HPV-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/08 C07K14/705 A61K35/17 A61P35/00 

Перекрестная ссылка на связанные заявки

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США на патент 62/567750, поданной 3 октября 2017 г., «HPV-специфические связывающие молекулы», предварительной заявки США на патент 62/597411, поданной 11 декабря 2017 г., «HPV-специфические связывающие молекулы» и предварительной заявки США на патент 62/653529, поданной 5 апреля 2018 г., «HPV-специфические связывающие молекулы», содержание которых включено в качестве ссылки в полном объеме.

Включение путем ссылки на Список последовательностей

[0002] Настоящая заявка подается вместе со Списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла 735042014140SeqList.txt, созданного 28 сентября 2018 года, размер которого составляет 2288524 байта. Информация в электронном формате Списка последовательностей включена в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники

[0003] Настоящее раскрытие относится в некоторых аспектах к связывающим молекулам, таким как те, которые распознают или связывают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E6 или E7 в контексте молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC). В частности, настоящее раскрытие относится к T-клеточным рецепторам (TCR) или антителам, включая их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают или распознают пептидный эпитоп E6 HPV 16 или E7. Настоящее раскрытие дополнительно относится к сконструированным клеткам, содержащим такие связывающие молекулы, например TCR или антитела (и химерные антигенные рецепторы, содержащие антитела), и их применению в адоптивной клеточной терапии.

Уровень техники

[0004] Вирус папилломы человека (HPV) является распространенным вирусом среди людей, который в некоторых случаях может передаваться при контакте с кожей, и является распространенным вирусом, передаваемым половым путем. Определенные подтипы HPV, такие как HPV 16, могут привести к определенным видам злокачественных новообразований, таким как рак шейки матки и другие виды злокачественных новообразований. В некоторых случаях злокачественное новообразование может быть связано с экспрессией онкобелков HPV Е6 и/или Е7. Например, HPV Е6 и/или Е7 могут способствовать прогрессированию злокачественного новообразования путем нацеливания на сигнальные пути опухолевых супрессоров, которые участвуют в контроле клеточного роста. Доступны определенные терапевтические агенты, нацеленные на клетки или опухоли, экспрессирующие HPV 16, но необходимы улучшенные агенты против HPV 16. Представлены варианты осуществления, которые удовлетворяют таким потребностям.

Сущность изобретения

[0005] В настоящем описании представлены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную бета область (Vβ), где: область Vα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987, 999, 999 или 1390, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или область Vβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.

[0006] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1185), где X₂ представляет собой A, G, V, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, N, A, Y, R или P; X₄ представляет собой E, S, A, G, F, N, D, V, P, L, I, M или R; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, A, S, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A или N; X₁₁ представляет собой Y, F, Q, R или N; X₁₂ представляет собой K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, M, F или V; X₁₄ представляет собой I, T, S, R, Y или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀KX₁₂I (SEQ ID NO: 1186), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой А, V или Е; X₃ представляет собой S, N, T, R или P; X₄ представляет собой E, A, G, F, V, P, I, D или S; X₅ представляет собой R, H, T, A P, S, G или F; X₆ представляет собой G, H, L, T, S или A, отсутствует; X₇ представляет собой S, T или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, T или отсутствует; Х₁₀ представляет собой F, Y или N; X₁₂ представляет собой Y, T или L; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YKYI (SEQ ID NO: 1187), где X₂ представляет собой A, V или E; X₃ представляет собой S, N или R; X₄ представляет собой E, G, V, P, I или D; X₅ представляет собой R, T, P, S, G или F; X₆ представляет собой G, T, S или отсутствует; X₇ представляет собой S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; Х₉ представляет собой Т или отсутствует; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1188), где X₂ представляет собой G, V, Q или M; X₃ представляет собой G, A, Y, S, N или R; X₄ представляет собой S, G, L, I, M или R; Х₅ представляет собой N, D, G, S, L, Q или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, D, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; X₁₄ представляет собой S, T или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃T (SEQ ID NO: 1189), где X₂ представляет собой G, V или Q; X₃ представляет собой G, Y, S или N; Х₄ представляет собой S, L или М; Х₅ представляет собой N, G, L или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇YKLS (SEQ ID NO: 1190), где X₂ представляет собой G или V; Х₃ представляет собой А или Y; X₄ представляет собой G, S или R; Х₅ представляет собой D или S; X₆ представляет собой N или отсутствует; X₇ представляет собой D или отсутствует.

[0007] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO:1200), X₂ представляет собой S, V, или I; X₃ представляет собой S, N, или A; X₄ представляет собой R, V, S, L, P, G, I, или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, R, T, или S; X₆ представляет собой L, G, A, D, R, V, или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T, или отсутствует; X₈ представляет собой S, или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, V, T, D, L, или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N, или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G, или N; X₁₂ представляет собой T, E, G, или K; X₁₃ представляет собой Q, Y, или L; X₁₄ представляет собой Y, F, T, или I; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO:1201), где X₄ представляет собой R, V, S, L, G, или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, T, или S; X₆ представляет собой A, L, R, D, G, или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, T, или отсутствует; X₈ представляет собой S, или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, T, D, L, или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N, или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G, или N; X₁₂ представляет собой T, E, или G; X₁₃ представляет собой Q, Y, или L; X₁₄ представляет собой Y, F, или T; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀TQY (SEQ ID NO: 1202), где X₄ представляет собой R, L, или G; X₅ представляет собой F, V, T, или Y; X₆ представляет собой L, или A, отсутствует; X₇ представляет собой G, или отсутствует; X₈ представляет собой S, G, или отсутствует; X₉ представляет собой T, G, P, или S; X₁₀ представляет собой D, или E.

[0008] В настоящем описании представлены T-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1185), где X₂ представляет собой A, G, V, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, N, A, Y, R или P; X₄ представляет собой E, S, A, G, F, N, D, V, P, L, I, M или R; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, A, S, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A или N; X₁₁ представляет собой Y, F, Q, R или N; X₁₂ представляет собой K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, M, F или V; X₁₄ представляет собой I, T, S, R, Y или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀KX₁₂I (SEQ ID NO: 1186), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой А, V или Е; X₃ представляет собой S, N, T, R или P; X₄ представляет собой E, A, G, F, V, P, I, D или S; X₅ представляет собой R, H, T, A P, S, G или F; X₆ представляет собой G, H, L, T, S или A, отсутствует; X₇ представляет собой S, T или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, T или отсутствует; Х₁₀ представляет собой F, Y или N; X₁₂ представляет собой Y, T или L; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YKYI (SEQ ID NO: 1187), где X₂ представляет собой A, V или E; X₃ представляет собой S, N или R; X₄ представляет собой E, G, V, P, I или D; X₅ представляет собой R, T, P, S, G или F; X₆ представляет собой G, T, S или отсутствует; X₇ представляет собой S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; Х₉ представляет собой Т или отсутствует; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1188), где X₂ представляет собой G, V, Q или M; X₃ представляет собой G, A, Y, S, N или R; X₄ представляет собой S, G, L, I, M или R; Х₅ представляет собой N, D, G, S, L, Q или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, D, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; X₁₄ представляет собой S, T или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃T (SEQ ID NO: 1189), где X₂ представляет собой G, V или Q; X₃ представляет собой G, Y, S или N; Х₄ представляет собой S, L или М; Х₅ представляет собой N, G, L или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇YKLS (SEQ ID NO: 1190), где X₂ представляет собой G или V; Х₃ представляет собой А или Y; X₄ представляет собой G, S или R; Х₅ представляет собой D или S; X₆ представляет собой N или отсутствует; X₇ представляет собой D или отсутствует.

[0009] В настоящем описании предложены T-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где: область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO:1200), X₂ представляет собой S, V, или I; X₃ представляет собой S, N, или A; X₄ представляет собой R, V, S, L, P, G, I, или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, R, T, или S; X₆ представляет собой L, G, A, D, R, V, или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T, или отсутствует; X₈ представляет собой S, или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, V, T, D, L, или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N, или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G, или N; X₁₂ представляет собой T, E, G, или K; X₁₃ представляет собой Q, Y, или L; X₁₄ представляет собой Y, F, T, или I; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO:1201), где X₄ представляет собой R, V, S, L, G, или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, T, или S; X₆ представляет собой A, L, R, D, G, или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, T, или отсутствует; X₈ представляет собой S, или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, T, D, L, или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N, или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G, или N; X₁₂ представляет собой T, E, или G; X₁₃ представляет собой Q, Y, или L; X₁₄ представляет собой Y, F, или T; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀TQY (SEQ ID NO: 1202), где X₄ представляет собой R, L, или G; X₅ представляет собой F, V, T, или Y; X₆ представляет собой L, или A, отсутствует; X₇ представляет собой G, или отсутствует; X₈ представляет собой S, G, или отсутствует; X₉ представляет собой T, G, P, или S; X₁₀ представляет собой D, или E.

[0010] В настоящем описании предложены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную бета область (Vβ), где: область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988, 1002 или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994 или 1010 или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности.

[0011] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит: область 1, определяющую комплементарность (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1191), где X₁ представляет собой N, S, D, T или V; X₂ представляет собой S, V, R, T или I; Х₃ представляет собой М, F, G, S, N, А, L, V или Р; X₄ представляет собой F, S, N, A или отсутствует; X₅ представляет собой D, S, Q, Y, N, V, T или P; и X₆ представляет собой Y, S, R, N, G или T; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1192), где X₁ представляет собой I, V, L, G, N, T, Y или M; X₂ представляет собой S, V, Y, L, P, F, I или T; X₃ представляет собой S, Y, K, L, T или F; X₄ представляет собой I, G, N, A, S или отсутствует; X₅ представляет собой S, D или отсутствует; X₆ представляет собой K, G, N, S, D, T или E; X₇ представляет собой D, E, G, A, K, L или N; и X₈ представляет собой K, V, D, P, N, T, L или M.

[0012] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность SX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1203), где X₂ представляет собой G или N; Х₃ представляет собой Н или D; Х₄ представляет собой Т, L, N или V; и X₅ представляет собой A, S, Y или T; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1204), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Q, Y или N; X₃ представляет собой G, N, R или Y; X₄ представляет собой N, G, E или T; X₅ представляет собой S, E, A или G; и X₆ представляет собой A, E, I или Q.

[0013] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связывает или распознает пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E7 в контексте молекулы MHC, пептидный эпитоп представляет собой или содержит E7 (11-19) YMLDLQPET (SEQ ID NO:236).

[0014] В некоторых вариантах осуществления TCR, предложенных в настоящем описании, область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988 или 1002, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999; и/или область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994, 1010 или 1381 или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380.

[0015] В некоторых вариантах осуществления область Vα дополнительно содержит: область 1, определяющую комплементарность (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 692, 710, 727, 742, 760, 171, 800, 816, 570, 909, 938, 151 или 1000; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 693, 711, 728, 743, 761, 172, 801, 817, 831, 571, 910, 939 152 или 1001.

[0016] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит: область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 701, 719, 154, 751 или 139; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 702, 720, 155, 752, 140 или 918.

[0017] В некоторых вариантах осуществления, область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 692, 693 и 694, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 703, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 712, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 721, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 729, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 736, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 744, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 753, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 760, 761 и 762, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 769, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 776, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 782, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 788, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 794, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 800, 801 и 802, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 809, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 818, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 825, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831 и 832, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 840, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 846, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 852, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831and 858, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 864, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 870, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 876, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 882, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 888, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 896, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 902, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 909, 910 и 911, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 919, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 926, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 932, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 938, 939 и 940, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 946, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 952, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 958, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151,152 и 964, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 970, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 976, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 982, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 988, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 729 и 994, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1000, 1001 и 1002, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 1009 и 1010, соответственно.

[0018] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленные в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937 951, 963, 975, 987, 999 или 1390; и/или область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленные в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380.

[0019] В некоторых вариантах осуществления, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 691 и 700, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 709 и 718, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:726 и 735, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:741 и 750, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:759 и 768, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:775 и 781, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:787 и 793, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:799 и 808, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:815 и 824, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:830 и 839, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:845 и 851, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:857 и 863, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:869 и 875, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:881 и 887, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:895 и 901, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:908 и 917, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:925 и 931, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:937 и 945, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:951 и 957, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:963 и 969, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:975 и 981, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:987 и 993, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:999 и 1008, соответственно; или области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1390 и 1380, соответственно.

[0020] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь дополнительно содержит константную область альфа (Cα) и/или бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ).

[0021] В некоторых вариантах осуществления области Cα и Cβ представляют собой константные области мыши. В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 262, 833, 1012, 1014, 1015, 1017, 1018, 1362, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 263, 1013 или 1016, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0022] В некоторых вариантах осуществления области Cα и Cβ представляют собой константные области человека. В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0023] В некоторых вариантах осуществления а) альфа-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 687, 705, 722, 737, 755, 771, 783, 795, 811, 826, 841, 853, 865, 877, 891, 904, 921, 933, 947 959, 971, 983, 995, 1386, последовательности аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1049, 1051, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1073, 1075, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или бета-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 696, 714, 731, 746, 764, 777, 789, 804, 820, 835, 847, 859, 871, 883, 897, 913, 927, 941, 953, 965, 977, 989, 1004 или 1376, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1050, 1052, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090 или 1092, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0024] В некоторых вариантах осуществления альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 687 и 696, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 705 и 714, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 722 и 731, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 737 и 746, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 755 и 764, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 771 и 777, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 783 и 789, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 795 и 804, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 811 и 820, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 826 и 835, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 841 и 847, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 853 и 859, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 865 и 871, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 877 и 883, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 891 и 897, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 904 и 913, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 921 и 927, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 933 и 941, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 947 и 953, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 959 и 965, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 971 и 977, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 983 и 989, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 995 и 1004, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1386 и 1376, соответственно.

[0025] В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более модификаций в α-цепи и/или β-цепи, так что, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются в клетке, частота ошибочного спаривания между α-цепью и β-цепью TCR и α-цепью и β-цепью эндогенного TCR уменьшается, экспрессия α-цепи и β-цепи TCR увеличивается и/или повышается стабильность α-цепи и β-цепи TCR, каждая по сравнению с экспрессией в клетке TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, не содержащих одной или более модификаций. В некоторых вариантах осуществления одна или более модификаций представляют собой замену, делецию или вставку одной или более аминокислот в области Cα и/или области Cβ. В некоторых вариантах осуществления одна или более модификаций содержат замену(замены) для введения одного или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

[0026] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Cα, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 48 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 или 524, или в положении, соответствующем положению 49 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 215 или 220; и/или область Cβ, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 57 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 214 или 216, или в положении, соответствующем положению 58 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 631 или 889. В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 200, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, содержащие один или более остатков цистеина, способных к образованию ненативной дисульфидной связи с бета-цепью; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 197,199, 632 или 890, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, которые содержит один или более остатков цистеина, способных к образованию ненативной дисульфидной связи с альфа-цепью.

[0027] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируются нуклеотидной последовательностью, которая была оптимизирована по кодонам. В некоторых вариантах осуществления а) альфа-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 688, 706, 723, 738, 756, 772, 784, 796, 812, 827, 842, 854, 866, 878, 892, 905, 922, 934, 948, 960, 972, 984, 996 или 1387, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1129, 1131, 1133, 1135, 1137, 1139, 1141, 1143, 1145, 1147, 1149, 1151, 1153, 1155, 1157, 1159, 1161, 1163, 1165, 1167, 1169, 1171, 1173 или 1385, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или бета-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 697, 715, 732, 747, 765, 778, 790, 805, 821, 836, 848, 860, 872, 884, 898, 914, 928, 942, 954, 966, 978, 990, 1005 или 1377, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174 или 1375, или нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0028] В некоторых вариантах осуществления альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 688 и 697, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 706 и 715, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 723 и 732, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 738 и 747, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 756 и 765, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 772 и 778, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 784 и 790, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 796 и 805, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 812 и 821, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 827 и 836, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 842 и 848, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 854 и 860, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 866 и 872, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 878 и 884, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 892 и 898, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 905 и 914, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 922 и 928, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 934 и 942, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 948 и 954, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 960 и 966, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 972 и 978, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 984 и 990, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 996 и 1005, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1387 и 1377, соответственно.

[0029] В некоторых вариантах осуществления альфа- и/или бета-цепь дополнительно содержит сигнальный пептид.

[0030] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 181, 184, 187, 189, 190, 192, 193, 310, 311; и/или бета-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 182, 185, 186, 188, 191 или 194.

[0031] В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент выделены или очищены или являются рекомбинантными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются моноклональными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются одноцепочечными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат две цепи.

[0032] В некоторых вариантах осуществления представленного TCR или его антигенсвязывающего фрагмента антигенспецифичность является, по меньшей мере, частично CD8-независимой.

[0033] В некоторых вариантах осуществления представленного TCR или его антигенсвязывающего фрагмента молекула MHC представляет собой молекулу HLA-A2.

[0034] Также в настоящем описании представлены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, или их альфа- или бета-цепь.

[0035] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, где: нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1049, 1051, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1073, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, или в нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичность последовательности; нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1050, 1052, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090 или 1092, или нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0036] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность оптимизирована по кодонам.

[0037] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, где: нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1129, 1131, 1133, 1135, 1137, 1139, 1141, 1143, 1145, 1147, 1149, 1151, 1153, 1155, 1157, 1159, 1161, 1163, 1165, 1167, 1169, 1171, 1173 или 1385 или нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174 или 1375, или нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0038] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы. В некоторых вариантах осуществления пептид, который вызывает пропуск рибосомы, представляет собой пептид P2A или T2A и/или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 204 или 211.

[0039] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462. 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472 или 1382, или нуклеотидной последовательности, имеющей с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0040] В настоящем описании также представлены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где: область Vα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676, или аминокислотная последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или область Vβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.

[0041] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂RX₄AX₆NNDMR, где X₂ представляет собой V или M; Х₄ представляет собой Р или D; и X₆ представляет собой N или R (SEQ ID NO: 1221). В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄WGX₇SNQPX₁₂H, где X₄ представляет собой L, F или P; X₇ представляет собой R или Q; и X₁₂ представляет собой Q или L (SEQ ID NO: 1216); или область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈SGNTIY, где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой W или Q; X₆ представляет собой G или P; Х₇ представляет собой R или S; и X₈ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 1217).

[0042] В настоящем описании также представлены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную бета область (Vβ), где область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂RX₄AX₆NNDMR, где X₂ представляет собой V или M; Х₄ представляет собой Р или D; и X₆ представляет собой N или R (SEQ ID NO: 1221).

[0043] В настоящем описании также представлены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где: область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄WGX₇SNQPX₁₂H, где X₄ представляет собой L, F или P; X₇ представляет собой R или Q; и X₁₂ представляет собой Q или L (SEQ ID NO: 1216); или область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈SGNTIY, где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой W или Q; X₆ представляет собой G или P; Х₇ представляет собой R или S; и X₈ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 1217).

[0044] В настоящем описании также представлены Т-клеточные рецепторы (TCR) или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную бета область (Vβ), где: область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679, или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности; область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686, или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности.

[0045] В любом из предложенных в настоящем описании вариантов осуществления область Vα содержит: область 1, определяющую комплементарность (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1191), где X₁ представляет собой N, S, D, T, или V; X₂ представляет собой S, V, R, T или I; Х₃ представляет собой М, F, G, S, N, А, L, V или Р; X₄ представляет собой F, S, N, A или отсутствует; X₅ представляет собой D, S, Q, Y, N, V, T или P; и X₆ представляет собой Y, S, R, N, G или T; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1192), где X₁ представляет собой I, V, L, G, N, T, Y или M; X₂ представляет собой S, V, Y, L, P, F, I или T; X₃ представляет собой S, Y, K, L, T или F; X₄ представляет собой I, G, N, A, S или отсутствует; X₅ представляет собой S, D или отсутствует; X₆ представляет собой K, G, N, S, D, T или E; X₇ представляет собой D, E, G, A, K, L или N; и X₈ представляет собой K, V, D, P, N, T, L или M.

[0046] В любом из предложенных в настоящем описании вариантов осуществления область Vβ содержит: область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность SX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1203), где X₂ представляет собой G или N; Х₃ представляет собой Н или D; Х₄ представляет собой Т, L, N или V; и X₅ представляет собой A, S, Y или T; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1204), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Q, Y или N; X₃ представляет собой G, N, R или Y; X₄ представляет собой N, G, E или T; X₅ представляет собой S, E, A или G; и X₆ представляет собой A, E, I или Q.

[0047] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связывает или распознает пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E6 в контексте молекулы MHC, пептидный эпитоп представляет собой или содержит E6 (29-38) TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233).

[0048] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676; и/или область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686 или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685.

[0049] В некоторых вариантах осуществления область Vα также содержит: область 1, определяющую комплементарность (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 161, 165, 537, 570, 142, 171 или 677; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 162, 166, 538, 571, 143, 172 или 678.

[0050] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит: область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 484, 148, 546, 561, 579, 168, 668 или 154; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 485, 149, 547, 562, 580, 169, 669 или 155.

[0051] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 478, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 484, 485 и 486, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 493, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 505, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 511, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 517, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 523, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 531, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 537, 538 и 539, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 546, 547 и 548, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 555, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 563, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 572, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 579, 580 и 581, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 594, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 606, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 612, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 618, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 624, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 630, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 638, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 644, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 650, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 656, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 662, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 668, 669 и 670, соответственно; или область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 677, 678 и 679, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 686, соответственно.

[0052] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленные в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676; и/или область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленные в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685.

[0053] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 478, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 484, 485 и 486, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 493, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 505, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 511, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 517, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 523, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 531, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 537, 538 и 539, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 546, 547 и 548, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 555, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 563, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 572, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 579, 580 и 581, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 594, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 606, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 612, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 618, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 624, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 630, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 638, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 644, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 650, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 656, соответственно; область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 662, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 668, 669 и 670, соответственно; или область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 677, 678 и 679, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 686, соответственно.

[0054] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь дополнительно содержит константную область альфа (Cα) и/или бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ).

[0055] В некоторых вариантах осуществления области Cα и Cβ представляют собой константные области мыши.

[0056] В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 262, 833, 1012, 1014, 1015, 1017, 1018 или 1362, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 263, 1013 или 1016, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0057] В некоторых вариантах осуществления области Cα и Cβ представляют собой константные области человека. В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0058] В некоторых вариантах осуществления а) альфа-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 473, 488, 500, 506, 518, 532, 550, 565, 583, 595, 607, 619, 633, 645, 657 или 672, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 389, 430, 1019, 1021, 1023, 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043 или 1045, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или бета-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 479, 494, 512, 526, 541, 556, 574, 589, 601, 613, 625, 639, 651, 663 или 681, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 390, 431, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044 или 1046, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0059] В некоторых вариантах осуществления альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 473 и 479, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 488 и 494, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 500 и 494, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 506 и 512, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 518 и 526, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 532 и 541, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 550 и 556, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 565 и 574, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 583 и 589, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 595 и 601, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 607 и 613, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 619 и 625, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 633 и 639, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 645 и 651, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 657 и 663, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 672 и 681, соответственно.

[0060] В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более модификаций в α-цепи и/или β-цепи, так что, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются в клетке, частота ошибочного спаривания между α-цепью и β-цепью TCR и α-цепью и β-цепью эндогенного TCR уменьшается, экспрессия α-цепи и β-цепи TCR увеличивается и/или повышается стабильность α-цепи и β-цепи TCR, каждая по сравнению с экспрессией в клетке TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, не содержащих одной или более модификаций. В некоторых вариантах осуществления одна или более модификаций представляют собой замену, делецию или вставку одной или более аминокислот в области Cα и/или области Cβ. В некоторых вариантах осуществления одна или более модификаций содержат замену(замены) для введения одного или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Cα, содержащую цистеин, в положении, соответствующем положению 48 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 или 524, или в положении, соответствующем положению 49 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 215 или 220; и/или область Cβ, содержащую цистеин, в положении, соответствующем положению 57 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 214 или 216, или в положении, соответствующем положению 58 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 631 или 889.

[0061] В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 200, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, содержащие один или более остатков цистеина, способных к образованию ненативной дисульфидной связи с бета-цепью; и/или область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 197,199, 632 или 890, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, которые содержит один или более остатков цистеина, способных к образованию ненативной дисульфидной связи с альфа-цепью.

[0062] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируются нуклеотидной последовательностью, которая была оптимизирована по кодонам.

[0063] В некоторых вариантах осуществления а) альфа-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 474, 489, 501, 507, 519, 533, 551, 566, 584, 596, 608, 620, 634, 646, 658 или 673, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1115, 1117, 1119, 1121, 1123, 1125 или 1127, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или бета-цепь содержит: аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 480, 495, 513, 527, 542, 557, 575, 590, 602, 614, 626, 640, 652, 664 или 682, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126 или 1128, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0064] В некоторых вариантах осуществления альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 474 и 482, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 489 и 497, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 501 и 497, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 507 и 515, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 519 и 529, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 533 и 544, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 551 и 559, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 566 и 577, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 584 и 592, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 596 и 604, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 608 и 616, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 620 и 628, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 634 и 642, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 646 и 654, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 658 и 666, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 673 и 684, соответственно.

[0065] В некоторых вариантах осуществления альфа- и/или бета-цепь дополнительно содержит сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 181, 184, 187, 189, 190, 192, 193, 310, 311; и/или бета-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 182, 185, 186, 188, 191 или 194.

[0066] В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент выделены или очищены или являются рекомбинантными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются моноклональными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются одноцепочечными. В некоторых вариантах осуществления представленный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат две цепи.

[0067] В некоторых вариантах осуществления представленного TCR или его антигенсвязывающего фрагмента антигенспецифичность является, по меньшей мере, частично CD8-независимой.

[0068] В некоторых вариантах осуществления представленного TCR или его антигенсвязывающего фрагмента молекула MHC представляет собой молекулу HLA-A2.

[0069] Также в настоящем описании представлены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, или их альфа- или бета-цепь.

[0070] В некоторых вариантах осуществления представленная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, где: нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 389., 430, 1019, 1021, 1023, 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043 или 1045, или нуклеотидной последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 390, 431, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034,1036, 1038, 1040, 1042, 1044 или 1046, или нуклеотидная последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0071] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность оптимизирована по кодонам.

[0072] В некоторых вариантах осуществления представленная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, где: нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOS: 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1115, 1117, 1119, 1121, 1123, 1125 или 1127, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126 или 1128, или нуклеотидная последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0073] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы. В некоторых вариантах осуществления пептид, который вызывает пропуск рибосомы, представляет собой пептид P2A или T2A и/или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 204 или 211.

[0074] В некоторых вариантах осуществления представленная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 или 447, или нуклеотидной последовательности, имеющей с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

[0075] В некоторых вариантах нуклеиновая кислота является синтетической. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.

[0076] В настоящем описании также представлены полинуклеотиды, содержащие (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из TCR или его антигенсвязывающую часть, представленные в настоящем описании, или содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из представленного TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем описании и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

[0077] Также в настоящем описании представлен полинуклеотид, содержащий (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть Т-клеточного рецептора (TCR), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая (i) бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержит вариабельную область бета (Vβ)) любого TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, и константную область бета (Cβ); и (ii) часть альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, где часть цепи TCRα составляет менее чем полноразмерная цепь TCRα и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

[0078] В некоторых вариантах осуществления любого из полинуклеотидов, предложенных в настоящем описании, цепь TCRα содержит константную область альфа (Cα), где по меньшей мере часть указанной Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления любого из полинуклеотидов, предложенных в настоящем описании, последовательность нуклеиновой кислоты (а) и один из одного или более плеч гомологии вместе содержат последовательность нуклеотидов, кодирующую Cα, которая менее чем полная длина нативной Cα, где по меньшей мере часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь TCRβ, находится в 5'-области от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRα.

[0079] В некоторых вариантах осуществления любого из предложенных в настоящем описании полинуклеотидов последовательность нуклеиновой кислоты (а) не содержит интрона. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (а) представляет собой последовательность, которая является экзогенной или гетерологичной для открытой рамки считывания эндогенного геномного локуса TRAC Т-клетки, необязательно Т-клетки человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке с одним или более экзонами или их частичной последовательностью, необязательно экзоном 1 или его частичной последовательностью, открытой рамки считывания локуса TRAC, содержащейся в одном или более плечах гомологии. В некоторых вариантах осуществления часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cα меньше полной длины нативной Cα. В некоторых вариантах осуществления дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 3155 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 348, или одним или более ее экзонами, или последовательностью, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 3155 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 348, или одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления дополнительная часть Cα кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1364, или последовательностью, которая демонстрирует, по меньшей мере, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1364 или ее частичной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления дополнительная часть области Cα и/или области Cβ, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или вставку одной или более аминокислот по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, причем необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

[0080] В некоторых вариантах осуществления любого из полинуклеотидов, предложенных в настоящем описании, одно или более плеч гомологии содержат 5'-плечо гомологии и/или 3'-плечо гомологии. В некоторых вариантах осуществления 5'-плечо гомологии содержит: а) последовательность, содержащую, по меньшей мере, содержащую или, по меньшей мере, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1343; b) последовательность, содержащую, по меньшей мере, содержащую или, по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1343; или c) последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1343. В некоторых вариантах осуществления 3'-плечо гомологии содержит: а) последовательность, содержащую, по меньшей мере, содержащую или, по меньшей мере, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1344; b) последовательность, содержащую, по меньшей мере, содержащую или, по меньшей мере, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1344; или c) последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1344.

[0081] В настоящем описании представлен полинуклеотид, содержащий (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из TCR или антигенсвязывающих фрагментов, предложенных в настоящем описании, или любую одну из молекул нуклеиновой кислоты, предложенных в настоящем описании, кодирующую TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

[0082] В настоящем описании представлен полинуклеотид, содержащий (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть Т-клеточного рецептора (TCR), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая (i) альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα), содержит вариабельную область альфа (Vα) любого TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем описании, и константную область альфа (Cα); и (ii) часть бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, где часть цепи TCRβ меньше полноразмерной цепи TCRβ и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

[0083] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных полинуклеотидов цепь TCRβ содержит константную область бета (Cβ), где, по меньшей мере, часть указанной Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (a) и один из одного или более плеч гомологии вместе содержат последовательность нуклеотидов, кодирующих Cβ, которая меньше полной длины нативногой Cβ, где по меньшей мере часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательности, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь TCRα, находится в 5'-области от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRα.

[0084] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных полинуклеотидов последовательность нуклеиновой кислоты (а) не содержит интрон. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (а) представляет собой последовательность, которая является экзогенной или гетерологичной для открытой рамки считывания эндогенного геномного локуса TRBC Т-клетки, необязательно Т-клетки человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке с одним или более экзонами или их частичной последовательностью, необязательно экзоном 1 или его частичной последовательностью, открытой рамки считывания локуса TRBC, содержащейся в одном или более плечах гомологии. В некоторых вариантах осуществления часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cβ меньше полной длины нативной Cβ. В некоторых вариантах осуществления дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 349, или одним или более ее экзонами, или последовательностью, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 349, или одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью; или последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1047, или одним или более ее экзонами, или последовательностью, которая демонстрирует, по меньшей мере, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1047, или одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или вставку одной или более аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, причем необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

[0085] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных полинуклеотидов одно или более плеч гомологии содержат 5'-плечо гомологии и/или 3'-плечо гомологии.

[0086] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных полинуклеотидов последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более полицистронных элементов. В некоторых вариантах осуществления полицистронный элемент(элементы) расположен между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или его часть, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или его часть. В некоторых вариантах осуществления один или более полицистронных элементов находятся в 5'-области от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или часть TCR, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR. В некоторых вариантах осуществления один или более полицистронных элементов представляют собой или содержат последовательность пропуска рибосомы, необязательно, где последовательность пропуска рибосомы представляет собой элемент T2A, P2A, E2A или F2A.

[0087] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных полинуклеотидов последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более гетерологичных или регуляторных контрольных элементов, функционально связанных с контролем экспрессии TCR, когда он экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления один или более гетерологичных регуляторных или контрольных элементов содержат промотор, энхансер, интрон, сигнал полиаденилирования, консенсусную последовательность Козака, акцепторную последовательность сплайсинга и/или донорную последовательность сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный регуляторный или контрольный элемент содержит гетерологичный промотор, необязательно промотор фактора элонгации 1 альфа человека (EF1α) или промотор MND или его вариант.

[0088] В некоторых вариантах осуществления представленный полинуклеотид представляет собой линейный полинуклеотид, необязательно двухцепочечный полинуклеотид или одноцепочечный полинуклеотид.

[0089] В настоящем описании также представлены векторы, содержащие любую из молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем документе, или любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор происходит из HIV-1. В некоторых вариантах осуществления любого из представленных векторов вирусный вектор представляет собой вектор AAV. В некоторых вариантах осуществления вектор AAV выбран из вектора AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 или AAV8.

