дополнительно вводят нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, обеспечивающие синтез 3-арилакриловых кислот, из которых, в свою очередь, происходит биосинтез функциональных аналогов гиспидина. Такие ферменты известны из уровня техники. Например, для биосинтеза коричной кислоты может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая фенилаланин-аммоний-лиазу Streptomyces maritimus, как описано в [Bang, H.B., Lee, Y.H., Kim, S.C. et al. Microb Cell Fact (2016) 15: 16. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0415-9]. Специалисту в данной области очевидно, что альтернативно могут быть использованы любые иные известные из уровня техники ферменты, осуществляющие реакции превращения ароматических аминокислот и других ароматических соединений в 3-арилакриловые кислоты. Например, для синтеза коричной кислоты может быть использована любая функциональная фенилаланин-аммоний-лиаза, например, фенилаланин-аммоний-лиаза, аминокислотная последовательность которой по существу сходна с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 117, например, последовательность которой идентична последовательности SEQ ID NO: 117 по крайней мере на 40%, в том числе, имеет с ней не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности).

[0335] В некоторых воплощениях для получения клеток-хозяев, экспрессирующих функциональную гиспидин-синтазу, требуется их ко-трансфекция нуклеиновой кислотой, кодирующей гиспидин-синтазу по изобретению, и нуклеиновой кислотой, кодирующей 4'-фосфопантотеинил трансферазу, способную осуществлять перенос 4-фосфопантетеинила от кофермента А на серин в ацилпереносящем домене поликетидсинтаз. В других воплощениях выбранные клетки-хозяева, например, клетки растений или клетки некоторых низших грибов (например, относящихся к роду Aspergillus) содержат эндогенную 4'-фосфопантотеинил трансферазу и ко-трансфекция не требуется.

[0336] Также обеспечивается применение комбинаций нуклеиновых кислот по изобретению. Так комбинация нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-гидроксилазу и гиспидин-синтазу, находит применение для получения клеток-продуцентов 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-она из 3-арилакриловой кислоты, например, для получения 3-гидроксигиспидина из кофейной кислоты и/или из тирозина. В некоторых воплощениях комбинация нуклеиновых кислот включает нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу. В некоторых воплощениях комбинация нуклеиновых кислот включает нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, обеспечивающие синтез 3-арилакриловой кислоты из метаболитов клетки, например, ферменты, обеспечивающие синтез кофейной кислоты из тирозина или синтез коричной кислоты из фенилаланина.

[0337] В некоторых воплощениях для получения клеток-продуцентов гиспидина из кофейной кислоты используется комбинация нуклеиновых кислот, кодирующих PKS и кумарат-КоА-лигазы. Пригодной для нужд настоящего изобретения являются нуклеиновая кислота, кодирующая функциональную PKS, аминокислотная последовательность которой по существу сходна или идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; например, PKS, аминокислотная последовательность которой идентична последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, по крайней мере на 40%, чаще по крайней мере на 45%, обычно по крайней мере на 50%, например, по крайней мере на 55%, или по крайней мере на 60%, или по крайней мере на 65%, или по крайней мере на 70%, или по крайней мере на 80%, или по крайней мере на 85%, или по крайней мере на 90%, или по крайней мере на 91%, или по крайней мере на 92%, или по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%. Также пригодной для нужд настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая функциональную кумарат-КоА-лигазу, катализирующую реакцию присоединения кофермента А к кофейной кислоте с образованием кофеил-КоА. Например, может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая функциональную кумарат-КоА-лигазу, аминокислотная последовательность которой идентична последовательности, показанной в SEQ ID NO: 141, или имеет с ней не менее 40% идентичности, например, не менее 45% идентичности, или не менее 50% идентичности, или не менее 55% идентичности, или не менее 60% идентичности, или не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, например, не менее 80% идентичности, не менее 85% идентичности, не менее 90% идентичности (например, по крайней мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности).

[0338] В некоторых воплощениях используется комбинация нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-гидроксилазу по изобретению, и нуклеиновой кислоты, кодирующей PKS. В преимущественных воплощениях комбинация также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу. Комбинация находит применение для получения клеток-продуцентов 3-гидроксигиспидина из кофейной кислоты и/или кофеил-КоА.

[0339] В некоторых воплощениях комбинация нуклеиновых кислот включает нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, обеспечивающие синтез кофейной кислоты из тирозина.

[0340] Особый интерес представляют комбинации нуклеиновых кислот по изобретению, используемые вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей люциферазу, способную окислять люциферины гриба с выделением света. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие люциферазы для нужд настоящего изобретения, могут быть клонированы из биологических источников, например, из гриба, относящегося к типу Basidiomycota, преимущественно к классу Basidiomycetes, в частности, к отряду Agaricales или получены с помощью методов генной инженерии. Мутанты люцифераз, обладающие люциферазной активностью, могут быть получены с использованием стандартных методик молекулярной биологии, таких как подробно описанные выше в разделе «Нуклеиновые кислоты». Мутации включают изменения одной или нескольких аминокислот, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот; N-концевые усечения или расширения, С-концевые усечения или расширения и т.п.В преимущественных воплощениях эти нуклеиновые кислоты кодируют люциферазы, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 40% идентичны, например, по крайней мере на 45% идентичны, или по крайней мере на 50% идентичны, или по крайней мере на 55% идентичны, или по крайней мере на 60% идентичны, или по крайней мере на 70% идентичны, или по крайней мере на 75% идентичны, или по крайней мере на 80% идентичны, или по крайней мере на 85% идентичны аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Например, они могут иметь аминокислотные последовательности, которые имеют не менее 90% идентичности (например, не менее 91%, не менее 92%, не менее 93%, не менее 94%, не менее 95%, не менее не менее 96%, не менее 97%, не менее 98%, не менее 99% идентичности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94, 96, 98. Неограничивающие примеры нуклеиновых кислот, кодирующих люциферазы, показаны в SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 и 95.

[0341] В некоторых воплощениях используется комбинация нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-гидроксилазу по изобретению, и нуклеиновой кислоты, кодирующей описанную выше люциферазу. Комбинация находит применение в широком спектре приложений при мечении организмов, тканей, клеток, клеточных органелл или белков с помощью биолюминесценции. Способы мечения организмов, тканей, клеток, клеточных органелл или белков с помощью люциферазы хорошо известны из уровня техники и подразумевают введение в клетку-хозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей люциферазу, например, в составе кассеты экспрессии, обеспечивающей экспрессию люциферазы в указанной клетке, ткани или организме. При добавлении подходящего люциферина к клеткам, ткани или организму, экспрессирующим люциферазу, возникает детектируемый свет.При мечении клеточных органелл или белков, нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, оперативно связывают с нуклеиновой кислотой, кодирующей соответственно сигнал локализации в исследуемой клеточной органелле или исследуемый белок. При ко-экспрессии в клетках люциферазы и гиспидин-синтазы настоящего изобретения биологические объекты (клетки, ткани, организмы, клеточные органеллы или белки) приобретают способность светиться в присутствии не только люциферина грибов, но и предлюциферина (последний в большинстве случаев отличается большей стабильностью в присутствии кислорода воздуха).

[0342] Также комбинация нуклеиновых кислот находит применение при исследовании зависимости активности двух промоторов в гетерологических системах экспрессии. В этом случае в клетку-хозяина вводится оперативно связанная с промотором «А» нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу, и оперативно связанная с промотором «Б» нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-гидроксилазу. Добавляя к аликвотам клеток (или клеточных экстрактов) люциферин, или предлюциферин, или смесь предлюциферина с люциферазой, по появлению свечения можно детектировать активность одного промотора «А» (свечение детектируется только в присутствии люциферина), одного промотора «Б» (свечение детектируется в присутствии смеси предлюциферина и люциферазы), или обоих промоторов (свечение детектируется во всех случаях).

[0343] В некоторых воплощениях комбинация также содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу. В некоторых воплощениях комбинация содержит дополнительно нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу.

[0344] В некоторых воплощениях комбинация содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу, нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, нуклеиновую кислоту, кодирующую PKS, и нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу.

[0345] Комбинации находят применение в широком спектре приложений при мечении организмов, тканей, клеток, клеточных органелл или белков с помощью биолюминесценции. В данном воплощении для получения свечения к биологическим объектам, экспрессирующим гиспидин-гидроксилазу, люциферазу и гиспидин-синтазу или гиспидин-гидроксилазу, люциферазу, PKS и кумарат-КоА-лигазу добавляют подходящий предшественник предлюциферина, например, кофейную кислоту или кумаровую кислоту.

[0346] Комбинации также находят применение в способах исследования зависимости активности трех промоторов в гетерологических системах экспрессии. Способы предполагают введение к клетку-хозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей люциферазу, под контролем промотора «А», нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-гидроксилазу под контролем промотора «Б» и нуклеиновой кислоты, кодирующей гиспидин-синтазу (или PKS), под контролем промотора «В». Если для созревания функциональной гиспидин-синтазы необходима ко-экспрессия 4'-фосфопантотеинил трансферазы, то ее также вводят в клетку под контролем любого пригодного конститутивного или индуцируемого промотора. Об одновременной активации всех трех промоторов будет свидетельствовать появление детектируемого света при добавлении к клеткам (или их экстрактам) подходящего предшественника предлюциферина.

[0347] Комбинации также находят применение при получении трансгенных светящихся организмов. В преимущественных воплощениях, трансгенные организмы получают из организмов, дикий тип которых не обладает способностью к биолюминесценции. Нуклеиновые кислоты, кодирующие целевые белки вводят в трансгенный организм в составе кассеты экспрессии или вектора, которые существуют в организме в виде внехромосомного элемента или интегрируются в геном организма, как описано выше в разделе «Трансгенные организмы», и обеспечиваю экспрессию целевых белков. Трансгенные организмы по изобретению отличаются тем, что экспрессируют кроме люциферазы, субстратом которой является люциферин гриба, по крайней мере гиспидин-гидроксилазу. В преимущественных воплощениях они также экспрессируют гиспидин-синтазу. В других преимущественных воплощениях они экспрессируют также PKS. В других преимущественных воплощениях они экспрессируют также PKS. В некоторых воплощениях, они экспрессируют также кумарат-КоА-лигазу. Известно, что эндогенная кумарат-КоА-лигаза присутствует во многих растительных организмах, поэтому ее дополнительное введение осуществляется в случаях, когда эндогенная кумарат-КоА-лигаза отсутствует.

[0348] В некоторых воплощениях они также экспрессируют кофеилпируват-гидролазу. В отличие от организмов, экспрессирующих только люциферазу, трансгенные организмы, полученные с использованием нуклеиновых кислот настоящего изобретения, приобретают способность светиться в присутствии предлюциферинов и/или предшественников предлюциферинов - 3-арилакриловой кислот (чаще всего - кофейной кислоты) - представляющих собой наиболее дешевый и стабильный субстрат для получения биолюминесценции, который может быть добавлен в воду для полива растений, или в среду культивирования микроорганизмов, или в корм или среду обитания животных (например, рыб). Биолюминесцентные трансгенные организмы (растения, или животные, или грибы) находят применение в качестве источников света, а также используются для декоративных целей. Биолюминесцентные трансгенные организмы, клетки и клеточные культуры также можно использовать в различных скринингах, в которых интенсивность биолюминесценции меняется в зависимости от внешнего воздействия. Например, их можно использовать при анализе влияния различных факторов на активность промоторов, регулирующих экспрессию экзогенных нуклеиновых кислот.

[0349] Особый интерес представляют автономно биолюминесцентные трансгенные организмы, которые также обеспечиваются настоящим изобретением.

[0350] В некоторых воплощениях в указанных организмах в качестве метаболита присутствует хотя бы одна 3-арилакриловая кислота со структурной формулой

,

где R - арил или гетероарил.

[0351] В качестве неограничивающих примеров подобных организмов можно привести высшие и низшие растения, включая цветковые растения и мхи. Для получения автономно светящихся трансгенных растений в них вводят способные к экспрессии соответствующих ферментов нуклеиновые кислоты, кодирующие гиспидин-синтазу, гиспидин-гидроксилазу и люциферазу, способную окислять люциферин гриба с выделением света. Так как растения содержат, как правило, эндогенную 4'-фосфопантотеинил трансферазу, то дополнительного введения нуклеиновой кислоты, кодирующий этот фермент, для получения автономно светящихся растений, как правило, не требуется.

[0352] В некоторых воплощениях для получения автономно биолюминесцентных трансгенных организмов используются организмы, которые в природе не производят 3-арилакриловых кислот.Примерами таких организмов являются животные и многие микроорганизмы, например, дрожжи и бактерии. Для получения автономной биолюминесценции в организмы в этом случае дополнительно вводят способные к экспрессии нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, обеспечивающие биосинтез 3-арилакриловых кислот из метаболитов клетки, например, кофейной кислоты из тирозина. При необходимости в организмы также вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу.

[0353] В некоторых воплощениях для получения автономно светящихся организмов в них вводят способные к экспрессии соответствующих ферментов нуклеиновые кислоты, кодирующие PKS, гиспидин-гидроксилазу и люциферазу, способную окислять люциферин гриба с выделением света. В преимущественных воплощениях указанные клетки, ткани и организмы содержат достаточное количество кофеил-КоА и малонил-коА для осуществления реакции синтеза гиспидина.

[0354] В случаях, когда трансгенный организм не производит достаточных количеств кофеил-КоА в ходе нормальных метаболических процессов, в указанные клетки или организмы также вводится нуклеиновая кислота, кодирующая кумарат-КоА-лигазу, а также, при необходимости, ферменты биосинтеза кофейной кислоты из тирозина.

[0355] В преимущественных воплощениях комбинация нуклеиновых кислот для получения автономно биолюминесцентных клеток или трансгенных организмов также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу. Как продемонстрировано в экспериментальной части ниже, экспрессия кофеилпируват-гидролазы приводит к увеличению интенсивности биолюминесценции автономно-светящихся биолюминесцентных клеток или трансгенных организмов. В преимущественных воплощениях интенсивность биолюминесценции увеличивается по крайней мере в 1.5 раза, чаще по крайней мере в 2 раза, обычно по крайней мере в пять раз, например, в 7-9 раз, например, в 8 или более раз.

[0356] Автономно биолюминесцентные трансгенные организмы (растения, или животные, или грибы), а также клетки и клеточные культуры отличаются от трансгенных организмов, клеток и клеточных культур, экспрессирующих только люциферазу и известных из уровня техники, тем, что для их свечения не требуется экзогенного добавления к ним люциферина или его предшественника.

[0357] В некоторых воплощениях вместо комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу, используется нуклеиновая кислота, кодирующая белок слияния этих двух ферментов. Специалисту в данной области очевидно, что указанный белок слияния и комбинация нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу, являются взаимозаменяемыми объектами во всех способах использования. Также очевидно, что на основе нуклеиновых кислот по изобретению могут быть изготовлены другие белки слияния, которые будут сохранять свойства партнеров слияния; такие белки слияния и кодирующие их нуклеиновые кислоты могут без ограничения использоваться вместо комбинаций отдельных белков и нуклеиновых кислот.

[0358] Во всех описанных выше применениях и способах нуклеиновые кислоты могут находиться в форме кассет экспрессии, которые можно применять для обеспечения экспрессии кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Нуклеиновую кислоту можно интродуцировать в клетку-хозяина в составе вектора для осуществления экспрессии в пригодной клетке-хозяине или не включая ее в вектор, например, ее можно встраивать в липосому или вирусную частицу. В альтернативном варианте очищенную молекулу нуклеиновой кислоты можно встраивать непосредственно в клетку-хозяина с помощью пригодных средств, например, путем прямого эндоцитозного поглощения. Генетическую конструкцию можно интродуцировать непосредственно в клетки организма-хозяина (например, растения) путем трансфекции, инфекции, микроинъекции, клеточного слияния, слияния протопластов, путем бомбардировки микроснарядами или с помощью «генной пушки» (пушки для обстрела несущими генетические конструкции микрочастицами).

[0359] Так же обеспечивается применение поликлональных и моноклональных антител по изобретению. Они находят применение в способах окрашивания препаратов тканей, клеток или организмов для выявления локализации экспрессированных или природных гиспидин-гидроксилаз, гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз по изобретению. Способы окрашивания с помощью специфческих антител хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в [Быков В. Л. Цитология и общая гистология]. Прямой иммуногистохимический метод основан на реакции специфического связывания меченых антител непосредственно с выявляемым веществом, непрямой иммуногистохимический метод основан на том, что немеченые первичные антитела связываются с выявляемым веществом, а далее уже их выявляют при помощи вторичных меченых антител, при этом первичные антитела служат антигенами для вторичных антител. Также антитела находят применение для остановки ферментативной реакции. Контакт антитела со специфичным партнером по связыванию приводит к ингибированию ферментативной реакции. Также антитела находят применение в методах очистки рекомбинантных и природных белков по изобретению с помощью аффинной хроматографии. Способы аффинной хроматографии известны из уровня техники и описаны, например, в [Ninfa et al (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology (2 ed.). Wiley. p.133.; Cuatrecasas (1970). JBC. Retrieved November 22, 2017].

Наборы и изделия

[0360] Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое включает описанные выше гиспидин-гидроксилазу, или гиспидин-синтазу, или кофеилпируват-гидролазу, или нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеуказанный фермент, предпочтительно с элементами для обеспечения экспрессии целевого белка в клетке-хозяине, например, вектор или кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок. Альтернативно, нуклеиновые кислоты могут содержать фланкирующие последовательности для ее встраивания в целевой вектор. Нуклеиновые кислоты могут быть включены в лишенные промотора векторы, предназначенные для удобного клонирования целевых регуляторных элементов. Рекомбинантные белки могут находиться в лиофилизированном состоянии или в растворенном виде в буферном растворе. Нуклеиновые кислоты могут находится в лиофилизированном состоянии или в виде осадка в спиртовом растворе или в растворенном виде в воде или буферном растворе.

[0361] В некоторых воплощениях изделие включает клетки, экспрессирующие одну или несколько из вышеперечисленных нуклеиновых кислот.

[0362] В некоторых воплощениях изделие включает трансгенный организм, экспрессирующий одну или несколько из вышеперечисленных нуклеиновых кислот.

[0363] В некоторых воплощениях изделие включает антитела для окрашивания, и/или ингибирования и\или аффинной хроматографии вышеуказанных ферментов.

[0364] Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и приложенной к нему инструкцией. Приемлемыми контейнерами являются, например, флаконы, ампулы, пробирки, шприцы, планшеты для клеток, чашки Петри и т.д. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Выбор подходящего контейнера очевиден специалисту в данной области.

[0365] Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, реакционный буфер, или компоненты для его изготовления, буфер для разведения и/или растворения и/или хранения белков или нуклеиновых кислот, или компоненты для его изготовления, деионизованую воду, вторичные антитела к специфическим антителам по изобретению, среду для культивирования клеток или компоненты для ее изготовления, питание для трансгенного организма.

[0366] Изделия также включают инструкции для осуществления предлагаемых методов. Инструкции могут присутствовать в разных формах, при этом к изделию может прилагаться одна или несколько таких форм, например, инструкция может быть представлена в виде файла на электронном носителе и\или быть представлена на печатном носителе.

[0367] Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей. Набор может включать комбинацию белков по изобретению или комбинацию нуклеиновых кислот по изобретению, предпочтительно с элементами для обеспечения экспрессии целевых белков в клетке-хозяине, например, вектор или кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок. В некоторых воплощениях набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, способную окислять люциферин гриба с выделением света. В некоторых воплощениях набор может содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, вовлеченные в биосинтез кофейной кислоты из тирозина. В некоторых воплощениях набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу. В некоторых воплощениях набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую PKS. В некоторых воплощениях набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу.

[0368] В некоторых воплощениях набор может также содержать антитела для очистки рекомбинантных белков или окрашивания экспрессированных белков в клетках-хозяевах. В некоторых воплощениях набор может также содержать праймеры, комплементарные участкам указанной нуклеиновой кислоты, для амплификации нуклеиновой кислоты или ее фрагмента. В некоторых воплощениях набор может также содержать один или несколько люциферинов грибов и/или предлюциферинов и/или предшественников предлюциферинов. Указанные соединения могут находиться в виде сухого порошка, в виде раствора в органическом растворителе, в виде раствора в воде. В некоторых воплощениях набор может включать клетки, содержащие одну или несколько из вышеперечисленных нуклеиновых кислот.В некоторых воплощениях набор может включать трансгенный организм по изобретение, например, штамм продуцент или трансгенное автономно биолюминесцентное растение. Все компоненты набора помещаются в подходящие контейнеры. Наборы как правило также включают инструкцию по использованию.

[0369] Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

[0370] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Экспериментальная часть (Примеры)

Пример 1. Выделение последовательностей гиспидин-гидроксилаз

[0371] Суммарная РНК из мицелия Neonothopanus nambi была выделена по методу, описанному в [Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159]. кДНК была амплифицирована с помощью SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, США) согласно протоколу производителя. Полученная кДНК была использована для амплификации кодирующей последовательности люциферазы, нуклеотидная и аминокислотная последовательности которой показаны в SEQ ID NOs: 79, 80. Кодирующая последовательность была клонирована в вектор pGAPZ (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя и трансформирована в компетентные клетки E.coli штамма XL1 Blue. Бактерии выращивали на чашках Петри в присутствии антибиотика зеоцина. Через 16 ч колонии были смыты с чашек, интенсивно перемешаны, и из них была выделена плазмидная ДНК с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия). Выделенная плазмидная ДНК была линеаризована по сайту рестрикции AvrII и использована для трансформации клеток Pichia pastoris GS115. Электропорация была проведена по методу с использованием ацетата лития и дитиотреитола, описанному в [Wu and Letchworth, Biotechniques, 2004, 36:152-4]. Электропорированные клетки были рассеяны на чашки Петри со средой RDB medium, содержащей 1 M сорбитола, 2% (вес/объем) глюкозы, 1.34% (вес/объем) дрожжевую основу азотного агара (YNB), 0.005% (вес/объем) смеси аминокислот, 0.00004% (вес/объем) биотина и 2% (вес/объем) агара. Полученные колонии опрыскивали раствором 3-гидроксигиспидина, детектируя присутствие в клетках люциферазы по появлению света. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США). Колонии, в которых детектировалось свечение в ответ на добавление 3-гидроксигиспидина отбирали для дальнейшей работы.

[0372] Далее амплифицированную суммарную кДНК из Neonothopanus nambi клонировали в вектор pGAPZ и трансформировали в компетентные клетки E.coli штамма XL1 Blue. Бактерии выращивали на чашках Петри в присутствии антибиотика зеоцина. Через 16 ч колонии были смыты с чашек, интенсивно перемешаны, и из них была выделена плазмидная ДНК с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия). Выделенная плазмидная ДНК была линеаризована по сайту рестрикции AvrII и использована для трансформации клеток дрожжей Pichia pastoris GS115, конститутивно экспрессирующих люциферазу Neonothopanus nambi. Трансформацию осуществляли методом электропорации как описано выше. Клетки были рассеяны на чашки Петри со средой RDB, содержащей 1 M сорбитола, 2% (вес/объем) глюкозы, 1.34% (вес/объем) дрожжевую основу азотного агара (YNB), 0.005% (вес/объем) смеси аминокислот, 0.00004% (вес/объем) биотина и 2% (вес/объем) агара. Разнообразие итоговой библиотеки кДНК Neonothopanus nambi в дрожжах составило порядка одного миллиона клонов. Полученные колонии опрыскивали раствором гиспидина, детектируя присутствие в клетках гиспидин-гидроксилазы по появлению света. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, США). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, экспрессирующие только люциферазу, и клетки дрожжей дикого типа. При скрининге библиотеки колонии, в которых детектировалось свечение, отбирали и использовали для ПЦР в качестве матрицы со стандартными плазмидными праймерами. Продукты ПЦР секвенировали по методу Сенгера, чтобы определить последовательность экспрессируемого гена. Полученная последовательность нуклеиновой кислоты гиспидин-гидроксилазы показана в SEQ ID NO: 1. Кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 2.

[0373] На Фиг. 4 показано свечение клеток Pichia pastoris, экспрессирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу или только люциферазу, или дрожжи дикого типа, при опрыскивании колоний 3-гидроксигиспидином (люциферин) и гиспидином (предлюциферин). Данные показывают, что в присутствии гиспидин-гидроксилазы в клетках образуется люциферин.

[0374] На следующем этапе из грибов Armillaria fuscipes, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Mycena chlorophos, Neonothopanus nambi, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius и Panellus stipticus была выделена геномная ДНК и проведено полногеномное секвенирование по технологии Illumina HiSeq (Illumina, США) согласно рекомендациям производителя. Результаты секвенирования были использованы для предсказания аминокислотных последовательностей гипотетических белков и использованы для поиска гомологов гиспидин-гидроксилазы из Neonothopanus nambi. Поиск гомологов осуществлялся с помощью программного обеспечения, предоставляемого National Center for Biotechnology Information. Был также проведен поиск аминокислотных последовательностей в данных геномного секвенирования грибов в базе данных NCBI Genbank. При поиске использовали стандартные параметры поиска blastp.В результате были идентифицированы последовательности гомологов гиспидин-гидроксилазы из Neonothopanus nambi - в Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos.

[0375] Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гомологов гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi показаны в SEQ ID NOs: 3-28.

[0376] Все выявленные ферменты по существу сходны друг с другом. Степень идентичности аминокислотных последовательностей показана в Таблице 4.

Таблица 4. Процент идентичности аминокислотных последовательностей полноразмерных природных белков гиспидин-гидроксилаз. SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:2 100 61 71 72 70 89 72 73 73 73 69 SEQ ID NO:4 61 100 50 48 48 63 49 51 50 50 45 SEQ ID NO:6 71 50 100 69 69 71 85 86 87 88 67 SEQ ID NO:6 72 48 69 100 76 72 71 72 72 72 71 SEQ ID NO:18 72 48 70 99 76 72 71 73 73 73 71 SEQ ID NO:8 70 48 69 76 100 71 70 70 71 71 73 SEQ ID NO:10 70 48 69 76 99 71 70 70 71 71 73 SEQ ID NO:14 89 63 71 72 71 100 72 75 73 74 71 SEQ ID NO:20 72 49 85 71 70 72 100 91 92 93 68 SEQ ID NO:22 73 51 86 72 70 75 91 100 93 93 69 SEQ ID NO:24 73 50 87 72 71 73 92 93 100 95 69 SEQ ID No:26 73 50 88 72 71 74 93 93 95 100 69 SEQ ID NO:28 69 45 67 71 73 71 68 69 69 69 100

[0377] Из Panellus stipticus и Mycena citricolor было выделено несколько высокогомологичных аминокислотных последовательностей гиспидин-гидроксилазы, отличающихся единичными аминокислотными заменами. Их нуклеотидные и аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NOs 7-13 (Panellus stipticus) и SEQ ID NOs 15-18 (Mycena citricolor). Дальнейшее исследование свойств указанных белков не выявило влияния этих замен на ферментативные свойства.

[0378] Кодирующие последовательности выявленных гомологов (SEQ ID NOs: 3-28) были клонированы и трансформированы в клетки Pichia pastoris GS115, конститутивно экспрессирующие люциферазу Neonothopanus nambi по описанному выше протоколу. Полученные колонии опрыскивали раствором гиспидина, детектируя присутствие в клетках гиспидин-гидроксилазы по появлению света. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США). Все колонии, экспрессирующие тестируемые гены (SEQ ID NOs: 3,5,7,9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25,27), производили в 1000-100000000 раз больше света при опрыскивании раствором гиспидина, чем контрольные клетки, что подтверждает способность ферментов, кодируемых протестированными генами, катализировать превращение гиспидина в 3-гидроксигиспидин (люциферин грибов).

[0379] Был проведен структурный анализ аминокислотных последовательностей выявленных ферментов. Анализ с помощью программного обеспечения SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), доступное в сети Интернет по адресу http://smart.embl-heidelberg.de [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P Nucleic Acids Res 2014; doi:10.1093/nar/gku949] выявил, что в состав всех выявленных белков входит FAD/NAD(P)-связывающий домен (FAD/NAD(P) binding domain, IPR002938 - код по публичной базе данных InterPro, доступной в сети Интернет по адресу http://www.ebi.ac.uk/interpro). Этот домен участвует в связывании ФАД и НАД у ряда ферментов, в частности, монооксигеназ - представителей крупного суперсемейства ферментов, добавляющих гидроксильную группу к субстрату и найденных в метаболических путях множества организмов. Выявленные гиспидин-гидроксилазы кроме FAD/NAD(P)-связывающего домена содержат оперативно связанные с ним N- и C-концевые аминокислотные последовательности (Фиг. 1). С помощью множественного выравнивания и сравнения аминокислотных последовательностей, выявленных гиспидин-гидроксилаз (Фиг. 1) было обнаружено, что они содержат в своем составе несколько консервативных аминокислотных мотивов (консенсусных последовательностей), характерных только для данной группы ферментов (SEQ ID NOs: 29-33). Консенсусные участки внутри аминокислотных последовательностей оперативно связаны через аминокислотные вставки.

Пример 2. Экспрессия гиспидин-гидроксилазы и люциферазы грибов в клетках млекопитающих и их совместное использование для мечения клеток

[0380] Кодирующие последовательности гиспидин-гидроксилазы и люциферазы из Neonothopanus nambi, полученные как описано в Примере 1, оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих (гуманизировали). Оптимизированные нуклеиновые кислоты (SEQ ID NOs: 99 и 100) получали синтетическим путем. Кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы клонировали в вектор pmKate2-keratin (Евроген, Россия), используя сайты рестрикции NheI и NotI вместо последовательности, кодирующий белок слияния mKate2-keratin. Последовательность люциферазы была амплифицирована с помощью ПЦР, обработана эндонуклеазами рестрикции NheI и EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, MA) и лигирована в лентивирусный вектор pRRLSIN.cPPT.EF1. Плазмидную ДНК очищали с помощью наборов для очистки плазмидной ДНК (Евроген). Плазмидная ДНК, содержащая ген люциферазы, была использована для создания стабильно экспрессирующих линий HEK293NT. Векторные частицы были получены кальциево-фосфатной трансфекцией (Invitrogen, Carlsbad, CA) клеток HELK293T согласно протоколу, указанному на сайте производителя. За 24 часа до трансфекции 1 500 ООО клеток были посажены в 60-мм культуральную чашку. Для трансфекции использовали около 4 и 1.2 мкг упаковочных плазмид pR8.91 и pMD.G, а также 5 мкг трансферной плазмиды, содержащей последовательность люциферазы. Вирусные частицы были собраны спустя 24 часа после трансфекции, сконцентрированы в 10 раз и использованы для трансдукции клеток HEK293NT. Около 100% клеток HEK293NT стабильно экспрессировали люциферазу Neonothopanus nambi.

[0381] Полученные клетки подвергали повторной трансфекции вектором, содержащим кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы, с помощью трансфекционного реагента FuGENE HD (Promega, США) по протоколу производителя. Спустя 24 часа после трансфекции в среду добавляли гиспидин в концентрации 800 мкг/мл, и детектировали свечение клеток с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer). Полученные клетки испускали свет с интенсивностью более чем на два порядка превышающей сигнал, исходящий от нетрансфицированных контрольных клеток (Рис. 5).

[0382] Клетки визуализировали в проходящем свете, в канале для детекции зеленой люминесценции. Экспрессия гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi в клетках человека приводила к появлению отчетливого светового сигнала в зеленой области спектра в присутствии гиспидина, позволяющего отличить трансфицированные клетки от нетрансфицированных.

Пример 3. Использование гиспидин-гидроксилазы с аналогами гиспидина в клеточном лизате

[0383] Клетки HEK293NT, экспрессирующие люциферазу и гиспидин-гидроксилазу Neonothopanus nambi, полученные как описано в Примере 2, смывали с чашек Петри спустя 24 часа после трансфекции с помощью раствора Версена с добавлением 0.025% трипсина, меняли среду на фосфатно-солевой буфер с pH 8.0 центрифугированием, ресуспендировали клетки, лизировали ультразвуком в приборе Bioruptor (Diagenode, Бельгия) в течение 7 минут при температуре 0°C в условиях, рекомендованных производителем, а в среду добавляли 1 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, США), а также гиспидин или один из его аналогов:

(E)-4-гидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-он, (E)-6-(2-(1H-индол-3-ил)винил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, или (E)-4-гидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он в концентрации 660 мкг/мл. Спектры биолюминесценции детектировали с помощью спектрофлюориметра Varian Cary Eclipse. Испускание света в лизатах наблюдалось при добавлении всех указанных функциональных аналогов гиспидина. В зависимости от используемого люциферина наблюдалось ожидаемое смещение максимума люминесценции.

Пример 4. Получение рекомбинантных гиспидин-гидроксилаз

[0384] На 5'-конец нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-3-гидроксилазы и люциферазу из Neonothopanus nambi, полученные как описано в примерах 1 и 2, была оперативно присоединена полигистидиновая последовательность (гис-таг). Полученные конструкции были клонированы в вектор pET-23 с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII. Вектор использовали для трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21-DE3. Клетки высевали на чашки Петри со средой LB, содержащей 1.5% агар, ампициллин 100 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 37°С.Колонии Escherichia coli затем переносили в 4 мл жидкой среды LB с добавлением ампициллина, инкубировали в течение ночи при покачивании при 37oC. 1 мл ночной культуры переносили в 100 мл среду Overnight Express Autoinduction medium (Novagen), в которую был предварительно добавлен ампициллин. Культуру растили при 37oC в течение 2.5 часов до достижения оптической плотности 0.6 ОЕ при 600 нм, а затем растили на комнатной температуре в течение 16 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20 минут в центрифуге Eppendorf 5810R, ресуспендировали в 35 мл буфера (50 мМ Тris HCl рН 8.0, 150 мМ NaCl). Клетки разрушали ультразвуком и снова центрифугировали. Для очистки рекомбинантных белков использовали металл-аффинную хроматографию на смоле TALON (Clontech, США). Наличие ожидаемого рекомбинантного продукта подтверждали с помощью электрофореза.

[0385] Аликвоты выделенных рекомбинантных гиспидин-гидроксилаз использовали для проверки функциональности и стабильности. Для определения функциональности 15 мкл раствора выделенного рекомбинантного белка вносили в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0), 0.5 мкл очищенной рекомбинантной люциферазы Neonothopanus nambi, 1 мМ НАДФН и 0.2 мкМ гиспидина. Пробирку помещали в люминометр. Активность выделенных рекомбинантных белков приводила к испусканию света при соединении с гиспидином и его аналогами, описанными в примере 3, в присутствии люциферазы Neonothopanus nambi. Во всех случаях интенсивность испускаемого света при использовании гиспидина была наибольшей при использовании гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, и наименьшей - у гиспидин-гидроксилазы Armillaria mellea.