[0090] В настоящем описании также представлены сконструированные клетки. В некоторых вариантах осуществления представленные сконструированные клетки содержат любую из молекул нуклеиновой кислоты, предложенных в настоящем описании, любой из полинуклеотидов, предложенных в настоящем описании, или любой из векторов, предложенных в настоящем описании.

[0091] В настоящем описании также представлены сконструированные клетки. В некоторых вариантах осуществления представленные сконструированные клетки содержат любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе.

[0092] В некоторых вариантах осуществления представленные сконструированные клетки содержат генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC). В некоторых вариантах осуществления ген TRBC представляет собой один или оба из гена константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или гена константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2).

[0093] В настоящем описании также представлены сконструированные клетки, содержащие TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, где: (1) клетка содержит генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC) и/или не экспрессирует, или не экспрессирует на детектируемом уровне, или экспрессирует менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от уровня дикого типа, генный продукт эндогенного TRAC или TRBC; и (2) TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат любой TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, представленный в настоящем описании, необязательно рекомбинантный TCR или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора (TRAC).

[0094] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток эндогенный локус TRAC дополнительно модифицируется путем интеграции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, в локусе TRAC, необязательно посредством направляемой гомологией репарации (HDR). В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус TRAC дополнительно модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, необязательно посредством направляемой гомологией репарации (HDR).

[0095] В настоящем описании также представлена сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRAC, кодирующий любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем описании.

[0096] В настоящем описании также представлена сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRAC, где эндогенный локус TRAC модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, причем указанная трансгенная последовательность кодирует (i) бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента и константную область бета (Cβ); и (ii) часть альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, где по меньшей мере часть константной области альфа (Cα) TCR кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью.

[0097] В некоторых из любых вариантов осуществления представленных сконструированных клеток TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Cα, причем по меньшей мере часть указанной Cα кодируется открытой рамкой считывания или ее частичной последовательностью эндогенного локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус TRAC содержит слияние в рамке (i) трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, и (ii) открытой рамки считывания или ее частичной последовательности эндогенного локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления трансгенная последовательность не содержит последовательности, кодирующей 3'-UTR или интрон. В некоторых вариантах осуществления открытая рамка считывания или ее частичная последовательность содержит 3'-UTR эндогенного локуса TRAC.

[0098] В некоторых из любых вариантов осуществления представленных сконструированных клеток трансгенная последовательность интегрирована в 3'-области от большинства 5'-нуклеотидов экзона 1 и в 5'-области от большинства 3'-нуклеотидов экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть Cα кодируется по меньшей мере экзонами 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть Cα кодируется по меньшей мере частью экзона 1 и экзонов 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.

[0099] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток трансгенная последовательность кодирует бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ) и/или вариабельную область альфа TCR (Vα).

[0100] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток сконструированная клетка дополнительно содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC), необязательно локуса TRBC1 или TRBC2.

[0101] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток сконструированная клетка содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC). В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус TRBC дополнительно модифицируется путем интеграции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, в локус TRBC, необязательно через HDR. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус TRBC дополнительно модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно посредством репарации, направляемой гомологией (HDR).

[0102] В настоящем описании представлена сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRBC, кодирующий любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0103] В настоящем описании представлена сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRBC, где эндогенный локус TRBC модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, причем указанная трансгенная последовательность кодирует (i) альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента и константную область альфа (Cα); и (ii) часть бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) любого из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, где по меньшей мере часть константной области бета (Cβ) TCR кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью.

[0104] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Cβ, причем по меньшей мере, часть указанной Cβ кодируется открытой рамкой считывания или ее частичной последовательностью эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус TRBC содержит слияние в рамке (i) трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, и (ii) открытой рамки считывания или ее частичной последовательности эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах осуществления трансгенная последовательность не содержит последовательности, кодирующей 3'-UTR или интрон. В некоторых вариантах осуществления открытая рамка считывания или ее частичная последовательность содержит 3'-UTR эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах осуществления трансгенная последовательность интегрирована в 3'-области от большинства 5'-нуклеотидов экзона 1 и в 5'-области от большинства 3'-нуклеотидов экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть Cβ кодируется по меньшей мере экзонами 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть Cβ кодируется по меньшей мере частью экзона 1 и экзонов 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.

[0105] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток трансгенная последовательность кодирует альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα) и/или вариабельную область бета TCR (Vβ).

[0106] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток локус TRBC представляет собой один или оба из локуса константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2). В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка дополнительно содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

[0107] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток трансгенная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит один или более полицистронных элементов. В некоторых вариантах осуществления один или более полицистронных элементов находятся в 5'-области от трансгенной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полицистронный элемент(элементы) расположен между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или его часть, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или его часть. В некоторых вариантах осуществления один или более полицистронных элементов представляют собой или содержат последовательность пропуска рибосомы, необязательно, где последовательность пропуска рибосомы представляет собой элемент T2A, P2A, E2A или F2A.

[0108] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток трансгенная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит один или более гетерологичных или регуляторных контрольных элементов, функционально связанных с контролем экспрессии TCR, при экспрессии из сконструированной. В некоторых вариантах осуществления один или более гетерологичных регуляторных или контрольных элементов содержат промотор, энхансер, интрон, сигнал полиаденилирования, консенсусную последовательность Козака, акцепторную последовательность сплайсинга и/или донорную последовательность сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный регуляторный или контрольный элемент содержит гетерологичный промотор, необязательно промотор фактора элонгации 1 альфа человека (EF1α) или промотор MND или его вариант.

[0109] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных сконструированных клеток TCR или его антигенсвязывающий фрагмент является гетерологичным по отношению к клетке. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка представляет собой клеточную линию. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка представляет собой первичную клетку, полученную от пациента. В некоторых вариантах осуществления пациентом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD8+. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD4+.

[0110] В настоящем описании также представлены способы получения любых сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, которые включают введение любого из векторов, описанных в настоящем документе, в клетку in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, и введение осуществляется путем трансдукции.

[0111] В настоящем описании также представлен способ получения клетки, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем описании, любой из молекулы нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, любого из полинуклеотидов, предложенных в настоящем описании, или любого из векторов, предложенных в настоящем описании, в клетку in vitro или ex vivo.

[0112] В некоторых вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают введение в клетку одного или более агентов, где каждый из одного или более агентов независимо способен индуцировать генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC). В некоторых вариантах осуществления один или более агентов, способных индуцировать генетическое нарушение, включают ДНК-связывающий белок или ДНК-связывающую нуклеиновую кислоту, которая специфически связывается или гибридизуется с сайтом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение, включают (а) слитый белок, содержащий ДНК-нацеленный белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых вариантах осуществления ДНК-нацеленный белок или РНК-направленная нуклеаза включают белок цинкового пальца (ZFP), белок TAL или нуклеазу (Cas), ассоциированную с нуклеиновой кислотой CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), специфичную для сайта-мишени в пределах гена TRAC и/или TRBC. В некоторых вариантах осуществления один или более агентов включают нуклеазу цинкового пальца (ZFN), нуклеазу TAL-эффектора (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, которая специфически связывается, распознает или гибридизуется с сайтом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления каждый из одного или более агентов содержит гид-РНК (гРНК), имеющую нацеливающий домен, который комплементарен по меньшей мере одному сайту-мишени.

[0113] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов вводят в виде рибонуклеопротеинового комплекса (RNP), содержащего гРНК и белок Cas9. В некоторых вариантах осуществления RNP вводят посредством электропорации, генной пушки, трансфекции фосфатом кальция, сжатия или сдавливания клеток. В некоторых вариантах осуществления RNP вводят посредством электропорации.

[0114] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов вводят в виде одного или более полинуклеотидов, кодирующих гРНК и/или белок Cas9.

[0115] В некоторых вариантах осуществления любого из представленных способов один или более агентов и молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотида или вектора вводят одновременно или последовательно, в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или вектор вводят после введения одного или более агентов. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или вектор вводят сразу после или в течение примерно 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 6 минут, 6 минут, 8 минут, 9 минуты, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 40 минут, 50 минут, 60 минут, 90 минут, 2 часов, 3 часов или 4 часов после введения агента.

[0116] В настоящем описании также представлены композиции. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат любые из сконструированных клеток, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки содержат CD4+ и/или CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки содержат CD4+ и CD8+ T-клетки.

[0117] В настоящем описании также представлены композиции. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат любые сконструированные клетки CD8+ и любые сконструированные клетки CD4+, описанные в настоящем документе.

[0118] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связывают или распознает пептидный эпитоп HPV 16 в контексте молекулы МНС, которая является по меньшей мере частично независимой от CD8. В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетка и CD4+ клетка сконструированы с одним и тем же TCR или его антигенсвязывающим фрагментом и/или каждая из них сконструирована с TCR или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связывают или распознают один и тот же пептидный эпитоп HPV 16 в контекст молекулы МНС.

[0119] В некоторых вариантах осуществления любая из предложенных в настоящем описании композиций также содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0120] В настоящем описании также представлены способы лечения. В некоторых вариантах осуществления представленные способы лечения включают введение любой из сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, пациенту, имеющему заболевание или расстройство, ассоциированное с HPV.

[0121] В настоящем описании также представлены способы лечения. В некоторых вариантах осуществления представленные способы лечения включают введение любой композиции, описанной в настоящем документе, пациенту, имеющему заболевание или расстройство, ассоциированное с HPV. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство ассоциировано с HPV16. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек.

[0122] В настоящем описании также представлены композиции, такие как любая из композиций, описанных в настоящем документе, для применения при лечении заболевания или расстройства, ассоциированного с HPV.

[0123] В настоящем описании также представлены применения композиций, таких как любая из предложенных в настоящем описании композиций, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с HPV. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство ассоциировано с HPV16. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек.

Краткое описание чертежей

[0124] ФИГ. 1 демонстрирует литическую активность моноклональных Т-клеточных линий, экспрессирующих иллюстративные TCR, инкубированные с клетками-мишенями SiHa или клетками-мишенями Caski, на основе процента клеток-мишеней, положительных по каспазе, в различные оценочные моменты времени. Конкретно, результаты показаны для Т-клеточных линий, экспрессирующих модифицированную версию TCR 5 и модифицированную версию TCR 12.

[0125] На ФИГ. 2A-2L показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat (Отр. кнтрл. CD4+), и CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, экспрессирующей различные E6(29-38)-специфичные TCR (CD4+ TCR-E6 (29)), CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 (CD8), или CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E6 (29-38) -специфичные TCR (CD8+ TCR-E6 (29)). В частности, результаты показаны для эталонного TCR, модифицированной версии TCR 5, модифицированной версии TCR 4, модифицированной версии TCR 3 и модифицированной версии TCR 8.

[0126] На ФИГ. 3А-3D показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat (Отр. контрл. CD4+), клеточной линией, экспрессирующей различные E7 (11-19) -специфичные TCR (CD4+ TCR-E7 (11-19)), CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 (CD8), или CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E7 (11-19) -специфичные TCR (CD8+ TCR-E7) (11-19)). В частности, результаты показаны для модифицированной версии TCR 7 и модифицированной версии TCR 12.

[0127] На ФИГ. 4А-4В показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat (Отр. кнтрл., CD4+), CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, экспрессирующей различные специфичные для E7 (86-93) TCR (CD4+ TCR-E7 (86-93)), CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 (CD8), или CD4+ клеточной линией, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E7 (86-93) -специфичные TCR (CD8+ TCR-E7(86-93)). В частности, результаты показаны для модифицированной версии TCR 11.

[0128] На ФИГ. 5А-5С показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера и в клеточной линии, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E6 (29-38) -специфичные TCR в CD8+ клетках. Результаты показаны для TCR 9, TCR13, TCR14, эталонного TCR, способного связываться с HLA-A2/E6 (29-38) (эталонный TCR) и клеток, которые были подвергнуты ложной трансфекции (имитация) (ФИГ.5A); TCR 17, TCR 21, TCR 22, эталонный TCR и Имитация (ФИГ. 5B); и TCR 18, TCR 23, TCR 24 и TCR 27 (ФИГ. 5C).

[0129] На ФИГ. 5D-5F показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера и в клеточной линии, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E6(29-38) -специфичные TCR. Результаты показаны для TCR 15, TCR 16, TCR 17, TCR 19, TCR 20 и TCR 21 (ФИГ. 5D); TCR 18, TCR 23, TCR 24, TCR 27 и TCR 28 (ФИГ. 5E); и TCR 25, TCR 26, TCR 29 и TCR 30 (ФИГ. 5F).

[0130] На ФИГ. 6А-6G показаны результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера и в клеточной линии, полученной из Jurkat, которая также экспрессирует экзогенный CD8 и различные E7(11-19) -специфичные TCR. Результаты показаны для TCR 12 и клеток, которые были ложно трансфецированы (имитация) (ФИГ.6A); TCR 31, TCR 32, TCR 33 и TCR 34 (ФИГ. 6B); TCR 12, TCR 49, TCR 50 и TCR 51 (ФИГ.6C); TCR 35, TCR 36, TCR 37, TCR 38, TCR 53 и TCR 54 (ФИГ.6D); TCR 39, TCR 40, TCR 41, TCR 42, TCR 43 и TCR 44 (ФИГ. 6E); и TCR 45, TCR 46, TCR 47, TCR 48, TCR 54 и TCR 55 (ФИГ. 6F). На ФИГ.6G показаны соответствующие результаты проточной цитометрии для связывания тетрамера в клетках, которые сконструированы для экспрессии рекомбинантных TCR, которые, как было обнаружено, демонстрируют CD8-зависимое связывание тетрамера (слева, TCR49) или CD8-независимое связывание тетрамера (справа, TCR37).

[0131] На ФИГ.7А и 7В показана эффективность нокаута эндогенного гена TCR в первичных Т-клетках, измеренная путем оценки экспрессии CD3 с использованием проточной цитометрии.

[0132] На ФИГ.8А показаны результаты проточной цитометрии для оценки эффективности нокаута эндогенного TCR в клетках, электропорированных RNP, нацеленных на эндогенные гены TCR (эндо. TCR KO) по сравнению с контрольными клетками (эндо. TCR WT). На ФИГ.8B показаны результаты анализа проточной цитометрией, оценивающего экспрессию суррогатного маркера для экспрессии TCR и связывания тетрамера E6 в CD4 и CD8 клетках. На ФИГ.8С показана продукция IFNγ клетками с эндогенным TCR (эндо. TCR WT) и эндогенным TCR KO (эндо. TCR KO) для TCR 16 и 31, и сравнивали с контролем ложной трансдукции.

[0133] На ФИГ. 9A-9J показана экспрессия TCR, которую оценивали по связыванию тетрамера E7 (11-19), цитолитической активности и продукции интерферона-гамма после инкубации с антиген-специфическими клетками-мишенями, в клетках, сконструированных для экспрессии различных иллюстративных рекомбинантных TCR. На ФИГ.9А (TCR 49), ФИГ.9D (TCR 53) и ФИГ.9G (TCR 37) показана экспрессия TCR, которую оценивали по связыванию тетрамера E7 (11-19). На ФИГ.9B (TCR 49), ФИГ. 9E (TCR 53), ФИГ. 9H (TCR 37) и ФИГ. 9J (TCR 37) показана цитолитическая активность, которую отслеживали по уменьшенному световому сигналу NucRed. На ФИГ. 9C (TCR 49), ФИГ. 9F (TCR 53), ФИГ. 9I (TCR 37) и ФИГ. 9J (TCR 37) показана продукция интерферона-гамма TCR-экспрессирующими клетками после инкубации с антиген-специфическими клетками-мишенями.

[0134] На ФИГ.10А-10В показана экспрессия иллюстративных TCR в клетках с нокаутом эндогенных генов TCR по сравнению с клетками, которые сохранили эндогенные гены TCR, что оценивали по связыванию тетрамера E7 (11-19).

[0135] На ФИГ.11А-11В показана оценка чувствительности к пептиду иллюстративных TCR в клетках с нокаутом эндогенных генов TCR по сравнению с клетками, которые сохранили эндогенные гены TCR, что оценивали по продукции гамма-интерферона после инкубации с T2-клетками, стимулированными пептидом.

[0136] На ФИГ. 12А показано, что лизис клеток-мишеней измеряли по потере мишени каждые 2 часа с использованием визуализации живых клеток. На ФИГ. 12B-12C показана оценка цитолитической активности и продукции цитокина интерферона-гамма примерными TCR в клетках с нокаутом эндогенных генов TCR по сравнению с клетками, которые сохранили эндогенные гены TCR.

[0137] На ФИГ. 13 показаны изменения объема опухоли с течением времени на мышиной модели с подкожными опухолями UPCI: SCC152 (ATCC® CRL-3240 ™), где мышам вводили только CD4+ рекомбинантные TCR-экспрессирующие клетки (перевернутый треугольник), только CD8+ рекомбинантные TCR-экспрессирующие клетки (треугольник) или смесь CD4+ и CD8+ рекомбинантных TCR-экспрессирующих клеток (квадрат) по сравнению с мышами, которые не получали никакого лечения (круг).

[0138] На ФИГ. 14A-14G представляют собой изображения нескольких иллюстративных гРНК.

[0139] На ФИГ. 14А изображена модульная молекула гРНК, частично полученная (или частично смоделированная на основе последовательности) из Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 42 и 43 Международной публикации РСТ. No. WO2015161276, соответственно в порядке появления);

[0140] На ФИГ. 14B изображена мономолекулярную (или химерная) молекула гРНК, частично полученная из S. pyogenes, в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 44 Международной публикации РСТ. No. WO2015161276);

[0141] На ФИГ. 14C изображена мономолекулярная молекула гРНК, полученная частично из S. pyogenes, в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 45 Международной публикации РСТ. No. WO2015161276);

[0142] На ФИГ. 14D изображена мономолекулярная молекула гРНК, частично полученная из S. pyogenes, в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 46 Международной публикации РСТ No. WO2015161276);

[0143] На ФИГ. 14E изображена мономолекулярная молекула гРНК, частично полученная из S. pyogenes, в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 47 Международной публикации РСТ. No. WO2015161276);

[0144] На ФИГ. 14F изображена модульная молекула гРНК, частично полученная из Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) в виде дуплексной структуры (SEQ ID NO: 48 и 49 Международной публикации РСТ No. WO2015161276, соответственно в порядке появления);

[0145] На ФИГ. 14G показано выравнивание модульных молекул гРНК S. pyogenes и S. thermophiles (SEQ ID NO: 50-53 Международной публикации РСТ No. WO2015161276, соответственно в порядке появления).

[0146] На ФИГ. 15A-15G изображено выравнивание последовательностей Cas9 от Chylinski et al. (RNA Biol. 2013; 10 (5): 726-737). N-концевой RuvC-подобный домен помечен рамкой и обозначен «у». Два других RuvC-подобных домена помечены рамкой и обозначены «b». HNH-подобный домен помечен рамкой и обозначен «g». Sm: S. mutans (SEQ ID NO: 1331); Sp: S. pyogenes (SEQ ID NO: 1332); St: S. thermophilus (SEQ ID NO: 1333); Li: L. innocua (SEQ ID NO: 1334). Мотив: это мотив на основе четырех последовательностей: остатки, сохраненные во всех четырех последовательностях, указаны однобуквенным сокращением аминокислот; «*» обозначает любую аминокислоту, найденную в соответствующем положении любой из четырех последовательностей; и «-» обозначает любую аминокислоту, например любую из 20 встречающихся в природе аминокислот.

[0147] На ФИГ. 16A-16C изображено выравнивание последовательностей Cas9 из S. pyogenes и Neisseria meningitides (N. meningitidis). N-концевой RuvC-подобный домен помечен рамкой и обозначен «Y». Два других RuvC-подобных домена помечены рамкой и обозначены «B». HNH-подобный домен помечен рамкой и обозначен «G». Sp: S. pyogenes; Нм: N. meningitidis. Мотив: это мотив на основе двух последовательностей: остатки, консервативные в обеих последовательностях, обозначены одним аминокислотным обозначением; «*» обозначает любую аминокислоту, найденную в соответствующем положении любой из двух последовательностей; «-» обозначает любую аминокислоту, например любую из 20 встречающихся в природе аминокислот, а «-» обозначает любую аминокислоту, например любую из 20 встречающихся в природе аминокислот, или то, что она отсутствует.

[0148] На ФИГ. 17А изображена поверхностная экспрессия CD8 и тетрамера пептид-МНС в комплексе с антигеном, распознаваемым примерным рекомбинантным TCR (TCR 49), что оценивали с помощью проточной цитометрии, для Т-клеток, подверженных нокауту эндогенных генов, кодирующих TCR, сконструированных для экспрессии TCR 49 с использованием различных способов экспрессии: клетки, подвергали лентивирусной трансдукции для случайной интеграции рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей («TCR 49 Lenti»), клетки, подвергали случайной интеграции, и CRISPR/Cas9-опосредованному нокаут (KO) TRAC («TCR 49 Lenti KO»); или клетки, подвергали направленной интеграции с помощью HDR в локусе TRAC рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, под контролем человеческого промотора EF1α (TCR 49 HDR KO). На ФИГ. 17B и 17C показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI; ФИГ. 17B) и коэффициент вариации (стандартное отклонение сигнала в популяции клеток, деленное на среднее значение сигнала в соответствующей популяции; ФИГ. 17C) экспрессии на клеточной поверхности связывания тетрамера пептид-MHC в CD8+ T-клетках, сконструированных для экспрессии TCR 49.

[0149] На ФИГ. 18А-18С изображено окрашивание и плотность рецептора для TCR (TCR 49) с использованием антитела Vbeta22, специфичного для рекомбинантного TCR или тетрамера пептид-MHC.

[0150] На ФИГ. 19 показана средняя цитолитическая активность различных рекомбинантных TCR 49-экспрессирующих CD8+ T-клеток, как описано выше, полученных от 2 доноров, представленных площадью под кривой (AUC)% умерщвления, по сравнению с контролем ложной трансдукции и нормализованной к экспрессии Vbeta22 (специфическое окрашивание для рекомбинантного TCR) для каждой группы, описанной выше, после инкубации эффекторных клеток, как описано выше, с клетками-мишенями, экспрессирующими E7 HPV 16 при соотношении эффектор/мишень (E:T) 10:1, 5:1 и 2,5:1. CD8+ Клетки, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим эталонный TCR, способный связываться с E7 HPV 16, но содержащий мышиные области Cα и Cβ, оценивали в качестве контроля («Lenti Ref»).

[0151] На ФИГ. 20 изображена средняя секреция IFNγ (пг/мл) различными рекомбинантными TCR 49-экспрессирующими CD8+ T-клетками, как описано выше.

[0152] На ФИГ. На ФИГ.21А и 21В показана поверхностная экспрессия CD8, CD3, Vbeta22 (специфическое окрашивание для рекомбинантного TCR) и тетрамера пептид-MHC в комплексе с антигеном, распознаваемым рекомбинантным TCR, согласно оценке проточной цитометрией для Т-клеток, подвергнутых нокауту эндогенных TCR-кодирующих генов, сконструированных для экспрессии рекомбинантного T-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных методов экспрессии: клеток, подвергнутых CRISPR/Cas9-опосредованному нокауту (KO) TRAC и TRBC («TCRαβ KO») или сохраняющих экспрессию эндогенного TCR («TCRαβ WT»); клеток, подвергнутых направленной интеграции с помощью HDR в локус TRAC рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α или MND («HDR EF1α» или «HDR MND»); клеток, подвергнутых лентивирусной трансдукции для случайной интеграции рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей («lenti человек») или рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, содержащих константный домен мыши («lenti мышь»), или ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.»).

[0153] На ФИГ. 21C и 21D показана среднегеометрическая интенсивность флуоресценции (gMFI) экспрессии на клеточной поверхности Vbeta22 и связывания тетрамера пептид-MHC в CD8+ (ФИГ. 21C) или CD4+ (ФИГ. 21D) Т-клетках, сконструированных для экспрессии рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных способов экспрессии, как описано выше.

[0154] На ФИГ. 21E и 21F показан коэффициент вариации (стандартное отклонение сигнала в популяции клеток, деленное на среднее значение сигнала в соответствующей популяции) в CD8+ T-клетках, сконструированных для экспрессии рекомбинантного T-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных методов экспрессии, как описано выше, для экспрессии тетрамера пептид-MHC (ФИГ. 21E) и связывания Vbeta22 (ФИГ. 21F).

[0155] На ФИГ. 22A-22C изображена поверхностная экспрессия CD3 и CD8, которую оценивали с помощью проточной цитометрии, для Т-клеток, подвергнутых нокауту эндогенных TCR-кодирующих генов, сконструированных для экспрессии рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных методов экспрессии: клетки, подвергнутые CRISPR/Cas9-опосредованному нокауту (KO) TRAC, TRBC или обоих TRAC и TRBC; клетки, подвергнутые направленной интеграции с помощью HDR в локусе TRAC рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α, промотором MND или эндогенным промотором TCR-альфа, с использованием последовательности пропуска рибосомы P2A («HDR EF1α», «HDR MND» или «HDR P2A», соответственно), или клетки, подвергнутые ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.») (ФИГ. 22A); клетки, сохраняющие экспрессию эндогенного TCR и подлежащие лентивирусной трансдукции для случайной интеграции рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α («lenti EF1α») или промотором MND («lenti MND»), или связанных с промотором EF1α с последовательностями, кодирующими укороченный рецептора, в качестве суррогатного маркера («lenti EF1α/tReceptor»), или подвергнутые ложной трансдукции в качестве контроля («имитация») (ФИГ. 22B). На ФИГ. 22С изображен процент CD3+CD8+ клеток среди CD8+ клеток в каждой из групп, описанных выше.

[0156] На ФИГ. 23A-23C изображено связывание тетрамера пептид-MHC и поверхностная экспрессия CD8, что оценивали с помощью проточной цитометрии, для T-клеток, подвергнутых нокауту эндогенных TCR-кодирующих генов, сконструированных для экспрессии рекомбинантного T-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных методов экспрессии : клетки, подвергали CRISPR/Cas9-опосредованному нокауту (KO) TRAC, TRBC или как TRAC, так и TRBC; клетки, подвергали направленной интеграции с помощью HDR в локусе TRAC рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α, промотором MND или эндогенным промотором TCR альфа, с использованием последовательности пропуска рибосомы P2A («HDR EF1α», «HDR MND» или «HDR P2A», соответственно) или клетки, подвергали ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.») (ФИГ. 23A); клетки, сохраняющие экспрессию эндогенного TCR и подлежащие лентивирусной трансдукции для случайной интеграции рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α («lenti EF1α») или промотором MND («lenti MND»), или связанных с промотором EF1α с последовательностями, кодирующими укороченный рецептор в качестве суррогатного маркера («lenti EF1α/tReceptor») или подвергали ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.») (ФИГ. 23B). На ФИГ. 23C изображен процент тетрамер+ CD8+ клеток среди CD8+ клеток в каждой из групп, описанных выше, на 7 и 13 день.

[0157] На ФИГ. 24A-24D изображена поверхностная экспрессия Vbeta22 (специфическое окрашивание для рекомбинантного TCR) и CD8, которую оценивали с помощью проточной цитометрии, для T-клеток, подвергнутых нокауту эндогенных TCR-кодирующих генов, сконструированных для экспрессии рекомбинантного T-клеточного рецептора (TCR) с использованием различных методов экспрессии: клетки подвергали CRISPR/Cas9-опосредованному нокауту (KO) TRAC, TRBC или как TRAC, так и TRBC; клетки подвергали направленной интеграции с помощью HDR в локусе TRAC рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α, промотором MND или эндогенным промотором TCR альфа, с использованием последовательности пропуска рибосомы P2A («HDR EF1α», «HDR MND» или «HDR P2A», соответственно), или клетки подвергали ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.») (ФИГ. 24A); клетки, сохраняющие экспрессию эндогенного TCR и подлежащие лентивирусной трансдукции для случайной интеграции рекомбинантных TCR-кодирующих последовательностей, связанных с промотором EF1α («lenti EF1α») или промотором MND («lenti MND»), или связанных с промотором EF1α с последовательностями, кодирующими укороченный рецептор в качестве суррогатного маркера («lenti EF1α/Рецептор») или подвергали ложной трансдукции в качестве контроля («ложн. трансд.») (ФИГ. 24B). [0601] На ФИГ. 24C и 24D изображен процент Vbeta22+CD8+ клеток среди CD8+ клеток (ФИГ. 24C) и процент Vbeta22+CD4+ клеток среди CD4+ клеток (ФИГ. 24D) в каждой из групп, описанных выше, на 7 и 13 день.

[0158] На ФИГ. 25 изображена цитолитическая активность различных рекомбинантных TCR-экспрессирующих CD8+ T-клеток, как описано выше, представленная площадью под кривой (AUC) % уничтожения, по сравнению с контролем ложной трансдукции и нормализованная к экспрессии Vbeta22 для каждой группы, в результате инкубации эффекторных клеток, как описано выше, с клетками-мишенями, экспрессирующими HPV 16 Е7 при соотношении эффектора к мишени (E:T) 10:1, 5:1 и 2,5:1. CD8+ клетки, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим эталонный TCR, способный связываться с E7 HPV 16, но содержащий мышиные области Cα и Cβ, оценивали в качестве контроля («Lenti мышь E7 эталон»).

[0159] На ФИГ. 26 изображена секреция IFNγ (пг/мл) различными рекомбинантными TCR-экспрессирующими CD8+ T-клетками, как описано выше, в результате инкубации эффекторных клеток, как описано выше, с клетками-мишенями, экспрессирующими E7 HPV 16 при соотношении эффектора к мишени (E:T) 10:1 и 2,5:1. CD8+ клетки, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим эталонный TCR, способный связываться с E7 HPV 16, но содержащий мышиные области Cα и Cβ, оценивали в качестве контроля («Lenti мышь E7 эталон»).

[0160] На ФИГ. 27 изображена тепловая карта, показывающая относительную активность различных рекомбинантных TCR-экспрессирующих T-клеток, как описано выше, в различных функциональных анализах: AUC% уничтожения при соотношениях E:T 10:1, 5:1 и 2,5:1 («AUC»), связывание тетрамера в CD8+ клетках на 7 и 13 день («тетрамер CD8»), анализ пролиферации («подсчет CTV») с использованием клеток SCC152 или клеток-мишеней Т2, стимулированных антигенным пептидом, и секреция IFNγ из CD8+ клеток («IFNg, секретируемый CD8»).

Подробное описание изобретения

I. Т-клеточные рецепторы и другие HPV-специфичные молекулы

[0161] В настоящем описании представлены связывающие молекулы, такие как те, которые связывают или распознают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16, например, пептидный эпитоп HPV 16, E6 или E7, в контексте молекулы MHC. Такие связывающие молекулы включают Т-клеточные рецепторы (TCR) и их антигенсвязывающие фрагменты и антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые проявляют антигенную специфичность для связывания или распознавания пептидного эпитопа E6 HPV 16 или E7 HPV 16. Также в некоторых вариантах осуществления представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие связывающие молекулы, сконструированные клетки, содержащие связывающие молекулы, композиции и способы лечения, включающие введение таких связывающих молекул, сконструированных клеток или композиций.

[0162] В большинстве случаев HPV является возбудителем рака шейки матки и вовлечен в анальный, вагинальный, рак вульвы, полового члена и ротоглотки и другие злокачественные новообразования. Как правило, геном HPV содержит раннюю область, содержащую шесть открытых рамок считывания (E1, E2, E4, E5, E6 и E7), которые кодируют белки, участвующие в трансформации и репликации клеток, и позднюю область, содержащую две открытые рамки считывания (L1 и L2), которые кодируют белки вирусного капсида. В целом, E6 и E7 являются онкогенами, которые могут влиять на регуляцию клеточного цикла и способствовать образованию злокачественных новообразований. Например, продукт гена E6 может вызвать деградацию p53, а продукт гена E7 может вызвать инактивацию ретинобластомы (Rb).

[0163] В некоторых аспектах представленная HPV 16-связывающая молекула, включающая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело против HPV 16, например, фрагменты этого антитела, и белки, такие как химерные молекулы, содержащие одно или более из вышеупомянутого, такие как химерные рецепторы, например TCR-подобные CAR, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие TCR или CAR, связываются с пептидным эпитопом, полученным из белка E6 HPV16. В некоторых аспектах представленная HPV 16-связывающая молекула, включающая TCR или его антигенсвязывающие фрагменты, или антитело против HPV 16, например фрагменты антител и содержащие их белки, такие как химерные рецепторы, например TCR-подобные CAR, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие TCR или CAR, связываются с пептидным эпитопом, полученным из белка Е7 HPV16.