Пример 5. Получение 3-гидроксигиспидина, (Е)-3,4-дигидрокси-6-стирил-2H-пиран-2-она и (Е)-3,4-дигидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-она с использованием рекомбинантной гиспидин-гидроксилазы

[0386] Выделенную рекомбинантную гиспидин-гидроксилазу из Neonothopanus nambi, полученную как описано в Примере 4, добавляли к реакционным смесям, содержащим 1 мМ НАДФН и 0.2 мкМ гиспидина, (Е)-4-гидрокси-6-стирил-2H-пиран-2-она или (Е)-4-гидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-она в 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0). Через 30 минут реакционную смесь анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя синтетические люциферины в качестве стандартов. Хроматография продемонстрировала возникновение пиков, соответствующих гидроксилированным по третьему положению производным: 3-гидроксигиспидину, (Е)-3,4-дигидрокси-6-стирил-2H-пиран-2-ону и (Е)-3,4-дигидрокси-6-(4-гидрокси-стирил)-2H-пиран-2-ону.

Пример 6. Детекция биолюминесценции с помощью белка слияния гиспидин-гидроксилазы и люциферазы

[0387] Гуманизированные последовательности ДНК, кодирующие гиспидин-гидроксилазу и люциферазу Neonothopanus nambi, полученные как описано в Примере 2, оперативно сшивали друг с другом посредством гибкого короткого пептидного линкера с аминокислотной последовательностью GGSGGSGGS (SEQ ID NOs:115). Последовательности нуклеотидов и аминокислот полученного химерного белка показаны в SEQ ID NO 101 и 102. Нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный белок, клонировали в вектор pEGFP-N1 (Clontech, США) вместо гена EGFP под контроль цитомегаловирусного промотора. Полученную конструкцию трансфицировали в клетки HEK293T. Также в качестве контроля котрансфицировали аналогичные векторы, содержащие гены гиспидин-гидроксилазы и люциферазы по-отдельности. Трансфекцию проводили с помощью трансфекционного агента FuGENE HD (Promega, USA) по протоколу производителя. Через 24 часа после трансфекции 1 млн клеток ресуспендировали в 0,5 мл PBS и регистрировали люминесценцию без добавления гиспидина и с добавлением гиспидина (10 мкг на 1 млн клеток) с помощью люминометра. Добавление гиспидина приводило к появлению в клетках биолюминесценции в зеленой области спектра (Фиг. 6). К появлению биолюминесцентного сигнала также приводило и добавление 3-гидроксигиспидина. Экспрессия белков слияния гиспидин-гидроксилазы с люциферазой вместо одной люциферазы позволяет использовать более стабильные предшественники люциферина (гиспидин, бисноръянгонин и другие) для биолюминесцентного мечения клеток и не требует котрансфекции двух нуклеиновых кислот в клетки.

Пример 7. Приготовление поликлональных антител

[0388] Кодирующие последовательности гиспидин-гидроксилаз Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 1) и Armillaria mellea (SEQ ID NO: 19) были синтетически получены в виде линейной двуцепочечной ДНК и клонированы в экспрессионные векторы pQE-30 (Qiagen, Германия) таким образом, что рекомбинантные белки содержали на N-конце гистидиновую метку. После экспрессии в E.coli, рекомбинантные белки были очищены с помощью металл-аффинной смолы TALON (Clontech, США) в денатурирующих условиях. Препараты очищенного белка, эмульсифицированные в адъюванте Фрейнда, были использованы для четырех иммунизаций кроликов с месячными интервалами. Кровь кроликов отбирали на десятый или одиннадцатый дни после иммунизаций. Активность полученных поликлональных антисывороток проверяли с помощью методов ELISA и Вестерн-иммуноблоттинга на панели очищенных рекомбинантных гиспидин-гидроксилаз, полученных как описано в примере 4.

[0389] Антитела, полученные при иммунизации кролика белком из Neonothopanus nambi, демонстрировали активность против денатурированной и неденатурированной гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi и против денатурированной гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus gardneri.

Антитела, полученные при иммунизации кролика белком из Armillaria mellea были активны против денатурированных и неденатурированных гиспидин-гидроксилаз из Armillaria mellea, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae и Armillaria fuscipes.

Пример 8. Получение трансгенных растений, экспрессирующих гиспидин-гидроксилазу и люциферазу Neonothopanus nambi

[0390] Кодирующие последовательности гиспидин-гидроксилазы и люциферазы Neonothopanus nambi были оптимизированы для экспрессии в клетках мха Physcomitrella patens. Затем in silico была создана кассета экспрессии, содержащая промотор гена aktI риса, 5'-нетранслируемую область цитомегаловируса человека, кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы, оптимизированную для экспрессии в клетках растений (SEQ ID NO 103), стоп-кодон, последовательность терминатора из гена osc агробактерии Agrobacterium tumefaciens, промотор убиквитина риса, оптимизированную для экспрессии в клетках мха кодирующую последовательность люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO 112), терминатор из гена nos агробактерии Agrobacterium tumefaciens.

[0391] Полученная последовательность была синтезирована, таким образом, что все указанные фрагменты оказались оперативно сшиты между собой, и клонирована с помощью методики Gibson assembly [Gibson et al., Nat Methods, 2009, 6:343-5] в экспрессионный вектор pLand#1 (Institut Jean-Pierre Bourgin, Франция), между фрагментами ДНК, совпадающими с локусом геномной ДНК мха Physcomitrella patens между последовательностями высокоэкспрессируемых генов мха Pp3c16_6440V3.1 и Pp3c16_6460V3.1. Вектор pLand#1 также содержал последовательность гидовой РНК (sgRNA) для нуклеазы Cas9, комплементарную участку того же локуса ДНК.

[0392] Препарат плазмидной ДНК был котрансформирован вместе с экспрессионным вектором, содержащим последовательность нуклеазы Cas9 под промотором убиквитина Arabidopsis thaliana, в протопласты мха Physcomitrella patens согласно протоколу полиэтиленгликольной трансформации, описанному в [Cove et al., Cold Spring Harb Protoc., 2009, 2]. Протопласты затем инкубировали в среде BCD в течение двух дней в темноте при покачивании с интенсивностью 50 об/мин для регенерации клеточной стенки. Протопласты затем переносили на чашки Петри, содержащие агар и среду BCD и выращивали при 16-часовом освещении в течение недели. Трансформированные колонии мха скринировали с внешних геномных праймеров с помощью ПЦР для определения успешности интеграции генетической конструкции в геном, переносили на свежие чашки Петри и выращивали в тех же условиях освещения в течение 30 дней.

[0393] Полученные гаметофиты мха вымачивали в среде BCD, содержащей гиспидин в концентрации 900 мкг/мл, и анализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Все проанализированные трансгенные растения демонстрировали биолюминесценцию с интенсивностью, как минимум на два порядка превышающую интенсивность сигнала контрольных растений, экспрессирующих только люциферазу, инкубированных в том же растворе с гиспидином.

Пример 9. Идентификация гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз

[0394] Предшественники люциферина грибов, такие как гиспидин, относятся к большой группе химических соединений - производных поликетидов. Такие соединения могут быть теоретически получены из 3-арилакриловых кислот, в которых заместителем по третьему положению являются ароматические заместители, в том числе арил или гетероарил. Из уровня техники известно, что ферменты, вовлеченные в синтез поликетидов и их производных у различных организмов, представляют собой многодоменные комплексы, относящиеся к белковому суперсемейству поликетидсинтаз. В то же время из уровня техники не было известно ни одной поликетидсинтазы, способной осуществлять катализ реакции превращения 3-арилакриловой кислоты в замещенный 4-гидрокси-2H-пиран-2-он. Для поиска целевой поликетидсинтазы был использован скрининг библиотеки кДНК из Neonothopanus nambi.

[0395] Известно, что для получения функциональных поликетидсинтаз в дрожжевой системе гетерологической экспрессии необходимо дополнительно ввести в культуру ген, экспрессирующий 4'-фосфопантотеинил трансферазу - фермент, осуществляющий перенос 4-фосфопантетеинила от кофермента А на серин в ацилпереносящем домене поликетидсинтазы [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. Ген 4'-фосфопантотеинил трансферазы NpgA из Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs 104, 105), известный из уровня техники, был получен синтетическим путем и клонирован в вектор pGAPZ. Плазмида была линеаризована по сайту рестрикции AvrII и использована для трансформации линии дрожжей Pichia pastoris GS115, конститутивно экспрессирующих люциферазу и гиспидин-гидроксилазу Neonothopanus nambi, полученнной как описано в Примере 1. Разнообразие итоговой библиотеки кДНК Neonothopanus nambi в дрожжах составило порядка одного миллиона клонов.

[0396] Библиотеку кДНК из Neonothopanus nambi, экспрессированную в указанной линии дрожжей Pichia pastoris, получали по протоколу, приведенному в Примере 1 и использовали для идентификации гиспидин-синтаз и кофеилпируват-гидролаз. Клетки были рассеяны на чашки Петри со средой RDB medium, содержащей 1 M сорбитола, 2% (вес/объем) глюкозы, 1.34% (вес/объем) дрожжевую основу азотного агара (YNB), 0.005% (вес/объем) смеси аминокислот, 0.00004% (вес/объем) биотина и 2% (вес/объем) агара.

[0397] Для идентификации гена гиспидин-синтазы полученные колонии опрыскивали раствором кофейной кислоты (потенциального предшественника гиспидина), детектируя присутствие в клетках гиспидин-синтазы по появлению света. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, экспрессирующие только люциферазу и гиспидин-гидроксилазу, и клетки дрожжей дикого типа. При скрининге библиотеки колонии, в которых детектировалось свечение, отбирали и использовали для ПЦР в качестве матрицы со стандартными плазмидными праймерами. Продукты ПЦР секвенировали по методу Сенгера, чтобы определить последовательность экспрессируемого гена. Полученная последовательность нуклеиновой кислоты гиспидин-синтазы показана в SEQ ID NO: 34. Кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 35.

[0398] Полученную линию дрожжей Pichia pastoris, содержащую интегрированные в геном гены люциферазы, гиспидин-гидроксилазы и гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi, а также ген 4'-фосфопантотеинил трансферазы NpgA из Aspergillus nidulans, использовали далее для идентификации фермента, катализирующего превращение оксилюциферина ((2Е,5Е)-6-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновой кислоты) в кофейную кислоту. Линию клеток снова трансформировали линеаризованной плазмидной библиотекой генов Neonothopanus nambi, полученной на первом этапе работы. Колонии опрыскивали раствором кофеилпирувата, детектируя присутствие в клетках целевого фермента по появлению света. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, экспрессирующие только люциферазу и гиспидин-гидроксилазу, и клетки дрожжей дикого типа. При скрининге библиотеки колонии, в которых детектировалось свечение, отбирали и использовали для ПЦР в качестве матрицы со стандартными плазмидными праймерами. Продукты ПЦР секвенировали по методу Сенгера, чтобы определить последовательность экспрессируемого гена. Полученная последовательность нуклеиновой кислоты выделенного фермента показана в SEQ ID NO: 64. Кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 65. Выявленный фермент получил название кофеилпируват-гидролаза.

Пример 10. Идентификация гомологов гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi и кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi

[0399] Для поиска гомологов гиспидин синтазы и кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi использовали данные полногеномного секвенирования из биолюминесцентных грибов, полученные как описано в Примере 1. Поиск гомологов осуществлялся с помощью программного обеспечения, предоставляемого National Center for Biotechnology Information. Был также проведен поиск аминокислотных последовательностей в данных геномного секвенирования грибов в базе данных NCBI Genbank. При поиске использовали стандартные параметры поиска blastp.

[0400] Были идентифицированы последовательности гомологов гиспидин-синтазы из Neonothopanus nambi - в Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos. Их нуклеотидные и аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NO 36-55. Все выявленные ферменты были по существу сходны друг с другом. Степень идентичности аминокислотных последовательностей показана в Таблице 5.

Таблица 5. Процент идентичности аминокислотных последовательностей полноразмерных природных белков гиспидин-синтаз SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:35 100 56 57 56 51 81 57 50 57 57 SEQ ID NO:53 56 100 80 52 45 55 88 46 88 88 SEQ ID NO:43 57 80 100 52 47 56 83 45 85 86 SEQ ID NO:45 56 52 52 100 53 54 52 54 53 53 SEQ ID NO:37 51 45 47 53 100 51 46 51 47 47 SEQ ID NO:41 81 55 56 54 51 100 55 50 56 56 SEQ ID NO:55 57 88 83 52 46 55 100 46 90 91 SEQ ID NO:47 50 46 45 54 51 50 46 100 46 46 SEQ ID NO:49 57 88 85 53 47 56 90 46 100 95 SEQ ID NO:51 57 88 86 53 47 56 91 46 95 100

[0401] Из Panellus stipticus было выделено две высокогомологичные аминокислотные последовательности гиспидин-синтаз, отличающиеся единичной аминокислотной заменой. Их нуклеотидные и аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NO 36-39.

[0402] Выявленные ферменты были проверены на способность осуществлять реакцию превращения кофейной кислоты в гиспидин с помощью способа, описанного в примере 9.

[0403] Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей выявленных белков позволило идентифицировать несколько высокогомологичных фрагментов аминокислотной последовательности, характерных для данной группы ферментов. Консенсусные последовательности для этих фрагментов показаны в SEQ ID NOs: 70-77. Указанные последовательности разделены протяженными аминокислотными последовательностями как показано на Фиг. 2.

[0404] Последовательности гомологов кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi были идентифицированы в Neonothopanus gardneri, Armillaria mellea, Armillaria fuscipes, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae Нуклеотидные и аминокислотные последовательности выявленных гомологов показаны в SEQ ID NOs: 66-75. Выявленные ферменты были проверены на способность осуществлять реакцию превращения кофеилпирувата в кофейную кислоту с помощью способа, описанного в Примере 9.

[0405] Все выявленные ферменты по существу сходны друг с другом и имеют длину 280-320 аминокислот.Степень идентичности аминокислотных последовательностей показана в Таблице 6.

Таблица 6. Процент идентичности аминокислотных последовательностей полноразмерных природных белков кофеиллпируват-гидролаз. SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:73 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:71 SEQ ID NO:65 100 64 64 64 64 64 SEQ ID NO:73 64 100 92 62 96 95 SEQ ID NO:75 64 92 100 62 90 90 SEQ ID NO:67 64 62 62 100 60 61 SEQ ID NO:69 64 96 90 60 100 97 SEQ ID NO:71 64 95 90 61 97 100

[0406] Анализ с помощью программного обеспечения SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), доступное в сети Интернет по адресу http://smart.embl-heidelberg.de [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P Nucleic Acids Res 2014; doi:10.1093/nar/gku949] выявил, что в состав выявленных ферментов входит расположенный ближе к С-концу фумарилацетазный домен (EC 3.7.1.2) длиной около 200 аминокислот, однако консервативная область начинается примерно с 8 аминокислоты согласно нумерации аминокислот кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi. Множественное выравнивание позволило выявить консенсусные последовательности (SEQ ID NOs 76-78), характерные для данной группы белков, разделенные аминокислотными вставками с более низкой идентичностью. Положение консенсусных последовательностей показано на (Фиг. 3).

Пример 11. Получение рекомбинантных гиспидин-синтазы и кофеилпируват-гидролазы и их использование для получения биолюминесценции

[0407] На 5'-концы нуклеиновых кислот, кодирующих гиспидин-синтазу и кофеилпируват-гидролазу Neonothopanus nambi, полученных как описано в примере 9, была оперативно присоединена последовательность, кодирующая полигистидин (гис-таг), и полученные конструкции были клонированы в вектор pET-23 с помощью эндонуклеаз рестрикции NotI и SacI. Векторы использовали для трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21-DE3-codon+, которую осуществляли электропорацией. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри со средой LB, содержащей 1.5% агар, ампициллин 100 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 37°С.Колонии Escherichia coli затем переносили в 4 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, инкубировали в течение ночи при покачивании при 37°С.1 мл ночной культуры переносили в 200 мл среды Overnight Express Autoinduction medium (Novagen), в которую был предварительно добавлен ампициллин. Культуру инкубировали при 37°С в течение 3 часов до достижения оптической плотности 0.6 ОЕ при 600 нм, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20 минут в центрифуге Eppendorf 5810R, ресуспендировали в 20 мл буфера (50 мМ Тris HCl рН 8.0, 150 мМ NaCl), лизировали ультразвуком в приборе Bioruptor (Diagenode, Бельгия) в течение 7 минут при температуре 0°C в условиях, рекомендованных производителем, и снова центрифугировали. Белок из лизата получали с помощью аффинной хроматографии на смоле Talon (Clontech, США). Наличие ожидаемого рекомбинантного продукта подтверждали с помощью электрофореза по наличию полос ожидаемой длины.

[0408] Аликвоты выделенных рекомбинантных белков использовали для проверки функциональности.

[0409] Для определения функциональности гиспидин-синтазы 30 мкл раствора выделенного рекомбинантного белка вносили в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0, все компоненты - Sigma-Aldrich, США), 0.5 мкл очищенной рекомбинантной люциферазы Neonothopanus nambi, полученной как описано в Примере 4, 1 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, США), 15 мкл очищенной рекомбинантной гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, полученной как описано в Примере 4, 10 мМ АТФ (ThermoFisher Scientific, США), 1 мМ КоА (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ Малонил-КоА (Sigma-Aldrich, США). Пробирку помещали в люминометр GloMax 20/20 (Promega, США). Реакционные смеси демонстрировали биолюминесцентное свечение при добавлении в раствор 20 мкМ кофейной кислоты (Sigma-Aldrich, США). Испускаемый свет обладал максимумом эмиссии в области 520-535 нм.

[0410] Для определения функциональности кофеилпируват-гидролазы 10 мкл раствора выделенного рекомбинантного белка вносили в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0), 0.5 мкл люциферазы Neonothopanus nambi, 1 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, США), 15 мкл гиспидин-гидроксилазы, 10 мМ АТФ (ThermoFisher Scientific, США), 1 мМ КоА (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ Малонил-КоА (Sigma-Aldrich, США), 30 мкл очищенной рекомбинантной гиспидин-синтазы. Пробирку помещали в люминометр GloMax 20/20 (Promega, США). Биолюминесцентное свечение реакционной смеси детектировалось при добавлении в раствор 25 мкМ кофеилпирувата, свидетельствуя о способности тестируемого фермента разлагать кофеилпируват до кофейной кислоты. Испускаемый свет обладал максимумом эмиссии в области 520-535 нм.

[0411] Полученные ферменты использовали для получения свечения (биолюминесценции) в реакции с люциферазой и гиспидин-гидроксилазой Neonothopanus nambi, полученными как описано в Примере 4. По 5 мкл раствора каждого выделенного рекомбинантного белка вносили в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0), 1 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, США), 10 мМ АТФ (ThermoFisher Scientific, США), 1 мМ КоА (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ малонил-КоА (Sigma-Aldrich, США) и 0.2 мкМ одной из 3-арилакриловых кислот: паракумаровой кислоты (Sigma-Aldrich, США), коричной кислоты (Sigma-Aldrich, США) или феруловой кислоты (Abcam, США). В другом эксперименте в пробирку вместо замещенной 3-арилакриловой кислоты добавляли аналоги оксилюциферина грибов - (2Е,5Е)-2-гидрокси-6-(4-гидроксифенил)-4-оксогекса-2,5-диеновую, (2Е,5Е)-2-гидрокси-4-оксо-6-фенилгекса-2,5-диеновую, или (2Е,5Е)-2-гидрокси-6-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-4-оксогекса-2,5-диеновую кислоты - также в концентрации 0.2 мкМ. Пробирки помещали в люминометр. Активность выделенных рекомбинантных белков приводила к испусканию света в каждой из описанных реакций.

Пример 13. Получение гиспидина из кофейной кислоты

[0412] Кассета экспрессии, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs 34, 35), под контролем конститутивного промотора J23100, и кассета экспрессии, содержащая ген 4'-фосфопантотеинил трансферазы NpgA из Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs 104, 105) под контролем промотора araBAD, фланкированные участками гомологии к сайту SS9 были получены синтетическим путем и клонированы в бактериальный экспрессионный вектор, содержащий кассету устойчивости к зеоцину. Полученную конструкцию использовали для трансформации и интеграции в геном E.coli BW25113 при помощи рекомбинации, опосредованной белками бактериофага лямбда как описано в Bassalo et al. [ACS Synth Biol. 2016 Jul 15;5(7):561-8], с использованием отбора на устойчивость к зеоцину. Интеграцию полноразмерной конструкции подтверждали с помощью ПЦР с праймеров, специфичных к участкам гомологии SS9, а затем убеждались в корректности интегрированной конструкции секвенированием ПЦР-продукта геномной ДНК по методу Сэнгера.

[0413] Полученный штамм E.coli использовали для получения гиспидина. На первой этапе, бактерии культивировали в пяти 50-мл пластиковых пробирках в среде LB в течение 10 часов при покачивании 200 оборотов в минуту при 37°C. 250 мл полученной культуры добавляли к 3.3 литрам ферментационной среды в ферментер Biostat B5 (Braun, Германия) так, что начальная оптическая плотность культуры при 600 нм составляла около 0.35. Ферментационная среда содержала 10 г/л пептона, 5 г/л кофейной кислоты, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 25 г/л глюкозы, 15 г/л (NH4)2SO4, 2 г/л KH₂PO₄, 2 г/л MgSO4·7×H₂O, 14.7× мг/л CaCl₂, 0.1 мг/л тиамина, 1.8 мг/л, и 0.1% раствора следующего состава: ЭДТА 8 мг/л, CoCl₂·6×H₂O 2.5 мг/л, MnCl₂·4H₂O 15 мг/л, CuCl₂·2H₂O 1.5 мг/л, H₃BO3 3 мг/л, Na₂MoO4·2H₂O 2.5 мг/л, Zn(CH₃COO)2·2H₂O 13 мг/л, цитрат железа(III) 100 мг/л, гидрохлорида тиамина 4.5 мг/л. Ферментацию осуществляли при 37×°C, с аэрацией 3×л/мин и перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Спустя 25 часов культивирования к культуре добавляли арабинозу до финальной концентрации 0.1×мМ. pH контролировали автоматически добавлением NH4OH, доводя pH до значения 7.0. Раствор, содержащий глюкозу 500 г/л, кофейную кислоту 5 г/ л, арабинозу 2 г/л, триптон 25 г/л, дрожжевой экстракт 50 г/л, MgSO4·7H₂O 17.2 г/л, (NH4)SO4 7.5 г/л, аскорбиновую кислоту 18 г/л, добавляли в ферментер для поддержания уровня глюкозы каждый раз при повышении pH до 7.1. Спустя 56 часов культивирования концентрация гиспидина в среде составляла 1.23×г/л. Среда из ферментера, а также очищенный из нее с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии гиспидин, обладали активностью в биолюминесцентной реакции с гиспидин-гидроксилазой и люциферазой Neonothopanus nambi.

Пример 13. Получение 3-гидроксигиспидина из кофейной кислоты

[0414] Кассета экспрессии, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs 1, 2) под контролем промотора J23100, была получена синтетически и клонирована в бактериальный экспрессионный вектор, содержащий ген устойчивости к спектиномицину. Полученный вектор трансформировали в клетки E.coli, экспрессирующие гиспидин-синтазу Neonothopanus nambi, ген устойчивости к зеоцину и ген NpgA, полученные как описано в примере 12. Полученные бактерии использовали для получения 3-гидроксигиспидина путем ферментации, по протоколу, описанному в Примере 12, однако с добавлением спектиномицина в концентрации 50 мг/мл во все используемые для культивирования среды. Спустя 48 часов культивирования концентрация 3-гидроксигиспидина в среде составляла 2.3×г/л. Среда из ферментера, а также очищенный из нее с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии 3-гидроксигиспидин, обладали активностью в биолюминесцентной реакции с люциферазой Neonothopanus nambi.

Пример 14. Получение гиспидина из метаболитов клетки и тирозина

[0415] Для производства биосинтетического гиспидина из тирозина был получен штамм E.coli, эффективно производящий тирозин и кофейную кислоту. Штамм E.coli был получен как описано в [Lin и Yan. Microb Cell Fact. 2012 Apr 4;11:42]. За основу для создания штамма была взята линия E.coli BW25113 с интегрированным мутантным геном пермеазы lacY (lacY A177C) по сайту attB, обеспечивающим равномерное потребление арабинозы клетками бактерий. Кассеты экспрессии, содержащие кодирующие последовательности генов тирозин-аммоний-лиазы Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107), и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E.coli (SEQ ID NOs: 108-111), каждый под контролем конститутивного промотора J23100, были получены синтетически и интегрированы в геном штамма E.coli, как описано в Примере 12. На следующем этапе в геном E.coli интегрировали плазмиду, полученную как описано в Примере 12 и содержащую кодирующую последовательность гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi под контролем конститутивного промотора J23100, кассету устойчивости к зеоцину из вектора pGAP-Z, а также ген NpgA. Интеграцию в геном E.coli осуществляли при помощи рекомбинации, опосредованной белками бактериофага лямбда, по методике из [Bassalo et al., ACS Synth Biol. 2016; 5(7):561-568]. Интеграцию полноразмерной конструкции подтверждали с помощью ПЦР с праймеров, специфичных к участкам гомологии SS9 (5'-CGGAGCATTTTGCATG-3' и 5'-TGTAGGATCAAGCTCAG-3'), а затем убеждались в корректности интегрированной конструкции секвенированием ПЦР-продукта геномной ДНК по методу Сэнгера. Полученный штамм бактерий использовали для получения биосинтетического гиспидина в ферментере.

[0416] Культивирование бактерий производили в ферментере, как описано в Примере 12, с единственным отличием - в среды для культивирования бактерий не добавляли кофейную кислоту. Биосинтетический гиспидин выделяли из среды с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Созданный штамм был способен к производству 1.20 мг/л гиспидина за 50×часов ферментации. Чистота полученного препарат составила 97.3%. Добавление тирозина в среды для культивирования в концентрации 10 г/мл позволяло повысить выход гиспидина до 108.3 мг/мл.

Пример 15. Создание трансгенных автономно биолюминесцентных дрожжей Pichia pastoris

[0417] Для создания автономно биолюминесцентных дрожжей Pichia pastoris были синтезированы кассеты экспрессии, содержащие под контролем промотора GAP и терминатора tAOX1 кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 79, 80), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 1, 2), гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 64, 65), белка NpgA Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs: 104, 105), тирозин-аммоний-лиазы Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107), и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E.coli (SEQ ID NOs: 108-111). Каждая кассета экспрессии была фланкирована последовательностями узнавания рестриктазы BsmBI. Также синтетически были получены участки гомологии к гену MET6 Pichia pastoris (Uniprot F2QTU9), фланкированные сайтами рестриктазы BsmBI. Синтетическую ДНК обрабатывали рестриктазами BsmBI и объединяли в одну плазмиду по протоколу клонирования Golden Gate, описанному в [Iverson et al., ACS Synth Biol. 2016 Jan 15;5(1):99-103]. 10 фмоль каждого из фрагментов ДНК смешивали в реакции, содержащей однократный буфер для ДНК-лигазы (Promega, США), 20 единиц активности ДНК-лигазы (Promega, США), 10 единиц активности эндонуклеазы рестрикции в общем объеме 10 мкл. Полученную реакционную смесь помещали в амплификатор и инкубировали при температурах 16°C и 37°C по следующему протоколу: 25 циклов инкубации при 37°C в течение 1.5 мин и при 16°C - 3 мин, затем единовременная инкубация при 50°C в течение 5 мин, а затем единовременная инкубация при 80°C в течение 10 мин. 5 мкл реакционной смеси трансформировали в химически компетентные клетки E.coli. Корректность сборки плазмидной ДНК подтверждали секвенированием по методу Сенгера, и препарат очищенной плазмидной ДНК использовали для трансформации клеток Pichia pastoris GS11 электропорацией. Электропорация была проведена по методу с использованием ацетата лития и дитиотреитола, описанному в [Wu and Letchworth, Biotechniques, 2004, 36:152-4]. Электропорированные клетки были рассеяны на чашки Петри со средой RDB, содержащей 1 M сорбитола, 2% (w/v) глюкозы, 1.34% (w/v) дрожжевую основу азотного агара (YNB), 0.005% (w/v) смеси аминокислот, 0.00004% (w/v) биотина и 2% (w/v) агара. Интеграцию кассеты генов в геном подтверждали с помощью ПЦР с праймеров, отжигающихся на участки гомологии. Полученный штамм дрожжей, содержащий корректную вставку в геноме, был способен автономно производить свет, в отличие от штамма дрожжей дикого типа (Фиг. 7, 8).

Пример 16. Создание трансгенных автономно биолюминесцентных цветковых растений

[0418] Для создания автономно биолюминесцентных цветковых растений на основе вектора pBI121 (Clontech, США) был создан бинарный вектор для агробактериальной трансформации, содержащий оптимизированные для экспрессии в растениях кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 112), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 113), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114) и ген устойчивости к канамицину, каждый ген - под контролем промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты. Последовательности для сборки кассет экспрессии получали синтетическим путем, сборку вектора осуществляли по протоколу клонирования Golden Gate, описанному в [Iverson et al., ACS Synth Biol. 2016 Jan 15;5(1):99-103].

[0419] Arabidopsis thaliana трансформировали путем совместного культивирования ткани растения с бактериями Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащими созданный бинарный вектор. Трансформацию осуществляли, применяя совместное культивирование сегментов корней Arabidopsis thaliana (экотип С24), как описано [Valvekens et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540]. Корни растений арабидопсиса культивировали на агаризованной среде Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина в течении 3 дней. Затем корни нарезали на кусочки длиной 0,5 см и переносили в 10 мл жидкой среды Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина и добавляли 1,0 мл среды ночной культуры агробактерий. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводили в течении 2-3 минут.После этого экспланты помещали на стерильные фильтры в чашки Петри с агаризованной средой того же состава. Через 48 часов инкубации в термостате при температуре 25°C экспланты переносили на свежую среду с цефотаксимом 500 мг/л и канамицином 50 мг/л. Через три недели начинали регенерацию растений на селективной среде, содержащей канамицин 50 мг/л. Трансгенные растения укореняли и переносили в среду проращивания или на грунт.Биолюминесценцию визуализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Более 90% трансгенных растений испускали свет, как минимум на два порядка превышающий сигнал от растений дикого типа.

[0420] Nicotiana benthamiana трансформировали путем совместного культивирования ткани растения с бактериями Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащими созданный бинарный вектор. Трансформацию осуществляли, применяя совместное культивирование сегментов листьев Nicotiana benthamiana. Затем листья нарезали на кусочки длиной 0,5 см и переносили в 10 мл жидкой среды Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина и добавляли 1,0 мл среды ночной культуры агробактерий. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводили в течении 2-3 минут.После этого экспланты помещали на стерильные фильтры в чашки Петри с агаризованной средой того же состава. Через 48 часов инкубации в термостате при температуре 25°C экспланты переносили на свежую среду с цефотаксимом 500 мг/л и канамицином 50 мг/л. Через три недели начинали регенерацию растений на селективной среде, содержащей канамицин 50 мг/л. Трансгенные растения укореняли и переносили в среду проращивания или на грунт.Биолюминесценцию визуализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Более 90% трансгенных растений испускали свет, как минимум на два порядка превышающий сигнал от растений дикого типа. Фотографии автономно светящихся растений Nicotiana benthamiana приведены на Фиг. 9.

[0421] Для создания автономно биолюминесцентной полевицы побегоносной Agrostis stolonifera L. в вектор pBI121 (Clontech, США) клонировали кодирующие последовательности генов метаболического каскада люциферина гриба, оптимизированные для экспрессии в растениях и фланкированные сайтами эндонуклеазы рестрикции BsaI: люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 126), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 117), гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 127), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 128) и ген устойчивости к гербициду глифосату (ген bar). Каждая последовательность находилась под контролем промотора CmYLCV [Stavolone et al., Plant Mol Biol. 2003 Nov;53(5):663-73]. Последовательности синтезировали по стандартной методике. Сборка вектора осуществлялась по протоколу клонирования Golden Gate. Трансформацию проводили методом агробактериальной трансформации эмбриогенного калусса. В жидкую среду добавляли ночную культуру бактерий Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащую созданный бинарный вектор. После двух дней кокультивации на агаризованой среде Мурасиге-Скуга, растения переносили на свежую среду с добавлением цефотаксима 500 мг/л и фосфинотрицина 10 мг/л. Регенерация растений начиналась через три недели. Трансгенные растения пересаживали на среду с половинным содержанием солей Мурасиге-Скуга и фосфинотрицином 8 мг/л для укоренения. Укорененные растения высаживали в теплицу. Около 25% полученных растений с корректной и полной интеграцией в геном метаболического каскада, обладали биолюминесценцией, превышающей биолюминесценцию контрольных растений дикого типа.

[0422] Особый интерес представляют организмы, способные испускать свет в определенных тканях или в определенное время суток. Такие организмы более эффективно расходуют ресурсы, требуемые для излучения света. Для создания автономно биолюминесцентных роз, испускающих свет только в лепестках, были отобраны несколько разновидностей роз с белыми лепестками. На основе вектора pBI121 (Clontech, США) было создано два бинарных вектора для агробактериальной трансформации, содержащих метаболический каскад из оптимизированных для экспрессии в растениях кодирующих последовательностей люциферазы Neonothopanus nambi, гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi, кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi и гена устойчивости к неомицину. Все гены, кроме гена люциферазы, были помещены под контроль промотора вируса мозаики цветной капусты 35S. В одном из векторов ген люциферазы был помещен под контроль промотора халконсинтазы розы, а в другом - под контроль промотора UEP1 хризантемы. Использовались синтетические нуклеиновые кислоты, необходимые для сборки вектора, фланкированные сайтами узнавания рестриктазы BsaI, сборка вектора осуществлялась по протоколу клонирования Golden Gate. Трансгенные растения розы Rosa hybrida L. cv. Tinike получали путем совместного культивирования эмбриогенного каллуса с бактериями Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащим один из бинарных векторов, описанных выше. Культивирование проводили в жидкой среде, содержащей макро- и микро-соли Мурасиге-Скуга, с добавлением кинетина 1-2 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 3 мг/л и 6-бензиламинопурина 1 мг/л в течении 40 минут.Каллус переносили на агаризованную среду того же состава. Через два дня экспланты переносили на свежую среду Мурасиге-Скуга с добавлением цефотаксима 500 мг/л и канамицина 50 мг/л. Формирование и регенерация побегов происходила через 5-8 недель. Побеги переносили на среду размножения или укоренения. Укорененные побеги высаживали в теплицу в торфяную смесь. Цветение наблюдали через 8 недель. Растения с развитыми цветками визуализировали в IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Для каждой из протестированных конструкций, все протестированные растения автономно испускали свет, как минимум на три порядка превышающий сигнал от растений дикого типа. Свет исходил только из тканей лепестков, подтверждая тканеспецифичное функционирование промоторов.