[0164] В некоторых аспектах связывающая молекула распознает или связывает эпитопы HPV 16, Е6 или Е7, в контексте молекулы МНС, такой как молекула МНС класса I. В некоторых аспектах молекула MHC класса I представляет собой молекулу HLA-A2, включая любой один или более ее подтипов, например HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 или *0207. В некоторых случаях могут быть различия в частоте подтипов между различными популяциями. Например, в некоторых вариантах осуществления более 95% HLA-A2-положительной европейской популяции составляют HLA-A*0201, тогда как в китайской популяции частота, как сообщается, составляет приблизительно 23% HLA-A*0201, 45% HLA-A*0207, 8% HLA-A*0206 и 23% HLA-A*0203. В некоторых вариантах осуществления молекула МНС представляет собой HLA-A*0201.

[0165] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент распознает или связывается с эпитопом или областью E6 HPV16 или E7 HPV 16, такими как пептидный эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 232-239 и как показано ниже в Таблице 1.

Таблица 1: HPV-16 Эпитопы Описание эпитопа Название эпитопа SEQ ID NO. KLPQLCTEL E6(18-26) 232 TIHDIILECV E6(29-38) 233 FAFRDLCIV E6(52-60) 234 TLGIVCPI E7(86-93) 235 YMLDLQPET E7(11-19) 236 GTLGIVCPI E7(85-93) 237 LLMGTLGIV E7(82-90) 238 TLHEYMLDL E7(7-15) 239

[0166] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выделены или очищены или являются рекомбинантными. В некоторых аспектах связывающая молекула, например TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула является моноклональной. В некоторых аспектах связывающая молекула представляет собой одну цепь. В других вариантах осуществления связывающая молекула содержит две цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, экспрессируются на поверхности клетки.

[0167] В некоторых аспектах представленные связывающие молекулы имеют одну или более указанных функциональных особенностей, таких как свойства связывания, включая связывание с конкретными эпитопами, и/или конкретные аффинности связывания, как описано.

А. Т-клеточные рецепторы (TCR)

[0168] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, которая распознает или связывает эпитоп или область HPV 16, представляет собой T-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0169] В некоторых вариантах осуществления «Т-клеточный рецептор» или «TCR» представляет собой молекулу, которая содержит вариабельные α и β-цепи (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно) или вариабельные γ- и δ-цепи (также известные как TCRγ и TCRδ, соответственно), или его антигенсвязывающие части, и которые способны специфически связываться с пептидом, связанным с молекулой МНС. В некоторых вариантах осуществления TCR представлен в форме αβ. Как правило, TCR, которые существуют в формах αβ и γδ, обычно структурно сходны, но экспрессирующие их T-клетки могут иметь различные анатомические локализации или функции. TCR может присутствовать на поверхности клетки или в растворимой форме. Обычно TCR присутствует на поверхности Т-клеток (или Т-лимфоцитов), где он обычно отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС).

[0170] Если не указано иное, термин «TCR» следует понимать как охватывающий полные TCR, а также их антигенсвязывающие части или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой интактный или полноразмерный TCR, такой как TCR, содержащий α-цепь и β-цепь. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающую часть, которая меньше чем полноразмерный TCR, но которая связывается со специфическим пептидом, связанным в молекуле MHC, как например, связывается с комплексом MHC-пептид. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть или фрагмент TCR может содержать только часть структурных доменов полноразмерного или интактного TCR, но все же способна связывать пептидный эпитоп, такой как комплекс MHC-пептид, с который связывает полный TCR. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть содержит вариабельные домены TCR, такие как вариабельная область α-цепи (Vα) и вариабельная область β-цепи (Vβ) TCR, или их антигенсвязывающие фрагменты, достаточные для образования сайта связывания для связывания с определенным комплексом MHC-пептид.

[0171] В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены TCR содержат области, определяющие комплементарность, (CDR), которые обычно составляют основной вклад в способности распознавания и связывания антигена и специфичность пептидного, MHC и/или комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления CDR TCR или их комбинации образуют весь или по существу весь антигенсвязывающий сайт данной молекулы TCR. Различные CDR в вариабельной области цепи TCR обычно разделены каркасными областями (FR), которые обычно демонстрируют меньшую вариабельность среди молекул TCR по сравнению с CDR (см., например, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87: 9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7: 3745, 1988; см. также Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). В некоторых вариантах осуществления CDR3 является основным CDR, ответственным за связывание или специфичность антигена, или является наиболее важным среди трех CDR в данной вариабельной области TCR для распознавания антигена и/или для взаимодействия с процессируемой пептидной частью комплекса пептид-MHC. В некоторых случаях CDR1 альфа-цепи может взаимодействовать с N-концевой частью некоторых антигенных пептидов. В некоторых контекстах CDR1 бета-цепи может взаимодействовать с С-концевой частью пептида. В некоторых контекстах CDR2 вносит наиболее сильный вклад или является основным CDR, ответственным за взаимодействие или распознавание части MHC комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область β-цепи может содержать дополнительную гипервариабельную область (CDR4 или HVR4), которая обычно участвует в связывании с суперантигеном, а не в распознавании антигена (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8: 411-426).

[0172] В некоторых вариантах осуществления α-цепь и/или -цепь TCR также могут содержать константный домен, трансмембранный домен и/или короткий цитоплазматический хвост (см., например, Janeway et al., Immunobiology: Immune System in Health). и Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). В некоторых аспектах каждая цепь (например, альфа или бета) TCR может иметь один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический хвост в С-концевой области. В некоторых вариантах осуществления TCR, например, через цитоплазматический хвост, ассоциирован с инвариантными белками комплекса CD3, участвующими в опосредовании сигнальной трансдукции. В некоторых случаях структура позволяет TCR связываться с другими молекулами, такими как CD3 и их субъединицы. Например, TCR, содержащий константные домены с трансмембранной областью, может закреплять белок в клеточной мембране и связываться с инвариантными субъединицами сигнального аппарата или комплекса CD3. Внутриклеточные хвосты сигнальных субъединиц CD3 (например, цепи CD3γ, CD3δ, CD3ε и CD3ζ) содержат один или более иммунорецепторных мотивов активации на основе тирозина или ITAM и обычно участвуют в сигнальной способности комплекса TCR.

[0173] Специалист в данной области может определить или идентифицировать различные домены или области TCR. В некоторых случаях точный локус домена или области может варьироваться в зависимости от конкретного структурного или гомологического моделирования или других особенностей, используемых для описания конкретного домена. Понятно, что ссылки на аминокислоты, в том числе на конкретную последовательность, представленную как SEQ ID NO, используемую для описания организации домена TCR, приведена в иллюстративных целях и не предназначена для ограничения объема представленных вариантов осуществления. В некоторых случаях конкретный домен (например, вариабельный или константный) может быть на несколько аминокислот (например, одну, две, три или четыре) длиннее или короче. В некоторых аспектах остатки TCR известны или могут быть идентифицированы в соответствии с системой нумерации Международной иммуногенетической информационной системы (IMGT) (см., например, www.imgt.org; см. также, Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 2&;55-77; and The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001). При использовании этой системы последовательности CDR1 в цепях Vα и/или Vβ TCR соответствуют аминокислотам, присутствующим между номерами остатков 27-38 включительно, последовательности CDR2 в цепях Vα и/или Vβ TCR соответствуют аминокислотам, присутствующим между номерами остатков 56-65 включительно, и последовательности CDR3 в цепях Vα и/или Vβ TCR соответствуют аминокислотам, присутствующим между номерами остатков 105-117 включительно.

[0174] В некоторых вариантах осуществления каждая из α-цепи и β-цепи TCR дополнительно содержат константный домен. В некоторых вариантах осуществления константный домен α-цепи (Cα) и константный домен β-цепи (Cβ) индивидуально относятся к млекопитающим, как например, константный домен человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления константный домен соседствует с клеточной мембраной. Например, в некоторых случаях внеклеточная часть TCR, образованная двумя цепями, содержит два мембранно-проксимальных константных домена и два мембранно-дистальных вариабельных домена, каждый из которых содержит CDR.

[0175] В некоторых вариантах осуществления каждый из доменов Cα и Cβ является человеческим. В некоторых вариантах осуществления Cα кодируется геном TRAC (номенклатура IMGT) или является его вариантом. В некоторых вариантах осуществления Cα имеет или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 213 или 220, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 213 или 220. В некоторых вариантах осуществления Cα имеет или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 212, 215 или 217, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 212, 215 или 217. В некоторых вариантах осуществления Cα имеет или содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 220 или 524. В некоторых вариантах осуществления Cβ кодируется генами TRBC1 или TRBC2 (IMGT номенклатура) или является их вариантами. В некоторых вариантах осуществления Cβ имеет или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889. В некоторых вариантах осуществления Cβ имеет или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889.

[0176] В некоторых вариантах осуществления любой из предложенных TCR или их антигенсвязывающих фрагментов может представлять собой химерный TCR человека/мыши. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит альфа-цепь и/или бета-цепь, содержащую константную область мыши. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой константную область мыши, которая представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 262, 317, 833, 1012, 1014, 1015, 1017 или 1018, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 262, 317, 833, 1012, 1014, 1015, 1017 или 1018. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 262, 317, 833, 1012, 1014, 1015, 1017 или 1018. В некоторых вариантах осуществления Cβ представляет собой константную область мыши, которая представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 263, 109, 1013 или 1016, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 263, 109 1013 или 1016. В некоторых вариантах осуществления Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 263, 109, 1013 или 1016. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 262 или 1014, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 262 или 1014, и/или Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 263, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 263. В некоторых вариантах осуществления Cα и/или Cβ представляет собой или содержит любые Cα и/или Cβ, описанные в WO 2015/184228, WO 2015/009604 и WO 2015/009606.

[0177] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент в данном документе содержит вариант альфа-цепи и/или бета-цепи, например альфа- и/или бета-цепи, которая содержит константную область мыши. В некоторых вариантах осуществления этот вариант содержит аминокислотную последовательность любого из TCR, описанных в настоящем документе, с одной, двумя, тремя или четырьмя или более аминокислотными заменами в константной области альфа или бета-цепи. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит аминокислотную последовательность любой из константных областей, описанных в настоящем документе, с одной, двумя, тремя или четырьмя или более аминокислотными заменами в константной области. В некоторых вариантах осуществления TCR (или их функциональные части), содержащие замещенную аминокислотную последовательность(и), преимущественно обеспечивают одно или более из улучшенного распознавания мишеней HPV 16, повышенной экспрессии клеткой-хозяином и повышенной противоопухолевой активности по сравнению с родительским TCR, содержащим незамещенную аминокислотную последовательность.

[0178] В некоторых вариантах осуществления замещенные аминокислотные последовательности константных областей мыши α и β-цепей TCR, SEQ ID NO: 1015 и 1016, соответственно, соответствуют всем или частям незамещенных аминокислотных последовательностей константной области мыши SEQ ID NO: 1014 и 263, соответственно, с SEQ ID NO: 1015, имеющей одну, две, три или четыре аминокислотные замены по сравнению с SEQ ID NO: 1014 и SEQ ID NO: 1016, имеющими одну аминокислотную замену по сравнению с SEQ ID NO: 263. В некоторых вариантах осуществления вариант TCR содержит аминокислотные последовательности (а) SEQ ID NO: 1015 (константная область альфа-цепи), где (i) X в положении 48 представляет собой Thr или Cys; (ii) X в положении 112 представляет собой Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met или Trp; (iii) X в положении 114 представляет собой Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met или Trp; и (iv) X в положении 115 представляет собой Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met или Trp; и (b) SEQ ID NO: 1016 (константная область бета-цепи), где X в положении 56 представляет собой Ser или Cys. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1015, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1015, и/или Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1016 или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1016.

[0179] В некоторых вариантах осуществления TCR может представлять собой гетеродимер из двух цепей α и β, которые связаны, например, посредством дисульфидной связи или дисульфидных связей. В некоторых вариантах осуществления константный домен TCR может содержать короткие соединительные последовательности, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, тем самым связывая две цепи TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR может иметь дополнительный остаток цистеина в каждой из α и β цепей, так что TCR содержит две дисульфидные связи в константных доменах. В некоторых вариантах осуществления каждый из константного и вариабельного доменов содержит дисульфидные связи, образованные остатками цистеина.

[0180] В некоторых вариантах осуществления TCR может содержать введенную дисульфидную связь или связи. В некоторых вариантах осуществления нативные дисульфидные связи отсутствуют. В некоторых вариантах осуществления один или более нативных цистеинов (например, в константном домене α-цепи и β-цепи), которые образуют природную межцепочечную дисульфидную связь, замещены другим остатком, таким как серин или аланин. В некоторых вариантах осуществления введенная дисульфидная связь может быть образована путем мутирования нецистеиновых остатков на альфа- и бета-цепях, как например, в константном домене α-цепи и β-цепи, на цистеин. Противоположные цистеины в α- и β-цепях TCR обеспечивают дисульфидную связь, которая связывает константные области α- и β-цепей TCR замещенного TCR друг с другом и которая отсутствует в TCR, содержащем незамещенную константную область человека или незамещенную константную область мыши. В некоторых вариантах осуществления присутствие ненативных остатков цистеина (например, приводящих к одной или более ненативным дисульфидным связям) в рекомбинантном TCR может способствовать продуцированию желаемого рекомбинантного TCR в клетке, в которую он введен, сверхэкспрессии несоответствующей пары TCR, содержащей нативную цепь TCR.

[0181] Иллюстративные ненативные дисульфидные связи TCR описаны в опубликованных Международных РСТ № WO 2006/000830 и WO 2006/037960. В некоторых вариантах осуществления цистеины могут быть введены или замещены в остатке Thr48 цепи Cα и Ser57 цепи Cβ, в остатке Thr45 цепи Cα и Ser77 цепи Cβ, в остатке Tyr10 цепи Cα и Ser17 в Cβ цепи, в остатке Thr45 цепи Cα и Asp59 цепи Cβ и/или в остатке Ser15 цепи Cα и Glu15 цепи Cβ относительно нумерации Cα, представленной в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 217 или 524, или Cβ, представленной в SEQ ID NO: 214 или 216. В некоторых вариантах осуществления вариант TCR представляет собой цистеин-замещенный химерный TCR, в котором один или оба из нативного Thr48 из SEQ ID NO: 1014 и нативного Ser57 из SEQ ID NO: 263 замещены Cys. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1017, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1017, и/или Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1016, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1013.

[0182] В некоторых вариантах осуществления любая из представленных мутаций цистеина может быть осуществлена в соответствующем положении в другой последовательности, например, в последовательностях мышиных Cα и Cβ, описанных выше. Термин «соответствующий» по отношению к положениям белка, как например, указание, что аминокислотные положения «соответствуют» аминокислотным положениям в раскрытой последовательности, такой как представлено в списке последовательностей, относится к аминокислотным положениям, идентифицированным после выравнивания с раскрытой последовательностью на основе структурного выравнивания последовательностей или с использованием стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Например, соответствующие остатки могут быть определены путем выравнивания эталонной последовательности с последовательностью Cα, представленной в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 220 или 524, или последовательностью Cβ, представленной в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, методами структурного выравнивания, как описано в настоящем документе. Выравнивая последовательности, специалист в данной области может идентифицировать соответствующие остатки, например, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве направляющих.

[0183] В некоторых вариантах осуществления этот вариант включает замены одной, двух или трех аминокислот в трансмембранном (ТМ) домене константной области одной или обеих α- и β-цепей гидрофобной аминокислотой для получения TCR с замещенной гидрофобной аминокислотой. Гидрофобная аминокислотная замена(замены) в домене ТМ TCR может увеличить гидрофобность домена ТМ TCR по сравнению с TCR, в котором отсутствует гидрофобная аминокислотная замена(замены) в домене ТМ. В некоторых вариантах осуществления вариант TCR содержит один, два или три нативных Ser 112, Met 114 и Gly 115 SEQ ID NO: 1014, и может быть независимо замещен с помощью Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met или Trp; например, с Leu, Ile или Val. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1018, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1018, и/или Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 263, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 263.

[0184] В некоторых вариантах осуществления этот вариант включает замены цистеина в константной области одной или обеих α- и β-цепей в комбинации с замещением(замещениями) одной, двух или трех аминокислот в трансмембранном (TM) домене константной области одной или обеих α- и β-цепей на гидрофобную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет нативный Thr48 SEQ ID NO: 1014, замещенный на Cys; один, два или три из нативного Ser 112, Met 114 и Gly 115 SEQ ID NO: 1014, независимо, замещенных на Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met или Trp; например, на Leu, Ile или Val; и нативный Ser56 SEQ ID NO: 19, замещенный на Cys. В некоторых вариантах осуществления Cα представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 833, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 833, и/или Cβ представляет собой или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 1013Ю, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1013.

[0185] Иллюстративные последовательности (например, CDR, Vα и/или последовательности константной области Vβ) предложенных TCR описаны ниже.

[0186] В некоторых вариантах осуществления TCR является полноразмерным TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой димерный TCR (dTCR). В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой одноцепочечный TCR (sc-TCR). TCR может быть связанным с клеткой или в растворимой форме. В некоторых вариантах осуществления TCR находится в связанной с клеткой форме, экспрессируемой на поверхности клетки.

[0187] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит первый полипептид, где последовательность, соответствующая представленной последовательности вариабельной области α-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области α-цепи TCR, и второй полипептид, где последовательность, соответствующая представленной последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области β-цепи TCR, причем первый и второй полипептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления связь может соответствовать нативной межцепочечной дисульфидной связи, присутствующей в нативных димерных αβ TCR. В некоторых вариантах осуществления межцепные дисульфидные связи отсутствуют в нативном TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более цистеинов могут быть включены во внеклеточные последовательности константной области полипептидной пары dTCR. В некоторых случаях может быть желательной как нативная, так и ненативная дисульфидная связь. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит трансмембранную последовательность для закрепления на мембране.

[0188] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит представленную α-цепь TCR, содержащую вариабельный α-домен, константный α-домен и первый мотив димеризации, присоединенный к C-концу константного α-домена, и представленную β-цепь TCR, содержащую вариабельный β-домен, константный β-домен и первый мотив димеризации, присоединенный к C-концу константного β-домена, где первый и второй мотивы димеризации легко взаимодействуют, образуя ковалентную связь между аминокислотой в первом мотиве димеризации и аминокислотой в втором мотиве димеризации, связывая α-цепь TCR и β-цепь TCR вместе.

[0189] В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой scTCR, который представляет собой одиночную аминокислотную цепь, содержащую α-цепь и β-цепь, который способен связываться с комплексами MHC-пептид. Как правило, scTCR можно генерировать с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, см., например, Международные опубликованные PCT No. WO 96/13593, WO 96/18105, WO 99/18129, WO 04/033685, WO 2006/037960, WO 2011/044186; Патент США № 7569664; и Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996).

[0190] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности представленной вариабельной области α-цепи TCR, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей представленной последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом аминокислотной последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константного домена β-цепи TCR, и линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[0191] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей представленной вариабельной области β-цепи TCR, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей представленной последовательности вариабельной области α-цепи TCR, слитой с N-концом аминокислотной последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константного домена α-цепи TCR, и линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[0192] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из представленной последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом последовательности внеклеточного константного домена α-цепи, и второй сегмент, состоящий из представленной последовательности вариабельной области β-цепи, слитой с N концом последовательности внеклеточного константного домена β-цепи, и трансмембранную последовательность и, необязательно, линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[0193] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из представленной последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом последовательности внеклеточного константного домена β-цепи, и второй сегмент, состоящий из представленной последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом последовательности внеклеточного константного домена α-цепи, и трансмембранную последовательность и, необязательно, линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[0194] В некоторых вариантах осуществления, чтобы scTCR связывался с комплексом MHC-пептид, α- и β-цепи должны быть спарены так, чтобы их последовательности вариабельных областей были ориентированы для такого связывания. Различные способы стимулирования спаривания α и β в scTCR хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления включена линкерная последовательность, которая связывает α- и β-цепи с образованием единой полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления линкер должен иметь достаточную длину, чтобы охватить расстояние между C-концом α-цепи и N-концом β-цепи или наоборот, при этом также гарантируя, что длина линкера не будет такой длинной, чтобы он блокировал или уменьшал связывание scTCR с целевым комплексом пептид-МНС.

[0195] В некоторых вариантах осуществления линкер scTCR, который связывает первый и второй сегменты TCR, может представлять собой любой линкер, способный образовывать одну цепь полипептида, сохраняя при этом специфичность связывания TCR. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность может, например, иметь формулу -P-AA-P-, где P представляет собой пролин, а AA представляет собой аминокислотную последовательность, где аминокислотами являются глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления первый и второй сегменты спарены так, что их последовательности вариабельных областей ориентированы для такого связывания. Следовательно, в некоторых случаях линкер имеет достаточную длину, чтобы охватить расстояние между C-концом первого сегмента и N-концом второго сегмента или наоборот, но пр этом он не слишком длинный, чтобы блокировать или уменьшать связывание scTCR с целевым лигандом. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать или может примерно содержать 10-45 аминокислот, как например, 10-30 аминокислот или 26-41 аминокислотный остаток, например, 29, 30, 31 или 32 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу -PGGG- (SGGGG) n-P-, где n равно 5 или 6, и P представляет собой пролин, G представляет собой глицин, и S представляет собой серин (SEQ ID NO: 266). В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 267).

[0196] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит дисульфидную связь между остатками одной аминокислотной цепи, которая в некоторых случаях может способствовать стабильности спаривания между α- и β-областями одноцепочечной молекулы (см., например, Патент США No. 7569664). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит ковалентную дисульфидную связь, связывающую остаток иммуноглобулиновой области константного домена α-цепи с остатком иммуноглобулиновой области константного домена β-цепи одноцепочечной молекулы. В некоторых вариантах осуществления дисульфидная связь соответствует нативной дисульфидной связи, присутствующей в нативном dTCR. В некоторых вариантах осуществления дисульфидная связь в нативном TCR отсутствует. В некоторых вариантах осуществления дисульфидная связь представляет собой введенную ненативную дисульфидную связь, например, путем включения одного или более цистеинов во внеклеточные последовательности константной области областей первой и второй цепей полипептида scTCR. Иллюстративные мутации цистеина включают любые, как описано выше. В некоторых случаях может присутствовать как нативная, так и ненативная дисульфидная связь.

[0197] В некоторых вариантах осуществления scTCR представляет собой укороченный TCR, связанный недисульфидной связью, в котором гетерологичные лейциновые застежки, слитые с их С-концами, облегчают ассоциацию цепи (см., например, международную публикацию PCT No. WO99/60120). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит вариабельный домен TCRα, ковалентно связанный с вариабельным доменом TCRβ через пептидный линкер (см., например, международную публикацию PCT No. WO99/18129).

[0198] В некоторых вариантах осуществления любой из представленных TCR, включая dTCR или scTCR, может быть связан с сигнальными доменами, которые способствуют получению активного TCR на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления TCR экспрессируется на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую трансмембранной последовательности. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является положительно заряженным. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может представлять собой трансмембранный домен Cα или Cβ. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может происходить из источника, отличного от TCR, например, из трансмембранной области CD3z, CD28 или B7.1. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую цитоплазматическим последовательностям. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит сигнальный домен CD3z. В некоторых вариантах осуществления TCR способен образовывать комплекс TCR с CD3.

[0199] В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой растворимый TCR. В некоторых вариантах осуществления растворимый TCR имеет структуру, как описано в WO 99/60120 или WO 03/020763. В некоторых вариантах осуществления TCR не содержит последовательности, соответствующей трансмембранной последовательности, например, чтобы позволить мембранное закрепление в клетке, в которой он экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления TCR не содержит последовательности, соответствующей цитоплазматическим последовательностям.

Иллюстративные TCR

[0200] В некоторых вариантах осуществления среди представленных TCR или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают или распознают пептидный эпитоп HPV 16 в контексте MHC (например, пептидный эпитоп E6 HPV 16 или пептидный эпитоп E7 HPV 16), присутствуют TCR или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат любую из последовательностей вариабельной области альфа- и/или бета-цепи (Vα или Vβ), как описано, индивидуально, или достаточную антигенсвязывающую часть такой цепи(цепей). В некоторых вариантах осуществления представленный анти-HPV 16 TCRили его антигенсвязывающий фрагмент (например, анти-E6 HPV 16 или анти-E7 HPV 16 TCR) содержит последовательность области Vα или ее достаточную антигенсвязывающую часть, которая содержит CDR-1, CDR-2 и/или CDR-3, как описано. В некоторых вариантах осуществления представленный анти-HPV 16 TCR или его антигенсвязывающий фрагмент (например, анти-E6 HPV 16 или анти-E7 HPV 16 TCR) содержит последовательность области Vβ или достаточную антигенсвязывающую часть, которая содержит CDR-1, CDR-2 и/или CDR-3, как описано. В некоторых вариантах осуществления анти-HPV 16 TCR или его антигенсвязывающий фрагмент (например, анти-E6 HPV 16 или анти-E7 HPV 16 TCR) содержат последовательность области Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и/или CDR-3, как описано, и содержит последовательность области Vβ, которая содержит CDR-1, CDR-2 и/или CDR-3, как описано. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере на или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичны такой последовательности.

[0201] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 1365), где X₁ представляет собой A, I или V; Х₂ представляет собой М, L, V, Е или А; X₃ представляет собой R, L, N или S; X₄ представляет собой E, V, P, T, F, I, R или A; X₅ представляет собой G, I, L, A, P, R, D или H; X₆ представляет собой R, T, G, S, N или H; X₇ представляет собой G, R, A, N или отсутствует; X₈ представляет собой T, G или отсутствует; X₉ отсутствует или представляет собой A или G; Х₁₀ отсутствует или представляет собой G; X₁₁ отсутствует или представляет собой G; X₁₂ отсутствует или представляет собой T; X₁₃ представляет собой F, Y, A, S или отсутствует; X₁₄ представляет собой G, Y или N; X₁₅ представляет собой F, G, T, N, Q или Y; X₁₆ представляет собой K, P, V, N или A; X₁₇ представляет собой T, L или F; и X₁₈ представляет собой I, V, T, H или N.

[0202] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 251), где X₁ представляет собой A, I или V; Х₂ представляет собой М, L, V, E или S; X₃ представляет собой R, L, N, Q, P или S; X₄ представляет собой E, V, P, T, F, I, R, G, S или A; X₅ представляет собой G, I, L, A, P, R, D, отсутствует или H; X₆ представляет собой R, T, G, S, N, отсутствует или представляет собой А; X₇ представляет собой G, R, N или отсутствует; X₈ представляет собой T, G или отсутствует; X₉ отсутствует или представляет собой A; Х₁₀ отсутствует или представляет собой G; X₁₁ отсутствует или представляет собой G; X₁₂ отсутствует или представляет собой T; X₁₃ представляет собой F, Y, S или отсутствует; X₁₄ представляет собой G, Y, отсутствует или представляет собой N; X₁₅ представляет собой F, G, T, N, Q или Y; X₁₆ представляет собой K, P, V, N или A; X₁₇ представляет собой T, L или F; и X₁₈ представляет собой I, V, T, H, F или N.

[0203] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 138, 144, 147, 153, 159, 163, 167, 173, 175, 301, 304, 308, 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662, 679, 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988 или 1002, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, содержащую CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 295, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661, 676, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999, или последовательности, которые по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0204] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ (SEQ ID NO: 1366), где X₁ представляет собой A или S; Х₂ представляет собой S, I или V; X₃ представляет собой S, T или V; X₄ представляет собой H, P, L, Y, T, D или Q; Х₅ представляет собой L, G, W, F, S или R; X₆ представляет собой A, G, L, S или T; X₇ представляет собой G, E, A, T, R или отсутствует; Х8 отсутствует или представляет собой G; X₉ отсутствует или представляет собой G; X₁₀ отсутствует, F, G, T, S или A; X₁₁ представляет собой T, N, H, A, S или F; X₁₂ представляет собой G, T, Q, D, Y или L; X₁₃ представляет собой E, P, T, G или W; X₁₄ представляет собой L, A, Q, Y или K; и X₁₅ представляет собой F, H, Y или T.

[0205] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ (SEQ ID NO: 261), где X₁ представляет собой A или S; Х₂ представляет собой S, I или V; X₃ представляет собой S, T или V; X₄ представляет собой H, P, L, Y, T, D или F; Х₅ представляет собой L, G, W, F, S, T или R; X₆ представляет собой A, G, L, S или T; X₇ представляет собой G, E, A, T, R, Q или отсутствует; Х8 отсутствует или представляет собой G; X₉ отсутствует или представляет собой G; X₁₀ отсутствует, F, G, T, S или R; X₁₁ представляет собой T, N, H, A, S, R или E; X₁₂ представляет собой G, T, Q, D, Y или R; X₁₃ представляет собой E, P, T или G; X₁₄ представляет собой L, A, Q или Y; и X₁₅ представляет собой F, H, Y или T.

[0206] В некоторых случаях TCR содержит область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 141, 146, 150, 156, 160, 164, 170, 174 178, 305, 309, 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670, 686, 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994, 1010 или 1381, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90 или 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит область Vβ, содержащую CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 296, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667, 685, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380, или последовательности, которая по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична такой последовательности.

[0207] В некоторых аспектах область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 1367), где X₁ представляет собой T, D, N или V; Х₂ представляет собой I или S; X₃ представляет собой S, D, A, P или M; X₄ представляет собой G, Q, P или отсутствует; X₅ представляет собой T, S, I или F; X₆ представляет собой D, Y, Q, T или S; и X₇ представляет собой Y, G, N или Q. В некоторых вариантах осуществления область Vα дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 247), где X₁ представляет собой G, Q, I, V или M; X₂ представляет собой L, S, Q, Y, F, T или G; X₃ представляет собой T, G, S или F; X₄ представляет собой Y, S, N, I или отсутствует; Х₅ отсутствует или представляет собой D; X₆ отсутствует, E, Q, S, M или K; X₇ представляет собой S, Q, R, G, D или N; и X₈ представляет собой N, E, M, T или K.

[0208] В некоторых аспектах область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 243), где X₁ представляет собой T, D, N, S или V; Х₂ представляет собой I или S; X₃ представляет собой S, D, A, P, N или Y; X₄ представляет собой G, Q, P или отсутствует; X₅ представляет собой T, S, I или F; X₆ представляет собой D, Y, Q, T, P или S; и X₇ представляет собой Y, G, N, A, S или Q.

[0209] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 142, 151, 157, 161, 165, 171, 302, 306, 537, 570, 677, 692, 710, 727, 742, 760, 800, 816, 909, 938 или 1000, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vα содержит CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 295, 297, 299. 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661, 676, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999 или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 143, 152, 158, 162, 166, 172, 303, 307, 538, 571, 678, 693, 711, 728, 743, 761, 801, 817, 831, 910, 939 или 1001, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 295, 297, 299. 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661, 676, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0210] В некоторых аспектах область Vβ дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1369), где X₁ представляет собой S, M или L; X₂ представляет собой G, E, D, N или Q; Х₃ представляет собой Н или V; X₄ представляет собой V, N, E, L или T; и X₅ представляет собой S, R, N, Y, A или M. В некоторых вариантах осуществления область Vβ дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 1368), где X₁ представляет собой F, Y, S или A; Х₂ представляет собой Q, Y, V или N; X₃ представляет собой N, D, G, F или Q; X₄ отсутствует или представляет собой G; X₅ представляет собой E, V, N, K или S; X₆ представляет собой A, K, G или E; и X₇ представляет собой Q, M, T, I или A.

[0211] В некоторых аспектах область Vβ дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 254), где X₁ представляет собой S или M; X₂ представляет собой G, E, D, N или Q; Х₃ представляет собой Н или V; X₄ представляет собой V, N, E, L или T; и X₅ представляет собой S, R, N, Y или M. В некоторых вариантах осуществления область Vβ дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃GX₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 257), где X₁ представляет собой F, S или A; Х₂ представляет собой Q, Y, V или N; X₃ представляет собой N, D, G или Q; Х₅ представляет собой Е, V, N или S; X₆ представляет собой A, K, G или E; и X₇ представляет собой Q, M, T, I или A.

[0212] В некоторых случаях область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 139, 145, 148, 154, 168, 176, 484, 546, 561, 579, 668, 701, 719 или 751, или последовательность, имеющую, по меньшей мере или примерно 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vβ содержит CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 296, 298, 300. 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667, 685, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 140, 149, 155, 169, 177, 485, 547, 562, 580, 669, 702, 720, 752, 918 или 1009, или последовательность, имеющую, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 296, 298, 300. 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667, 685, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0213] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 295, 297, 299, 477, 492, 504. 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661, 676, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. В некоторых случаях область Vβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 296, 298, 300, 483, 498, 516. 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667, 685, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993 или 1008, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит альфа-цепь, содержащую любую из таких последовательностей Vα-цепи и любую из таких последовательностей Vβ-цепи.

[0214] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь TCR или его антигенсвязывающего фрагмента дополнительно содержит константную область альфа (Cα) или ее часть. В некоторых аспектах бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ) или ее часть. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления TCR, например, E6 или E7 HPV 16 TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα) и константную область альфа (Cα) или ее часть и/или бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ) и константную область бета (Cβ) или ее часть.

[0215] В некоторых случаях области Cα и Cβ являются константными областями мыши. В некоторых вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 262 или 317, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых случаях область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 263 или 109, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую ​​как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0216] В некоторых вариантах осуществления области Cα и Cβ представляют собой константные области человека. В некоторых таких вариантах осуществления область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% последовательности идентичность, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая в по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0217] В некоторых вариантах осуществления области Cα и/или Cβ модифицируют, например, путем включения одного или более ненативных остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления константная область является модифицированной формой константной области человека (например, модифицированной по сравнению с областью Cα, представленной в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, и/или областью Cβ, представленной в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889. В некоторых вариантах осуществления модификацией является введение цистеина по остатку Thr48 цепи Cα и/или Ser57 цепи Cβ, по остатку Thr45 цепи Cα и/или Ser77 цепи Cβ, по остатку Tyr10 цепи Cα и/или Ser17 цепи Cβ, по остатку Thr45 цепи Cα и Asp59 цепи Cβ и/или по остатку Ser15 цепи Cα и Glu15 цепи Cβ со ссылкой на нумерацию Cα, прдставленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 или 524, или Cβ, прдставленную в SEQ ID NO: 214 или 216. Соответствующие остатки могут быть идентифицированы путем выравнивания эталонной последовательности с любой из SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 524 214 или 216. Например, Thr48 в цепи Cα выравнивается или соответствует Thr49 в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 215 или 220, и Ser57 в цепи Cβ выравнивается или соответствует Ser58 в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 631. или 889. В некоторых таких вариантах осуществления область Cα содержит ненативный цистеин в остатке 48 (или в соответствующем остатке, например в остатке 49) и содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 200, 201, 203, 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью и которая содержит введенный ненативный цистеиновый остаток или остатки. В некоторых аспектах область Cβ содержит ненативный цистеин в остатке 57 (или в соответствующем остатке, например в остатке 58) и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197, 199, 632, 890 или 1363, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью и которая содержит ненативный цистеиновый остаток или остатки.

[0218] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 287 или 291, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 285, 289, 293, 479, 494, 512, 526, 541, 556, 574, 589, 601, 613, 625, 639, 651, 663, 681, 696, 714, 731, 746, 764, 777, 789, 804, 820, 835, 847, 859, 871, 883, 897, 913, 927, 941, 953, 965, 977, 989, 1004 или 1376, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0219] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 284, 288 292, 474, 489, 501, 507, 519, 533, 551, 566, 584, 596, 608, 620, 634, 646, 658, 673, 688, 706, 723, 738, 756, 772, 784, 796, 812, 827, 842, 854, 866, 878, 892, 905, 922, 934, 948, 960, 972, 984, 996 или 1387, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 286, 290, 294, 480, 495, 513, 527, 542, 557, 575, 590, 602, 614, 626 640, 652, 664, 682, 697, 715, 732, 747, 765, 778, 790, 805, 821, 836, 848, 860, 872, 884, 898, 914, 928, 942, 954, 966, 978, 990, 1005 или 1377, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0220] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь и/или бета-цепь TCR кодируется последовательностью нуклеотидов, содержащей сигнальный пептид (также называемой лидерной последовательностью). Неограничивающими примерами такого сигнального пептида являются сигнальные пептиды, которые имеют или содержат последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 181-182, 184-194, 310, 311, 487, 540, 549, 564, 573, 582, 671, 680, 695, 704, 713, 730, 745, 754, 763, 770, 803, 810, 819, 834, 903, 912, 920, 1003 или 1011. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируется последовательностью нуклеотидов, которая кодирует: а) альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 318, 319, 322, 323, 326, 327, 330, 331, 334, 335, 338, 339, 130, 131, 134, 135, 195, 205, 222, 242, 253, 256, 313,314, 475, 476, 490, 491, 502, 503, 508, 509, 520, 521, 534, 535, 552, 553, 567, 568, 585, 586, 597, 598, 609, 610, 621, 622, 635, 636, 647, 648, 659, 660, 674, 675, 689, 690, 707, 708, 724, 725, 739, 740, 757, 758, 773, 774, 785, 786, 797, 798, 813, 814, 828, 829, 843, 844, 855, 856, 867, 868, 879, 880, 893, 894, 906, 907, 923,924, 935, 936, 949, 950, 961, 962, 973, 974, 985, 986, 997, 998, 1388, 1389, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющую, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или b) бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 110, 129, 132, 133, 179, 180, 206, 221, 246, 250, 260, 312, 315,316,481, 482, 496, 497, 514, 515, 616, 528, 529, 543, 544, 558, 559, 576, 577, 591, 592, 603, 604, 615, 627, 628, 641, 642, 653, 654, 665, 666, 683, 684, 698, 699, 716, 717, 733, 734, 748, 749, 766, 767, 779, 780, 791, 792, 806, 807, 822, 823, 837, 838, 849, 850, 861, 862, 873, 874, 885, 886, 899, 900, 915, 916, 929, 930, 943, 944, 955, 956, 967, 968, 979, 980, 991, 992, 1006, 1007 или 1378 -1379, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь и бета-цепь могут быть связаны через линкер, такой как любой, описанный в настоящем документе в другом месте.

[0221] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент распознает или связывается с эпитопом или областью E6 HPV16, таким как пептидный эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 232-234. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент не распознает или не связывается с эпитопом E6 (29-38), содержащим аминокислотную последовательность TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233). В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E6 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 234.

[0222] В некоторых аспектах TCR или антигенсвязывающий фрагмент распознают или связываются с эпитопом или областью белка Е7 HPV16, таким как пептидный эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 235-239. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент не распознает или не связывается с эпитопом E7 (11-19), содержащим аминокислотную последовательность YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236). В некоторых случаях пептид, полученный из E7 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235.

a. E6 HPV 16(29-38)

[0223] В некоторых случаях TCR распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E6 HPV16, который представляет собой или содержит E6 (29-38) TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233). В некоторых вариантах осуществления TCR распознает или связывается с E6 HPV 16 (29-38) в контексте MHC, такого как MHC класса I, например HLA-A2. В некоторых вариантах осуществления E6 HPV 16 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 264.

[0224] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 1370), где X₁ представляет собой A, I или В; Х₂ представляет собой М, L, S или V; Х₃ представляет собой R, L, Q или N; X₄ представляет собой E, V, T, P, G или F; X₅ представляет собой G, I, L, A, отсутствует или P; X₆ представляет собой R, T, G, отсутствует или представляет собой S; X₇ представляет собой G, R или отсутствует; X₈ представляет собой T, G или отсутствует; Х₉ отсутствует или представляет собой А; Х₁₀ отсутствует или представляет собой G; X₁₁ отсутствует или представляет собой G; X₁₂ отсутствует или представляет собой T; X₁₃ отсутствует или представляет собой S; X₁₄ представляет собой G, Y, отсутствует или представляет собой N; Х15 представляет собой F, G, N или Т; X₁₆ представляет собой K, N или P; Х17 представляет собой Т или L; и X₁₈ представляет собой I, F, V или T.

[0225] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 248), где X₁ представляет собой A, I или В; Х₂ представляет собой М, L, S или V; Х₃ представляет собой R, L, Q или N; X₄ представляет собой E, V, T, P, G или F; X₅ представляет собой G, I, L, A, отсутствует или P; X₆ представляет собой R, T, G, отсутствует или представляет собой S; X₇ представляет собой G, R или отсутствует; X₈ представляет собой T, G или отсутствует; Х₉ отсутствует или представляет собой А; Х₁₀ отсутствует или представляет собой G; X₁₁ отсутствует или представляет собой G; X₁₂ отсутствует или представляет собой T; X₁₃ отсутствует или представляет собой S; X₁₄ представляет собой G, Y, отсутствует или представляет собой N; Х15 представляет собой F, G, N или Т; X₁₆ представляет собой K, N или P; Х17 представляет собой Т или L; и X₁₈ представляет собой I, V, F или T.

[0226] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 1205), где X₁ представляет собой A, I или В; X₂ представляет собой M, L, A, V, S или E; X₃ представляет собой R, L, N, S, Q, K, G или W; X₄ представляет собой E, V, P, T, F, A, G, N, D или L; X₅ представляет собой G, I, D, L, A, P, H, N, R, T или отсутствует; X₆ представляет собой G, N, R, T, M, S, P или отсутствует; X₇ представляет собой G, V, D, L, Q, T, R, N или отсутствует; X₈ представляет собой T, D, S, L, G или отсутствует; X₉ представляет собой A, G, Q или отсутствует; X₁₀ представляет собой G или отсутствует; X₁₁ представляет собой G или отсутствует; Х₁₂ представляет собой Т или отсутствует; X₁₃ представляет собой S, A, T, G или отсутствует; X₁₄ представляет собой G, Y, T, N, A, W или отсутствует; X₁₅ представляет собой F, G, N, T, Y, D, S, R, Q или E; X₁₆ представляет собой K, P, A, N, D или Q; X₁₇ представляет собой L, M, I, V или T; и X₁₈ представляет собой I, T, V, N, F, R или Q.

[0227] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 1220), где X₁ представляет собой A, I или В; X₂ представляет собой M, L, A, V, S или E; X₃ представляет собой R, L, N, S, Q, K, G или W; X₄ представляет собой E, V, P, T, F, A, G, N, D или L; X₅ представляет собой G, I, D, L, A, P, N, R, T или отсутствует; X₆ представляет собой G, N, R, T, M, S, P или отсутствует; X₇ представляет собой G, V, D, L, Q, T, R или отсутствует; X₈ представляет собой T, D, S, L, G или отсутствует; X₉ представляет собой A, G, Q или отсутствует; X₁₀ представляет собой G или отсутствует; X₁₁ представляет собой G или отсутствует; Х₁₂ представляет собой Т или отсутствует; X₁₃ представляет собой S, A, T, G или отсутствует; X₁₄ представляет собой G, Y, T, N, A, W или отсутствует; X₁₅ представляет собой F, G, N, T, Y, D, S, R, Q или E; X₁₆ представляет собой K, P, A, D или Q; X₁₇ представляет собой L, M, I, V или T; и X₁₈ представляет собой I, T, V, F, R или Q.

[0228] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆LT (SEQ ID NO: 1206), где X₁ представляет собой A, I или В; X₂ представляет собой L, M, V или E; Х₃ представляет собой L, R, N, G или S; X₄ представляет собой V, T, F, N, E, P, G или L; X₅ представляет собой I, A, P, N, G или T; X₆ представляет собой R, G, S или T; X₇ представляет собой G, R, L, V или T; X₈ представляет собой T, G, L или отсутствует; X₉ представляет собой A, G, Q или отсутствует; X₁₀ представляет собой G или отсутствует; X₁₁ представляет собой G или отсутствует; Х₁₂ представляет собой Т или отсутствует; X₁₃ представляет собой S, T или G; X₁₄ представляет собой Y, A, G или N; X₁₅ представляет собой G, S, N, R или E; и X₁₆ представляет собой K или Q.

[0229] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AMRX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ (SEQ ID NO: 1207), где X₄ представляет собой E, T, A, D или L; Х₅ представляет собой G, A, N или R; Х6 представляет собой R, G, R, Т, М или S; X₇ представляет собой G, V, D, L или отсутствует; X₈ представляет собой T, D или отсутствует; X₉ представляет собой G или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, T, G или отсутствует; X₁₁ представляет собой G, Y, N, A или W; Х₁₂ представляет собой F, G, N, D, S или Y; X₁₃ представляет собой K, D, Q; Х14 представляет собой Т, L, М или I; и X₁₅ представляет собой I, T, R или Q.

[0230] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅KX₁₇X₁₈ (SEQ ID NO: 1208), где X₁ представляет собой I или V; Х₂ представляет собой L или V; Х₃ представляет собой L, N или R; Х₄ представляет собой V, F или G; X₅ представляет собой I, P, G или T; X₆ представляет собой R, S, P или G; X₇ представляет собой G, R, Q, T или V; Х8 представляет собой Т, G, S или L; X₉ представляет собой A, G, Q или отсутствует; X₁₀ представляет собой G или отсутствует; X₁₁ представляет собой G или отсутствует; Х₁₂ представляет собой Т или отсутствует; X₁₃ представляет собой G или S; Х14 представляет собой Y или N; X₁₅ представляет собой G, Q или E; Х17 представляет собой V или L; и X₁₈ представляет собой I или Т.

[0231] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂RX₄AX₆NNDMR (SEQ ID NO: 1221), где X₂ представляет собой V или M; Х₄ представляет собой Р или D; Х6 представляет собой N или R.

[0232] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 1371), где X₁ представляет собой T, D или N; Х₂ представляет собой I или S; X₃ представляет собой S, D или A; X₄ представляет собой G, Q, P или отсутствует; Х₅ представляет собой Т, S или I; Х6 представляет собой D, Y или Q; и X₇ представляет собой Y, G, N или Q. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 240), где X₁ представляет собой T, D S или N; Х₂ представляет собой I или S; X₃ представляет собой S, D, N, Y или A; X₄ представляет собой G, Q, P или отсутствует; Х₅ представляет собой Т, S, F или I; Х6 представляет собой D, Y, P или Q; и X₇ представляет собой Y, G, N, A, S или Q. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 1209), где X₁ представляет собой T, N, D или S; Х₂ представляет собой S, I или R; X₃ представляет собой D, S, M, A, Y, N или G; X₄ представляет собой Q, G, P или отсутствует; X₅ представляет собой S, T, F, I или N; X₆ представляет собой Y, D, Q, P, N или E; и X₇ представляет собой G, Y, N, S или A.

[0233] В некоторых примерах область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1372), где X₁ представляет собой G, Q, I или V; Х₂ представляет собой L, S, Q или Y; Х₃ представляет собой Т, G или S; X₄ представляет собой Y, S или отсутствует; Х₅ отсутствует или представляет собой D; X₆ отсутствует, E, Q или S; X₇ представляет собой S, Q, R или G; и X₈ представляет собой N или E. В некоторых примерах область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 244), где X₁ представляет собой G, Q, I, M, Y или V; Х₂ представляет собой L, S, Q, T или Y; Х₃ представляет собой Т, G, L или S; X₄ представляет собой Y, S, N, A или отсутствует; X₅ отсутствует, A или D; X₆ отсутствует, E, Q, T или S; X₇ представляет собой S, Q, R, L или G; и X₈ представляет собой N, V или E. В некоторых примерах область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1210), где X₁ представляет собой Q, G, I, V, Y, M, R или N; X₂ представляет собой G, L, S, Q, Y, T, N или V; X₃ представляет собой S, T, L или K; X₄ представляет собой Y, I, S, A, N, F или отсутствует; X₅ представляет собой D, A или отсутствует; X₆ представляет собой E, K, Q, S, T, G, D или отсутствует; X₇ представляет собой Q, S, N, R, G, L или D; и X₈ представляет собой N, K, E, V или L.

[0234] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃ (SEQ ID NO: 1373), где X₄ представляет собой H, P, L или Y; Х₅ представляет собой L, G, W, F или S; X₆ представляет собой A, G или L; X₇ представляет собой G, E, A, T или отсутствует; X₈ представляет собой F, G, T или S; Х₉ представляет собой Т, N, Н или А; X₁₀ представляет собой G, T, Q, D или Y; X₁₁ представляет собой E, P, T или G; X₁₂ представляет собой L, A, Q или Y; и X₁₃ представляет собой F, H, Y или T.

[0235] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃ (SEQ ID NO: 258), где X₃ представляет собой S или T; Х₄ представляет собой Н, Р, L, F или Y; Х₅ представляет собой L, G, W, F, T или S; X₆ представляет собой A, G или L; X₇ представляет собой G, E, A, T, Q или отсутствует; X₈ представляет собой F, G, T, R или S; X₉ представляет собой T, N, H, R, E или A; X₁₀ представляет собой G, T, Q, D, R или Y; X₁₁ представляет собой E, P, T или G; X₁₂ представляет собой L, A, Q или Y; и X₁₃ представляет собой F, H, Y или T.

[0236] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ (SEQ ID NO: 1211), где X₁ представляет собой A, S или В; X₂ представляет собой S, A или V; X₃ представляет собой S, V, R или Q; X₄ представляет собой H, P, Q, L, Y, G, T, F, S, R или E; X₅ представляет собой L, G, R, W, F, S, V, T, Y, Q или отсутствует; X₆ представляет собой A, G, L, T, E, P или отсутствует; X₇ представляет собой G, T, A, R, Q, N, S или отсутствует; X₈ представляет собой G, S или отсутствует; X₉ представляет собой G или отсутствует; X₁₀ представляет собой F, G, A, S, T, R, Q, L или отсутствует; X₁₁ представляет собой T, N, F, A, R, S, G или отсутствует; X₁₂ представляет собой G, T, L D, Y, N, Q, S или E; X₁₃ представляет собой E, W, T, G, K, N или P; X₁₄ представляет собой L, A, K, Q, Y или I; и X₁₅ представляет собой F, H, Y, T или I.

[0237] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ (SEQ ID NO: 1222), где X₁ представляет собой A, S или В; X₂ представляет собой S, A или V; X₃ представляет собой S, R или Q; X₄ представляет собой H, P, Q, L, Y, G, T, F, S, R или E; X₅ представляет собой L, G, R, W, F, S, V, T, Y, Q или отсутствует; X₆ представляет собой A, G, L, E, P или отсутствует; X₇ представляет собой G, T, A, R, Q, N, S или отсутствует; X₈ представляет собой G, S или отсутствует; X₉ представляет собой G или отсутствует; X₁₀ представляет собой F, G, A, S, T, R, Q, L или отсутствует; X₁₁ представляет собой T, N, F, A, R, S, G или отсутствует; X₁₂ представляет собой G, T, L D, Y, N, Q, S или E; X₁₃ представляет собой E, W, T, G, K, N или P; X₁₄ представляет собой L, A, K, Q, Y или I; и X₁₅ представляет собой F, H, Y, T или I.

[0238] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1212), где X₄ представляет собой H, P, Q, L, Y, F, R или E; X₅ представляет собой L, G, R, W, F, S, V, T, Y или Q; X₆ представляет собой A, G, L, E P; X₇ представляет собой G, T, A, R, Q, S или отсутствует; X₈ представляет собой G, S или отсутствует; X₉ представляет собой F, G, A, S, T, R, L или отсутствует; Х₁₀ представляет собой Т, N, А, F, R, S или G; X₁₁ представляет собой G, T, L, D, Y, Q, S, E или N; X₁₂ представляет собой E, W, T, G, P, K; X₁₃ представляет собой L, A, K, Q, Y или I; и X₁₄ представляет собой F, H, Y или T.

[0239] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃QY (SEQ ID NO: 1213), где X₁ представляет собой A или S; X₂ представляет собой S, V или A; Х₃ представляет собой S или V; Х₄ представляет собой L, Y, P или S; Х₅ представляет собой W, F, V, L или Y; X₆ представляет собой G, T или A; X₇ представляет собой A, R, Q, S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, T, R или G; X₁₁ представляет собой T, A, R, S или N; X₁₂ представляет собой D, Y, T или G; и X₁₃ представляет собой T или E.

[0240] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃QY (SEQ ID NO: 1223), где X₁ представляет собой A или S; Х₂ представляет собой S или А; Х₄ представляет собой L, Y, P или S; Х₅ представляет собой W, F, V, L или Y; X₆ представляет собой G или A; X₇ представляет собой A, R, Q, S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, T, R или G; X₁₁ представляет собой T, A, R, S или N; X₁₂ представляет собой D, Y, T или G; и X₁₃ представляет собой T или E.

[0241] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂F (SEQ ID NO: 1214), где X₃ представляет собой S, Q или Р; Х₄ представляет собой Н, Р, Т или Е; Х₅ представляет собой L, G, W или F; X₆ представляет собой A, G или отсутствует; X₇ представляет собой G, N, S, R или отсутствует; X₈ представляет собой F, G, Q, L, A или отсутствует; Х₉ представляет собой Т, N или А; X₁₀ представляет собой G, T, N или E; X₁₁ представляет собой E, N или K; и X₁₂ представляет собой L, A или Q.

[0242] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈NYX₁₁YT (SEQ ID NO: 1215), где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой S или Т; X₆ представляет собой G, T или A; Х₇ представляет собой Т или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; и X₁₁ представляет собой G или отсутствует.

[0243] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄WGX₇SNQPX₁₂H (SEQ ID NO: 1216), где X₄ представляет собой L, F или P; Х₇ представляет собой R или Q; и X₁₂ представляет собой Q или L.

[0244] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈SGNTIY (SEQ ID NO: 1217), где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой W или Q; X₆ представляет собой G или P; Х₇ представляет собой R или S; и X₈ представляет собой S или отсутствует.

[0245] В некоторых случаях область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂HX₄X₅ (SEQ ID NO: 252), где X₁ представляет собой S или M; X₂ представляет собой G, E, D или N; X₄ представляет собой V, N или E; и X₅ представляет собой S, R, N или Y. В некоторых случаях область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1218), где X₁ представляет собой S, M, D или L; X₂ представляет собой G, E, D, N, Q, S или F; X₃ представляет собой H, V, Y, N или Q; X₄ представляет собой A, S, F или отсутствует; X₅ представляет собой W V, N, E, T, P, Y, K, D или L; и X₆ представляет собой S, R, A, N, Y, M или T.

[0246] В некоторых случаях область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 255), где X₁ представляет собой F или S; Х₂ представляет собой Q, Y или V; Х₃ представляет собой N, D или G; Х₄ представляет собой Е или V; Х₅ представляет собой А, К или G; и X₆ представляет собой Q, M или T. В некоторых случаях область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 1219), где X₁ представляет собой F, Y, S AM; X₂ представляет собой N, Q, V, T, Y или A; X₃ представляет собой N, D, E, S, G, I, F, Q или L; X₄ представляет собой G, A, N или отсутствует; Х₅ представляет собой Е, К, V, Е, S, Т, G или N; X₆ представляет собой A, E, K, G, L, D, V или N; и X₇ представляет собой Q, M, T, A, V, E, P, D или I.

[0247] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 138, 144, 147, 163, 167, 173, 304, 308, 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых примерах область Vα содержит CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 142, 161, 165 171, 302, 306, 537, 570, или 677, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vα содержит CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vα дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 143, 162, 166, 172, 303, 307, 538, 571 или 678, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых случаях область Vα содержит CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0248] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 141, 146, 150, 164, 170 174, 305, 309, 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124 126, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 139, 145, 148, 168, 484, 546, 561, 579 или 668, или последовательность, имеющуюей по меньшей мере или примерно 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых случаях область Vβ содержит CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124 126, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления область Vβ дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 140, 149, 169, 485, 547, 562, 580 или 669, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых примерах область Vβ содержит CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685, или последовательности, имеющей по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0249] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 142, 161, 165, 171, 302, 306,537, 570 или 677, область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащая аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 143, 162, 166, 172, 303, 307,538, 571 или 678, и/или область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 138, 144, 147, 163, 167 173, 304, 308, 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичные таким последовательностям. В некоторых аспектах TCR или антигенсвязывающий его фрагмент содержит область Vβ, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 139, 145, 148, 168, 484, 546, 561, 579 или 668, область, определяющую комплементарность 2 (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 140, 149, 169, 485, 547, 562, 580 или 669, и/или область, определяющую комплементарность 3 (CDR-3), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 141, 146, 150, 164, 170 174, 305, 309, 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0250] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 141, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0251] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 144, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 145, 140 и 146, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0252] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 147, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 150, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0253] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 163, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 164, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0254] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 167, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 170, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0255] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 173, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 174, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0256] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 302, 303 и 304, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 305, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0257] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 306, 307 и 308, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 309, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0258] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 478, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 484, 485 и 486, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0259] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 493, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0260] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 505, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0261] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 511, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 517, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0262] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 523, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 531, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0263] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 537, 538 и 539, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 546, 547 и 548, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0264] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 555, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 563, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0265] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 572, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 579, 580 и 581, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0266] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 588, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 594, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0267] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 606, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0268] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 612, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 618, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0269] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 624, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 630, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0270] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 638, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 644, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0271] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 650, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 656, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0272] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 662, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 668, 669 и 670, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0273] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 677, 678 и 679, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 686, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0274] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676. В некоторых аспектах область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0275] В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент включают область Vα, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2, и CDR-3, представленные в Таблице 2; и область Vβ, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, представленные в Таблице 2. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие CDR, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблице 2.

Таблица 2: HPV16 E6(29-38) TCRCDR SEQ ID NO. Иллюстративный
TCR Альфа Бета CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TCR 3 136 137 138 139 140 141 TCR 4 142 143 144 145 140 146 TCR 5 136 137 147 148 149 150 TCR 8 161 162 163 148 149 164 TCR 9 165 166 167 168 169 170 TCR 10 171 172 173 148 149 174 TCR 13 302 303 304 139 140 305 TCR 14 306 307 308 148 149 309 TCR 15 136 137 478 484 485 486 TCR 16 161 162 493 148 149 499 TCR 17 165 166 505 148 149 499 TCR 18 161 162 511 148 149 517 TCR 19 136 137 523 148 149 531 TCR 20 537 538 539 546 547 548 TCR 21 136 137 555 561 562 563 TCR 22 570 571 572 579 580 581 TCR 23 136 137 588 148 149 594 TCR 24 136 137 600 148 149 606 TCR 25 136 137 612 148 149 618 TCR 26 136 137 624 168 169 630 TCR 27 142 143 638 561 562 644 TCR 28 171 172 650 148 149 656 TCR 29 136 137 662 668 669 670 TCR 30 677 678 679 154 155 686

[0276] В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит области Vα и Vβ, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 111 и 112, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 113 и 114, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 115 и 116, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 121 и 122, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 123 и 124, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 125 и 126, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 297 и 298, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 299 и 300, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 477 и 483, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 492 и 498, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 504 и 498, соответственно. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат области Vα и Vβ, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 510 и 516, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 522 и 530, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 536 и 545, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 554 и 560, соответственно. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат области Vα и Vβ, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 569 и 578, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 587 и 593, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 599 и 605, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 611 и 617, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 623 и 629, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 637 и 643, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 649 и 655, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 661 и 667, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 676 и 685, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0277] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь TCR или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат область Cα или ее часть, и/или бета-цепь дополнительно содержит область Cβ или ее часть. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 218 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 214, 216 или 631, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления области Cα и/или Cβ модифицируют, например, путем включения одного или более ненативных остатков цистеина, таких как любые, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержат ненативный цистеин в остатке 48 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью и которая содержит введенный ненативный цистеиновый остаток (например, Cys48). В некоторых аспектах область Cβ содержит ненативный цистеин в остатке 57 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197, 199 или 632, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, например, последовательность, имеющая, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0278] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 18, 28, 38, 68, 78, 88, 287, 291, 473, 488, 500, 506, 518, 532, 550, 565, 583, 595, 607, 619, 633, 645, 657 или 672, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 22, 32, 42, 72, 82, 92, 289, 293, 479, 494, 512, 526, 541, 556, 574, 589, 601, 613, 625, 639, 651, 663 или 681, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0279] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 19, 29, 39, 69, 79, 89, 288, 292, 474, 489, 501 507, 519, 533, 551, 566, 584, 596, 608, 620, 634, 646, 658 или 673, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая в по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 23, 33, 43, 73, 83, 93, 290, 294, 480, 495, 513, 527, 542, 557, 575, 590, 602, 614, 626, 640, 652, 664 или 682, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0280] В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленные в Таблице 3 или Таблице 4. В некоторых аспектах TCR содержит последовательности константной области альфа и константной области бета, такие как последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленные в Таблице 3 или Таблице 4. В некоторых случаях TCR содержит полную последовательность, содержащую вариабельную и константную области цепи, такую как последовательность, соответствующая SEQ ID NO, представленным в Таблицах 3 или 4 («Полная»). В некоторых вариантах осуществления полная последовательность, содержащая вариабельную и константную области, также включает сигнальную последовательность и, таким образом, содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO, представленным в Таблице 3 или 4 («Полная+сигнальная»). Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие последовательности, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблицах 3 и 4, соответственно.

Таблица 3: HPV16 E6(29-38) TCR нативный SEQ ID NO. Иллюстративный TCR Альфа Бета Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная
(Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 3 111 215 18 318 112 216 22 320 TCR 4 113 213 28 322 114 214 32 324 TCR 5 115 213 38 326 116 214 42 328 TCR 8 121 213 68 338 122 216 72 110 TCR 9 123 213 78 130 124 216 82 132 TCR 10 125 212 88 134 126 214 92 179 TCR 13 297 213 287 253 298 216 289 260 TCR 14 299 218 291 313 300 214 293 315 TCR 15 477 218 473 475 483 216 479 481 TCR 16 492 213 488 490 498 214 494 496 TCR 17 504 213 500 502 498 214 494 496 TCR 18 510 213 506 508 516 214 512 514 TCR 19 522 524 518 520 530 216 526 528 TCR 20 536 218 532 534 545 216 541 543 TCR 21 554 213 550 552 560 214 556 558 TCR 22 569 524 565 567 578 214 574 576 TCR 23 587 524 583 585 593 214 589 591 TCR 24 599 524 595 597 605 216 601 603 TCR 25 611 524 607 609 617 214 613 615 TCR 26 623 213 619 621 629 631 625 627 TCR 27 637 213 633 635 643 214 639 641 TCR 28 649 213 645 647 655 214 651 653 TCR 29 661 524 657 659 667 216 663 665 TCR 30 676 213 672 674 685 214 681 683

Таблица 4: HPV16 E6(29-38) TCR модифицированный SEQ ID NO. Иллюстративный модифицированный вариант TCR Alpha Beta Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная
(Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 3 111 198 19 319 112 199 23 321 TCR 4 113 196 29 323 114 197 33 325 TCR 5 115 196 39 327 116 197 43 329 TCR 8 121 203 69 339 122 199 73 129 TCR 9 123 203 79 131 124 199 83 133 TCR 10 125 198 89 135 126 197 93 180 TCR 13 297 203 288 256 298 199 290 312 TCR 14 299 201 292 314 300 197 294 316 TCR 15 477 201 474 476 483 199 480 482 TCR 16 492 203 489 491 498 197 495 497 TCR 17 504 203 501 503 498 197 495 497 TCR 18 510 203 507 509 516 197 513 515 TCR 19 522 525 519 521 530 199 527 529 TCR 20 536 201 533 535 545 199 542 544 TCR 21 554 203 551 553 560 197 557 559 TCR 22 569 525 566 568 578 197 575 577 TCR 23 587 525 584 586 593 197 590 592 TCR 24 599 525 596 598 605 199 602 604 TCR 25 611 525 608 610 617 197 614 616 TCR 26 623 203 620 622 629 632 626 628 TCR 27 637 203 634 636 643 197 640 642 TCR 28 649 203 646 648 655 197 652 654 TCR 29 661 525 658 660 667 199 664 666 TCR 30 676 203 673 675 685 197 682 684

b. HPV 16 Е7 (11-19)

[0281] В некоторых случаях TCR распознает или связывает пептидный эпитоп, полученный из E7 HPV 16, который представляет собой или содержит E7 (11-19) YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236). В некоторых вариантах осуществления TCR распознает или связывает E7 HPV 16 (11-19) в контексте MHC, такого как MHC класса I, например, HLA-A2. В некоторых вариантах осуществления E7 HPV 16 содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 265.

[0282] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO: 249), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой Е или V; X₃ представляет собой S или P; Х₄ представляет собой I, S или R; Х₅ представляет собой R, G или D; Х6 представляет собой G, A или N; X₇ представляет собой F, отсутствует или Y; Х8 представляет собой G или Т; Х₉ представляет собой Т, Q или N; X₁₀ представляет собой V, K или N; X₁₁ представляет собой L или F и X₁₂ представляет собой H, I или V. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂SX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO: 1374), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой Е или V; Х₄ представляет собой I или R; Х₅ представляет собой R или D; Х6 представляет собой G или N; Х₇ представляет собой F или Y; Х8 представляет собой N или Q; Х₉ представляет собой V или N; Х₁₀ представляет собой L или F; и X₁₁ представляет собой H или V.

[0283] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержfт область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1183), где X₁ представляет собой V или A; X₂ представляет собой V, A, G, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, A, N, Y, R, T или P; X₄ представляет собой E, A, S, G, R.F, N, D, V, P, L, I или M; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, A, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, N, A, S, L, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, Y, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, F, Y, Q, N или R; X₁₂ представляет собой N, K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, F, M или V; и X₁₄ представляет собой I, T, S, V, R или Y.