[0423] Для создания автономно биолюминесцентных растений, в которых биолюминесценция регулируется циркадными ритмами и активируется в темное время суток использовали ранее полученный бинарный вектор для агробактериальной трансформации, содержащий кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi, гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi, кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi и ген устойчивости к канамицину, каждый ген - под контролем промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты. В нем заменяли промотор для экспрессии люциферазы Neonothopanus nambi на промотор гена CAT3 из Arabidopsis thaliana. Транскрипция с промотора гена CAT3 регулируется циркадными ритмами и активируется в вечернее время. Последовательность промотора CAT3 известна из уровня техники [Michael и McClung, Plant Physiol. 2002 Oct;130(2):627-38]. Arabidopsis thaliana трансформировали путем совместного культивирования ткани растения с бактериями Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащими созданный бинарный вектор. Трансформацию осуществляли, применяя совместное культивирование сегментов корней Arabidopsis thaliana (экотип С24), как описано [Valvekens et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540]. Корни растений арабидопсиса культивировали на агаризованной среде Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина в течении 3 дней. Затем корни нарезали на кусочки длиной 0,5 см и переносили в 10 мл жидкой среды Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина и добавляли 1,0 мл среды ночной культуры агробактерий. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводили в течении 2-3 минут.После этого экспланты помещали на стерильные фильтры в чашки Петри с агаризованной средой того же состава. Через 48 часов инкубации в термостате при температуре 25°C экспланты переносили на свежую среду с цефотаксимом 500 мг/л и канамицином 50 мг/л. Через три недели начинали регенерацию растений на селективной среде, содержащей канамицин 50 мг/л. Трансгенные растения укореняли и переносили в среду проращивания, растили в условиях естественной смены дня и ночи. Биолюминесценцию визуализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer), помещая растения в прибор на сутки и регистрируя интенсивность биолюминесценции каждые полчаса. Растения испускали свет в течение суток, однако интенсивность биолюминесценции значительно модулировалась циркадными ритмами: интегральная интенсивность свечения в темное время суток превышала интегральную светимость в течение дня более, чем в 1000 раз для 85% процентов проанализированных растений.

Пример 17. Создание трансгенных автономно биолюминесцентных низших растений

[0424] Автономно биолюминесцентный мох Physcomitrella patens был создан с помощью котрансформации протопластов плазмидами способом, описанным в Примере 8. Были синтетически получены кассеты экспрессии, включающие оптимизированные для экспрессии в растениях кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 112), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 113), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114) и ген устойчивости к канамицину, каждая под контролем промотора актина 2 риса. Кассеты экспрессии оперативно сшивали в векторе pBI121 (Clontech, США) таким образом, чтобы конструкция, включающая полный метаболический каскад и ген устойчивости к канамицину, оказались фланкированы последовательностями, совпадающими с последовательностью целевого локуса в геноме мха. Сборка вектора осуществлялась по протоколу клонирования Golden Gate [Iverson et al., ACS Synth Biol. 2016 Jan 15;5(1):99-103]. Также в вектор клонировали ген гидовой РНК, комплементарный целевому участку в геноме мха. Плазмида с перечисленными генами была котрансформирована с плазмидой для конститутивной экспрессии нуклеазы Cas9, согласно протоколу полиэтиленгликольной трансформации, описанному в [Cove et al., Cold Spring Harb Protoc., 2009, 2]. Полученные трансформированные протопласты инкубировали без света в течение суток в среде BG-11, а затем переносили на чашки Петри со средой BG-11 и 8.5% агаром. Спустя месяц после выращивания на чашках при непрерывном облучении светом, проводили визуализацию в IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). 70% протестированных растений испускали свет, как минимум на порядок превышающий сигнал от растений дикого типа.

Пример 18. Получение трансгенных люминесцентных животных

[0425] Трансгенные рыбы Danio rerio, содержащие ген гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, были созданы по методу, описанному в [Hisano et al., Sci Rep., 2015, 5:8841]. Методика включает экспрессию гидовой РНК и нуклеазы Cas9 для создания точечного разрыва в области, гомологичной последовательности гидовой РНК. Для создания трансгенных животных были заказаны синтетические фрагменты ДНК, содержащие последовательности гидовой РНК из плазмиды pX330, Addgene #42230 и мРНК нуклеазы Cas9 под контролем промотора полимеразы бактериофага T7. Полученные фрагменты использовали для транскрипции in vitro с помощью реагентов из набора MAXIscript T7 kit (Life Technologies, США), а синтезированную РНК очищали с помощью набора для выделения РНК (Евроген, Россия).

[0426] Кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, фланкированную 50-нуклеотидными последовательностями из гена krtt1c19e Danio rerio, описанные в [Hisano et al., Sci Rep., 2015, 5:8841] получали синтетическим путем и клонировали в основу плазмиды pEGFP/C1, содержащую ориджин репликации pUC и кассету устойчивости в канамицину. Полученный вектор, мРНК нуклеазы Cas9 и гидовая РНК были растворены в инъекционном буфере (40 мМ HEPES (pH 7.4), 240 мМ KCl с добавлением 0.5% фенолового красного) и инъецированы в 1-2-клеточные зародыши ранее полученной линии Danio rerio, стабильно экспрессирующей люциферазу Neonothopanus nambi, в объеме около 1-2 нл. Из 48 зародышей, около 12 зародышей пережили инъекцию и демонстрировали нормальное развитие на четвертый день после оплодотворения.

[0427] Для регистрации биолюминесцентного сигнала раствор гиспидина инъецировали внутривенно в личинки Danio rerio согласно методике, описанной в [Cosentino et al., J Vis Exp.2010; (42): 2079]. Биолюминесценцию регистрировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). После регистрации из личинок выделяли геномную ДНК для подтверждения интеграции гена гиспидин-гидроксилазы в геном. Все личинки с корректной интеграцией гена гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi в геном демонстрировали биолюминесценцию с интенсивностью, как минимум на два порядка превышающую интенсивность сигнала, исходящего от рыб дикого типа после инъекции раствора гиспидина.

Пример 19. Исследование влияния кофеилпируват-гидролазы на свечение автономно биолюминесцентных организмов

[0428] Для исследования влияния кофеилпируват-гидролазы на свечение автономно биолюминесцентных организмов использовали бинарный вектор для агробактериальной трансформации, содержащий кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi, гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi, кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi и ген устойчивости к канамицину, каждый ген - под контролем промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, полученный как описано в Примере 16 и контрольный вектор, отличающийся тем, что из него была удалена последовательность кофеилпируват-гидролазы. Векторы использовали для трансформации Arabidopsis thaliana в одинаковых условиях по протоколу, описанному в Примере 16. Биолюминесценцию визуализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Сравнение интенсивностей биолюминесценции растений, экспрессирующих все четыре гена биолюминесцентной системы Neonothopanus nambi, с растениями, экспрессирующими только люциферазу, гиспидин-гидроксилазу и гиспидин-синтазу, выявило, что растения, дополнительно экспрессирующие кофеилпируват-гидролазу обладают в среднем в 8.3 раза более яркой биолюминесценцией. Приведенные данные свидетельствуют о том, что экспрессия кофеилпируват-гидролазы позволяет увеличить эффективность биолюминесцентного каскада, что приводит к увеличению интенсивности испускаемого растениями света.

Пример 20. Влияние внешнего добавления кофейной кислоты на биолюминесценцию трансгенных организмов

[0429] Автономно биолюминесцентные трансгенные растения Nicotiana benthamiana, полученные как описано в Примере 16, переносили на грунт и культивированы в течение восьми недель. Затем стебель растений срезали и помещали на два часа в воду, после чего измеряли интенсивность биолюминесценции с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Затем растения переносили в один из пяти водных растворов с концентрацией кофейной кислоты 0.4 г/л, 0.8 г/л, 1.6 г/л, 3.2 г/л или 6.4 г/л, а контрольные растения помещали в воду. Спустя еще два часа инкубации в растворе кофейной кислоты или воде снова измеряли биолюминесценцию. Во всех случаях интенсивность биолюминесценции растений, инкубированных в растворе кофейной кислоты, повышалась по сравнению с интенсивностью до помещения в раствор кофейной кислоты, причем наибольшие изменения наблюдались для растений, прошедших инкубацию в растворе c концентрацией 6.4 г/л. Контрольные растения, инкубированные в воде, не демонстрировали значимого изменения интенсивности биолюминесценции в течение четырех часов после начала инкубации.

Пример 21. Использование генов биолюминесцентной системы грибов для анализа активности промоторов и внутриклеточной логической интеграции внешних сигналов.

[0430] Кодирующие последовательности гиспидин-синтазы, гиспидин-гидроксилазы и люциферазы Neonothopanus nambi были использованы для мониторинга одновременной активации нескольких промоторов. Синтетические кассеты экспрессии, содержащие кодирующую последовательность гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35) под контролем индуцируемого арабинозой промотора E.coli araBAD, кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы (SEQ ID NOs 1, 2) под контролем индуцируемого IPTG промотора T7/lacO, и ген люциферазы (SEQ ID NOs: 79, 80) под контролем индуцируемого рамнозой промотора pRha, а также ген NpgA (SEQ ID NOs: 104, 105) под контролем конститутивного промотора J23100 (Registry of Standard Biological parts, Part:BBa_J23100). Полученные синтетические нуклеиновые кислоты клонировали в вектор MoClo_Level2 [Weber et al., PLoS One. 2011 Feb 18;6(2):e16765] вместо вставки, содержащий ген LacZ, с помощью эндонуклеазы рестрикции BpiI. Полученный вектор трансформировали в компетентные клетки штамма E.coli BL21 (NEB, США), содержащие геномную копию полимеразы бактериофага T7.

[0431] Для определения возможность регистрации одновременной активации нескольких промоторов, клетки, полученные на предыдущем этапе, подращивали в течение ночи в колбе в среде LB объемом 100 мл c добавлением ампициллина в концентрации 100 мг/л. На следующий день аликвоты культуры клеток помещали на 120 минут при температуре 24°С и покачивании 200 оборотов в минуту в одну из сред следующего состава:

1. Среда LB с добавлением 1% арабинозы,

2. Среда LB с добавлением 0.2% рамнозы,

3. Среда LB с добавлением 0.5% IPTG,

4. Среда LB с добавлением 1% арабинозы и 0.2% рамнозы,

5. Среда LB с добавлением 1% арабинозы и 0.5% IPTG,

6. Среда LB с добавлением 0.2% рамнозы и 0.5% IPTG,

7. Среда LB с добавлением 1% арабинозы, 0.2% рамнозы и 0.5% IPTG,

8. Среда LB (контроль).

[0432] После инкубации клетки осаждали центрифугированием, заменяли среду на фосфатно-солевой буфер с pH 7.4 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением кофейной кислоты (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 1 г/л, клетки ресуспендировали пипетированием. Биолюминесценцию клеток анализировали через полчаса с помощью люминометра GloMax 20/20 (Promega, США). Эксперимент повторяли в трех повторностях. Из восьми проанализированных проб интенсивность биолюминесценции значимо отличалась от биолюминесценции контрольных бактерий, инкубированных в среде LB (среда №8), только для бактерий, прошедших инкубацию в среде №7 (среда LB с добавлением 1% арабинозы, 0.2% рамнозы и 0.5% IPTG). Таким образом, свечение бактерий позволяло судить о помещении бактерий в среду, обеспечивающую одновременную активацию трех различных промоторов. В поставленном эксперименте бактериальные клетки интегрировали информацию о присутствии во внешней среде индуцирующих активность промоторов веществ и сигнализировали свечением только в случае, когда все три вещества присутствовали в среде одновременно, внутриклеточно выполняя логическую операцию «И».

[0433] Синтетические кассеты экспрессии, содержащие (1) кодирующую последовательность гиспидин-гидроксилазы (SEQ ID NOs: 1, 2) под контролем промотора Odf2 по [Pletz et al., Biochim Biophys Acta. 2013 Jun;1833(6):1338-46]; (2) кодирующую последовательность гиспидин-синтазы (SEQ ID NOs: 34, 35) под контролем промотора циклин-зависимой киназы CDK7; (3) люциферазы (SEQ ID NOs: 79, 80) под контролем промотора гена CCNH клонировали в вектор pmKate2-keratin (Евроген, Россия) вместо последовательностей цитомегаловирусного промотора и вставки mKate2-keratin. Так же кодирующую последовательность гена NpgA (SEQ ID NOs: 104, 105) клонировали в вектор pmKate2-keratin вместо последовательности вставки mKate2-keratin. Все полученные векторы ко-трансфицировали в клетки HEK293T с помощью трансфекционного реагента FuGENE HD (Promega, США) по протоколу производителя. Спустя 24 часа после трансфекции в среду добавляли кофейную кислоту в концентрации 5 мг/мл, и детектировали свечение клеток с помощью микроскопа Leica TCS SP8. Испускание света позволило определить одновременную активацию промоторов Odf2, CCNH и CDK7, причем интенсивность испускаемого света была связана со стадией клеточного цикла.

[0434] Полученные данные свидетельствуют о том, что гены биолюминесцентной системы грибов можно применять для мониторинга одновременной активности нескольких промоторов, для детекции наличия в среде различных веществ и их комбинаций, а также для логической интеграции внешних сигналов внутри клетки.

Пример 22. Выявление гиспидина в растительных экстрактах

[0435] Кодирующие последовательности гиспидин-гидроксилазы и люциферазы Neonothopanus nambi, полученные как описано в Примере 1, были клонированы в вектор pET23 под контроль промотора T7. Препараты очищенной плазмидной ДНК были использованы для транскрипции и трансляции белков in vitro с помощью набора PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB, США). Полученную реакционную смесь использовали для анализа наличия и концентрации гиспидина и его функциональных аналогов в лизатах около 19 различных растений (Chrysanthemum sp., Ananas comosus, Petunia atkinsiana, Picea abies, Urtica dioica, Solanum lycopersicum, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tobacum, Arabidopsis thaliana, Rosa glauca, Rosa rubiginosa, Equisetum arvense, Equisetum telmateia, Polygala sabulosa, Rosa rugosa, Clematis tashiroi, Kalanchoe sp., Triticum aestivum, Dianthus caryophyllus), добавляя 2 мкл лизата растения к 100 мкл реакционной смеси и регистрируя интенсивность испускаемого света с помощью люминометра GloMax (Promega, США). Было определено, что максимальная концентрация гиспидина и его функциональных аналогов содержится в лизатах хвощей Equisetum arvense и Equisetum telmateia. Также гиспидин или его функциональные аналоги были обнаружены в лизатах Polygala sabulosa, Rosa rugosa и Clematis tashiroi.

Пример 23. Выявление PKS, способных катализировать синтез гиспидина, и их использование для получения гиспидина в системах in vitro и in vivo.

[0436] Предшественники люциферина грибов, такие как гиспидин, относятся к группе производных поликетидов. Из уровня техники известно, что ферменты, вовлеченные в синтез поликетидов в растениях относятся к белковому суперсемейству поликетидсинтаз, причем в отличие от поликетидсинтаз грибов, поликетидсинтазы растений являются сравнительно компактными белками, использующими в качестве субстрата КоА-эфиры кислот, в том числе 3-арилакриловых кислот.Из уровня техники не было известно ни одной поликетидсинтазы, способной осуществлять катализ реакции превращения КоА-эфира кофейной кислоты в гиспидин, однако гиспидин обнаруживается во многих растительных организмах.

[0437] С помощью биоинформатического анализа были отобраны потенциально способные катализировать синтез гиспидина 11 поликетидсинтаз из следующих источников:

Aquilaria sinensis (2 фермента),

Hydrangea macrophylla,

Arabidopsis thaliana,

Physcomitrella patens,

Polygonum cuspidatum,

Rheum palmatum,

Rheum tataricum,

Wachendorfia thyrsiflora,

Piper methysticum (два фермента).

[0438] Была проведена оптимизация выбранных нуклеотидных последовательностей для экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris и растения Nicotiana benthamiana. Полученные нуклеиновые кислоты были получены синтетическим путем, клонированы в вектор pGAPZ и использованы для проверки способности экспрессированных белков синтезировать гиспидин.

[0439] Для этого в геном линии дрожжей Pichia pastoris GS115, конститутивно экспрессирующих люциферазу и гиспидин-гидроксилазу Neonothopanus nambi, полученной как описано в Примере 1, была дополнительно введена плазмида pGAPZ содержащая ген кумарат-КоА-лигазы 1 Arabidopsis thaliana (последовательности нуклеотидов и аминокислот для нее показаны в SEQ ID NOs: 140, 141), также полученный с помощью олигонуклеотидного синтеза. Плазмида была линеаризована по сайту рестрикции AvrII и использована для трансформации в клетки Pichia pastoris GS115.

[0440] Полученные клетки дрожжей, конститутивно экспрессирующие люциферазу и гиспидин-гидроксилазу Neonothopanus nambi и кумарат-КоА-лигазу 1 Arabidopsis thaliana, трансфецировали линеаризованными плазмидами, содержащими кодирующие последовательности PKS, и рассевали на чашки Петри со средой RDB, содержащей 1 M сорбитола, 2% (вес/объем) глюкозы, 1.34% (вес/объем) дрожжевую основу азотного агара (YNB), 0.005% (вес/объем) смеси аминокислот, 0.00004% (вес/объем) биотина и 2% (вес/объем) агара. Для идентификации ферментов, обладающих активностью гиспидин-синтаз, полученные колонии опрыскивали раствором кофейной кислоты, детектируя присутствие в клетках гиспидин-синтазы по появлению биолюминесценции. Испускаемый колониями свет детектировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США). В качестве отрицательного контроля использовали линию дрожжей, конститутивно экспрессирующих люциферазу, гиспидин-гидроксилазу и кумарат-КоА-лигазу 1, а также клетки дрожжей дикого типа. Среди проанализированных генов, активностью гиспидин-синтаз обладали 11 ферментов, последовательность которых показана в SEQ ID NOs: 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138. Кодируемые ими аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 соответственно. Наибольшую активность проявляли ферменты из PKS1 и PKS2 из Aquilaria sinensis (SEQ ID NOs:119, 121), PKS из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:123) и PKS из Hydrangea macrophylla (SEQ ID NO:125).