[0284] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность VVX₃X₄X₅X₆X₇X₈GX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃ (SEQ ID NO: 1184), где X₃ представляет собой S, N или T; Х₄ представляет собой R или F; Х₅ представляет собой D или А; Х6 представляет собой N или L; Х₇ представляет собой Т или отсутствует; Х8 представляет собой Y или G; Х₁₀ представляет собой Q или F; X₁₁ представляет собой N или K; Х₁₂ представляет собой F или Т; и Х₁₃ представляет собой V или I.

[0285] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1185), где X₂ представляет собой A, G, V, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, N, A, Y, R или P; X₄ представляет собой E, S, A, G, F, N, D, V, P, L, I, M или R; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, A, S, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A или N; X₁₁ представляет собой Y, F, Q, R или N; X₁₂ представляет собой K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, M, F или V; и X₁₄ представляет собой I, T, S, R, Y или V.

[0286] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀KX₁₂I (SEQ ID NO: 1186), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой А, V или Е; X₃ представляет собой S, N, T, R или P; X₄ представляет собой E, A, G, F, V, P, I, D или S; X₅ представляет собой R, H, T, A P, S, G или F; X₆ представляет собой G, H, L, T, S, A или отсутствует; X₇ представляет собой S, T или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, T или отсутствует; Х₁₀ представляет собой F, Y или N; и X₁₂ представляет собой Y, T или L.

[0287] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YKYI (SEQ ID NO: 1187), где X₂ представляет собой A, V или E; X₃ представляет собой S, N или R; X₄ представляет собой E, G, V, P, I или D; X₅ представляет собой R, T, P, S, G или F; X₆ представляет собой G, T, S или отсутствует; X₇ представляет собой S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; и X₉ представляет собой T или отсутствует.

[0288] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1188), где X₂ представляет собой G, V, Q, или М; X₃ представляет собой G, A, Y, S, N или R; X₄ представляет собой S, G, L, I, M или R; Х₅ представляет собой N, D, G, S, L, Q или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, D, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; и X₁₄ представляет собой S, T или V.

[0289] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃T (SEQ ID NO: 1189), где X₂ представляет собой G, V или Q; X₃ представляет собой G, Y, S или N; Х₄ представляет собой S, L или М; Х₅ представляет собой N, G, L или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; и X₁₃ представляет собой L или V.

[0290] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇YKLS (SEQ ID NO: 1190), где X₂ представляет собой G или V; Х₃ представляет собой А или Y; X₄ представляет собой G, S или R; Х₅ представляет собой D или S; X₆ представляет собой N или отсутствует; и X₇ представляет собой D или отсутствует.

[0291] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁SX₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 241), где X₁ представляет собой D или V; Х₃ представляет собой S или Р; Х₄ представляет собой S или F; Х₅ представляет собой Т или S; и X₆ представляет собой Y или N. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1191), где X₁ представляет собой N, S, D, T, или V; X₂ представляет собой S, V, R, T или I; Х₃ представляет собой М, F, G, S, N, А, L, V или Р; X₄ представляет собой F, S, N, A или отсутствует; X₅ представляет собой D, S, Q, Y, N, V, T или P; и X₆ представляет собой Y, S, R, N, G или T.

[0292] В некоторых случаях область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 245), где X₁ представляет собой I или M; Х₂ представляет собой F или Т; Х₃ является S или F; Х₄ представляет собой N или S; Х₅ представляет собой М или Е; Х6 представляет собой D или N; и X₇ представляет собой M или T. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1192), где X₁ представляет собой I, V, L, G, N, T, Y или M; X₂ представляет собой S, V, Y, L, P, F, I или T; X₃ представляет собой S, Y, K, L, T или F; X₄ представляет собой I, G, N, A, S или отсутствует; X₅ представляет собой S, D или отсутствует; X₆ представляет собой K, G, N, S, D, T или E; X₇ представляет собой D, E, G, A, K, L или N; и X₈ представляет собой K, V, D, P, N, T, L или M.

[0293] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂TX₄RX₆X₇YX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO: 259), где X₂ представляет собой S или I; Х₄ представляет собой Т или D; Х6 представляет собой S или Т; Х₇ представляет собой S или N; Х₉ представляет собой Е или G; Х₁₀ представляет собой Q или Y; и X₁₁ представляет собой Y или T.

[0294] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1193), где X₂ представляет собой S, M, I, К или V; X₃ представляет собой S, T, N или A; X₄ представляет собой R, V P, S, T, G, L, A, I или D; X₅ представляет собой F, G, R, Y, S, L, V или T; X₆ представляет собой L, G, D, A, S, T, V, R или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, R, V, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, Y, N, G или P; X₁₁ представляет собой D, Y, N, E, K или G; Х₁₂ представляет собой Т, Е, G или К; X₁₃ представляет собой Q, Y, A или L; и X₁₄ представляет собой Y, F, T или I.

[0295] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂TX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂ (SEQ ID NO: 1194), где X₂ представляет собой S, M, I, или К; X₄ представляет собой P, T, G, A, S или D; Х₅ представляет собой R или S; X₆ представляет собой D, G, S, T или V; X₇ представляет собой R, S или отсутствует; Х8 представляет собой Т, Y, G, N или S; X₉ представляет собой Y, N или K; Х₁₀ представляет собой Е или G; X₁₁ представляет собой Q, A или Y; и X₁₂ представляет собой Y, F или T.

[0296] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1195), где X₂ представляет собой S, M, I, или К; X₃ представляет собой S, T, A или N; X₄ представляет собой R, V, S, P, T, G, L или A; X₅ представляет собой F, G, R, Y, S, V или T; X₆ представляет собой L, G, D, A, S, T, V или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, R, V, T, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, Y, A, N, G или P; X₁₁ представляет собой D, Y, N, K, E или G; Х₁₂ представляет собой Т или Е; X₁₃ представляет собой Q, A или L; и X₁₄ представляет собой Y или F.

[0297] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁QY (SEQ ID NO: 1196), где X₂ представляет собой S, M, I, или К; X₃ представляет собой S, T, A или N; X₄ представляет собой R, P, S, G, L, A или T; X₅ представляет собой F, R, Y, V или T; X₆ представляет собой L, D, A, S, T, V или отсутствует; X₇ представляет собой G, R или отсутствует; X₈ представляет собой S, G, V или отсутствует; X₉ представляет собой T, A, G, N, S или P; Х₁₀ представляет собой D, Y или E; и X₁₁ представляет собой T или E.

[0298] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉1YEQY (SEQ ID NO: 1197), где X₂ представляет собой S, M, I, или К; X₃ представляет собой S, T, A или N; X₄ представляет собой P, S, G, T или A; Х₅ представляет собой R или Y; X₆ представляет собой D, A, S, T или V; X₇ представляет собой R или отсутствует; X₈ представляет собой G, V или отсутствует; и X₉ представляет собой S, T, A или N.

[0299] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASTX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁EX₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1198), где X₄ представляет собой T, P или G; Х₅ представляет собой R или S; X₆ представляет собой S, D, G или V; X₇ представляет собой D или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, R или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, T, Y или G; X₁₁ представляет собой Y, N или K; X₁₃ представляет собой Q или A; и X₁₄ представляет собой Y или F.

[0300] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈YGYT (SEQ ID NO: 1199), где X₂ представляет собой S или I; Х₃ представляет собой S или Т; Х₄ представляет собой L, A или D; X₅ представляет собой L, T или R; X₆ представляет собой L, T или R; X₇ представляет собой G, D или отсутствует; и Х8 представляет собой А или N.

[0301] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1200), где X₂ представляет собой S, V или I; X₃ представляет собой S, N или A; X₄ представляет собой R, V, S, L, P, G, I или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, R, T или S; X₆ представляет собой L, G, A, D, R, V или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, V, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е, G или К; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; и X₁₄ представляет собой Y, F, T или I.

[0302] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1201), где X₄ представляет собой R, V, S, L, G или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, T или S; X₆ представляет собой A, L, R, D, G или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е, G или Т; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; и X₁₄ представляет собой Y, F или T.

[0303] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀TQY (SEQ ID NO: 1202), где X₄ представляет собой R, L или G; X₅ представляет собой F, V, T или Y; X₆ представляет собой L, A или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой S, G или отсутствует; X₉ представляет собой T, G, P или S; и X₁₀ представляет собой D или E.

[0304] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность SX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1203), где X₂ представляет собой G или N; Х₃ представляет собой Н или D; Х₄ представляет собой Т, L, N или V; и X₅ представляет собой A, S, Y или T.

[0305] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1204), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Q, Y или N; X₃ представляет собой G, N, R или Y; X₄ представляет собой N, G, E или T; X₅ представляет собой S, E, A или G; и X₆ представляет собой A, E, I или Q.

[0306] В некоторых аспектах область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 154, 701, 719 или 751. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 155, 702, 720, 752, 918 или 1009.

[0307] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 153, 159, 301, 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988, 1002 или 1391, или CDR3, содержащиеся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119, 295, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987, 999 или 1390. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит последовательность CDR3, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную таким последовательностям.

[0308] В некоторых вариантах осуществления область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 151, 157, 171, 692, 710, 727, 742, 760, 800, 816, 909, 938 или 1000, или последовательность, имеющую, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vα дополнительно содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 152, 158, 172, 693, 711, 728, 743, 761, 801, 817, 831, 910, 939 или 1001, или последовательность, имеющую, по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0309] В некоторых аспектах область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 156, 160, 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994, 1010 или 1381, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120, 296, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981 993, 1008, 1380. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит последовательность CDR3, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичную таким последовательностям. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 154, 701, 719 или 751, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых случаях область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 155, 702, 720, 752, 918 или 1009, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0310] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 153, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0311] В некоторых аспектах область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 157, 158 и 159, соответственно. В некоторых таких аспектах область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 160, соответственно. Также среди предложенных TCR имеются те, которые имеют последовательности, по меньшей мере, на 90 или 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны таким последовательностям.

[0312] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 301, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0313] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 692, 693 и 694, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 703, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0314] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 712, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 721, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0315] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 729, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 736, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0316] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 744, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 753, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0317] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 760, 761 и 762, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 769, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0318] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 776, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 782, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0319] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 788, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 794, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0320] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 800, 801 и 802, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 809, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0321] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 818, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 825, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0322] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831 и 832, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 840, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0323] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 846, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 852, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0324] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831 и 858, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 864, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0325] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 870, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 876, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0326] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 882, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 888, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0327] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 896, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 902, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0328] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 909, 910 и 911, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 918 и 919, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0329] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 926, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 932, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0330] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 938, 939 и 940, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 946, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0331] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 952, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 958, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0332] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 964, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 970, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0333] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 976, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 982, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0334] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 988, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 994, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0335] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1000, 1001 и 1002, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 1009 и 1010, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0336] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область Vα, которая содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 1391, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 1381, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0337] В некоторых случаях область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119, 295, 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987, 999 или 1390. В некоторых случаях область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120, 296, 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0338] В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент включают область Vα, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2, и CDR-3, представленные в Таблице 5, и область Vβ, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2, и CDR-3, представленные в Таблице 5. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие CDR, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблице 5.

Таблица 5: HPV16 E7(11-19) TCR CDR SEQ ID NO. Иллюстративный TCR Альфа Бета CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TCR 6 151 152 153 154 155 156 TCR 7 157 158 159 154 155 160 TCR 12 151 152 301 154 155 156 TCR 31 692 693 694 701 702 703 TCR 32 710 711 712 719 720 721 TCR 33 727 728 729 154 155 736 TCR 34 742 743 744 751 752 753 TCR 35 760 761 762 719 720 769 TCR 36 171 172 776 154 155 782 TCR 37 742 743 788 139 140 794 TCR 38 800 801 802 751 752 809 TCR 39 816 817 818 154 155 825 TCR 40 816 831 832 154 155 840 TCR 41 171 172 846 154 155 852 TCR 42 816 831 858 154 155 864 TCR 43 727 728 870 154 155 876 TCR 44 570 571 882 719 720 888 TCR 45 816 817 896 701 702 902 TCR 46 909 910 911 701 918 919 TCR 47 727 728 926 154 155 932 TCR 48 938 939 940 154 155 946 TCR 49 727 728 952 154 155 958 TCR 50 151 152 964 719 720 970 TCR 51 727 728 976 154 155 982 TCR 52 710 711 988 719 720 994 TCR 53 1000 1001 1002 139 1009 1010 TCR 54 157 158 159 154 155 160 TCR 55 151 152 301 154 155 156 TCR 66 171 172 1391 154 155 1381

[0339] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат области Vα и Vβ, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 117 и 118 или 296, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 119 и 120, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 295 и 118 или 296, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 691 и 700, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 709 и 718, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 726 и 735, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 741 и 750, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 759 и 768, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 775 и 781, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 787 и 793, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 799 и 808, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 815 и 824, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 830 и 839, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 845 и 851, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 857 и 863, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 869 и 875, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 881 и 887, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 895 и 901, соответственно. В некоторых аспектах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 908 и 917, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 925 и 931, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 937 и 945, соответственно. В некоторых примерах области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 951 и 957, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 963 и 969, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 975 и 981, соответственно. В некоторых случаях области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 987 и 993, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 999 и 1008, соответственно. В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1390 и 1380, соответственно.

[0340] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь TCR или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат область Cα или ее часть, и/или бета-цепь дополнительно содержит область Cβ или ее часть. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержат аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 213, 217, 218 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую ​​как последовательность, имеющая в по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления области Cα и/или Cβ модифицируют, например, путем включения одного или более ненативных остатков цистеина, таких как любые, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержат ненативный цистеин в остатке 48 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 200, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, такую ​​как последовательность, имеющую, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью и которая содержит введенный ненативный цистеиновый остаток (например, Cys48). В некоторых аспектах область Cβ содержит ненативный цистеин в остатке 57 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197, 199, 890 или 1363, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0341] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 48, 58, 283, 687, 705, 722, 737, 755, 771, 783, 795, 811, 826, 841, 853, 865, 877, 891, 904, 921, 933, 947, 959, 971, 983, 995 или 1386, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 52, 285, 62, 696, 714, 731, 746, 764, 777, 789, 804, 820, 835, 847, 859, 871, 883, 897, 913, 927, 941, 953, 965, 977, 989, 1004 или 1376, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0342] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 49, 59, 284, 688, 706, 723, 738, 756, 772, 784, 796, 812, 827, 842, 854, 866, 878, 892, 905, 922, 934, 948, 960, 972, 984, 996 или 1387, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащая последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 53, 63, 286, 697, 715, 732, 747, 765, 778, 790, 805, 821, 836, 848, 860, 872, 884, 898, 914, 928, 928, 942, 954, 966, 978, 990, 1005 или 1377, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такая как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0343] В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленным в Таблице 6 или Таблице 7. В некоторых аспектах TCR содержит последовательности константной области альфа и константной области бета, такие как последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленным в Таблице 6 или Таблице 7. В некоторых случаях TCR содержит полную последовательность, содержащую вариабельную и константную области цепи, такую как последовательность, соответствующая SEQ ID NO, представленным в Таблице 6 или Таблице 7 («Полная»). В некоторых вариантах осуществления полная последовательность, содержащая вариабельную и константную области, также включает сигнальную последовательность и, таким образом, содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO, представленным в Таблице 6 или Таблице 7 («Полная+сигнальная»). Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие последовательности, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблицах 6 и 7, соответственно.

Таблица 6: HPV16 E7(11-19) TCR нативный SEQ ID NO. Иллюстративный TCR Альфа Бета Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная
(Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 6 117 217 48 330 118, 296 216 52, 285 332, 246 TCR 7 119 218 58 334 120 214 62 336 TCR 12 295 213 283 222 118, 296 216 52, 285 332, 246 TCR 31 691 213 687 689 700 216 696 698 TCR 32 709 213 705 707 718 216 714 716 TCR 33 726 213 722 724 735 216 731 733 TCR 34 741 213 737 739 750 216 746 748 TCR 35 759 213 755 757 768 216 764 766 TCR 36 775 218 771 773 781 216 777 779 TCR 37 787 213 783 785 793 214 789 791 TCR 38 799 213 795 797 808 216 804 806 TCR 39 815 213 811 813 824 214 820 822 TCR 40 830 213 826 828 839 216 835 837 TCR 41 845 213 841 843 851 216 847 849 TCR 42 857 213 853 855 863 216 859 861 TCR 43 869 213 865 867 875 216 871 873 TCR 44 881 213 877 879 887 889 883 885 TCR 45 895 213 891 893 901 216 897 899 TCR 46 908 213 904 906 917 216 913 915 TCR 47 925 524 921 923 931 216 927 929 TCR 48 937 213 933 935 945 216 941 943 TCR 49 951 213 947 949 957 216 953 955 TCR 50 963 213 959 961 969 214 965 967 TCR 51 975 213 971 973 981 214 977 979 TCR 52 987 213 983 985 993 214 989 991 TCR 53 999 213 995 997 1008 216 1004 1006 TCR 54 119 218 58 334 120 214 62 336 TCR 55 295 213 283 222 118, 296 216 52, 285 332, 246 TCR 66 1390 218 1386 1388 1380 216 1376 1378

Таблица 7: HPV16 E7(11-19) TCR модифицированный SEQ ID NO. Иллюстративная модифицированная версия TCR Альфа Бета Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная (Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 6 117 200 49 331 118, 296 199 53, 286 333, 250 TCR 7 119 201 59 335 120 197 63 337 TCR 12 295 196 284 242 118, 296 199 53, 286 333, 250 TCR 31 691 203 688 690 700 199 697 699 TCR 32 709 203 706 708 718 199 715 717 TCR 33 726 203 723 725 735 199 732 734 TCR 34 741 203 738 740 750 199 747 749 TCR 35 759 203 756 758 768 199 765 767 TCR 36 775 201 772 774 781 199 778 780 TCR 37 787 203 784 786 793 197 790 792 TCR 38 799 203 796 798 808 199 805 807 TCR 39 815 203 812 814 824 197 821 823 TCR 40 830 203 827 829 839 199 836 838 TCR 41 845 203 842 844 851 199 848 850 TCR 42 857 203 854 856 863 199 860 862 TCR 43 869 203 866 868 875 199 872 874 TCR 44 881 203 878 880 887 890 884 886 TCR 45 895 203 892 894 901 199 898 900 TCR 46 908 203 905 907 917 199 914 916 TCR 47 925 525 922 924 931 199 928 930 TCR 48 937 203 934 936 945 199 942 944 TCR 49 951 203 948 950 957 199 954 956 TCR 50 963 203 960 962 969 197 966 968 TCR 51 975 203 972 974 981 199 978 980 TCR 52 987 203 984 986 993 199 990 992 TCR 53 999 203 996 998 1008 199 1005 1007 TCR 54 119 201 59 335 120 197 63 337 TCR 55 295 196 284 242 118, 296 199 53, 286 333, 250 TCR 66 1390 201 1387 1389 1380 199 1377 1379

c. HPV 16 Е7 (86-93)

[0344] В некоторых случаях TCR распознает или связывает пептидный эпитоп, полученный из E7 HPV 16, который представляет собой или содержит E7 (86-93) TLGIVCPI (SEQ ID NO: 235). В некоторых вариантах осуществления TCR распознает или связывает E7 HPV 16 (86-93) в контексте MHC, такого как MHC класса I, например, HLA-A2.

[0345] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 175. В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит последовательность CDR3, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную таким последовательностям. В некоторых аспектах область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 142, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vα содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0346] В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 178, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых случаях область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 176, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Vβ содержит область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 177, или последовательность, имеющую по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0347] В некоторых вариантах осуществления область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 175, соответственно. В некоторых таких вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 176, 177 и 178, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые имеют последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0348] В некоторых аспектах область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в SEQ ID NO: 127. В некоторых вариантах осуществления область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в SEQ ID NO: 128. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0349] В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент включают область Vα, содержащую область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно содержащие аминокислоные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, представленные в Таблице 8, и область Vβ, содержащую область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, представленные в Таблице 8. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие CDR, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблице 8.

Таблица 8: HPV16 E7(86-93) TCR CDR SEQ ID NO. Иллюстративный TCR Альфа Бета CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TCR 11 142 143 175 176 177 178

[0350] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат области Vα и Vβ, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 127 и 128, соответственно. Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.

[0351] В некоторых вариантах осуществления альфа-цепь TCR или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат область Cα или ее часть, и/или бета-цепь дополнительно содержит область Cβ или ее часть. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213 или 217, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых аспектах область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 214 или 216, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления области Cα и/или Cβ модифицируют, например, путем включения одного или более ненативных остатков цистеина, таких как любые, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления область Cα или ее часть содержит ненативный цистеин в остатке 48 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 200, или последовательность аминокислот, которая имеет с ней по меньшей мере 90% идентичность последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере или примерно 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью и которая содержит введенный ненативный цистеиновый остаток (например, Cys48). В некоторых аспектах область Cβ содержит ненативный цистеин в остатке 57 и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197 или 199, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0352] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 98, или последовательность аминокислот, которая имеет с ней по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 102, или последовательность аминокислот, которая имеет с ней по меньшей мере 90% идентичности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0353] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат альфа-цепь, содержащую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 99, или последовательность аминокислот, которая имеет с ней по меньшей мере 90% идентичности последовательности, такую как последовательность, имеющая, по меньшей мере, или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью, и/или бета-цепь, содержащая последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 103, или последовательность аминокислот, которая имеет с ней по меньшей мере 90% идентичности, такую как последовательность, имеющая по меньшей мере или примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.

[0354] В некоторых вариантах осуществления области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленным в Таблице 9 или Таблице 10. В некоторых аспектах TCR содержит последовательности константной области альфа и константной области бета, такие как последовательности, соответствующие SEQ ID NO, представленным в Таблице 9 или Таблице 10. В некоторых случаях TCR содержит полную последовательность, содержащую вариабельную и константную области цепи, такую ​​как последовательность, соответствующая SEQ ID NO, представленным в Таблице 9 или Таблице 10 («Полная»). В некоторых вариантах осуществления полная последовательность, содержащая вариабельную и константную области, также включает сигнальную последовательность и, таким образом, содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO, представленным в Таблице 9 или Таблице 10 («Полныйая+сигнальная»). Также среди представленных TCR имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере, или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, содержащие такие последовательности, или их модифицированные версии, как описано в другом месте настоящего документа, также представлены в Таблицах 9 и 10, соответственно.

Таблица 9: HPV16 E7(86-93) TCR нативный SEQ ID NO. Иллюстративный TCR Альфа Бета Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная (Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 11 127 217 98 195 128 216 102 352

Таблица 10: HPV16 E7(86-93) TCR модифицированные SEQ ID NO. Иллюстративная модифицированная версия TCR Альфа Бета Вариабельная (Vα) Константная Полная Полная+сигнальная Вариабельная (Vβ) Константная Полная Полная+сигнальная TCR 11 127 200 99 205 128 199 103 221

2. Варианты и модификации

[0355] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, являются модифицированными или были модифицированы. В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, например TCR или их антигенсвязывающие фрагменты, включают одну или более вариаций аминокислот, например замен, делеций, вставок и/или мутаций, по сравнению с последовательностью связывающей молекулы, например, TCR, описанной в настоящем документе. Иллюстративные варианты включают варианты, предназначенные для улучшения аффинности связывания и/или других биологических свойств молекулы связывания. Варианты аминокислотных последовательностей связывающей молекулы могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую связывающую молекулу, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях связывающей молекулы. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.

[0356] В некоторых вариантах осуществления способы направленной эволюции используются для создания TCR с измененными свойствами, такими как более высокая аффинность к конкретному пептиду в контексте молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления направленная эволюция достигается методами дисплея, включая, но не ограничиваясь этим, дрожжевой дисплей (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), фаговый дисплей (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) или Т-клеточный дисплей (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). В некоторых вариантах осуществления способы дисплея включают конструирование или модификацию известного, родительского или эталонного TCR. Например, в некоторых случаях эталонный TCR, такой как любой, представленный в настоящем описании, может использоваться в качестве матрицы для получения мутагенизированных TCR, в которых в одном или более остатках CDR мутированы, и выбираются мутанты с желаемым измененным свойством, такими как более высокая аффмнность к пептидному эпитопу в контексте молекулы МНС.

[0357] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, например TCR или их антигенсвязывающие фрагменты, включают одну или более аминокислотных замен, например, по сравнению с последовательностью связывающей молекулой, например, TCR, описанной в настоящем документе, и/или по сравнению с последовательностью естественного репертуара, например, человеческого репертуара. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают области CDR, FR и/или константные области. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющую интерес связывающую молекулу, и продукты подвергаются скринингу на предмет желаемой активности, например, сохраненной/улучшенной антигенной аффинности или авидности, сниженной иммуногенности, улучшенного периода полужизни, CD8-независимого связывания или активности, поверхностной экспрессии, стимулирования спаривания цепей TCR и/или других улучшенных свойств или функций.

[0358] В некоторых вариантах осуществления один или более остатков в CDR родительской связывающей молекулы, например TCR, является/являются замещенными. В некоторых вариантах осуществления замена выполняется для возвращения последовательности или положения в последовательности к последовательности зародышевой линии, такой как последовательность связывающей молекулы, присутствующая в зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии), например, для уменьшения вероятности иммуногенности, например, после введения человеку.

[0359] В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут происходить в одной или более CDR, если такие изменения существенно не снижают способность связывающей молекулы, например TCR или ее антигенсвязывающего фрагмента, связывать антиген. Например, в CDR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предусмотрено в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, присутствовать вне антигенсвязывающих остатков в CDR. В определенных вариантах осуществления вариабельных последовательностей, предложенных в настоящем описании, каждая CDR либо не изменяется, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

[0360] Вставки аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или более аминокислотных остатков.

[0361] В некоторых аспектах TCR или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать одну или более модификаций в альфа-цепи и/или бета-цепи, так что когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются в клетке, частота ошибочного спаривания между альфа-цепью и бета-цепью TCR и эндогенной альфа-цепью и бета-цепью TCR снижается, экспрессия альфа-цепи и бета-цепи TCR увеличивается и/или повышается стабильность альфа-цепи и бета-цепи TCR.

[0362] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит один или более ненативных остатков цистеина для введения ковалентной дисульфидной связи, связывающей остаток области иммуноглобулина константного домена α-цепи с остатком области иммуноглобулина константного домена β-цепи. В некоторых вариантах осуществления один или более цистеинов могут быть включены во внеклеточные последовательности константной области первого и второго сегментов полипептида TCR. Иллюстративные неограничивающие модификации в TCR для введения ненативных остатков цистеина описаны в настоящем документе (см. также международную публикацию PCT No. WO2006/000830 и WO2006037960). В некоторых случаях может быть желательной как нативная, так и ненативная дисульфидная связь. В некоторых вариантах осуществления TCR или антигенсвязывающий фрагмент модифицируют таким образом, чтобы в нативном TCR отсутствовала межцепочечная дисульфидная связь.

[0363] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен константной области TCR может быть модифицирован так, чтобы он содержал большее количество гидрофобных остатков (см., например, Haga-Friedman et al. (2012) Journal of Immunology, 188: 5538-5546). В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область α-цепи TCR содержит одну или более мутаций, соответствующих S116L, G119V или F120L, применительно к нумерации Cα, представленной в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 220, или 524.

[0364] В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая TCR, дополнительно включает маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который может использоваться для подтверждения трансдукции или конструирования клетки для экспрессии TCR, такого как укороченная версия рецептора клеточной поверхности, такого как укороченный EGFR (tEGFR). Иллюстративные суррогатные маркеры могут включать укороченные формы полипептидов клеточной поверхности, такие как укороченные формы, которые не функциональны и не трансдуцируют или не способны к трансдукции сигнала, или сигнала, обычно трансдуцируемого полноразмерной формой полипептида клеточной поверхности, и/или не интернализуются или не способны интернализоваться. Иллюстративные укороченные полипептиды клеточной поверхности, включая укороченные формы факторов роста или других рецепторов, такие как укороченный рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (tHER2), укороченный рецептор эпидермального фактора роста (tEGFR, иллюстративная последовательность tEGFR, представленная в SEQ ID NO: 273 или 343) или простат-специфический мембранный антиген (PSMA) или его модифицированная форма. tEGFR может содержать эпитоп, распознаваемый антителом цетуксимаб (Erbitux®) или другим терапевтическим антителом против EGFR или связывающей молекулой, которые можно использовать для идентификации или отбора клеток, которые были сконструированы с помощью конструкции tEGFR и кодируемого экзогенного белка, и/или для устранения или отделения клеток, экспрессирующих кодируемый экзогенный белок. См. Патент США № 8802374 и Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34 (4): 430-434). В некоторых аспектах маркер, например суррогатный маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR, CD19 или укороченный CD19, например укороченный CD19, не являющийся человеческим, или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой или содержит флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), такой как супер-кратный GFP (sfGFP), красный флуоресцентный белок (RFP), такой как tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed или DsRed2, голубой флуоресцентный белок (CFP), сине-зеленый флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (EBFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP) и их варианты, включая видовые варианты, мономерные варианты и кодон-оптимизированные и/или улучшенные варианты флуоресцентных белков. В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой или содержит фермент, такой как люцифераза, ген lacZ из E. coli, щелочную фосфатазу, секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT). Иллюстративные светоизлучающие репортерные гены включают люциферазу (luc), β-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-глюкуронидазу (GUS) или их варианты.

[0365] В некоторых вариантах осуществления маркер является маркером селекции. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой или содержит полипептид, который придает устойчивость к экзогенным агентам или лекарственным средствам. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой ген устойчивости к антибиотику. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой ген устойчивости к антибиотику, придающий устойчивость к антибиотику клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой или содержит ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к бластидину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к генетицину или ген устойчивости к зеоцину или их модифицированную форму.

[0366] В некоторых аспектах маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептора эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим последовательность линкера, такую как расщепляемая последовательность линкера, например, T2A. Смотри WO2014031687. В некоторых вариантах осуществления введение конструкции, кодирующей TCR и EGFRt, разделенных T2A, P2A или другим переключателем рибосомы, может позволить экспрессировать два белка из одной и той же конструкции, так что EGFRt можно использовать в качестве маркера для детектирования клеток, экспрессирующих такую конструкцию. Примеры таких маркеров, которые можно использовать, описаны ниже.

[0367] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируется нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована или была оптимизирована по кодонам. Иллюстративные кодон-оптимизированные варианты описаны в другом месте настоящего документа.

B. Антитела

[0368] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит любую одну или более CDR, как описано выше в отношении TCR.

[0369] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой и легкой цепи, содержащие CDR1, CDR2 и/или CDR3, содержащиеся в альфа-цепи, и CDR1, CDR2 и/или CDR3, содержащиеся в бета-цепи, как представлено в Таблице 2, Таблице 5 или Таблице 8. Также среди представленных антител или антигенсвязывающих фрагментов имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичные таким последовательностям.

[0370] В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123 125, 297, 299, 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676. В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область, которая содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124 126, 298, 300, 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685. Также среди представленных антител или антигенсвязывающих фрагментов имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичные таким последовательностям.

[0371] В некоторых вариантах осуществления представленное антитело или фрагмент антитела представляет собой антитело человека. В некоторых вариантах осуществления представленное антитело или фрагмент антитела содержат область VH, которая содержит часть, имеющую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью V-сегмента тяжелой цепи зародышевой линии человека, часть, которая имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью D-сегмента тяжелой цепи зародышевой линии человека, и/или часть, имеющую, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью J-сегмента тяжелой цепи зародышевой линии человека; и/или содержит область VL, которая содержит часть, имеющую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью V-сегмента каппа- или лямбда-цепи зародышевой линии человека и/или часть, имеющую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью J-сегмента каппа- или лямбда-цепи зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления часть области VH соответствует CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3. В некоторых вариантах осуществления часть области VH соответствует каркасной области 1 (FR1), FR2, FR2 и/или FR4. В некоторых вариантах осуществления часть области VL соответствует CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3. В некоторых вариантах осуществления часть области VL соответствует FR1, FR2, FR2 и/или FR4.

[0372] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат каркасную область, которая содержит последовательности генных сегментов зародышевой линии человека. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат область VH, в которой находится каркасная область, например FR1, FR2, FR3 и FR4, имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека, таким как V- и/или J-сегмент. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит область VL, в которой каркасная область, например FR1, FR2, FR3 и FR4 имеют по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека, таким как V- и/или сегмент. Например, в некоторых таких вариантах осуществления каркасная последовательность последовательности VH и/или VL отличается не более чем на 10 аминокислот, например не более чем на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту по сравнению с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, например TCR-подобные антитела специфически распознают пептидный эпитоп в контексте молекулы MHC, такой как MHC класса I. В некоторых случаях молекула MHC класса I представляет собой молекулу HLA-A2, например, HLA-A2*01.

[0373] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознают или связываются с эпитопом или областью E6 HPV16, таким как пептидный эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 232-234. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают или связываются с пептидным эпитопом, полученным из E6 HPV16, представляют собой или содержат последовательность, представленную в SEQ ID NO: 233.

[0374] В некоторых аспектах TCR или антигенсвязывающий фрагмент распознают или связываются с эпитопом или областью белка Е7 HPV16, таким как пептидный эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 235-239. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент не распознает или не связывается с эпитопом E7 (11-19), содержащим аминокислотную последовательность YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236). В некоторых случаях пептид, полученный из E7 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235.

[0375] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления представлены антитела против HPV, включая функциональные фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления домены антител VH и/или VL или их антигенсвязывающий сайт способны специфически связываться с пептидным эпитопом HPV 16. В некоторых вариантах осуществления антитела включают вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, такие как scFv. Антитела включают антитела, которые специфически связываются с HPV, например E6 HPV 16 или E7 HPV 16. [0382] Среди представленных антител против HPV есть человеческие антитела. Антитела включают выделенные антитела. Также представлены молекулы, содержащие такие антитела, например одноцепочечные белки, слитые белки и/или рекомбинантные рецепторы, такие как химерные рецепторы, включая антигенные рецепторы.

[0376] Термин «антитело» в настоящем описании используется в самом широком смысле и включает поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, включая фрагменты (Fab) антигенсвязывающих фрагментов, F(ab')2-фрагменты, Fab-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты рекомбинантного IgG (rIgG), вариабельные области тяжелой цепи (VH), способные специфически связываться с антигеном, фрагменты одноцепочечных антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), и фрагменты однодоменных антител (например, sdAb, sdFv, нанотело). Термин охватывает генетически сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептидные антитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, полиспецифичные, например, биспецифичные, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv. Если не указано иное, термин «антитело» следует понимать как охватывающий его функциональные фрагменты. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, включая IgG и его подклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.

[0377] В некоторых вариантах осуществления тяжелая и легкая цепи антитела могут быть полноразмерными или могут представлять собой антигенсвязывающую часть (Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv)). В других вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, в частности, выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, более конкретно, IgG1 (например, из человеческого IgG1). В другом варианте осуществления константная область легкой цепи антитела выбрана, например, из каппа или лямбда, в частности, каппа.

[0378] Среди представленных антител есть фрагменты антител. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; вариабельные области тяжелой цепи (VH), молекулы одноцепочечных антител, такие как scFvs и однодоменные антитела VH; и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой фрагменты одноцепочечных антител, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.

[0379] Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» при использовании в отношении антитела, такого как фрагмент антитела, относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три CDR. (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., стр. 91 (2007). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. Смотри, например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

[0380] Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, включающие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело.

[0381] Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой полученные рекомбинантным путем фрагменты, такие как фрагменты, содержащие струкутры, которые не встречаются в природе, такие как фрагменты с двумя или более областями или цепями антител, соединенными синтетическими линкерами, например пептидными линкерами, и/или которые могут не получаться путем ферментативного расщепления природного интактного антитела. В некоторых аспектах фрагменты антител представляют собой scFv.

[0382] Среди представленных антител против HPV есть человеческие антитела. «Антитело человека» представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или источником, не являющимся человеческим, который использует репертуар антител человека или другие последовательности, кодирующие антитела человека, включая библиотеки антител человека. Термин исключает гуманизированные формы антител, не являющихся человеческими, содержащих антигенсвязывающие области, не являющиеся человеческими, такие как те, в которых все или по существу все CDR не являются человеческими. Термин включает антигенсвязывающие фрагменты антител человека.

[0383] «Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR получены из CDR, не являющихся человеческими, и все или по существу все аминокислотные остатки FR получены из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, не являющегося человеческим относится к варианту антитела, не являющегося человеческим, которое подверглось гуманизации, как правило, для снижения иммуногенности у человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела, из которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

[0384] Человеческие антитела могут быть получены введением иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для производства интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Антитела человека также могут быть получены из библиотек антител человека, включая фаговый дисплей и бесклеточные библиотеки, содержащие кодирующие антитела последовательности, полученные из репертуара человека.

[0385] В число представленных антител входят моноклональные антитела, включая фрагменты моноклональных антител. Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции или внутри популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных вариантов, содержащих природные мутации или возникающие во время продуцирования препарата моноклонального антитела, причем такие варианты, как правило, присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных эпитопов, каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одного эпитопа на антигене. Термин не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, получение из гибридомы, методы рекомбинантной ДНК, фаговый дисплей и другие методы дисплея антител.

[0386] Используемый в настоящем описании термин «соответствующая форма» антитела означает, что при сравнении свойства или активности двух антител это свойство сравнивается с использованием одной и той же формы антитела. Например, если указано, что антитело обладает большей активностью по сравнению с активностью соответствующей формы первого антитела, это означает, что конкретная форма, такая как scFv этого антитела, обладает большей активностью по сравнению с формой scFv первого антитела.

[0387] «Эффекторные функции» относятся к тем биологическим активностям, которые относятся к области Fc антитела, которые зависят от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); Связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.

[0388] В некоторых вариантах осуществления антитело, например фрагмент антитела, может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую ​​как один или более доменов константной области. В некоторых вариантах осуществления константные области включают константную область легкой цепи и/или константную область 1 тяжелой цепи (CH1). В некоторых вариантах осуществления антитело включает домен CH2 и/или CH3, такой как область Fc. В некоторых вариантах осуществления область Fc представляет собой область Fc человеческого IgG, такого как IgG1 или IgG4.

[0389] Термин «область Fc» в настоящем описании используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Термин включает области Fc с нативной последовательностью и варианты областей Fc. В одном варианте осуществления область Fc тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или не присутствовать. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или константной области осуществляется в соответствии с системой нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0390] Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат область Fc, как определено в настоящем описании.

[0391] «Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонентов его естественной среды. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают до чистоты более чем 95% или 99%, что определяется, например, электрофоретически (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографически (например, ионнообменная хроматография или ВЭЖХ с обращенной фазой). Для обзора способов оценки чистоты антител см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).

1. Варианты и модификации

[0392] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты включают одну или более вариаций аминокислот, например замен, делеций, вставок и/или мутаций, по сравнению с последовательностью антитела, описанной в настоящем документе. Иллюстративные варианты включают варианты, предназначенные для улучшения аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.

[0393] В некоторых вариантах осуществления антитела включают одну или более аминокислотных замен, например, по сравнению с последовательностью антител, описанной в настоящем документе, и/или по сравнению с последовательностью природного репертуара, например человеческого репертуара. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают CDR и FR. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело, и продукты будут подвергнуты скринингу на предмет желаемой активности, например, сохраненного/улучшенного связывания антигена, сниженной иммуногенности, улучшенного периода полужизни и/или улучшенной эффекторной функции, такой как способность стимулировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

[0394] В некоторых вариантах осуществления один или более остатков в CDR исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела) замещены. В некоторых вариантах осуществления замена выполняется для возвращения последовательности или положения в последовательности к последовательности зародышевой линии, такой как последовательность антитела, присутствующая в зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии), например, для уменьшения вероятности иммуногенности, например, после введения человеку.

[0395] В некоторых вариантах осуществления изменения делаются в «горячих точках» CDR, остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)) и/или остатках, которые контактируют с антигеном, причем полученный вариант VH или VL тестируют на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах осуществления аффинного созревания разнообразие вводится в вариабельные гены, выбранные для созревания любым из множества способов (например, ПЦР пониженной точности, перетасовка цепей или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем можно создать вторичную библиотеку и провести ее скрининг для выявления любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает CDR-направленные подходы, в которых несколько остатков CDR (например, 4-6 остатков за раз) рандомизированы. Остатки CDR, участвующие в связывании антигена, могут быть конкретно идентифицированы, например, с использованием аланинсканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, CDR-H3 и CDR-L3 часто являются мишенями.

[0396] В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут происходить в одной или более CDR, при условии, что такие изменения существенно не снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, в CDR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предусмотрено в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, присутствовать вне антигенсвязывающих остатков в CDR. В некоторых вариантах вариантах осуществления вариантов последовательностей VH и VL, представленных выше, каждая CDR либо не изменена, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

[0397] Вставки аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или более аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие варианты вставок молекулы антитела включают слияние с N- или C-концом антитела с ферментом или полипептидом, который увеличивает период полужизни антитела в сыворотке.

[0398] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент изменяют для увеличения или уменьшения степени, до которой антитело гликозилируется, например, путем удаления или вставки одного или более сайтов гликозилирования путем изменения аминокислотной последовательности и/или путем модификации олигосахарида(олигосахаридов), присоединенных к сайтам гликозилирования, например, с использованием определенных клеточных линий.

[0399] Иллюстративные модификации, варианты и клеточные линии описаны, например, в патентных публикациях No. US 2003/0157108, US 2004/0093621, US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Патентная заявка США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); и WO2003/085107); WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Патент США № 6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.); WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0400] Среди модифицированных антител имеются антитела, имеющие одну или более аминокислотных модификаций в области Fc, такие как антитела, имеющие последовательность области Fc человека или другую часть константной области (например, область Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более положениях аминокислот.

[0401] Такие модификации могут быть сделаны, например, для улучшения периода полужизни, изменения связывания с одним или более типами Fc-рецепторов и/или изменения эффекторных функций.

[0402] Также среди вариантов присутствуют сконструированные антитела, содержащие цистеин, такие как «thioMAb», и другие сконструированные варианты по цистеину, в которых один или более остатков антитела замещены остатками цистеина для генерации реакционноспособных тиоловых групп в доступных сайтах, например, для использования в конъюгации агентов и линкер-агентов для получения иммуноконъюгатов. Сконструированные с использованием цистеина антитела описаны, например, в Патенты США № 7855275 и 7521541.

[0403] В некоторых вариантах осуществления антитела модифицированы, чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, включая водорастворимые полимеры. Иллюстративные полимеры включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6- триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли (н-винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может иметь преимущества при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, прикрепленных к антителу, может варьироваться, и если присоединено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть определены на основе соображений, включающих, но не ограничивающихся ими, конкретные свойства или функции антитела, подлежащего улучшению, независимо от того, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенные условия и т. д.

2. TCR-подобные CAR

[0404] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть экспрессируются на клетках в виде части рекомбинантного рецептора, такого как рецептор антигена. Среди антигенных рецепторов присутствуют функциональные рецепторы, отличные от TCR-антигенных рецепторов, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). Как правило, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который проявляет TCR-подобную специфичность, направленную против пептида в контексте молекулы MHC, также может называться TCR-подобным CAR.

[0405] Таким образом, среди представленных связывающих молекул, например, HPV 16 E6 или E7-связывающих молекул, присутствуют антигенные рецепторы, такие как те, которые включают одно из представленных антител, например TCR-подобные антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенные рецепторы и другие химерные рецепторы специфически связываются с областью или эпитопом E6 или E7 HPV16, такие как антигенные рецепторы, содержащие представленные антитела против E6 или E7 HPV 16 или фрагменты антител, например, TCR-подобные антитела. Среди антигенных рецепторов присутствуют функциональные рецепторы, отличные от TCR-антигенных рецепторов, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). Также представлены клетки, экспрессирующие CAR, и их применение в адоптивной клеточной терапии, такой как лечение заболеваний и расстройств, связанных с экспрессией E6 или E7 HPV 16.

[0406] Таким образом, в настоящем документе представлены TCR-подобные CAR, которые содержат молекулу, не относящуюся к TCR, которая проявляет специфичность Т-клеточных рецепторов, как например, для эпитопа Т-клеток или пептидного эпитопа, когда отображается или презентируется в контексте молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления TCR-подобный CAR может содержать антитело или его антигенсвязывающую часть, например TCR-подобное антитело, такое как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть является реакционноспособной в отношении специфического пептидного эпитопа в контексте молекулы МНС, где антитело или фрагмент антитела могут дифференцировать конкретный пептид в контексте молекулы МНС от одной молекулы МНС, только конкретный пептид и, в некоторых случаях, нерелевантный пептид в контексте молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть могут проявлять более высокую аффинность связывания, чем Т-клеточный рецептор.

[0407] Иллюстративные антигенные рецепторы, включающие CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки включают те, которые описаны, например, в международных публикациях патентных заявок WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014/031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, в публикациях патентных заявок США US2002/131960, US2013/287748, US2013/0149337, в Патентах США № 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, а также в еврпейской патентной заявке EP 2537416 и/или описанные в Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLOS ONE 8 (4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах антигенные рецепторы включают CAR, как описано в Патенте США № 7446190 и те, которые описаны в публикации международной заявки на патент: WO2014/055668 A1. Примеры CAR включают CAR, как описано в любой из вышеупомянутых публикаций, таких как WO2014/031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, Патент США № 7446190, Патент США № 8389282, например, и в котором антигенсвязывающая часть, например scFv, заменена антителом, например, как предусмотрено в настоящем описании.

[0408] В некоторых вариантах осуществления CAR, как правило, включают внеклеточный антигенсвязывающий домен (или лиганд-связывающий), в том числе в виде антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного для пептида в контексте молекулы МНС, связанный с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, в некоторых аспектах через линкеры и/или трансмембранные домены. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы обычно могут имитировать или аппроксимировать сигнал через природный антигенный рецептор, такого как TCR, и, необязательно, сигнал через такой рецептор в комбинации с костимуляторным рецептором.

[0409] В некоторых вариантах осуществления CAR обычно включает в свою внеклеточную часть одну или более антигенсвязывающих молекул, таких как один или более антигенсвязывающих фрагментов, доменов или частей, или один или более вариабельных доменов антител, и/или молекулы антител. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антигенсвязывающую часть или части молекулы антитела, такие как одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), полученный из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела (mAb). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, такое как антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), которое специфически распознает пептидный эпитоп, презентированный на поверхности клетки в контексте молекулы MHC.

[0410] В некоторых аспектах компонент антигенспецифического связывания или распознавания связан с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления CAR включает трансмембранный домен, слитый с внеклеточным доменом CAR. В одном варианте осуществления используется трансмембранный домен, который естественным образом ассоциирован с одним из доменов в CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен отбирают или модифицируют путем замены аминокислот, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.

[0411] Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления происходит из природного или синтетического источника. Если источник является природным, домен в некоторых аспектах происходит из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, происходящие из (т.е. которые содержат по меньшей мере трансмембранную область(области)) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно, трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет фенилаланина, триптофана и валина будет присутствовать на каждом конце синтетического трансмембранного домена.

[0412] В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как линкер, содержащий глицины и серины, например глицин-сериновый дублет, и образует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.

[0413] В некоторых вариантах осуществления CAR, например TCR-подобный CAR, такой как его часть антитела, дополнительно включает спейсер, который может представлять собой или включать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или ее вариант или модифицированную версию, такую как шарнирная область, например шарнирная область IgG4, и/или область CH1/CL и/или Fc. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть присходит из человеческого IgG, такого как IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах часть константной области служит спейсерной областью между компонентом распознавания антигена, например scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает повышенную чувствительность клетки после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. В некоторых примерах спейсер имеет длину, составляющую или примерно составляющую 12 аминокислот или не более чем 12 аминокислот. Иллюстративные спейсеры включают те, которые содержат по меньшей мере примерно от 10 до 229 аминокислот, примерно от 10 до 200 аминокислот, примерно от 10 до 175 аминокислот, примерно от 10 до 150 аминокислот, примерно от 10 до 125 аминокислот, примерно от 10 до 100 аминокислот, примерно от 10 до 75 аминокислот, примерно от 10 до 50 аминокислот, примерно от 10 до 40 аминокислот, примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 10 до 20 аминокислот или примерно от 10 до 15 аминокислот, и включая любое целое число между конечными точками любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит примерно 12 аминокислот или менее, примерно 119 аминокислот или менее или примерно 229 аминокислот или менее. Иллюстративные спейсеры включают только шарнир IgG4, шарнир IgG4, связанный с доменами СН2 и СН3, или шарнир IgG4, связанный с доменом СН3. Иллюстративные спейсеры включают, но не ограничиваются ими, те, что описаны в Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153 или в публикации международной патентной заявки № WO2014/031687.

[0414] В некоторых вариантах осуществления константная область или часть присходит из человеческого IgG, такого как IgG4 или IgG1. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность ESKYGPPCPPCP (представленную в SEQ ID NO: 268) и кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 269. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 270. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 271. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть происходит из IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 272. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, которая имеет, по меньшей мере, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 268, 270, 271 или 272.

[0415] Домен распознавания антигена обычно связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через комплекс антигенного рецептора, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связаны с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В одном варианте осуществления используется трансмембранный домен, который естественным образом ассоциирован с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен отбирают или модифицируют путем замены аминокислот, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.

[0416] Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления происходит из природного или синтетического источника. Если источник является природным, домен в некоторых аспектах происходит из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, происходящие из (то есть включают по меньшей мере трансмембранную область (области)) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно, трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет фенилаланина, триптофана и валина будет присутствовать на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь осуществляется линкерами, спейсерами и/или трансмембранным доменом (доменами).

[0417] К внутриклеточным сигнальным доменам относятся те, которые имитируют или аппроксимируют сигнал через рецептор природного антигена, сигнал через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором и/или сигнал только через один костимулирующий рецептор. В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как линкер, содержащий глицины и серины, например глицин-сериновый дублет, и образует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.

[0418] CAR обычно включает, по меньшей мере, один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых вариантах осуществления CAR включает внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3+TCR, которая обеспечивает активацию Т-клеток и цитотоксичность, например, цепь CD3-дзета. Таким образом, в некоторых аспектах антигенсвязывающая молекула связана с одним или более клеточными сигнальными модулями. В некоторых вариантах осуществления клеточные сигнальные модули включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или трансмембранные домены других CD. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно включает часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR включает химерную молекулу между CD3-дзета (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.

[0419] В некоторых вариантах осуществления после лигирования CAR цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен CAR активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунной клетки, например, T-клетки, сконструированные для экспрессии CAR. Например, в некоторых контекстах CAR индуцирует функцию T-клетки, такую как цитолитическая активность или Т-хелперная активность, как например, секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления вместо интактной иммуностимулирующей цепи используется, например, укороченная часть внутриклеточного сигнального домена антигенного рецепторного компонента или костимулирующей молекулы, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR), а в некоторых аспектах также последовательности корецепторов, которые в естественном контексте действуют совместно с таким рецептором, инициируя сигнальную трансдукцию рекрутирования антигенного рецептора, и/или любое производное или вариант таких молекул, и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает такой же функциональной способностью.

[0420] В контексте природного TCR для полной активации обычно требуется не только передача сигналов через TCR, но и костимулирующий сигнал. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, чтобы способствовать полной активации, компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала также включен в CAR. В других вариантах осуществления CAR не включает в себя компонент для генерации костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах дополнительный CAR экспрессируется в той же клетке и обеспечивает компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах клетка содержит первый CAR, который содержит сигнальные домены для индукции первичного сигнала, и второй CAR, который связывается со вторым антигеном и содержит компонент для генерации костимулирующего сигнала. Например, первый CAR может быть активирующим CAR, а второй CAR может быть костимулирующим CAR. В некоторых аспектах оба CAR должны быть лигированы, чтобы индуцировать конкретную эффекторную функцию в клетке, которая может обеспечить специфичность и селективность для типа клетки-мишени.

[0421] Т-клеточная активация в некоторых аспектах описывается как опосредуемая двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, чтобы обеспечить вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает в себя один или оба из таких сигнальных компонентов.

[0422] В некоторых аспектах CAR включает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные мотивы активации на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают последовательности, полученные из TCR или CD3-дзета, FcR-гамма, CD3-гамма, CD3-дельта или CD3-эпсилон. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(молекулы) в CAR содержит (содержат) цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, происходящую из CD3-дзета.

[0423] В некоторых вариантах осуществления CAR включает в себя сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах один и тот же CAR включает как активирующий, так и костимулирующий компоненты; в других аспектах активирующий домен обеспечивается одним CAR, тогда как костимулирующий компонент обеспечивается другим CAR, распознающим другой антиген.

[0424] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен включен в один CAR, тогда как костимулирующий компонент обеспечивается другим химерным рецептором, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR и костимулирующие рецепторы, оба экспрессируются на одной и той же клетке (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах рецептор, содержащий антитело против Е6 или Е7 HPV 16, является стимулирующим или активирующим CAR; в других аспектах это костимулирующий рецептор. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибирующие CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (December, 2013)), такой как ингибирующий рецептор, распознающий пептидный эпитоп, отличный от E6 HPV 16 или E7 HPV 16, посредством чего активирующий сигнал, доставляемый через CAR, нацеленный на HPV 16, уменьшается или ингибируется связыванием ингибирующий CAR с его лигандом, например, для уменьшения эффектов ошибочного нацеливания.

[0425] В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая представленный TCR или другую связывающую молекулу, дополнительно экспрессирует дополнительный рецептор, такой как рецептор, способный доставлять костимулирующий сигнал или сигнал, стимулирующий выживание, такой как костимулирующий рецептор (см. WO2014/055668), и/или для блокирования или изменения результата ингибирующего сигнала, такого как сигнал, обычно доставляемый посредством иммунной контрольной точки, или другую иммуноингибирующую молекулу, такую как экспрессируемая в микроокружении опухоли, например, для повышения эффективности таких сконструированных клеток. См., например, Tang et al., Am J Transl Res. 2015; 7 (3): 460-473. В некоторых вариантах осуществления клетка может дополнительно включать один или более других экзогенных или рекомбинантных или сконструированных компонентов, таких как один или более экзогенных факторов и/или костимулирующих лигандов, которые экспрессируются клетками или секретируются ими и могут стимулировать функцию, например, в микроокружении. Примеры таких лигандов и компонентов включают, например, TNFR и/или рецепторы или лиганды семейства Ig, например 41BBL, CD40, CD40L, CD80, CD86, цитокины, хемокины и/или антитела или другие молекулы, такие как scFv. См., например, публикацию патентной заявки № WO2008121420 A1, WO2014134165 A1, US20140219975 A1. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат один или более ингибирующих рецепторов (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (December, 2013)), таких как те, которые связываются с лигандом или антигеном, не ассоциированными с заболеванием или состоянием или не экспрессируемыми при таких заболеваниях или состояниях.

[0426] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный домен CD28 и сигнальный домен, связанный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерные костимулирующие домены CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9), связанные с внутриклеточным доменом CD3-дзета.

[0427] В некоторых вариантах осуществления CAR включает один или более, например, два или более костимулирующих домена и домен активации, например, первичный домен активации, в цитоплазматической части. Иллюстративные CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-дзета, CD28 и 4-1BB.

[0428] В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR или другой антигенный рецептор, дополнительно включает маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который может использоваться для подтверждения трансдукции или конструирования клетки для экспрессии рецептора, такого как укороченная версия рецептора клеточной поверхности, такого как укороченный EGFR (tEGFR). Иллюстративные суррогатные маркеры могут включать укороченные формы полипептидов клеточной поверхности, такие как укороченные формы, которые не функциональны и не трансдуцируют или не способны к трансдукции сигнала, или сигнала, обычно трансдуцируемого полноразмерной формой полипептида клеточной поверхности, и/или не интернализуются или не способны интернализоваться. Иллюстративные укороченные полипептиды клеточной поверхности, включая укороченные формы факторов роста или других рецепторов, такие как укороченный рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (tHER2), укороченный рецептор эпидермального фактора роста (tEGFR, иллюстративная последовательность tEGFR, представленная в SEQ ID NO: 273 или 343) или простат-специфический мембранный антиген (PSMA) или его модифицированная форма. tEGFR может содержать эпитоп, распознаваемый антителом цетуксимаб (Erbitux®) или другим терапевтическим антителом против EGFR или связывающей молекулой, которые можно использовать для идентификации или отбора клеток, которые были сконструированы с помощью конструкции tEGFR и кодируемого экзогенного белка, и/или для устранения или отделения клеток, экспрессирующих кодируемый экзогенный белок. См. Патент США № 8802374 и Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34 (4): 430-434). В некоторых аспектах маркер, например суррогатный маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR, CD19 или укороченный CD19, например укороченный CD19, не являющийся человеческим, или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой или содержит флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), такой как супер-кратный GFP (sfGFP), красный флуоресцентный белок (RFP), такой как tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed или DsRed2, голубой флуоресцентный белок (CFP), сине-зеленый флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (EBFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP) и их варианты, включая видовые варианты, мономерные варианты и кодон-оптимизированные и/или улучшенные варианты флуоресцентных белков. В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой или содержит фермент, такой как люцифераза, ген lacZ из E. coli, щелочную фосфатазу, секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT). Иллюстративные светоизлучающие репортерные гены включают люциферазу (luc), β-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-глюкуронидазу (GUS) или их варианты.

[0429] В некоторых вариантах осуществления маркер является маркером селекции. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой или содержит полипептид, который придает устойчивость к экзогенным агентам или лекарственным средствам. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой ген устойчивости к антибиотику. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой ген устойчивости к антибиотику, придающий устойчивость к антибиотику клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления маркер селекции представляет собой или содержит ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к бластидину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к генетицину или ген устойчивости к зеоцину или их модифицированную форму.

[0430] В некоторых аспектах маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептора эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим последовательность линкера, такую как расщепляемая последовательность линкера, например, T2A. Смотри WO2014031687. [0480] В некоторых вариантах осуществления введение конструкции, кодирующей CAR и EGFRt, разделенных переключателем рибосомы T2A, может экспрессировать два белка из одной и той же конструкции, так что EGFRt можно использовать в качестве маркера для детектирования клеток, экспрессирующих такую конструкцию. В некоторых вариантах осуществления маркер и, необязательно, линкерная последовательность могут быть любыми, как описано в опубликованной патентной заявке №. WO2014031687. Например, маркер может быть укороченным EGFR (tEGFR), который, необязательно, связан с последовательностью линкера, такой как расщепляемая последовательность линкера T2A. Иллюстративный полипептид для укороченного EGFR (например, tEGFR) содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 273 или 343, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 273 или 343. Иллюстративная линкерная последовательность T2A содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 211 или 274, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 211 или 274.

[0431] В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например белок клеточной поверхности или его часть, которые не обнаружены в природе в Т-клетках или не обнаружены в природе на поверхности Т-клеток.

[0432] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой не собственную молекулу, например, не-собственный белок, то есть такие, которые не распознаются как «свои» иммунной системой хозяина, в которую будут адоптивно переноситься клетки.

[0433] В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтической функции и/или не производит никакого эффекта, кроме как для использования в качестве маркера для генетического конструирования, например, для отбора успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, иным образом оказывающую некоторый желаемый эффект, как например лиганд для клетки, встречающийся in vivo, такой как молекула костимулирующей или иммунной контрольной точки, для усиления и/или ослабления ответов клеток при адоптивном переносе и встрече с лигандом.

[0434] В некоторых случаях CAR относятся к CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения представляет собой тот, который обеспечивает только сигнал, индуцированный CD3-цепью, при связывании антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения представляют собой такие, которые обеспечивают такой сигнал и костимулирующий сигнал, например, такой, который включает внутриклеточный сигнальный домен из костимулирующего рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения в некоторых аспектах представляет собой тот, который включает множество костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.

[0435] В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую TCR-подобное антитело или фрагмент, описанный в настоящем документе, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент включают scFv, а внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает в себя сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. Внеклеточный домен и трансмембранный могут быть связаны прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны спейсером, таким как любой описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы Т-клеток, как например между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах костимулирующей молекулой Т-клеток является CD28 или 41BB.

[0436] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, например фрагмент антитела, как предусмотрено в настоящем документе, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28, или его функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальная часть CD28, или его функциональный вариант, и сигнальная часть CD3 дзета или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, например фрагмент антитела, как предусмотрено в настоящем документе, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28, или его функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть 4-1BB, или его функциональный вариант, и сигнальная часть CD3-дзета или ее функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления CAR дополнительно включает спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, такую часть как шарнир Ig, например, шарнир IgG4, как например спейсер в виде шарнира.

[0437] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рецептора, например TCR-подобный CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого CD28 (например, регистр. No P01747.1) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 275, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 275. В некоторых вариантах осуществления часть CAR, содержащая трансмембранный домен, содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 276, или последовательность аминокислот, имеющую, по меньшей мере, или примерно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 276.

[0438] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный компонент(компоненты) CAR, например, TCR-подобный CAR, содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен CD28 человека или его функциональный вариант, или часть, такую как домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. Например, внутриклеточный сигнальный домен может содержать последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 277 или 278, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 277 или 278. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен 4-1BB (например, регистр. No Q07011.1) или его функциональный вариант или часть, такую как последовательность аминокислот, представленная в SEQ ID NO: 279, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 279.

[0439] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR, например, TCR-подобный CAR содержит стимулирующий сигнальный домен CD3-дзета человека или его функциональный вариант, как например цитоплазматический домен 112 AA изоформы 3 человеческого CD3ζ (регистр. No: P20963.2) или сигнальный домен CD3-дзета, как описано в Патенте США № 7446190 или в Патенте США № 8911993. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 280, 281 или 282 или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 280, 281 или 282.

[0440] В некоторых аспектах спейсер содержит только шарнирную область IgG, такую как только шарнир IgG4 или IgG1, такой как спейсер в виде только шарнира, представленный в SEQ ID NO: 268. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит шарнир Ig, например шарнир, полученный из IgG4, необязательно связанный с доменами СН2 и/или СН3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный с доменами СН2 и СН3, как представлено в SEQ ID NO: 271. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный только с доменом СН3, как представлено в SEQ ID NO: 270. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит последовательность, богатую глицином-серином, или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.

[0441] Например, в некоторых вариантах осуществления TCR-подобный CAR включает в себя TCR-подобное антитело или фрагмент, такие как любые из предложенных в настоящем описании, включая scFv, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих Ig-петли, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный сигнальный домен CD28 и сигнальный домен CD3 дзета. В некоторых вариантах осуществления TCR-подобный CAR включает в себя TCR-подобное антитело или фрагмент, такие как любые из предложенных в настоящем описании, включая scFv, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих Ig-шарнир, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный сигнальный домен CD28 и сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления такие TCR-подобные конструкции CAR дополнительно включают в себя элемент пропуска рибосомы T2A и/или последовательность tEGFR, например, в 3'-области от CAR.

[0442] В некоторых вариантах осуществления такие конструкции CAR дополнительно включают в себя элемент пропуска рибосомы T2A и/или последовательность tEGFR, например, в 3'-области от CAR, как представлено в SEQ ID NO: 211 или 274, и последовательность tEGFR, представленную в SEQ ID NO: 273 или 343, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 211, 273, 343 или 274.

[0443] В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело или фрагмент E6 или E7 HPV 16, такие как любое из антител пртив E6 или E7 HPV16, включая sdAb (например, содержащие только область VH) и scFv, описанные в настоящем документе, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих Ig-шарнир, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный сигнальный домен CD28 и сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело или фрагмент HPV 16, такие как любое из антител против E6 или E7 HPV 16, включая sdAb и scFv, описанные в настоящем документе, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих Ig-шарнир, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный сигнальный домен CD28 и сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления такие конструкции CAR дополнительно включают в себя элемент пропуска рибосомы T2A и/или последовательность tEGFR, например, в 3'-области от CAR.

3. Иллюстративные особенности связывающих молекул и сконструированных клеток

[0444] В некоторых аспектах предусмотрены связывающие молекулы, например, TCR или TCR-подобные CAR имеют одну или более указанных функциональных особенностей, таких как свойства связывания, включая связывание с конкретными эпитопами, отсутствие нецелевого связывания или активности и/или специфические аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления любой один или более признаков представленного TCR можно оценить путем экспрессии TCR, например, путем введения одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих TCR, в T-клетку, такую как первичная T-клетка или T-клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная линия представляет собой клетку Jurkat или клеточную линию, полученную из Jurkat. Примером клеточной линии, полученной из Jurkat, является клеточная линия J.RT3-T3.5 (ATCC® TIB-153™), полученная путем обработки клеточной линии лейкоза Jurkat с помощью радиационного мутагенеза и отрицательного отбора с помощью моноклонального антитела против OKT3 (см. Weiss). & Stobo, J. Ex. Med. 160 (5): 1284-1299 (1984)).