[0441] Нуклеиновая кислота, кодирующая PKS из Hydrangea macrophylla (SEQ ID NOs: 124, 125) была использована для получения рекомбинантного белка по методике, описанной в Примере 4. Наличие ожидаемого рекомбинантного продукта подтверждали с помощью электрофореза по наличию полос ожидаемой длины. Аликвоты выделенного рекомбинантного белка использовали для проверки функциональности: 30 мкл раствора выделенного рекомбинантного белка вносили в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (0.2 M Na-фосфат буфера, 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM) pH 8.0, все компоненты - Sigma-Aldrich, США), 0.5 мкл очищенной рекомбинантной люциферазы Neonothopanus nambi, полученной как описано в Примере 4, 1 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, США), 15 мкл очищенной рекомбинантной гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi, полученной как описано в Примере 4, 10 мМ АТФ (ThermoFisher Scientific, США), 1 мМ КоА (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ Малонил-КоА (Sigma-Aldrich, США). Пробирку помещали в люминометр GloMax 20/20 (Promega, США). Реакционные смеси демонстрировали биолюминесцентное свечение при добавлении в раствор 20 мкМ кофеил-КоА. Испускаемый свет обладал максимумом эмиссии в области 520-535 нм.

[0442] Нуклеиновая кислота, кодирующая PKS2 из Aquilaria sinensis (SEQ ID NO:120, 121) была использована для получения штамма продуцента гиспидина. Для этого синтезировали кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту SEQ ID NO:120 под контролем конститутивного промотора J23100, и кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 140, кодирующую 4-кумарат-КоА-лигазу 1 из Arabidopsis thaliana, под контролем промотора araBAD; обе кассеты экспрессии фланкировали участками гомологии к сайту SS9. Кассеты экспрессии клонировали в бактериальный экспрессионный вектор, содержащий кассету устойчивости к зеоцину и использовали для трансформации и интеграции в геном E.coli BW25113 при помощи рекомбинации, опосредованной белками бактериофага лямбда как описано в Bassalo et al. [ACS Synth Biol. 2016 Jul 15;5(7):561-8], с использованием отбора на устойчивость к зеоцину. Интеграцию полноразмерной конструкции подтверждали с помощью ПЦР с праймеров, специфичных к участкам гомологии SS9, а затем убеждались в корректности интегрированной конструкции секвенированием ПЦР-продукта геномной ДНК по методу Сэнгера.

[0443] Полученный штамм E.coli использовали для получения гиспидина. На первой этапе, бактерии культивировали в пяти 50-мл пластиковых пробирках в среде LB в течение 10 часов при покачивании 200 оборотов в минуту при 37°C. 250 мл полученной культуры добавляли к 3.3 литрам ферментационной среды в ферментер Biostat B5 (Braun, Германия) так, что начальная оптическая плотность культуры при 600 нм составляла около 0.35. Ферментационная среда содержала 10 г/л пептона, 5 г/л кофейной кислоты, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 25 г/л глюкозы, 15 г/л (NH₄)₂SO₄, 2 г/л KH₂PO₄, 2 г/л MgSO₄·7×H₂O, 14.7× мг/л CaCl₂, 0.1 мг/л тиамина, 1.8 мг/л, и 0.1% раствора следующего состава: ЭДТА 8 мг/л, CoCl₂·6×H₂O 2.5 мг/л, MnCl₂·4H₂O 15 мг/л, CuCl₂·2H₂O 1.5 мг/л, H₃BO₃ 3 мг/л, Na₂MoO4·2H₂O 2.5 мг/л, Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 13 мг/л, цитрат железа(III) 100 мг/л, гидрохлорида тиамина 4.5 мг/л. Ферментацию осуществляли при 37°C, с аэрацией 3×л/мин и перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Спустя 25 часов культивирования к культуре добавляли арабинозу до финальной концентрации 0.1×мМ. pH контролировали автоматически добавлением NH4OH, доводя pH до значения 7.0. Раствор, содержащий глюкозу 500 г/л, кофейную кислоту 5 г/ л, арабинозу 2 г/л, триптон 25 г/л, дрожжевой экстракт 50 г/л, MgSO4·7H₂O 17.2 г/л, (NH₄)SO₄ 7.5 г/л, аскорбиновую кислоту 18 г/л, добавляли в ферментер для поддержания уровня глюкозы каждый раз при повышении pH до 7.1. Спустя 56 часов культивирования концентрация гиспидина в среде составляла 3.48×г/л. Среда из ферментера, а также очищенный из нее с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии гиспидин, обладали активностью в биолюминесцентной реакции с гиспидин-гидроксилазой и люциферазой Neonothopanus nambi, полученными как описано в Примере 4.

[0444] Для создания автономно биолюминесцентных дрожжей Pichia pastoris были использованы кассеты экспрессии, содержащие под контролем промотора GAP и терминатора tAOX1 кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 79, 80), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 1, 2), гиспидин-синтазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 64, 65), тирозин-аммоний-лиазы Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107), и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E.coli (SEQ ID NOs: 108-111), описанные как описано в Примере 15, а так же были синтезированы аналогичные кассеты экспрессии, содержащие кодирующие последовательности 4-кумарат-КоА-лигазы 1 из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs: 140, 141) и трех PKS: из Aquilaria sinensis (SEQ ID NOs:120, 121), PKS из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs:122, 123) и PKS из Hydrangea macrophylla (SEQ ID NO:124, 125). Каждая кассета экспрессии была фланкирована последовательностями узнавания рестриктазы BsmBI. Также синтетически были получены участки гомологии к гену MET6 Pichia pastoris (Uniprot F2QTU9), фланкированные сайтами рестриктазы BsmBI. Синтетическую ДНК обрабатывали рестриктазами BsmBI и объединяли в одну плазмиду по протоколу клонирования Golden Gate, описанному в [Iverson et al., ACS Synth Biol. 2016 Jan 15;5(1):99-103]. Было изготовлено три плазмиды, отличающиеся включенной в их состав PKS. Полученные плазмиды использовали для получения трансгенных дрожжей Pichia pastoris по методике, описанной в Примере 15. Интеграцию кассеты генов в геном подтверждали с помощью ПЦР с праймеров, ожигающихся на участки гомологии. Все три полученных штамма дрожжей, содержащих корректную вставку в геноме, были способены автономно производить свет, в отличие от штамма дрожжей дикого типа.

[0445] Для создания автономно биолюминесцентных цветковых растений на основе вектора pBI121 (Clontech, США) был создан набор бинарных векторов для агробактериальной трансформации, содержащий оптимизированные для экспрессии в растениях кодирующие последовательности люциферазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 112), гиспидин-гидроксилазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), кофеилпируват-гидролазы Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114), ген устойчивости к канамицину, и PKS (SEQ ID NOs: 122, 123), каждый ген - под контролем промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты. Последовательности для сборки кассет экспрессии получали синтетическим путем, сборку вектора осуществляли по протоколу клонирования Golden Gate, описанному в [Iverson et al., ACS Synth Biol. 2016 Jan 15;5(1):99-103]. Nicotiana tabacum трансформировали путем совместного культивирования ткани растения с бактериями Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, 1991 Oct; 9(10):963-7], содержащими созданный бинарный вектор. Трансформацию осуществляли, применяя совместное культивирование сегментов листьев Nicotiana tabacum. Затем листья нарезали на кусочки длиной 0,5 см и переносили в 10 мл жидкой среды Гамборга B-5 c 20 г/л глюкозы, 0,5 г/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 кинетина и добавляли 1,0 мл среды ночной культуры агробактерий. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводили в течении 2-3 минут.После этого экспланты помещали на стерильные фильтры в чашки Петри с агаризованной средой того же состава. Через 48 часов инкубации в термостате при температуре 25°C экспланты переносили на свежую среду с цефотаксимом 500 мг/л и канамицином 50 мг/л. Через три недели начинали регенерацию растений на селективной среде, содержащей канамицин 50 мг/л. Трансгенные растения укореняли и переносили в среду проращивания или на грунт.Биолюминесценцию визуализировали с помощью IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer). Трансгенных растений испускали свет, как минимум на три порядка превышающий сигнал от растений дикого типа.

Пример 24. Комбинации нуклеиновых кислот

[0446] Комбинация 1:

[0447] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; и (б) Нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.

[0448] Комбинация может быть использована для получения биолюминесценции в системах экспрессии in vitro или in vivo в присутствии вещества, выбранного из группы 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-онов, имеющих структурную формулу

,

в котором заместителем по шестому положению является 2-арилвинильный или 2-гетероарилвинильный заместитель (R-CH=CH-), в том числе 2-(3,4-дигидроксистирил), 2-(4-гидроксистирил), 2-(4-(диэтиламино)стирил), 2-(2-(1H-индол-3-ил)винил), 2-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил), 2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил.

[0449] Также указанная комбинация может быть использована для исследования зависимости двух промоторов в гетерологических системах экспрессии.

[0450] Также указанная комбинация может быть использована для выявления гиспидина и его аналогов в биологических образцах.

[0451] Также указанная комбинация может быть использована для мечения клеток с помощью биолюминесценции. Появляющейся в присутствии гиспидина и его функциональных аналогов.

[0452] Комбинация 2:

[0453] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, и (б) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.

[0454] Комбинация может быть использована для получения люциферина грибов в системах экспрессии in vitro или in vivo из вещества, выбранного из замещенной акриловой кислоты со структурной формулой

[0455] ,

где R - арил или гетероарил (например, из кофейной кислоты).

[0456] Комбинация 3:

[0457] Включает все компоненты, указанные в Комбинации 2, а также нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.

[0458] Комбинация может быть использована для получения биолюминесценции в системах экспрессии in vitro или in vivo в присутствии вещества, выбранного из замещенной акриловой кислоты со структурной формулой

[0459] ,

где R - арил или гетероарил.

[0460] Комбинация может быть использована для получения биолюминесцентных клеток и трансгенных организмов. Также указанная комбинация может быть использована для исследования зависимости трех промоторов в гетерологических системах экспрессии.

[0461] Комбинация 4.

[0462] Включает все компоненты, указанные в Комбинации 3, также нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

[0463] Комбинация может быть использована для получения биолюминесцентных клеток и трансгенных организмов.

[0464] Комбинация 5.

[0465] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55; и (б) Нуклеиновая кислота, кодирующая гена 4'-фосфопантотеинил трансферазу, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 105

[0466] Комбинация может быть использована для получения гиспидина из кофейной кислоты в системах экспрессии in vitro и in vivo.

[0467] Комбинация 6

[0468] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55; (б) Нуклеиновая кислота, кодирующая гена 4'-фосфопантотеинил трансферазу, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 105; и (в) нуклеиновые кислоты, кодирующме ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

[0469] ,

где R - арил или гетероарил из метаболитов клетки (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы).

[0470] Комбинация может быть использована для получения гиспидина из тирозина в системах экспрессии in vitro и in vivo.

[0471] Комбинации 2-4 могут также включать кодирующую последовательность гена 4'-фосфопантотеинил трансферазы NpgA (SEQ ID NOs: 104, 105) или иного фермента, проявляющего ту же активность.

[0472] Комбинация 7

[0473] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, и (б) Нуклеиновая кислота, кодирующая PKS, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139.

[0474] Комбинация может быть использована для получения 3-гидроксигиспидина в системах экспрессии in vitro или in vivo из кофеил-КоА.

[0475] Комбинация 8

[001] Включает все компоненты, указанные в Комбинации 7, а также нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Комбинация может быть использована для получения биолюминесценции в системах экспрессии in vitro или in vivo в присутствии кофеил-КоА.

[0476] Комбинация 9

[0477] Включает все компоненты, указанные в Комбинации 8, также нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

[0478] Комбинация может быть использована для получения биолюминесцентных клеток и трансгенных организмов.

[0479] Комбинация 10

[0480] Состав: (а) Нуклеиновая кислота, кодирующая PKS, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; и (б) нуклеиновая кислота, кодирующая 4-кумарат-КоА-лигазу 1 из Arabidopsis thaliana, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 141.

[0481] Комбинация может быть использована для получения гиспидина из кофейной кислоты в системах экспрессии in vitro и in vivo.

[0482] Комбинация 11

[0483] Включает все компоненты, указанные в Комбинации 10, также нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза кофейной кислоты (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы).

[0484] Комбинация может быть использована для получения гиспидина из тирозина в системах экспрессии in vitro и in vivo.

[0485] Пример 25. Комбинации рекомбинантных белков

[0486] Комбинация 1

[0487] Состав: (а) гиспидин-гидроксилаза, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; и (б) гиспидин-синтаза, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.

[0488] Комбинация может быть использована для получения люциферина грибов из вещества, выбранного из 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил (например из кофейной кислоты).

[0489] Комбинация 2

[0490] Включает компоненты, указанные в комбинации 1, так же люциферазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.

[0491] Комбинация может быть использована для детекции наличия в образце 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

[0492] ,

где R - арил или гетероарил (например, из кофейной кислоты).

[0493] Комбинация 3

[0494] Состав: (а) гиспидин-гидроксилаза, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; и (б) PKS, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; и (в) 4-кумарат-КоА-лигаза 1 из Arabidopsis thaliana, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 141. Комбинация может быть использована для получения люциферина грибов из кофейной кислоты.

Пример 25. Наборы

[0495] В приведенных ниже примерах нуклеиновые кислоты могут быть включены в кассеты экспрессии или векторы и оперативно сшиты с регуляторными элементами для их экспрессии в клетке-хозяине. Альтернативно, нуклеиновые кислоты могут содержать фланкирующие последовательности для ее встраивания в целевой вектор. Нуклеиновые кислоты могут быть включены в лишенные промотора векторы, предназначенные для удобного клонирования целевых регуляторных элементов.

[0496] Набор реагентов #1 включает очищенный препарат гиспидин-синтазы настоящего изобретения и может быть использован для получения гиспидина из кофейной кислоты. Также набор может быть использован для получения другого 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

из соответствующей 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил.

[0497] Набор реагентов может также включать реакционный буфер. Например, 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM), 1 мМ НАДФН, 10 мМ АТФ, 1 мМ КоА, 1 мМ Малонил-КоА или компоненты для приготовления реакционного буфера.

[0498] Набор реагентов может также включать деионизованную воду.

[0499] Набор реагентов может также включать инструкцию по применению набора.

[0500] Набор реагентов #2 включает очищенный препарат гиспидин-синтазы настоящего изобретения и очищенный препарат гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения и может быть использован для получения люциферина грибов из вещества, выбранного из 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил (например, из кофейной кислоты).

[0501] Набор реагентов может также включать реакционный буфер: 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM), 1 мМ НАДФН, 10 мМ АТФ, 1 мМ КоА, 1 мМ Малонил-КоА или компоненты для приготовления реакционного буфера.

[0502] Набор реагентов может также включать деионизованную воду.

[0503] Набор реагентов может также включать инструкцию по применению набора.

[0504] Набор реагентов #3 включает очищенный препарат гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения и может быть использован для получения люциферина грибов из 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил. Например, набор может быть использован для получения 3-гидроксигиспидина из гиспидина.

[0505] Набор реагентов может также включать реакционный буфер. Например, 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозида (DDM), 1 мМ НАДФН.

[0506] Набор реагентов может так же включать деионизованную воду.

[0507] Набор реагентов может также включать инструкцию по применению набора.

[0508] Наборы реагентов #4 и #5 отличатся от наборов #2 и #3 тем, что содержат очищенную люциферазу, субстратом которой является 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил.

[0509] Наборы могут быть использованы для выявления 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой ,

где R - арил или гетероарил (например, из кофейной кислоты) и/или 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, (например, гиспидина) в биологических пробах, например, в растительных экстрактах, экстрактах грибов и в микроорганизмах.

[0510] Наборы реагентов могут также включать реакционный буфер (как описано в описании наборов 2 и 3) для осуществления реакции или компоненты для приготовления реакционного буфера.

[0511] Набор реагентов может так же включать деионизованную воду.

[0512] Набор реагентов может также включать инструкцию по применению набора.

[0513] Набор реагентов может также включать кофейную кислоту. Например, водный раствор кофейной кислоты или осадок для разведения в воде.

[0514] Набор реагентов может также включать гиспидин.

[0515] Способы применения наборов

[0516] Для определения присутствия кофейной кислоты в исследуемом образце в кювету следует добавить 5 мкл смеси ферментов к 95 мкл размороженного на льду реакционного буфера, аккуратно перемешать, добавить 5 мкл анализируемого образца, снова аккуратно перемешать и поместить в люминометр. Интегрировать биолюминесцентный сигнал в течение двух минут в температурных условиях, не превышающих 30°C. В таких же условиях провести контрольные измерения с добавлением вместо аликвоты анализируемого образца 5 мкл раствора кофейной кислоты или 5 мкл воды. О наличии кофейной кислоты в образце в детектируемых количествах можно говорить, если свет, излучаемый анализируемым образцом, превышает фоновый сигнал, зарегистрированный от образца с водой.

[0517] Чувствительность: набор позволяет определить наличие в среде кофейной кислоты в концентрации, превышающей 1 нМ.

[0518] Условия хранения: все компоненты набора следует хранить при температуре, не превышающей -20°С.

[0519] Для определения присутствия гиспидина в исследуемом образце в кювету следует добавить 5 мкл смеси ферментов к 95 мкл размороженного на льду реакционного буфера, аккуратно перемешать, добавить 5 мкл анализируемого образца, снова аккуратно перемешать и поместить в люминометр. Интегрировать биолюминесцентный сигнал в течение двух минут в температурных условиях, не превышающих 30°C. В таких же условиях провести контрольные измерения с добавлением вместо аликвоты анализируемого образца 5 мкл раствора гиспидина или 5 мкл воды. О наличии гиспидина в образце в детектируемых количествах можно говорить, если свет, излучаемый анализируемым образцом, превышает фоновый сигнал, зарегистрированный от образца с водой.

[0520] Чувствительность: набор позволяет определить наличие в среде гиспидина в концентрации, превышающей 100 пМ.

[0521] Условия хранения: все компоненты набора следует хранить при температуре, не превышающей -20°С.