[0445] В некоторых вариантах осуществления предложенные связывающие молекулы способны связываться с пептидным эпитопом HPV16, например, эпитопом HPV 16, Е6 или Е7, такой как описанный выше, по меньшей мере с определенной аффинностью, измеренной любым из ряда известных способов. В некоторых вариантах осуществления пептидный эпитоп представляет собой пептид в контексте молекулы МНС или лиганда. В некоторых вариантах осуществления аффинность представлена константой равновесия диссоциации (KD) или константой ассоциации (ka). В некоторых вариантах осуществления аффинность представлена EC50.

[0446] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR, связывается, например, специфически связывается, с пептидным эпитопом, например, в комплексе с молекулой MHC, с аффинностью или KA (то есть константой равновесия ассоциации конкретного связывающего взаимодействия с единицами 1/M, равной отношению скорости ассоциации [kon или ka] к скорости диссоциации [koff или kd] для этой реакции ассоциации, предполагающей бимолекулярное взаимодействие), равной или превышающей 10⁵ М^-1. В некоторых вариантах осуществления TCR или его фрагмент проявляют аффинность связывания пептидного эпитопа с KD (то есть с константой равновесия диссоциации конкретного связывающего взаимодействия с единицами M; равной отношению скорости диссоциации [koff или kd] к скорости ассоциации [kon или ka] для этой реакции ассоциации, при условии бимолекулярного взаимодействия), равной или меньшей 10^-5 М. Например, константа равновесия диссоциации KD находится в диапазоне от или примерно от 10^-5 М до или примерно до 10^-12 М, например, от или примерно от 10^-6 М до или примерно до 10^-10 М, от или примерно от 10^-7 М до или прмерно до 10^-11 М, от или примерно от 10^-6 М до или примерно до 10^-8 М, или от или примерно от 10^-7 М до или примерно до 10^-8 М. Скорость ассоциации (константа скорости ассоциации; kon или ka; единицы 1/Мс) и скорость диссоциации (константа скорости диссоциации; koff или kd; единицы 1/с) может быть определена с использованием любого из методов анализа, известных в данной области, например, поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

[0447] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания может быть классифицирована как высокая аффинность или низкая аффинность. В некоторых случаях связывающая молекула (например, TCR), которая проявляет связывание от низкой до умеренной аффинности, демонстрирует KA до 10⁷ М^-1, до 10⁶ М^-1, до 10⁵ М^-1. В некоторых случаях связывающая молекула (например, TCR), которая проявляет высокую аффинность связывания с конкретным эпитопом, взаимодействует с таким эпитопом с помощью KA, составляющей по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М^-1, по меньшей мере 10¹² М^-1 или по меньшей мере 10¹³ М^-1. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (EC50) и/или константа диссоциации молекулы, связывающей пептидный эпитоп HPV 16, E6 или E7, составляет от или примерно от 0,1 нМ до 1 мкМ, от 1 нМ до 1 мкМ, от 1 нМ до 500 нМ, от 1 нМ до 100 нМ, от 1 нМ до 50 нМ, от 1 нМ до 10 нМ, от 10 нМ до 500 нМ, от 10 нМ до 100 нМ, от 10 нМ до 50 нМ, от 50 нМ до 500 нМ, от 50 нМ до 100 нМ или от 100 до 500 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (EC50) и/или константа диссоциации молекулы, связывающей пептидный эпитоп HPV 16, E6 или E7, равна или примерно равна или составляет менее чем или примерно 1 мкМ, 500 нм, 100 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 18 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 14 нМ, 13 нМ, 12 нМ, 11 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ.

[0448] Известно множество анализов для оценки аффинности связывания и/или определения того, связывается ли связывающая молекула со специфическим лигандом (например, пептидом в контексте молекулы МНС). Специалист в данной области может определить аффинность связывания связывающей молекулы, например TCR, для эпитопа Т-клеток полипептида-мишени, например, с помощью любого из ряда анализов связывания, которые хорошо известны в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления аппарат BIAcore может использоваться для определения константы связывания комплекса между двумя белками. Константа диссоциации для комплекса может быть определена путем мониторинга изменений показателя преломления во времени при прохождении буфера по чипу. Другие подходящие анализы для измерения связывания одного белка с другим включают, например, иммуноанализы, такие как иммуноферментные анализы (ИФА) и радиоиммуноанализы (RIA), или определение связывания путем мониторинга изменения спектроскопических или оптических свойств белков. через флуоресценцию, УФ-поглощение, круговой дихроизм или ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Другие иллюстративные анализы включают, но не ограничиваются ими, вестерн-блот, ИФА, аналитическое ультрацентрифугирование, спектроскопию и анализ поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®) (см., Например, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560, 1993; и Патенты США № 5283173, 5468614 или эквивалент), проточную цитометрию, секвенирование и другие методы детектирования экспрессированных нуклеиновых кислот. В одном примере кажущуюся аффинность к TCR измеряют путем оценки связывания с различными концентрациями тетрамеров, например, с помощью проточной цитометрии с использованием меченых тетрамеров. В одном примере кажущуюся KD TCR измеряют с использованием 2-кратных разведений меченых тетрамеров в диапазоне концентраций с последующим определением кривых связывания с помощью нелинейной регрессии, причем кажущуюся KD определяют как концентрацию лиганда, при которой получают половину максимального связывания.

[0449] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы проявляют предпочтение связывания для распознавания антигеном HPV 16, E6- или E7-экспрессирующих клеток, по сравнению с HPV 16, E6- или E7-негативными клетками, такими как конкретные клетки, известные и/или описанные в настоящем документе для экспрессии HPV 16 E6 или E7, и которые, как известно, не экспрессируют E6 или E7 HPV 16. В некоторых вариантах осуществления предпочтение связывания наблюдается, когда измеряется значительно более высокая степень связывания с HPV 16 E6- или E7-экспрессирующими клетками по сравнению с клетками, экспрессирующими Е6 или Е7, не относящиеся к HPV 16. В некоторых вариантах осуществления детектируется кратное изменение степени связывания, например, измеренное по средней интенсивности флуоресценции в анализе на основе проточной цитометрии и/или константе диссоциации или EC50, для клеток, экспрессирующих E6 HPV 16 или E7 HPV 16, по сравнению с клетками, экспрессирующими Е6 или Е7, не относящиеся к HPV 16, составляет, по меньшей мере, 1,5 или 2, 3, 4, 5, 6 или более.

[0450] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR не проявляет перекрестно-реактивного или нецелевого связывания, такого как нежелательное нецелевое связывание, например, нецелевое связывание с антигенами, присутствующими в здоровых или нормальных тканях или клетках. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR распознает, например, специфически связывается только с одним пептидным эпитопом или антигенным комплексом, как например распознает только конкретный эпитоп HPV 16 Е6 или Е7, представленный в любой из SEQ ID NO: 232-239, или его антигенный комплекс. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления представленные связывающие молекулы, например, TCR имеют пониженный риск вызывать нежелательные побочные эффекты, например, из-за распознавания нецелевого пептидного эпитопа.

[0451] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR, не распознает, например, не связывает специфически, связанный с последовательностью пептидный эпитоп эпитопа E6 или E7 HPV 16, представленный в любой из SEQ ID NO: 232-239, т. е. не распознает эпитоп, имеющий некоторые общие аминокислоты с эпитопом HPV 16, E6 или E7, представленным в любой из SEQ ID NO: 232-239, как например, не распознает эпитоп, который отличается на 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков из такого эпитопа, когда эпитопы выровнены. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR, не распознает эпитоп, не относящийся к последовательности эпитопа E6 или E7 HPV 16, представленного в любой из SEQ ID NO: 232-239, то есть не распознает эпитоп, который существенно отличается по последовательности по сравнению с эпитопом HPC 16 E6 или E7, представленным в любой из SEQ ID NO: 232-239, как например, отличается более чем на 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных остатков от такого эпитопа при выравнивании эпитопов. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR, не распознает эпитоп Е6 или Е7 HPV 16, представленный в любой из SEQ ID NO: 232-239, в контексте другого аллеля МНС, как например в контексте аллеля МНС, отличного от HLA-A2.

[0452] Как правило, специфическое связывание связывающей молекулы, например, TCR с пептидным эпитопом, например в комплексе с МНС определяется наличием антигенсвязывающего сайта, содержащего одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR). В целом понятно, что специфическое связывание не означает, что конкретный пептидный эпитоп, например в комплексе с МНС является единственной вещью, с которой может связываться молекула МНС-пептид, поскольку также могут происходить неспецифические связывающие взаимодействия с другими молекулами. В некоторых вариантах осуществления связывание связывающей молекулы с пептидом в контексте молекулы МНС имеет более высокую аффинность, чем связывание с другими молекулами, например, другим пептидом в контексте молекулы МНС или нерелевантным (контрольным) пептидом в контексте молекулы МНС, как например, по меньшей мере, примерно в 2 раза, по меньшей мере, примерно в 10 раз, по меньшей мере, примерно в 20 раз, по меньшей мере, примерно в 50 раз или, по меньшей мере, примерно в 100 раз выше, чем аффинность связывания с другими молекулами.

[0453] В некоторых вариантах осуществления связывающую молекулу, например TCR, можно оценивать на безопасность или активность нецелевого связывания с использованием любого из ряда анализов скрининга, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления генерирование иммунного ответа на конкретную связывающую молекулу, например TCR, можно измерить в присутствии клеток, о которых известно, что они не экспрессируют пептидный эпитоп-мишень, таких как клетки, происходящие из нормальной ткани (тканей), аллогенной клеточные линии, которые экспрессируют один или более различных типов МНС, или ткани или клетки из других источников. В некоторых вариантах осуществления клетки или ткани включают нормальные клетки или ткани. Например, в некоторых случаях клетки или ткани могут включать мозг, мышцы, печень, толстую кишку, почку, легкое, яичник, плаценту, сердце, поджелудочную железу, простату, эпителий или кожу, яичко, надпочечник, кишечник, костный мозг или селезенку. В некоторых вариантах осуществления связывание с клетками можно тестировать в 2-мерных культурах. В некоторых вариантах осуществления связывание с клетками можно тестировать в 3-мерных культурах. В некоторых вариантах осуществления в качестве контроля ткани или клетки могут быть такими, которые, как известно, экспрессируют эпитоп-мишень. Иммунный ответ можно оценивать прямо или косвенно, например, путем оценки активации иммунных клеток, таких как Т-клетки (например, цитотоксической активности), продукции цитокинов (например, гамма-интерферона) или активации сигнального каскада.

[0454] В некоторых вариантах осуществления потенциальные нецелевые мишени могут быть идентифицированы путем выполнения гомологического сканирования генома человека с использованием конкретного эпитопа-мишени, например, для идентификации потенциальных эпитопов, связанных с последовательностью. В некоторых случаях база данных последовательностей белков может быть проанализирована для идентификации пептидов, сходных с пептидным эпитопом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления, чтобы облегчить идентификацию потенциальных связанных с последовательностями эпитопов, представляющих интерес, сначала может быть идентифицирован мотив связывания. В некоторых вариантах осуществления мотив связывания может быть идентифицирован путем пептидного сканирования, такого как аланинсканирующий мутагенез эпитопа-мишени (например, эпитопа E6 HPV 16 или E7 HPV 16, представленного в любой из SEQ ID NO: 232-239), чтобы идентифицировать мотив связывания, распознаваемый связывающей молекулой, см., например, WO2014/096803. В некоторых вариантах осуществления мотив связывания может быть идентифицирован мутагенезом пептида-мишени, так что генерируется ряд мутантов, в которых каждая аминокислота или ее подмножество заменены на другой аминокислотный остаток, протестированный на его активность относительно исходного эпитопа-мишени, и идентифицируют те остатки, которые вовлечены или необходимы для связывания. В некоторых вариантах осуществления может быть получен ряд мутантов, в которых аминокислотный остаток в каждом положении эпитопа-мишени мутирован во все альтернативные аминокислоты. В некоторых случаях после идентификации мотива связывания (то есть аминокислотных остатков, которые не являются толерантными и участвуют в связывании или требуются для него), в базах данных белков можно искать белки, которые содержат мотив связывания.

[0455] В некоторых вариантах осуществления подходящие белковые базы данных включают, но не ограничиваются ими, UniProtKB/Swiss-Prot (http://www.uniprot.org/), Информационный ресурс по белкам (PI R) (http://pir.georgetown.edu/pirwww). /index.shtml) и/или Эталонная последовательность (RefSeq) (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq). Поиск пептидного мотива может быть выполнен с использованием любого из множества инструментов, которые можно найти на сайтах ресурсов по биоинформатике, таких как ExPASY (http://www.expasy.org/). Например, инструмент поиска ScanProsite идентифицирует определенные пользователем мотивы во всех белковых последовательностях в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot Protein (De Castro et al. Nucleic Acids Res. 2006 Jul 1; 34 (Web Server issue):W362-5). В некоторых случаях поиск может проводиться для пептидов человеческого происхождения или организмов, которые обычно присутствуют у людей, таких как вирусные или бактериальные патогены или комменсальные бактерии.

[0456] В некоторых вариантах осуществления, если потенциальный нецелевой эпитоп идентифицирован, связывающая молекула, например, TCR, может быть изменена таким образом, чтобы больше не было перекрестной реактивности с нецелевым пептидом (пептид), сохраняя при этом связывание, предпочтительно с высокой аффинностью, с целевым пептидным эпитопом. Например, Т-клеточные рецепторы могут быть перепроектированы путем мутагенеза с использованием способов, описанных в WO 03/020763.

[0457] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, например сконструированные клетки, содержащие связывающие молекулы, например TCR, вызывают иммунный ответ на HPV 16. В некоторых вариантах осуществления цитотоксические T-лимфоциты (CTL) могут активироваться, когда клетки, содержащие связывающие молекулы, например TCR, контактируют с клетками-мишенями, такими как клетки, которые экспрессируют HPV 16, такие как E6 HPV 16 или E7 HPV 16. Например, клетки, содержащие TCR, могут индуцировать лизис клеток-мишеней, таких как HPV 16-экспрессирующие, например, HPV 16 E6- или E7-экспрессирующие клетки. В некоторых аспектах способность связывающих молекул, таких как клетки, экспрессирующие связывающие молекулы, например TCR или CAR, вызывать иммунный ответ, может быть определена путем измерения высвобождения цитокинов. В некоторых вариантах осуществления в ответ на совместное культивирование или экспонирование с клетками, экспрессирующими связывающие молекулы, например, TCR или CAR, различные цитокины высвобождаются, когда клетки стимулируются соответствующей клеткой-мишенью, которая, как известно, экспрессирует HPV 16, такой как HPV 16 Е6 или HPV 16 Е7. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают IFN-γ, TNF-α и GM-CSF. Иллюстративные клетки, которые, как известно, экспрессируют HPV 16, включают, но не ограничиваются ими, клетки CaSki (ATCC No. CRL-1550, которые содержат примерно 600 копий интегрированного HPV16) или другие опухолевые клетки, экспрессирующие соответствующую молекулу MHC и соответствующий пептидный эпитоп, например эпитоп E6 или E7 HPV 16, такой как любой из представленных в SEQ ID NO: 232 -239.

[0458] В некоторых вариантах осуществления может быть определена активация CTL. Существует множество методов для анализа активности CTL. В некоторых вариантах осуществления активность CTL можно оценить, анализируя культуру на наличие CTL, которые лизируют радиоактивно меченные клетки-мишени, такие как мишени, стимулированные специфическим пептидом. Эти методы включают мечение клеток-мишеней радионуклидами, такими как Na2, 51CrO4 или 3H-тимидином, и измерение высвобождения или удержания радионуклидов в клетках-мишенях в качестве показателя клеточной смерти. В некоторых вариантах осуществления известно, что CTL высвобождают различные цитокины, когда они стимулируются соответствующей клеткой-мишенью, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая соответствующую молекулу МНС и соответствующий пептидный эпитоп, и присутствие таких эпитоп-специфичных CTL может определяется путем измерения высвобождения цитокинов. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают IFN-γ, TNF-α и GM-CSF. Анализы на эти цитокины хорошо известны в данной области, и их выбор оставлен на усмотрение специалиста. Методология измерения как клеточной смрти клеток-мишеней, так и высвобождения цитокинов в качестве меры реактивности CTL приведена в Coligan, J.E. et al. (Current Protocols in Immunology, 1999, John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк).

[0459] В некоторых вариантах осуществления продуцирование цитокинов может быть измерено как показатель иммунного ответа. В некоторых случаях такие измеренные цитокины могут включать, без ограничения, интерлейкин-2 (IL-2), интерферон-гамма (IFNγ), интерлейкин-4 (IL-4), TNF-альфа, интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12) или TGF-бета. Анализы для измерения цитокинов хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, ИФА, внутриклеточное окрашивание цитокинов, тест-систему для определния цитокинов (cytometric bead array), ОТ-ПЦР, ELISPOT, проточную цитометрию и биологические анализы, в которых клетки, чувствительные к соответствующему цитокину, тестируют на респонсивность (например, пролиферацию) в присутствии тестируемого образца.

[0460] В некоторых вариантах осуществления клетки, котоорые подвергаются воздействию связывающих молекул, например клетки, содержащие связывающие молекулы, такие как TCR или CAR, оценивают на иммунологическое считывание, такое как Т-клеточный анализ. В некоторых вариантах осуществления клетки, содержащие связывающую молекулу, могут активировать ответ CD8+ T-клеток. В одном варианте осуществления ответы CD8+ Т-клеток можно оценивать путем мониторинга реактивности CTL с использованием анализов, которые включают, но не ограничиваются ими, лизис клеток-мишеней через высвобождение 51Cr или детектирование высвобождения интерферона-гамма, например, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), внутриклеточного окрашивания цитокинов или ELISPOT. В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, например клетки, содержащие связывающие молекулы, такие как TCR или CAR, могут активировать ответ CD4+ T-клеток. В некоторых аспектах ответы CD4+ T-клеток можно оценивать с помощью анализов, которые измеряют пролиферацию, таких как включение [3H] -тимидина в клеточную ДНК и/или продуцирование цитокинов, таких как ИФА, внутриклеточное окрашивание цитокинов или ELISPOT. В некоторых случаях цитокин может включать, например, интерлейкин-2 (IL-2), интерферон-гамма (IFN-гамма), интерлейкин-4 (IL-4), TNF-альфа, интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12) или TGF бета. В некоторых вариантах осуществления распознавание или связывание пептидного эпитопа, такого как эпитоп МНС класса II, с помощью связывающей молекулы может вызывать или активировать ответ CD4+ T-клеток и/или ответ CD8+ T-клеток.

[0461] В некоторых вариантах осуществления специфичность и/или функция связывания (например, способность вызывать иммунный ответ на HPV 16) связывающей молекулы, например, TCR или ее антигенсвязывающего фрагмента, является, по меньшей мере, частично CD8-независимой. В некоторых случаях распознавание TCR пептида в контексте молекулы МНС и последующая активация Т-клеток облегчаются в присутствии корецептора CD8. Например, взаимодействие с корецептором CD8 может облегчать низкоаффинные или умеренноаффинные взаимодействиям TCR и/или активацию T-клеток (см., например, Kerry et al. J. Immunology (2003) 171 (9): 4493-4503 и Robbins et al. J. Immunology (2008) 180 (9): 6116-6131). Среди представленных связывающих молекул есть молекулы, например, TCR, которые демонстрируют CD8-независимое связывание с пептидным эпитопом E6 или E7 HPV. В некоторых вариантах осуществления такие связывающие молекулы, например, TCR могут иметь более высокую функциональную авидность или аффинность, чем TCR или их антигенсвязывающие фрагменты, которые требуют наличия коэкспрессии CD8. В некоторых аспектах представленные CD8-независимые связывающие молекулы, такие как TCR, могут быть экспрессированы или сконструированы в клетках, например, Т-клетках, которые не экспрессируют CD8, как например, могут быть экспрессированы или сконструированы в клетках CD4+. В некоторых вариантах осуществления среди представленных сконструированных клеток, не экспрессирующих CD8, например, CD4+ клетки представляют собой клетки, экспрессирующие рекомбинантную связывающую молекулу, например, TCR или антигенсвязывающий фрагмент, которые демонстрируют, по меньшей мере, или, по меньшей мере, примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более специфичности связывания, аффинности и/или авидности к пептиду в контексте молекулы МНС в виде той же самой связывающей молекулы (например, TCR или ее антигенсвязывающего фрагмента), которая экспрессируется на CD8+ Т-клетке.

II. Нуклеиновые кислоты, векторы и способы экспрессии

[0462] Также представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие любую из представленных связывающих молекул, например TCR или их антигенсвязывающие фрагменты, или антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или CAR, содержащие такие антитела, такие как те, которые описаны в настоящем документе. Нуклеиновые кислоты могут включать те, которые включают природные и/или не встречающиеся в природе нуклеотиды и основания, например, такие, которые содержат модификации остова. Термины «молекула нуклеиновой кислоты», «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к полимеру нуклеотидов. Такие полимеры нуклеотидов могут содержать природные и/или неприродные нуклеотиды и включают, но не ограничиваются ими, ДНК, РНК и ПНК. «Последовательность нуклеиновой кислоты» относится к линейной последовательности нуклеотидов, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид.

[0463] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, например TCR или его антигенсвязывающая часть могут представлять собой природный белок, полученный рекомбинантным путем, или его мутированную форму, в которой одно или более свойств, таких как характеристика связывания, были изменены. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота является синтетической. В некоторых случаях нуклеиновая кислота представляет собой или содержит кДНК. В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты может быть модифицирована для использования в конструкциях, описанных в настоящем документе, как например, для оптимизации кодонов. В некоторых случаях последовательности могут быть сконструированы так, чтобы содержать концевые последовательности сайтов рестрикции для целей клонирования в векторы.

[0464] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу, например TCR, может быть получена из различных источников, как например с помощью полимеразной цепной реакции амплификации (ПЦР) кодирующих нуклеиновых кислот внутри данной клетки или клеток или выделенных из них. В некоторых вариантах осуществления TCR получают из биологического источника, такого как клетки, такие как T-клетки (например, цитотоксические T-клетки), гибридомы T-клеток или другие общедоступные источники. В некоторых вариантах осуществления TCR может быть получен от одного из различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса или другое млекопитающее, как например, обычно от человека. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут быть получены из выделенных клеток in vivo, таких как клетки нормальных (или здоровых) индивидуумов или больных пациентов, включая Т-клетки, присутствующие в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) или инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут представлять собой культивируемые гибридомы Т-клеток или клон. Например, в некоторых вариантах осуществления для создания вектора, кодирующего TCR, α- и β-цепи можно амплифицировать с помощью ПЦР из общей кДНК, выделенной из клона Т-клеток, экспрессирующих интересующий TCR, и клонировать в экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления α- и β-цепи могут быть получены синтетически. В некоторых вариантах осуществления α- и β-цепи клонируются в один и тот же вектор.

[0465] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающая часть могут быть получены синтетически на основе знания последовательности TCR.

[0466] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь.

[0467] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая альфа-цепь, содержит одно из следующего: остатки 61-816 SEQ ID NO: 20, остатки 58-804 SEQ ID NO: 30, остатки 61-825 SEQ ID NO: 40, остатки 64-813 SEQ ID NO: 50, остатки 64-816 SEQ ID NO: 60, остатки 58-807 SEQ ID NO: 70, остатки 61-825 SEQ ID NO: 80, остатки 67-831 SEQ ID NO: 90, остатки 58-801 SEQ ID NO: 100, остатки 64-810 SEQ ID NO: 183, остатки 58-801 SEQ ID NO: 202, остатки 67-813 SEQ ID NO: 219, их вырожденную последовательность или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности. В некоторых аспектах нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит одно из следующего: остатки 58-936 SEQ ID NO: 17, остатки 58-930 SEQ ID NO: 16, остатки 58-939 SEQ ID NO: 24, остатки 64-930 SEQ ID NO: 34 или 44, остатки 58-933 SEQ ID NO: 55, остатки 58-927 SEQ ID NO: 64, остатки 64-936 SEQ ID NO: 74, остатки 58-933 SEQ ID NO: 84, остатки 63-930 из SEQ ID NO: 94, остатки 46-936 SEQ ID NO: 104, остатки 58-933 SEQ ID NO: 108, их вырожденную последовательность или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности.

[0468] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и/или нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, оптимизирована по кодонам. Как правило, оптимизация кодонов включает баланс процентного соотношения кодонов, отобранных с использованием известной представленности транспортной РНК человека, так что ни одна из них не перегружена или не ограничена. Это может быть необходимо в некоторых случаях, потому что большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном, и использование кодонов варьируется от организма к организму. Различия в использовании кодонов между трансфецированными генами и клетками-хозяевами могут влиять на экспрессию белка и иммуногенность конструкции нуклеиновой кислоты. В общем, для оптимизации кодонов выбираются кодоны для отбора таких кодонов, которые находятся в балансе с частотой их использования у человека. Как правило, избыточность кодонов для аминокислот такова, что разные кодоны кодируют одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления при выборе кодона для замены может быть желательно, чтобы получающаяся мутация представляла собой молчащую мутацию, так чтобы замена кодона не влияла на аминокислотную последовательность. Как правило, последний нуклеотид кодона может оставаться неизменным, не влияя на аминокислотную последовательность.

[0469] В некоторых случаях последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая альфа-цепь, содержит одно из следующего: остатки 67-825 SEQ ID NO: 10, остатки 58-813 SEQ ID NO: 11, остатки 64-822 SEQ ID NO: 12 остатки 61-825 SEQ ID NO: 21, остатки 58-813 SEQ ID NO: 31, остатки 61-834 SEQ ID NO: 41, остатки 63-822 SEQ ID NO: 51, остатки 64-825 SEQ ID NO: 61, остатки 58-816 SEQ ID NO: 71, остатки 61-834 SEQ ID NO: 81, остатки 67-840 SEQ ID NO: 91, остатки 58-810 SEQ ID NO: 101, их вырожденную последовательность или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности. В некоторых примерах нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит одно из следующего: остатки 58-930 SEQ ID NO: 7, остатки 58-936 SEQ ID NO: 8, остатки 58-933 SEQ ID NO: 9 остатки 58 -939 SEQ ID NO: 25, остатки 64-930 SEQ ID NO: 35, 45 или 95, остатки 58-933 SEQ ID NO: 54 или 85, остатки 58-927 SEQ ID NO: 65, остатки 64-936 SEQ ID NO: 75, остатки 46-936 SEQ ID NO: 105, их вырожденную последовательность или последовательность, имеющая с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности.

[0470] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая альфа-цепь и/или бета-цепь TCR, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO, представленным в Таблице 11. Также среди представленных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих TCR, имеются такие, которые содержат последовательности, по меньшей мере или примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентичные таким последовательностям. Иллюстративные TCR, кодированные такими последовательностями, или их модифицированные версии, также представлены в Таблице 11.

Таблица 11: HPV16 E6 & E7 TCR нуклеотидные SEQ ID NO. Иллюстративный TCR или его модифицированная версия Альфа Бета Нативная Кодон-оптимизированная Нативная Кодон-оптимизированная TCR 3 20 21 24 25 TCR 4 30 31 34 35 TCR 5 40 41 44 45 TCR 8 70 71 74 75 TCR 9 80 81 84 85 TCR 10 90 91 94 95 TCR 6 50 51 54 55 TCR 7 60 61 64 65 TCR 11 100 101 104 105 TCR 12 183 12 108 9 TCR 13 202 11 17 8 TCR 14 219 10 16 7 TCR 15 389 1097 390 1098 TCR 16 430 1099 431 1100 TCR 17 1019 1101 1020 1102 TCR 18 1021 1103 1022 1104 TCR 19 1023 1105 1024 1106 TCR 20 1025 1107 1026 1108 TCR 21 1027 1109 1028 1110 TCR 22 1029 1111 1030 1112 TCR 23 1031 1113 1032 1114 TCR 24 1033 1115 1034 1116 TCR 25 1035 1117 1036 1118 TCR 26 1037 1119 1038 1120 TCR 27 1039 1121 1040 1122 TCR 28 1041 1123 1042 1124 TCR 29 1043 1125 1044 1126 TCR 30 1045 1127 1046 1128 TCR 31 1225 1129 1224 1130 TCR 32 1049 1131 1050 1132 TCR 33 1051 1133 1052 1134 TCR 34 1226 1135 1227 1136 TCR 35 1055 1137 1056 1138 TCR 36 1057 1139 1058 1140 TCR 37 1059 1141 1060 1142 TCR 38 1061 1143 1062 1144 TCR 39 1063 1145 1064 1146 TCR 40 1065 1147 1066 1148 TCR 41 1067 1149 1068 1150 TCR 42 1069 1151 1070 1152 TCR 43 1071 1153 1072 1154 TCR 44 1073 1155 1074 1156 TCR 45 1075 1157 1076 1158 TCR 46 1077 1159 1078 1160 TCR 47 1079 1161 1080 1162 TCR 48 1081 1163 1082 1164 TCR 49 1083 1165 1084 1166 TCR 50 1085 1167 1086 1168 TCR 51 1087 1169 1088 1170 TCR 52 1089 1171 1090 1172 TCR 53 1091 1173 1092 1174 TCR 54 1093 1175 1094 1176 TCR 55 1095 1177 1228 1178 TCR 66 1385 1375

[0471] Также представлены векторы или конструкции, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления векторы или конструкции содержат один или более промоторов, функционально связанных с нуклеотидом, кодирующим альфа-цепь и/или бета-цепь. В некоторых вариантах осуществления промотор функционально связан с одной или болееи молекулами нуклеиновой кислоты.

[0472] В некоторых вариантах осуществления вектор или конструкция могут содержать один промотор, который управляет экспрессией одной или более молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления такие промоторы могут быть полицистронными (бицистронными или трицистронными, см., например, Патент США № 6060273). Например, в некоторых вариантах осуществления транскрипционные единицы могут быть сконструированы как бицистронные единицы, содержащие IRES (внутренний участок посадки рибосомы), который позволяет коэкспрессировать генные продукты (например, кодировать альфа-цепь и/или бета-цепь TCR) посредством сообщения от одного промотора. Альтернативно, в некоторых случаях один промотор может направлять экспрессию РНК, которая содержит в одной открытой рамке считывания (ORF) два или три гена (например, кодирующих альфа-цепь и/или бета-цепь TCR), отделенных друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляемый пептид (например, T2A) или сайт узнавания протеазы (например, фурина). Таким образом, ORF кодирует один полипротеин, который либо во время трансляции (в случае 2A, например, T2A), либо после трансляции расщепляется на отдельные белки. В некоторых случаях пептид, такой как T2A, может заставить рибосому пропускать (пропуск рибосомы) синтез пептидной связи на C-конце элемента 2A, приводя к разделению между концом последовательности 2A и следующим пептидом, расположенным в 3'-области (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. с2:13 (2004) и deFelipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004). Примерами пептидов расщепления 2А, включая те, которые могут индуцировать пропуск рибосомы, являются вирус Thosea asigna (T2A, например, SEQ ID NO: 211). или 274), свиной тешовирус-1 (P2A, например, SEQ ID NO: 204 или 345), вирус конского ринита A (E2A, например, SEQ ID NO: 346) и последовательности 2A из вируса ящура (F2A, например, SEQ ID NO: 344), как описано в Патентной публикации США № 2007/0116690.

[0473] В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутренний участок посадки рибосомы (IRES), или пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы. В некоторых таких случаях пептид, который вызывает пропуск рибосомы, представляет собой пептид P2A или T2A и/или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 204, 211, 274 или 345. В некоторых аспектах нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид, который вызывает пропуск рибосомы, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 207, 208, 209 или 210, 347, 1096, 1179, 1180 или 1181.

[0474] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, присутствуют в любом порядке, разделенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей внутренний участок посадки рибосомы (IRES), или пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы. Например, в некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую бета-цепь, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность IRES или пептид, который вызывает пропуск рибосомы, например последовательность P2A или T2A, как описано в настоящем документе, и нуклеиновую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-цепь, в таком порядке. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-цепь, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует IRES, или пептидную последовательность, которая вызывает пропуск рибосомы, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует бета-цепь, в таком порядке.

[0475] Таким образом, в некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, содержащий бета-цепь, IRES или пептид, который вызывает пропуск рибосомы, и альфа-цепь, в таком порядке. В других аспектах молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, содержащий альфа-цепь, IRES или пептид, который вызывает пропуск рибосомы, и бета-цепь, в таком порядке.

[0476] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в Таблице 12, или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, представленный в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230,231, 340-342, 350-388, 391-429 или 1383-1384, или последовательности, имеющей с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в любой из SEQ ID NO: 13, 14, 15, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 432-472, или 1382, или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.