[0522] Набор реагентов #6 включает нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу настоящего изобретения. Например, гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.

[0523] Набор реагентов может также содержать инструкцию по применению нуклеиновой кислоты.

[0524] Набор реагентов может также содержать деионизованную воду или буфер для растворения лиофилизированной нуклеиновой кислоты и/или разведения раствора нуклеиновой кислоты.

[0525] Набор реагентов может также содержать праймеры, комплементарные участкам указанной нуклеиновой кислоты, для амплификации нуклеиновой кислоты или ее фрагмента.

[0526] Набор реагентов может быть использован для получения рекомбинантной гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения или для экспрессии гиспидин-гидроксилазы в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах. После экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность катализировать реакцию превращения экзогенного или эндогенного 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил. Например, они приобретают способность катализировать реакцию превращения гиспидина в 3-гидроксигиспидин.

[0527] Набор реагентов #7 включает нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу настоящего изобретения. Например, гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.

[0528] Набор реагентов может также содержать инструкцию по применению нуклеиновой кислоты.

[0529] Набор реагентов может также содержать деионизованную воду или буфер для растворения лиофилизированной нуклеиновой кислоты и/или разведения раствора нуклеиновой кислоты.

[0530] Набор реагентов может также содержать праймеры, комплементарные участкам указанной нуклеиновой кислоты, для амплификации нуклеиновой кислоты или ее фрагмента.

[0531] Набор реагентов может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу, например, 4'-фосфопантотеинил трансферазу, имеющую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 105.

[0532] Набор реагентов может быть использован для получения рекомбинантной гиспидин-синтазы настоящего изобретения или для экспрессии гиспидин-гидроксилазы в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах.

[0533] После экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность катализировать реакцию превращения 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

[0534] ,

где R - арил или гетероарил, в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющих структурную формулу

.

[0535] Например, они приобретают способность катализировать реакцию превращения кофейной кислоты в гиспидин и/или коричной кислоты в (Е)-4-гидрокси-6-стирил-2Н-пиран-2-он и/или паракумаровой кислоты в бисноръянгонин и/или (E)-3-(6-гидроксинафталин-2-ил)пропеновой кислоты в (Е)-4-гидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2Н-пиран-2-он и/или (Е)-3-(1Н-индол-3-ил)пропеновой кислоты в (Е)-6-(2-(1Н-индол-3-ил)винил)-4-гидрокси-2Н-пиран-2-он.

[0536] Набор реагентов может также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы. В этом составе набор может быть использован для получения гиспидина из тирозина в системах экспрессии in vitro и in vivo.

[0537] Набор реагентов #8 включает нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу настоящего изобретения и нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу настоящего изобретения. Например, гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 и гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.

[0538] Набор реагентов может также содержать инструкцию по применению нуклеиновых кислот.

[0539] Набор реагентов может также содержать деионизованную воду или буфер для растворения лиофилизированной нуклеиновой кислоты и/или разведения раствора нуклеиновой кислоты.

[0540] Набор реагентов может также содержать праймеры, комплементарные участкам входящих в набор нуклеиновых кислот, для амплификации этих нуклеиновых кислот или их фрагментов.

[0541] Набор реагентов может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу, например, 4'-фосфопантотеинил трансферазу, имеющую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 105.

[0542] Набор реагентов может также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты из метаболитов клетки, например, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы.

[0543] Набор может быть использован для любого применения, описанного для наборов 6 и 7. Набор также может быть использован для экспрессии гиспидин-гидроксилазы и гиспидин-синтазы в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах. После экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность производить 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу ,

где R - арил или гетероарил, из соответствующей 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

.

[0544] Набор также может быть использован для экспрессии в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах гиспидин-гидроксилазы, гиспидин- синтазы вместе с тирозин-аммоний-лиазой и компонентами HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы. После экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность производить гиспидин из тирозина и метаболитов клетки.

[0545] Набор реагентов #9 включает нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу настоящего изобретения. Например, гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, способную окислять с выделением света по крайней мере один из люциферинов грибов. Например, может быть использована люцифераза, аминокислотная последовательность которой выбрана из в SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.

[0546] Набор реагентов может также содержать инструкцию по применению нуклеиновых кислот.

[0547] Набор реагентов может также содержать деионизованную воду или буфер для растворения лиофилизированной нуклеиновой кислоты и/или разведения раствора нуклеиновой кислоты.

[0548] Набор реагентов может также содержать праймеры, комплементарные участкам входящих в набор нуклеиновых кислот, для амплификации этих нуклеиновых кислот или их фрагментов.

[0549] Набор может быть использован для мечения клеток и/или клеточных линий и/или организмов, где указанные клетки, клеточные линии и/или организмы эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают в результате экспрессии указанных нуклеиновых кислот способность к биолюминесценции в присутствии экзогенного или эндогенного предлюциферина грибов. Например, они приобретают способность к биолюминесценции в присутствии гиспидина.

[0550] Набор может быть также использован для исследования ко-активации промоторов целевых генов.

[0551] Набор может также включать нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу настоящего изобретения, например, гиспидин-синтазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55. В этом случае набор может быть использован для получения клеток, клеточных линий и трансгенных организмов, способных к биолюминесценции в присутствии экзогенной или эндогенной 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой

[0552]

где R - арил или гетероарил. Например, в присутствии 3-арилакриловой кислоты, выбранной из группы: кофейная кислота, или коричная кислота, или пара-кумаровая кислота, или кумаровая кислота, или умбеллиновая кислота, или синаповая кислота, или феруловая кислота. В частности, набор может быть использован для получения автономно биолюминесцирующих трансгенных организмов, например, растений или грибов.

[0553] Набор может также включать нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу, например, 4'-фосфопантотеинил трансферазу, имеющую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 105 или ей подобную.

[0554] Набор может так же содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты из метаболитов клетки.

[0555] Набор может так же содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу настоящего изобретения, например, кофеилпируват-гидролазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

[0556] Набор может быть также использован для любого применения, описанного для наборов #6-#8.

[0557] Набор может быть также использован для создания клеточных линий, позволяющих определить наличие кофейной кислоты в исследуемом образце.

[0558] Набор реагентов #10 включает клетки Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0, несущие плазмиду, содержащую кодирующие последовательности гиспидин-синтазы, гиспидин-гидроксилазы, люциферазы, фосфопантотеинил-трансферазы NpgA и гена устойчивости к антибиотику (например, к канамицину) под контролем подходящего промотора, например, промотора 35S вируса мозаики цветной капусты.

[0559] Набор реагентов может так же включать праймеры для определения корректности интеграции кассеты экспрессии в клетки двудольных цветковых растений.

[0560] Набор реагентов может быть использован для получения автономно биолюминесцентных двудольных растений.

[0561] Набор реагентов может так же включать инструкцию по применению набора.

[0562] Способ применения: Произвести трансформацию двудольного растения клетками агробактерий из набора по протоколу, оптимально подходящему для данного вида растения. Селекцию растений проводить на среде с антибиотиком (например, канамицином). Корректность полноразмерной интеграции кассеты экспрессии произвести с помощью ПЦР с праймерами из набора.

[0563] Условия хранения: компетентные клетки агробактерий следует хранить при температуре, не превышающей -70°С, допускается хранение раствора кофейной кислоты при температурах, не превышающих -20°С.

[0564] Набор реагентов #11

[0565] Набор включает очищенный препарат PKS и очищенный препарат гиспидин-гидроксилазы настоящего изобретения и может быть использован для получения люциферина грибов из кофеил-КоА. Набор реагентов может так же включать реакционный буфер: 0.2 M натрий-фосфатный буфер (pH 8.0) с добавлением 0.5 M Na₂SO4, 0.1% додецилмальтозид (DDM), 1 мМ НАДФН, 10 мМ АТФ, 1 мМ Малонил-КоА или компоненты для приготовления реакционного буфера. Набор реагентов может так же включать деионизованную воду. Набор реагентов может так же включать инструкцию по применению набора.

[0566] Набор реагентов #12

[0567] Набор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую PKS и нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-гидроксилазу настоящего изобретения. Например, PKS, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 и гиспидин-гидроксилазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.

[0568] Набор реагентов может также содержать инструкцию по применению нуклеиновых кислот.Набор реагентов может также содержать деионизованную воду или буфер для растворения лиофилизированной нуклеиновой кислоты и/или разведения раствора нуклеиновой кислоты. Набор реагентов может также содержать праймеры, комплементарные участкам входящих в набор нуклеиновых кислот, для амплификации этих нуклеиновых кислот или их фрагментов.

[0569] Набор реагентов может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу, например, кумарат-КоА-лигазы, имеющую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 141.

[0570] Набор реагентов может также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза кофейной кислоты из метаболитов клетки, например, кодирующие тирозин-аммоний-лиазу и компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы. Набор реагентов может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую кофеилпируват-гидролазу настоящего изобретения.

[0571] Набор реагентов может быть использован для экспрессии гиспидин-гидроксилазы и PKS в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах. После экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность производить 3-гидроксигиспидин из кофейной кислоты. Набор также может быть использован для экспрессии в клетках и/или клеточных линиях и/или организмах гиспидин-гидроксилазы, PKS вместе с кумарат-КоА-лигазой, кофеил-пируватгидролазой и/или комбинацией тирозин-аммоний-лиазы и компонентов HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы. После экспрессии нуклеиновых кислот в клетках, клеточных линиях и/или организмах эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность производить 3-гидроксигиспидин из тирозина и метаболитов клетки.

[0572] Набор может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую люциферазу, способную окислять 3-гидроксигиспидин с выделением света. В этом случае набор может быть использован для мечения клеток и/или клеточных линий и/или организмов, где указанные клетки, клеточные линии и/или организмы эти клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают в результате экспрессии указанных нуклеиновых кислот способность к биолюминесценции в присутствии экзогенного или эндогенного гиспидина и/или кофеил-КоА и/или кофейной кислоты. Например, клетки, клеточные линии и/или организмы приобретают способность к автономной биолюминесценции.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Общество с ограниченной ответственностью «Планта»

<120> Кофеилпируват-гидролазы и их применение

<130> 424509

<160> 141

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> Neonothopanus nambi

<400> 1

atggcatcgt ttgagaattc tctaagcgtt ttgattgtcg gggccggact tggtgggctt 60

gctgctgcca tcgcgctgcg tcgccaaggg catgtcgtga aaatatacga ctcctctagc 120

ttcaaagccg aacttggtgc gggactcgct gtgccgccta acaccttgcg cagtctacag 180

caacttggtt gcaataccga gaacctcaat ggtgtggata atctttgctt cactgcgatg 240

gggtatgacg ggagtgtagg gatgatgaac aacatgactg actatcgaga ggcatacggt 300

acttcttgga tcatggtcca ccgcgttgac ttgcataacg agctgatgcg cgtagcactt 360

gatccaggtg ggctcggacc tcctgcgaca ctccatctta atcatcgtgt cacattctgc 420

gatgtcgacg cttgcaccgt gacattcacc aacgggacca ctcaatcagc tgatctcatc 480

gttggtgcag acggtatacg ctctaccatt cggcggtttg tcttagaaga agacgtgact 540

gtgcctgcgt caggaatcgt cgggtttcga tggcttgtac aagctgacgc gctggaccca 600

tatcctgaac tcgactggat tgttaaaaag cctcctctag gcgcgcgact gatctccact 660

cctcagaatc cacagtctgg tgttggcttg gctgacaggc gcactatcat catctacgca 720

tgtcgtggcg gcaccatggt caatgtcctt gcagtgcatg atgacgaacg tgaccagaac 780

accgcagatt ggagtgtacc ggcttccaaa gacgatctat ttcgtgtttt ccacgattac 840

catccacgct ttcggcggct tttagagctt gcgcaggata ttaatctctg gcaaatgcgt 900

gttgtacctg ttttgaaaaa atgggttaac aagcgggttt gcttgttagg agatgctgcg 960

cacgcttctt taccgacgtt gggtcaaggt tttggtatgg gtctggaaga tgccgtagca 1020

cttggtacac tccttccaaa gggtaccact gcatctcaga tcgagactcg acttgcggtg 1080

tacgaacagc tacgtaagga tcgtgcggaa tttgttgcgg ctgaatcata tgaagagcaa 1140

tatgttcctg aaatgcgggg actttatctg aggtcaaagg aactgcgtga tagagtcatg 1200

ggttatgata tcaaagtgga gagcgagaag gttctcgaga cgctcctaag aagttctaat 1260

tctgcc 1266

<210> 2

<211> 422

<212> PRT

<213> Neonothopanus nambi

<400> 2

Met Ala Ser Phe Glu Asn Ser Leu Ser Val Leu Ile Val Gly Ala Gly

1 5 10 15

Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala Ile Ala Leu Arg Arg Gln Gly His Val

20 25 30

Val Lys Ile Tyr Asp Ser Ser Ser Phe Lys Ala Glu Leu Gly Ala Gly

35 40 45

Leu Ala Val Pro Pro Asn Thr Leu Arg Ser Leu Gln Gln Leu Gly Cys

50 55 60

Asn Thr Glu Asn Leu Asn Gly Val Asp Asn Leu Cys Phe Thr Ala Met

65 70 75 80

Gly Tyr Asp Gly Ser Val Gly Met Met Asn Asn Met Thr Asp Tyr Arg

85 90 95

Glu Ala Tyr Gly Thr Ser Trp Ile Met Val His Arg Val Asp Leu His

100 105 110

Asn Glu Leu Met Arg Val Ala Leu Asp Pro Gly Gly Leu Gly Pro Pro

115 120 125

Ala Thr Leu His Leu Asn His Arg Val Thr Phe Cys Asp Val Asp Ala

130 135 140

Cys Thr Val Thr Phe Thr Asn Gly Thr Thr Gln Ser Ala Asp Leu Ile

145 150 155 160

Val Gly Ala Asp Gly Ile Arg Ser Thr Ile Arg Arg Phe Val Leu Glu

165 170 175

Glu Asp Val Thr Val Pro Ala Ser Gly Ile Val Gly Phe Arg Trp Leu

180 185 190

Val Gln Ala Asp Ala Leu Asp Pro Tyr Pro Glu Leu Asp Trp Ile Val

195 200 205

Lys Lys Pro Pro Leu Gly Ala Arg Leu Ile Ser Thr Pro Gln Asn Pro

210 215 220

Gln Ser Gly Val Gly Leu Ala Asp Arg Arg Thr Ile Ile Ile Tyr Ala

225 230 235 240

Cys Arg Gly Gly Thr Met Val Asn Val Leu Ala Val His Asp Asp Glu

245 250 255

Arg Asp Gln Asn Thr Ala Asp Trp Ser Val Pro Ala Ser Lys Asp Asp

260 265 270

Leu Phe Arg Val Phe His Asp Tyr His Pro Arg Phe Arg Arg Leu Leu

275 280 285

Glu Leu Ala Gln Asp Ile Asn Leu Trp Gln Met Arg Val Val Pro Val

290 295 300

Leu Lys Lys Trp Val Asn Lys Arg Val Cys Leu Leu Gly Asp Ala Ala

305 310 315 320

His Ala Ser Leu Pro Thr Leu Gly Gln Gly Phe Gly Met Gly Leu Glu

325 330 335

Asp Ala Val Ala Leu Gly Thr Leu Leu Pro Lys Gly Thr Thr Ala Ser

340 345 350

Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ala Val Tyr Glu Gln Leu Arg Lys Asp Arg

355 360 365

Ala Glu Phe Val Ala Ala Glu Ser Tyr Glu Glu Gln Tyr Val Pro Glu

370 375 380

Met Arg Gly Leu Tyr Leu Arg Ser Lys Glu Leu Arg Asp Arg Val Met

385 390 395 400

Gly Tyr Asp Ile Lys Val Glu Ser Glu Lys Val Leu Glu Thr Leu Leu

405 410 415

Arg Ser Ser Asn Ser Ala

420

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> Omphalotus olearius

<400> 3

atgacgccct ccgagagtcc tttgaatatc tcgattgttg gtgctgggct cggggggctt 60

gctgcagcta ttgcgctgcg tcgtcaaggt catatcatca gaatcttcga ctcgtcaagt 120

tttaaaacgg aactgggtgc tggacttgct gttccaccca atacattacg cagtcttcag 180

gaacttggct gtgatattca gaacttcaat gccgtggaca atctttgttt caccgcgatg 240

ggctacgacg ggagtgtagg gatgatgaac aatatgactg actatcgtga ggcgtatggt 300

gttccctggg tcatggtcca ccgcgttgac ctacataatg aactgcgacg tgtggcactc 360

gatccagatg gccttggacc tcctgcagca ttgcacctca atcatcgtgt gacatcctgc 420

gatgtcgatt cctgcaccgt cacattcgct aacggaaccg ctcatacagc ggatctcatc 480

gttggcgcgg atggtatacg ctcttccatc cgacccttcg tgttgggaga agacgtaatc 540

gtacctgcaa caggaatcgc aggatttcga tggctcatac aagccgaccg gctagatgcg 600

tatcctgaac tcgactggat tgtcaagaac cctcctctcg gcgcgcgatt gatttctgct 660

ccggctcgga aggaacgttc tgtaatcagc gaagcccggc ctgatcgacg tacgattata 720

ttatatgcgt gtcgtggtgg tactattgtc aatgtccttg cggtgcacga cgacgaacgt 780

gatcaggaca ccgtagaatg gagcgtgcca gctaccaaag acgacctatt tcgcgttttc 840

aacgattatc acccaagatt tcggcgactt ctggacctgg cggaggatgt taatctctgg 900

cagatgcgtg ttgtgcctgt tttgagacga tgggttaata aacgggtttg cttgctggga 960

gatgcagcac atgcttcttt accgacattg ggtcaaggtt ttggtatggg tctcgaggat 1020

gcggtggcac ttggtacgct tcttccgagc gggactactg tgtcacagat tgaaatccga 1080

ctttgggtgt atgaaaaact gcgcaaggag cgtgctgaat ttgtttcggc tgaatcgtat 1140

gaagaacact gctctgtgga ttgctataaa tctcataaag cccagtcgac atccaataca 1200

gtgacagaag cagacgacat cttggaagaa ccaaagcctc tgaagccttt atcgtctctg 1260

aaatggccgt acgttcccga agaaccttcg tatcctgatc ccctccaaag aaacgacccc 1320

aaacccctac aactcagaca ctacgaagca atagctacat ctcctgcagt acgggaggtc 1380

ctatcgagtc atccgaatct ccctgcttta ttgacgtcta tcgacaaact gagaggtttt 1440

gatcgcgaac gagctttaga aaaggcgttg gaggttactg cgcctgcgct tgttgatgat 1500

tcaagggctg tagcgctgga ggacgatgta ctcgcaatga gagcattggt agaagcgatt 1560

gaaggtgctg ttaggggcaa taaagaagac gcattaggtc tggattggac tggtagtact 1620

<210> 4

<211> 540

<212> PRT

<213> Omphalotus olearius

<400> 4

Met Thr Pro Ser Glu Ser Pro Leu Asn Ile Ser Ile Val Gly Ala Gly

1 5 10 15

Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala Ile Ala Leu Arg Arg Gln Gly His Ile

20 25 30

Ile Arg Ile Phe Asp Ser Ser Ser Phe Lys Thr Glu Leu Gly Ala Gly

35 40 45

Leu Ala Val Pro Pro Asn Thr Leu Arg Ser Leu Gln Glu Leu Gly Cys

50 55 60

Asp Ile Gln Asn Phe Asn Ala Val Asp Asn Leu Cys Phe Thr Ala Met

65 70 75 80

Gly Tyr Asp Gly Ser Val Gly Met Met Asn Asn Met Thr Asp Tyr Arg

85 90 95

Glu Ala Tyr Gly Val Pro Trp Val Met Val His Arg Val Asp Leu His

100 105 110

Asn Glu Leu Arg Arg Val Ala Leu Asp Pro Asp Gly Leu Gly Pro Pro

115 120 125

Ala Ala Leu His Leu Asn His Arg Val Thr Ser Cys Asp Val Asp Ser

130 135 140

Cys Thr Val Thr Phe Ala Asn Gly Thr Ala His Thr Ala Asp Leu Ile

145 150 155 160

Val Gly Ala Asp Gly Ile Arg Ser Ser Ile Arg Pro Phe Val Leu Gly

165 170 175

Glu Asp Val Ile Val Pro Ala Thr Gly Ile Ala Gly Phe Arg Trp Leu

180 185 190

Ile Gln Ala Asp Arg Leu Asp Ala Tyr Pro Glu Leu Asp Trp Ile Val

195 200 205

Lys Asn Pro Pro Leu Gly Ala Arg Leu Ile Ser Ala Pro Ala Arg Lys

210 215 220

Glu Arg Ser Val Ile Ser Glu Ala Arg Pro Asp Arg Arg Thr Ile Ile

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Cys Arg Gly Gly Thr Ile Val Asn Val Leu Ala Val His

245 250 255

Asp Asp Glu Arg Asp Gln Asp Thr Val Glu Trp Ser Val Pro Ala Thr

260 265 270

Lys Asp Asp Leu Phe Arg Val Phe Asn Asp Tyr His Pro Arg Phe Arg

275 280 285

Arg Leu Leu Asp Leu Ala Glu Asp Val Asn Leu Trp Gln Met Arg Val

290 295 300

Val Pro Val Leu Arg Arg Trp Val Asn Lys Arg Val Cys Leu Leu Gly

305 310 315 320

Asp Ala Ala His Ala Ser Leu Pro Thr Leu Gly Gln Gly Phe Gly Met

325 330 335

Gly Leu Glu Asp Ala Val Ala Leu Gly Thr Leu Leu Pro Ser Gly Thr

340 345 350

Thr Val Ser Gln Ile Glu Ile Arg Leu Trp Val Tyr Glu Lys Leu Arg

355 360 365

Lys Glu Arg Ala Glu Phe Val Ser Ala Glu Ser Tyr Glu Glu His Cys

370 375 380

Ser Val Asp Cys Tyr Lys Ser His Lys Ala Gln Ser Thr Ser Asn Thr

385 390 395 400

Val Thr Glu Ala Asp Asp Ile Leu Glu Glu Pro Lys Pro Leu Lys Pro

405 410 415

Leu Ser Ser Leu Lys Trp Pro Tyr Val Pro Glu Glu Pro Ser Tyr Pro

420 425 430

Asp Pro Leu Gln Arg Asn Asp Pro Lys Pro Leu Gln Leu Arg His Tyr

435 440 445

Glu Ala Ile Ala Thr Ser Pro Ala Val Arg Glu Val Leu Ser Ser His

450 455 460

Pro Asn Leu Pro Ala Leu Leu Thr Ser Ile Asp Lys Leu Arg Gly Phe

465 470 475 480

Asp Arg Glu Arg Ala Leu Glu Lys Ala Leu Glu Val Thr Ala Pro Ala

485 490 495

Leu Val Asp Asp Ser Arg Ala Val Ala Leu Glu Asp Asp Val Leu Ala

500 505 510

Met Arg Ala Leu Val Glu Ala Ile Glu Gly Ala Val Arg Gly Asn Lys

515 520 525

Glu Asp Ala Leu Gly Leu Asp Trp Thr Gly Ser Thr

530 535 540

<210> 5

<211> 1329

<212> DNA

<213> Guyanagaster necrorhiza

<400> 5

atgcaacaaa tcgacgaagt gtgcccattg aaagtgatcg ttgtaggtgc tggacttggg 60

ggcctttctg ctgccattgc ccttcgtagg caaggccatt gtgtccatat actggaatcg 120

tcaagtttca agagcgaact tggcgcaggt ctcgcagtac cgcccaatac tgtacgctca 180

cttcgaggcc taggctgtaa catcgacaat ctcaagcctg tggataatct ttgtttcact 240

gccatggcgc atgacggaag tcctggtatg atgaataaca tgacggacta tggccaggcg 300

tatggagatc cttgggtaat ggcgcatcgt gttgaccttc acaatgagct catgcgagtg 360

gcccttgaac ccgaaaaaac gggacctcct gcccagcttc gtctggacag ccaggtggca 420

tcttgcaatg tagatgcctg taccgtttct cttgtcgacg gaacaattta ttccgctgat 480

cttatcgttg gtgcagacgg aattaggtct accatacgct cctatgtttt ggacgcagaa 540

atagacatac ctcctaccgg tatcgctgga taccgttggc tcacacctgc agaagctttg 600

gagccatatc ccgaactcga ctggatcatc aagaacccac ccctaggagc acgtttaatc 660

acagctcctg tacgccgaaa cgacagcatt gagcagtcgg gtcctgctcc tatttctgag 720

aaggctgaca agcgtacgat catcatctac gcgtgccgga atggtactat gcttaacgtt 780

ctcggtgtac acgatgaccc tcgcaaccag aacgaagttg gatggaacgt gccagttacc 840

caagaaagtt tgctggattt ttttaaagac tatcatcccc gattcaagcg tctgcttgag 900

ctggctgaca atgttcatct gtggcaaatg cgcgtcgtcc cgcggcttga gacttggatc 960

aataaacgcg tgtgtttgtt gggcgattct gcgcatgcat cattaccaac actcggtcaa 1020

ggcttcggga tgggacttga ggatgccgta gcccttgcaa ccctccttcc gatgggaacc 1080

aaagtgtctg acatcgagaa ccgcctcgtc gcctacgaaa gcttgcgtaa ggggcgcgct 1140

gagtatgtgg ccatggaatc gttcgaacaa cagaatatcc cggaaaagcg aggcttgtat 1200

ctcaggtctt ctatgatgcg tgacgaaatc atgggttatg atgtcaaagc cgaggctgag 1260

aaggttttta aagaattaat gacctcgact gataaggtta cataccgtcc ccatgtggac 1320

tgtctatgg 1329

<210> 6

<211> 443

<212> PRT

<213> Guyanagaster necrorhiza

<400> 6

Met Gln Gln Ile Asp Glu Val Cys Pro Leu Lys Val Ile Val Val Gly

1 5 10 15

Ala Gly Leu Gly Gly Leu Ser Ala Ala Ile Ala Leu Arg Arg Gln Gly

20 25 30

His Cys Val His Ile Leu Glu Ser Ser Ser Phe Lys Ser Glu Leu Gly

35 40 45

Ala Gly Leu Ala Val Pro Pro Asn Thr Val Arg Ser Leu Arg Gly Leu

50 55 60

Gly Cys Asn Ile Asp Asn Leu Lys Pro Val Asp Asn Leu Cys Phe Thr

65 70 75 80

Ala Met Ala His Asp Gly Ser Pro Gly Met Met Asn Asn Met Thr Asp

85 90 95

Tyr Gly Gln Ala Tyr Gly Asp Pro Trp Val Met Ala His Arg Val Asp

100 105 110

Leu His Asn Glu Leu Met Arg Val Ala Leu Glu Pro Glu Lys Thr Gly

115 120 125

Pro Pro Ala Gln Leu Arg Leu Asp Ser Gln Val Ala Ser Cys Asn Val

130 135 140

Asp Ala Cys Thr Val Ser Leu Val Asp Gly Thr Ile Tyr Ser Ala Asp

145 150 155 160

Leu Ile Val Gly Ala Asp Gly Ile Arg Ser Thr Ile Arg Ser Tyr Val

165 170 175

Leu Asp Ala Glu Ile Asp Ile Pro Pro Thr Gly Ile Ala Gly Tyr Arg

180 185 190

Trp Leu Thr Pro Ala Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Pro Glu Leu Asp Trp

195 200 205

Ile Ile Lys Asn Pro Pro Leu Gly Ala Arg Leu Ile Thr Ala Pro Val

210 215 220

Arg Arg Asn Asp Ser Ile Glu Gln Ser Gly Pro Ala Pro Ile Ser Glu

225 230 235 240

Lys Ala Asp Lys Arg Thr Ile Ile Ile Tyr Ala Cys Arg Asn Gly Thr

245 250 255

Met Leu Asn Val Leu Gly Val His Asp Asp Pro Arg Asn Gln Asn Glu

260 265 270

Val Gly Trp Asn Val Pro Val Thr Gln Glu Ser Leu Leu Asp Phe Phe

275 280 285

Lys Asp Tyr His Pro Arg Phe Lys Arg Leu Leu Glu Leu Ala Asp Asn

290 295 300

Val His Leu Trp Gln Met Arg Val Val Pro Arg Leu Glu Thr Trp Ile

305 310 315 320

Asn Lys Arg Val Cys Leu Leu Gly Asp Ser Ala His Ala Ser Leu Pro

325 330 335

Thr Leu Gly Gln Gly Phe Gly Met Gly Leu Glu Asp Ala Val Ala Leu

340 345 350

Ala Thr Leu Leu Pro Met Gly Thr Lys Val Ser Asp Ile Glu Asn Arg

355 360 365

Leu Val Ala Tyr Glu Ser Leu Arg Lys Gly Arg Ala Glu Tyr Val Ala

370 375 380

Met Glu Ser Phe Glu Gln Gln Asn Ile Pro Glu Lys Arg Gly Leu Tyr

385 390 395 400

Leu Arg Ser Ser Met Met Arg Asp Glu Ile Met Gly Tyr Asp Val Lys

405 410 415

Ala Glu Ala Glu Lys Val Phe Lys Glu Leu Met Thr Ser Thr Asp Lys

420 425 430

Val Thr Tyr Arg Pro His Val Asp Cys Leu Trp

435 440

<210> 7

<211> 1284

<212> DNA

<213> Panellus stipticus

<400> 7

atgtcacaag gcactgaaga ctcgccctca ctcttcgcaa tagttgtcgg tgctggtctg 60

gtcggctttg ccgctgccgt cgcgctgcgc cgtcaaggtc accgtgtcac gatctacgaa 120

tcttcaagct ttaagacaga acttggggcg ggcctcgcga tcccttcaaa cacattgcga 180

tgcttggttg gccttggatg tactgtcgcc aacatggatc ccgtcaataa tctttgtttt 240

acatcgatgg catacgatgg taccgcgggg atgaaaagcg acagctccga ctacgaggcg 300

cagtatggca ctccctggat catggcccac cgcgtcgatc tgcacaagga gcttcgtcgc 360

ctggcagtgg atcccgaggg caccggtccc cccgcagaac tgcaccttag ccaccgggtt 420

gtctcctgcg acgtcgaatc cggctccgtc acgctcctgg acggctccgt tcagtcagca 480

gacttgataa ttggggctga tggaattcgt tcaaccgttc gcaaatttgt cgtaggcgaa 540

gaaatagcaa tccccccatc tcgtacggcg ggcttccgct ggctcacaca agcaagcgct 600

cttgacccct accccgaact ggattggatc gtgaaaacgc cgccgttggg tgctcgggta 660

atctccgctc cgattcaacc tccagaagtc acccacatcg accaccgtac gatcgtcatc 720

tatgcctgtc gcggaggtcg tctcgtaaat gttctaggaa tacatgagga tctgcgcgac 780

caggattctg tcgactggaa cgtccccata acgcgagaag cgctgctcca ctttttcgga 840

gactaccacc cacggttcaa gcggctcttg gagctcgcgg aggacgtaca cgtctggcag 900

atgcgcgtgg tccccccact gccgacatgg gtgaacggcc gcgtatgcat catgggcgac 960

gcagcgcatg catcgcttcc cacactggga caagggtttg gcatgggcct cgaagacgcg 1020

gtcgcgctcg ggacgctgct ttctagttcg acgccgtcaa gcgacattcc aagccgtctc 1080

gtcgcgtacg agaagcttcg caaagcgcgc gctgagtatg tttccaaaga gtcgtacgaa 1140

cagcagcatg tccgagaaaa gagagggctg tatctccggt cccgagaaat gcgggatgtg 1200

atcatgggat acgacgtgaa gaaggaggca gaacggatct tgagcgagat cagcattgca 1260

caagaacagt gtgctgttca tgat 1284

<210> 8

<211> 428

<212> PRT

<213> Panellus stipticus

<400> 8

Met Ser Gln Gly Thr Glu Asp Ser Pro Ser Leu Phe Ala Ile Val Val

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Val Gly Phe Ala Ala Ala Val Ala Leu Arg Arg Gln

20 25 30

Gly His Arg Val Thr Ile Tyr Glu Ser Ser Ser Phe Lys Thr Glu Leu

35 40 45

Gly Ala Gly Leu Ala Ile Pro Ser Asn Thr Leu Arg Cys Leu Val Gly

50 55 60

Leu Gly Cys Thr Val Ala Asn Met Asp Pro Val Asn Asn Leu Cys Phe

65 70 75 80

Thr Ser Met Ala Tyr Asp Gly Thr Ala Gly Met Lys Ser Asp Ser Ser

85 90 95

Asp Tyr Glu Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Trp Ile Met Ala His Arg Val

100 105 110

Asp Leu His Lys Glu Leu Arg Arg Leu Ala Val Asp Pro Glu Gly Thr

115 120 125

Gly Pro Pro Ala Glu Leu His Leu Ser His Arg Val Val Ser Cys Asp

130 135 140

Val Glu Ser Gly Ser Val Thr Leu Leu Asp Gly Ser Val Gln Ser Ala

145 150 155 160

Asp Leu Ile Ile Gly Ala Asp Gly Ile Arg Ser Thr Val Arg Lys Phe

165 170 175

Val Val Gly Glu Glu Ile Ala Ile Pro Pro Ser Arg Thr Ala Gly Phe

180 185 190

Arg Trp Leu Thr Gln Ala Ser Ala Leu Asp Pro Tyr Pro Glu Leu Asp

195 200 205

Trp Ile Val Lys Thr Pro Pro Leu Gly Ala Arg Val Ile Ser Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Pro Glu Val Thr His Ile Asp His Arg Thr Ile Val Ile

225 230 235 240

Tyr Ala Cys Arg Gly Gly Arg Leu Val Asn Val Leu Gly Ile His Glu

245 250 255

Asp Leu Arg Asp Gln Asp Ser Val Asp Trp Asn Val Pro Ile Thr Arg

260 265 270

Glu Ala Leu Leu His Phe Phe Gly Asp Tyr His Pro Arg Phe Lys Arg

275 280 285

Leu Leu Glu Leu Ala Glu Asp Val His Val Trp Gln Met Arg Val Val

290 295 300

Pro Pro Leu Pro Thr Trp Val Asn Gly Arg Val Cys Ile Met Gly Asp

305 310 315 320

Ala Ala His Ala Ser Leu Pro Thr Leu Gly Gln Gly Phe Gly Met Gly

325 330 335

Leu Glu Asp Ala Val Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ser Ser Ser Thr Pro

340 345 350

Ser Ser Asp Ile Pro Ser Arg Leu Val Ala Tyr Glu Lys Leu Arg Lys

355 360 365

Ala Arg Ala Glu Tyr Val Ser Lys Glu Ser Tyr Glu Gln Gln His Val

370 375 380

Arg Glu Lys Arg Gly Leu Tyr Leu Arg Ser Arg Glu Met Arg Asp Val

385 390 395 400

Ile Met Gly Tyr Asp Val Lys Lys Glu Ala Glu Arg Ile Leu Ser Glu

405 410 415

Ile Ser Ile Ala Gln Glu Gln Cys Ala Val His Asp

420 425

<210> 9

<211> 1284

<212> DNA

<213> Panellus stipticus

<400> 9