[0477] Также представлены полипептиды, содержащие последовательность, кодируемую любой из представленных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах полипептид содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO, представленным в Таблице 12, или последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 223, 224, 225, 226, 227., 228, 229, 230, 231, 340-342, 350-388, или 391-429, или 1383-1384, или последовательность, имеющую с ними, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. Примеры таких TCR или их модифицированных версий также представлены в Таблице 12.

Таблица 12: HPV16 E6 & E7 TCR SEQ ID NO. Иллюстративный TCR или его модифицированная версия Полная кодируемая аминокислотная последовательность Полная нуклеотидная последовательность Нативная Модифицированная Кодон-оптимизированная TCR 3 223 27 26 TCR 4 224 37 36 TCR 5 225 47 46 TCR 8 228 77 76 TCR 9 229 87 86 TCR 10 230 97 96 TCR 6 226 57 56 TCR 7 227 67 66 TCR 11 231 107 106 TCR 12 340 3 15 TCR 13 341 2 14 TCR 14 342 1 13 TCR 15 391 350 432 TCR 16 392 351 433 TCR 17 393 352 434 TCR 18 394 353 435 TCR 19 395 354 436 TCR 20 396 355 437 TCR 21 397 356 438 TCR 22 398 357 439 TCR 23 399 358 440 TCR 24 400 359 441 TCR 25 401 360 442 TCR 26 402 361 443 TCR 27 403 362 444 TCR 28 404 363 445 TCR 29 405 364 446 TCR 30 406 365 447 TCR 31 407 366 448 TCR 32 408 367 449 TCR 33 409 368 450 TCR 34 410 369 451 TCR 35 411 370 452 TCR 36 412 371 453 TCR 37 413 372 454 TCR 38 414 373 455 TCR 39 415 374 456 TCR 40 416 375 457 TCR 41 417 376 458 TCR 42 418 377 459 TCR 43 419 378 460 TCR 44 420 379 461 TCR 45 421 380 462 TCR 46 422 381 463 TCR 47 423 382 464 TCR 48 424 383 465 TCR 49 425 384 466 TCR 50 426 385 467 TCR 51 427 386 468 TCR 52 428 387 469 TCR 53 429 388 470 TCR 54 227 67 471 TCR 55 340 3 472 TCR 66 1383 1384 1382

[0478] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно кодировать маркер (например, EGFRt или другой маркер, как описано), который отделен от CAR или отделен от цепей TCR с помощью линкера, такого как расщепляемая линкерная последовательность или пептидная последовательность, которая вызывает пропуск рибосомы, например, T2A или P2A.

[0479] В некоторых вариантах осуществления конструкция может быть расположена в любом порядке, так что последовательность, кодирующая маркер, находится в 3'-области относительно последовательности альфа и/или бета, в 5'-области относительно последовательности альфа и/или бета и/или между последовательностью альфа и бета, где в некоторых случаях каждый отдельный компонент разделен расщепляемой линкерной последовательностью или пептидом, который вызывает пропуск рибосомы (например, T2A или P2A) или IRES. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует маркер (например, EGFRt), расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A), бета-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A) и альфа-цепь. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует маркер (например, EGFRt), расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A), альфа-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A) и бета-цепь. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует бета-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосом (например, T2A или P2A), альфа-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосом (например, T2A или P2A) и маркер (например, EGFRt). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосом (например, T2A или P2A), бета-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосом (например, T2A или P2A) и маркер (например, EGFRt). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A), маркер (например, EGFRt), расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A) и бета-цепь. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит в указанном порядке последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует бета-цепь, расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A), маркер (например, EGFRt), расщепляемый линкер или последовательность пропуска рибосомы (например, T2A или P2A) и альфа-цепь.

[0480] В некоторых вариантах осуществления введение конструкции, кодирующей CAR и EGFRt, разделенных переключателем рибосомы T2A, может экспрессировать два белка из одной и той же конструкции, так что EGFRt можно использовать в качестве маркера для детектирования клеток, экспрессирующих такую конструкцию.

[0481] Нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую вариабельную область альфа (Vα) или вариабельную область легкой цепи (VL) TCR или антитела, соответственно. В некоторых случаях нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, содержащую вариабельную область бета (Vβ) или вариабельную область тяжелой цепи (VH) TCR или антитела, соответственно. В дополнительном варианте осуществления представлены один или более векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту.

[0482] Также представлены векторы, такие как те, которые содержат любую из нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или обе цепи связывающей молекулы, например TCR, клонируют в подходящий вектор или экспрессирующие векторы. Экспрессирующий вектор может быть любым подходящим рекомбинантным экспрессирующим вектором и может использоваться для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Подходящие векторы включают векторы, предназначенные для размножения и наращивания или для экспрессии, или того и другого, такие как плазмиды и вирусы. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

[0483] В некоторых вариантах осуществления вектор может представлять собой вектор серии pUC (Fermentas Life Sciences), серии pBluescript (Stratagene, Ла Холья, Калифорния), серии pET (Novagen, Мэдисон, Висконсин), Серии pGEX (Pharmacia Biotech, Упсала, Швеция) или серия pEX (Clontech, Пало-Альто, Калифорния). В некоторых случаях также могут использоваться векторы бактериофагов, такие как λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. В некоторых вариантах осуществления могут использоваться экспрессирующие векторы растений, и они включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы животных включают pEUK-Cl, pMAM и pMAMneo (Clontech). В некоторых случаях вектор является вирусным вектором. В некоторых таких аспектах вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор. векторы экспрессииВ некоторых случаях лентивирусный вектор происходит из HIV-1.

[0484] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК. В некоторых вариантах осуществления векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые специфичны для типа хозяина (например, бактерии, гриба, растения или животного), в который должен быть введен вектор, если это целесообразно, и принимая во внимание, является ли вектор на основе ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей связывающую молекулу, такую как TCR, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой невирусный промотор или вирусный промотор, такой как промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV и промотор, присутствующий в длинном концевом повторе вируса мышиных стволовых клеток. Другие промоторы, известные специалисту в данной области, также рассматриваются.

[0485] Также представлены способы получения связывающих молекул (включая антигенсвязывающие фрагменты). В некоторых вариантах осуществления представлена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. Для рекомбинантной продукции связывающих молекул нуклеиновая кислота, кодирующая связывающую молекулу, например, как описано выше, может быть выделена и вставлена в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с использованием традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими альфа- и бета-цепи TCR или тяжелые и легкие цепи антитела). В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения связывающей молекулы, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающую молекулу, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии связывающей молекулы, и, возможно, восстановление связывающей молекулы из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).

[0486] В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую область Vβ TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую область Vα TCR или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и VL антитела или антигенсвязывающего его фрагмента. В некоторых аспектах клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую область Vα TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующая аминокислотную последовательность, содержащую область Vβ TCR или его антигенсвязывающего фрагмента. В других аспектах клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0487] В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии для векторов, кодирующих связывающие молекулы, включая грибы и штаммы дрожжей, пути гликозилирования которых были модифицированы, чтобы имитировать или приблизить их к клеткам человека. Смотри Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

[0488] Иллюстративные эукариотические клетки, которые можно использовать для экспрессии полипептидов, включают, но не ограничиваются ими, клетки COS, включая клетки COS 7; клетки 293, в том числе клетки 293-6E; клетки CHO, включая CHO-S, DG44. Клетки Lec13 CHO и клетки FUT8 СНО; Клетки PER.C6®; и клетки NSO. В некоторых вариантах осуществления конкретная эукариотическая клетка-хозяин выбирается на основании ее способности осуществлять желаемые посттрансляционные модификации в связывающей молекуле. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки СНО продуцируют полипептиды, которые имеют более высокий уровень сиалилирования, чем тот же полипептид, продуцируемый в клетках 293. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула продуцируется в бесклеточной системе. Иллюстративные бесклеточные системы описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).

III. Методы идентификации и генерации Т-клеточных рецепторов

[0489] В некоторых вариантах осуществления предложены способы идентификации и генерирования Т-клеточных рецепторов, направленных на антиген-мишень. В некоторых аспектах способы включают воздействие на биологические образцы, содержащие Т-клетки, такие как первичные Т-клетки, включая образцы, полученные от нормальных доноров или пациентов, имеющих заболевание или состояние, представляющее интерес, множественных раундов воздействия антигена и оценки. В некоторых аспектах раунды включают использование искусственных или сконструированных антигенпрезентирующих клеток, таких как аутологичные дендритные клетки или другие APC, стимулированные желаемым пептидным антигеном, для стимулирования презентирования на MHC, таком как MHC класса I или II. В некоторых аспектах проводят множественные раунды воздействия антигена, а в некоторых аспектах Т-клетки сортируют после одного или более раундов, например, на основании способности связываться с желаемым антигеном (таким как тетрамеры пептид-МНС). В некоторых аспектах сортировка осуществляется проточной цитометрией. В некоторых аспектах клетки из клеток, которые, как считается, связываются с желаемым антигеном (положительная фракция), и клетки, которые, как считается, не связываются с антигеном, оценивают, например, методами секвенирования отдельных клеток. В некоторых аспектах метод определяет последовательности и идентифицирует на уровне одной клетки TCR, присутствующие в каждом образце. В некоторых аспектах способы могут количественно определять количество копий данной пары TCR, присутствующих в образце, и, как таковые, могут оценивать количество данного TCR в данном образце и/или его обогащение по сравнению с другим образцом, например обогащение или избыток в положительной (антигенсвязывающей) фракции, например, в течение одного или более раундов, например, по сравнению с отрицательной фракцией. В некоторых аспектах такие анализы проводят для генерирования антигенспецифических Т-клеточных рецепторов (TCR), которые специфически связываются с пептидными антигенами вируса папилломы человека 16 или 18, такими как пептиды, полученные из E6 или E7, такие как E6 (29-38) или E7 (11-19) пептид, например, презентированный на молекулах MHC-I и выживший и/или обогащенный в течение некоторого времени после множества раундов стимуляции антигеном. В некоторых аспектах создаются клональные Т-клеточные линии, и последовательности отдельных спаренных альфа- и бета-цепей TCR и их содержание в различных популяциях определяют на основе одной клетки с использованием высокопроизводительного секвенирования спаренного TCR.

[0490] В некоторых аспектах пептид-стимулированные HLA: A02: 01APC были получены с использованием пептида E6 HPV 16 (29-38) (TIHDIILECV; SEQ ID NO: 233) или пептида E7 (11-19) (YMLDLQPET; SEQ ID NO: 236). Аутологичные CD8+ Т-клетки от нормальных человеческих доноров инкубируют в течение нескольких циклов с пептид-стимулированными клетками, и отбор проводят на основе связывания аутологичными тетрамерами МНС с пептидной нагрузкой.

[0491] В некоторых аспектах клетки подвергали множественным, таким как в общей сложности двум, трем или более, рацндам стимуляции в присутствии пептид-стимулированных клеток (например, с определенной концентрацией пептида 1000 нг/мл, поддерживаемой в течение трех раундов). После одного или более из таких раундов, как, например, после первого и/или после второго и третьего раундов стимуляции, клетки сортировали с помощью проточной цитометрии на популяции, положительные и отрицательные, соответственно, для связывания с тетрамерами пептид-МНС, содержащими соответствующий тетрамер. Клетки тетрамер-положительных и отрицательных популяций, после каждого или одного или более из одного или более, как например после второго и третьего, раундов в некоторых аспектах, подвергают секвенированию TCR из одной клетки, чтобы оценить наличие и частоту встречаемости отдельных TCR в разных популяциях, а также устойчивость клонов TCR в течение множества раундов стимуляции антигеном.

[0492] В некоторых аспектах клеточные популяции из положительных и отрицательных фракций (то есть отсортированных методом проточной цитометрии на основе положительного и отрицательного окрашивания соответственно для связывания с соответствующим антигеном, таким как пептид-MHC, таким как тетрамеры с нагрузкой, например, как определено проточной цитометрией), после одного или более раундов, подвергаются высокопроизводительному секвенированию одной клетки для пар альфа- и бета-цепей TCR. Секвенирование TCR с высокой призводительностью в одной клетке в некоторых аспектах выполняется, как в целом описано в опубликованных патентных заявках PCT, публикациях под номерами WO2012/048340, WO2012/048341 и WO2016/044227. Таким образом, в методах секвенирования в некоторых аспектах используются капли, содержащие одну клетку, и образцы и молекулярные штрих-коды, чтобы идентифицировать отдельные пары последовательностей альфа- и бета-цепей TCR на уровне одной клетки для каждой из большого числа (например, миллионов) отдельных клеток, присутствующих в одной исходной композиции, и оценить численность каждой пары TCR в различных оцененных популяциях. Способность идентифицировать и количественно определять пары TCR на уровне одной клетки в некоторых вариантах осуществления позволяет оценивать частоту каждой из различных пар TCR в каждой из отдельных положительных и отрицательных фракций, а также оценивать обогащение и стойкость TCR в течение множества раундов антигенной стимуляции.

[0493] В некоторых аспектах способы генерируют, идентифицируют, выделяют и/или отбирают пары TCR, которые обогащены антигенсвязывающим, например, пептид-связывающими, фракциями, после по меньшей мере одного, а в некоторых аспектах - после множества раундов стимуляции. В некоторых аспектах TCR присутствуют и/или присутствуют в желаемом количестве и/или предпочтительно обогащены после раундов 1, 2 и/или 3, а в некоторых аспектах, по меньшей мере, после множества раундов воздействия антигена. В некоторых аспектах TCR обогащаются в популяции с течением времени после нескольких циклов воздействия антигена. Также предложены TCR, полученные или идентифицированные с использованием таких способов, такие как TCR, обладающие такими свойствами, как способность выживать и/или распространяться в течение нескольких раундов воздействия антигена, например, в анализе пептид-стимулированных АРС.

IV. Сконструированные клетки

[0494] Также предложены клетки, такие как клетки, которые были сконструированы так, чтобы содержать связывающую молекулу, описанную в настоящем документе. Также предложены популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками, как например, в которых клетки, экспрессирующие связывающую молекулу, составляют, по меньшей мере, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%., 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более процентов от общего числа клеток в композиции или клетках определенного типа, таких как Т-клетки или CD8+ или CD4+ клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки являются первичными Т-клетками. Среди композиций представлены фармацевтические композиции и составы для введения, например, для адоптивной клеточной терапии. Также предложены терапевтические способы введения клеток и композиций индивидуумам, например пациентам.

[0495] Таким образом, также предложены генетически сконструированные клетки, экспрессирующие связывающие молекулы. Клетки, как правило, представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и, как правило, представляют собой клетки человека. В некоторых вариантах осуществления клетки, происходящие из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, представляют собой клетки иммунной системы, такие как клетки врожденного или адаптивного иммунитета, например миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, обычно Т-клетки и/или NK-клетки. Другие иллюстративные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки обычно представляют собой первичные клетки, такие как клетки, выделенные непосредственно у индивидуума и/или выделенные у индивидуума и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одно или более подмножеств Т-клеток или других типов клеток, таких как целые популяции Т-клеток, CD4+ клетки, CD8+ клетки и их субпопуляции, такие как те, которые определяются функцией, состоянием активации, зрелостью, потенциалом для дифференцировки, экспансией, рециркуляцией, локализацией и/или персистенцией, антигенспецифичностью, типом антигенного рецептора, присутствием в конкретном органе или компартменте, профилем секреции маркера или цитокина и/или степенью дифференцировки. Применительно к подлежащему лечению пациенту клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. В число методов входят готовые методы. В некоторых аспектах, таких как для готовых технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у пациента, приготовление, обработку, культивирование и/или конструирование их, как описано в настоящем документе, и повторное введение их одному и тому же пациенту до или после криоконсервации.

[0496] Среди подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4+ и/или CD8+ T-клеток присутствуют наивные T (TN) клетки, эффекторные T-клетки (TEFF), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые Т-клетки памяти (TSCM), Т-клетки центральной памяти (TCM), Т-клетки эффекторной памяти (TEM) или терминально дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, хелперные T-клетки, цитотоксический T клетки, ассоциированные со слизистой оболочкой инвариантные Т-клетки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные Т-клетки (Treg), хелперные Т-клетки, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета Т клетки и дельта/гамма Т клетки.

[0497] В некоторых вариантах осуществления клетки являются клетками-натуральными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.

[0498] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, введенных посредством генной инженерии, и тем самым экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, такой как нуклеиновая кислота, полученная из другого организма или клетки, которая, например, обычно не обнаруживается в клетке, которая была сконструирована, и/или в организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, такие как нуклеиновая кислота, не встречающаяся в природе, включая такую, которая содержит химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.

[0499] В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты (и/или их экспрессия) в предложенных клетках и/или композициях, содержащих такие клетки, восстанавливаются, удаляются, устраняются, нокаутируются или нарушаются. Такие гены и/или генные продукты в некоторых аспектах включают один или более генов, кодирующих (или их продукт) константную область TCR альфа (TRAC) и/или константную область TCR бета (TRBC; кодируется у людей TRBC1 или TRBC2), например, чтобы уменьшить или предотвратить экспрессию эндогенного TCR и/или его цепи в клетке, например Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты, такие как TRAC и/или TRBC, уменьшены, удалены, устранены, нокаутированы или нарушены в любой из сконструированных клеток, предложенных в настоящем описании, и/или в любом из способов получения сконструированных клеток, предложенных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки и/или сконструированные клетки, полученные способами, представляют собой клетки, которые были сконструированы для экспрессии связывающей молекулы, описанной в настоящем документе, популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками. В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты, такие как TRAC и/или TRBC, уменьшены, удалены, устранены, нокаутированы или нарушены в первичных Т-клетках, чтобы уменьшить, удалить, устранить, нокаутировать или нарушить экспрессию эндогенного TCR в первичных Т-клетках, например, сконструированных для экспрессии любого из Т-клеточных рецепторов, описанных в настоящем документе.

[0500] В некоторых вариантах осуществления уменьшение, удаление, устранение, нокаут или нарушение эндогенных генов, кодирующих TCR или цепь, домен и/или его область, осуществляют, например, любыми способами или процессами, описанными в настоящем документе, например в разделе V ниже.

A. Получение клеток для генетического конструирования

[0501] В некоторых вариантах осуществления получение сконструированных клеток включает одну или более стадий культивирования и/или получения. Клетки для введения связывающей молекулы, например TCR или CAR, могут быть выделены из образца, такого как биологический образец, например, полученный у пациента или происходящий от него. В некоторых вариантах осуществления пациент, у которого выделена клетка, является пациентом, имеющим заболевание или состояние или нуждающимся в клеточной терапии, или которому будет назначаться клеточная терапия. Пациентом в некоторых вариантах осуществления является человек, нуждающийся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или конструируют.

[0502] Соответственно, клетки в некоторых вариантах осуществления являются первичными клетками, например первичными клетками человека. Образцы включают ткани, жидкости и другие образцы, взятые непосредственно у пациента, а также образцы, полученные в результате одной или более стадий обработки, таких как разделение, центрифугирование, генетическое конструирование (например, трансдукция вирусным вектором), промывание и/или инкубация. Биологический образец может быть образцом, полученным непосредственно из биологического источника, или образцом, который обрабатывается. Биологические образцы включают, но не ограничиваются ими, жидкости организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, полученные из них.

[0503] В некоторых аспектах образец, из которого получены или выделены клетки, представляет собой кровь или образец, полученный из крови, или является или получен из продукта для афереза или лейкафереза. Примеры образцов включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), лейкоциты, костный мозг, тимус, биопсию ткани, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, лимфоидную ткань, связанную со слизистой оболочкой кишечника, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, толстую кишку, почки, поджелудочную железу, молочнойую железу, кость, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалины или другой орган и/или клетки, полученные из них. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.

[0504] В некоторых вариантах осуществления клетки получены из клеточных линий, например, Т-клеточных линий. Клетки в некоторых вариантах осуществления получают из ксеногенного источника, например, от мыши, крысы, примата, не являющегося человеком, или свиньи.

[0505] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает одну или более стадий получения и/или неаффинного подхода разделения клеток. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или более реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения желаемыми компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяются на основе одного или более свойств, таких как плотность, адгезивные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.

[0506] В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови пациента получают, например, путем афереза или лейкафереза. Образцы, в некоторых аспектах, содержат лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов.

[0507] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, собранные у пациента, промывают, например, для удаления фракции плазмы и помещения клеток в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе отсутствует кальций и/или магний, и/или множество, или всех двухвалентные катионы. В некоторых аспектах стадия промывки выполняется полуавтоматической «проточной» центрифугой (например, клеточным процессором Cobe 2991, Baxter) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых аспектах стадия промывки выполняется посредством фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывки, таких как, например, PBS без Ca⁺⁺/Mg⁺⁺. В некоторых вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют, и клетки непосредственно ресуспендируют в культуральной среде.

[0508] В некоторых вариантах осуществления способы включают методы разделения клеток на основе плотности, такие как получение лейкоцитов из периферической крови путем лизиса эритроцитов и центрифугирования в градиенте Перколла или Фиколла.

[0509] В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение клеток различных типов на основе экспрессии или наличия в клетке одной или более специфических молекул, таких как поверхностные маркеры, например поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления может использоваться любой известный способ разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой разделение на основе аффинности или иммуноаффинности. Например, выделение в некоторых аспектах включает разделение клеток и клеточных популяций на основе экспрессии клеток или уровня экспрессии одного или более маркеров, обычно маркеров клеточной поверхности, например, путем инкубации с антителом или партнером по связыванию, который специфически связывается с такими маркерами, за которыми обычно следуют стадии промывки и разделения клеток, содержащих связанное антитело или партнер связывания, от клеток, содержащих не связанное антитело или партнер связывания.

[0510] Такие стадии разделения могут быть основаны на положительном отборе, при котором клетки, содержащие связанные реагенты, сохраняются для дальнейшего использования, и/или на отрицательном отборе, при котором клетки, не связанные с антителом или партнером по связыванию, сохраняются. В некоторых примерах обе фракции сохраняются для дальнейшего использования. В некоторых аспектах отрицательный отбор может быть особенно полезным, когда нет доступных антител, которые бы конкретно идентифицировали тип клеток в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от желаемой популяции.

[0511] Разделение не должно приводить к 100% обогащению или удалению конкретной клеточной популяции или клеток, экспрессирующих определенный маркер. Например, положительный отбор или обогащение клетками определенного типа, такими как клетки, экспрессирующие маркер, относится к увеличению количества или процента таких клеток, но не обязательно приводит к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогично, отрицательный отбор, удаление или истощение клеток определенного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к уменьшению количества или процента таких клеток, но не должно приводить к полному удалению всех таких клеток.

[0512] В некоторых примерах выполняется несколько раундов стадий разделения, где положительно или отрицательно отобранная фракция из одной стадии подвергается другой стадии разделения, такой как последующий положительный или отрицательный отбор. В некоторых примерах одна стадия разделения может истощать клетки, экспрессирующие множество маркеров одновременно, например, путем инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, каждый из которых специфичен для маркера, на которого нацелен отрицательный отбор. Аналогичным образом, несколько типов клеток могут быть одновременно положительно отобраны путем инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, экспрессируемых на различных типах клеток.

[0513] Например, в некоторых аспектах специфические субпопуляции Т-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие на высоком уровне один или более поверхностных маркеров, например, CD28 +, CD62L +, CCR7 +, CD27 +, CD127 +, CD4+, CD8+, CD45RA+и/или CD45RO+Т-клетки выделяются с помощью методов положительного или отрицательного отбора.

[0514] Например, CD3 +, CD28+T-клетки могут быть положительно отобраны с использованием анти-CD3/анти-CD28 конъюгированных магнитных гранул (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Expander Expander).

[0515] В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляется путем обогащения определенной популяции клеток путем положительного отбора или истощения определенной популяции клеток путем отрицательного отбора. В некоторых вариантах осуществления положительный или отрицательный отбор осуществляется путем инкубации клеток с одним или более антителами или другими связывающими агентами, которые специфически связываются с одним или более поверхностными маркерами, экспрессируемыми или экспрессируемыми (маркер +) на относительно более высоком уровне (высокий уровень маркера) на положительно или отрицательно отобранных клетках, соответственно.

[0516] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки отделяют от образца РВМС путем отрицательного отбора маркеров, экспрессируемых на клетках, отличных от Т-клеток, таких как В-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14. В некоторых аспектах стадия отбора CD4+ или CD8+ используется для разделения CD4+ хелперных и CD8+ цитотоксических Т-клеток. Такие популяции CD4+ и CD8+ могут быть далее отсортированы в субпопуляции путем положительного или отрицательного отбора по маркерам, экспрессируемым или экспрессируемым в относительно более высокой степени в одной или более субпопуляциях наивных, клеток памяти и/или эффекторных Т-клеток.

[0517] В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетки дополнительно обогащаются или истощаются по отношению к наивным клеткам, клеткам центральной памяти, эффекторной памяти и/или стволовым клеткам центральной памяти, как например с помощью положительного или отрицательного отбора на основе поверхностных антигенов, связанных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) проводят для повышения эффективности, например, для улучшения долгосрочной выживаемости, экспансии и/или трансплантации после введения, которые в некоторых аспектах являются особенно устойчивыми в таких субпопуляциях. Смотри Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение T_CM-обогащенных CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток дополнительно повышает эффективность.

[0518] В вариантах осуществления Т-клетки памяти присутствуют как в CD62L +, так и в CD62L- субпопуляциях CD8+ лимфоцитов периферической крови. PBMC могут быть обогащены или истощены по фракциям CD62L-CD8+ и/или CD62L+CD8+, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.

[0519] В некоторых вариантах осуществления обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательном отборе клеток, экспрессирующих или высокоэкспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение популяции CD8+, обогащенной клетками TCM, осуществляется путем истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительного отбора или обогащения клетками, экспрессирующими CD62L. В одном аспекте обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) осуществляют, начиная с отрицательной фракции клеток, отобранных на основе экспрессии CD4, которая подвергается отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительному отбору на основе CD62L. Такой отбор в некоторых аспектах выполняется одновременно, а в других аспектах - последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах одна и та же стадия отбора на основе экспрессии CD4, используемая при получении популяции или субпопуляции клеток CD8+, также используется для генерирования популяции или субпопуляции клеток CD4+, так что как положительные, так и отрицательные фракции из разделения на основе CD4 сохраняются и используются на последующих стадиях методов, необязательно после одной или более дополнительных стадий положительного или отрицательного отбора.

[0520] В конкретном примере образец PBMC или другой образец лейкоцитов подвергают селекции клеток CD4+, где сохраняются как отрицательная, так и положительная фракции. Отрицательная фракция затем подвергается отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительному отбору на основе маркерной характеристики Т-клеток центральной памяти, такой как CD62L или CCR7, где положительный и отрицательный отборы проводятся в любом порядке.

[0521] CD4+ T-хелперные клетки сортируются на наивные, клетки центральной памяти и эффекторные клетки путем идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты могут быть получены стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления наивными CD4+ T-лимфоцитами являются CD45RO-, CD45RA +, CD62L +, CD4+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления CD4+ клетки центральной памяти представляют собой CD62L+и CD45RO +. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L- и CD45RO-.

[0522] В одном примере для обогащения клеток CD4+ путем отрицательного отбора коктейль из моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий партнер связаны с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная гранула или парамагнитная гранула, чтобы обеспечить разделение клеток для положительного и/или отрицательного отбора. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют с использованием иммуномагнитных (или аффинно-магнитных) методов разделения (рассмотрено в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[0523] В некоторых аспектах образец или композицию клеток, подлежащих разделению, инкубируют с небольшим намагничиваемым или магнитно-чувствительным материалом, таким как магнитно-чувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные гранулы (например, такие как гранулы Dynabeads или MACS). Магнитно-чувствительный материал, например частица, обычно прямо или косвенно связан с партнером по связыванию, например антителом, которое специфически связывается с молекулой, например поверхностным маркером, присутствующим на клетке, клетках или популяции клеток, которые желательно отделить, например, то, что желательно подвергнуть отрицательному или положительному отбору.

[0524] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или гранула содержат магнитно-чувствительный материал, связанный с конкретным связывающим элементом, таким как антитело или другой связывающий партнер. Существует много хорошо известных магнитно-чувствительных материалов, используемых в методах магнитного разделения. Подходящие магнитные частицы включают частицы, описанные у Molday, Патенты США 4452773 и в Европейском патенте EP 452342 B, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Частицы коллоидного размера, такие как описанные у Owen, Патенты США 4795698 и у Liberti et al., Патенты США № 5200084 являются другими примерами.

[0525] Инкубацию обычно проводят в условиях, при которых антитела или партнеры по связыванию или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами по связыванию, которые прикреплены к магнитной частице или грануле, специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.

[0526] В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле, и те клетки, к которым прикреплены магниточувствительные или намагничиваемые частицы, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. Для положительного отбора клетки, которые притягиваются к магниту, сохраняются; для отрицательного отбора сохраняются клетки, которые не притягиваются (клетки без метки). В некоторых аспектах комбинация положительного и отрицательного отбора выполняется во время одной и той же стадии отбора, где положительные и отрицательные фракции сохраняются и дополнительно обрабатываются или подвергаются дополнительным стадиям разделения.

[0527] В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы покрыты первичными антителами или другими партнерами по связыванию, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы прикрепляются к клеткам посредством покрытия первичными антителами, специфичными для одного или более маркеров. В некоторых вариантах осуществления клетки, а не гранулы, метят первичным антителом или партнером связывания, а затем добавляют магнитные частицы, покрытые специфическим для типа клеток вторичным антителом или другим партнером связывания (например, стрептавидином). В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы, покрытые стрептавидином, используются в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.

[0528] В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы оставляют прикрепленными к клеткам, которые затем следует инкубировать, культивировать и/или использовать в конструировании; в некоторых аспектах частицы остаются прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магниточувствительные частицы удаляются из клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами, и т. д. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразлагаемыми.

[0529] В некоторых вариантах осуществления отбор на основе аффинности осуществляется посредством магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotec, Оберн, Калифорния). Системы магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) способны отбирать клетки высокой чистоты с намагниченными частицами, прикрепленными к ним. В некоторых вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором нецелевые и целевые образцы последовательно элюируются после приложения внешнего магнитного поля. То есть клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживаются на месте, в то время как незакрепленные частицы элюируются. Затем, после того, как этот первая стадия элюирования завершена, образцы, которые были пойманы в ловушку в магнитном поле и не были элюированы, освобождаются каким-либо образом, так что их можно элюировать и восстанавливать. В некоторых вариантах осуществления нецелевые клетки метят и истощают из гетерогенной популяции клеток.

[0530] В некоторых вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы, устройства или аппарата, которые выполняют одну или более стадий способов из стадий выделения, подготовки, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или стадий приготовления. В некоторых аспектах система используется для выполнения каждой из этих стадий в закрытой или стерильной среде, например, чтобы минимизировать ошибки, манипуляции пользователя и/или загрязнение. В одном примере система представляет собой систему, как описано в международной заявке на патент, номер публикации WO2009/072003 или US 2011/0003380 A1.

[0531] В некоторых вариантах осуществления система или аппарат выполняют один или более, например, все стадии выделения, обработки, конструирования и приготовления состава в интегрированной или автономной системе и/или автоматизированным или программируемым образом. В некоторых аспектах система или аппарат включают в себя компьютер и/или компьютерную программу, связанную с системой или аппаратом, которые позволяют пользователю программировать, контролировать, оценивать результат и/или регулировать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и приготовления состава.

[0532] В некоторых аспектах разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматического разделения клеток на уровне клинического масштаба в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать в себя встроенный микрокомпьютер, блок магнитного разделения, перистальтическую помпу и различные пережимные клапаны. Встроенный компьютер в некоторых аспектах контролирует все компоненты прибора и дает указание системе выполнять повторяющиеся процедуры в стандартизированной последовательности. Блок магнитного разделения в некоторых аспектах включает в себя подвижный постоянный магнит и держатель для селекционной колонки. Перистальтическая помпа контролирует скорость потока по всем трубкам и вместе с пережимными клапанами обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и постоянную суспензию клеток.

[0533] Система CliniMACS в некоторых аспектах использует связанные с антителами намагничиваемые частицы, которые поставляются в стерильном непирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем пакет с препаратом клеток соединяется с комплектом трубок, которые, в свою очередь, соединяются с пакетом, содержащим буфер, и с пакетом для сбора клеток. Комплект трубок состоит из предварительно собранных стерильных трубок, включая предварительную колонку и разделительную колонку, и предназначен только для одноразового использования. После запуска программы разделения система автоматически наносит образец клеток на разделительную колонку. Меченые клетки задерживаются в колонке, в то время как немеченые клетки удаляются с помощью серии стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования со способами, описанными в настоящем документе, являются немечеными и не задерживаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования со способами, описанными в настоящем документе, помечены и задерживаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования в описанных в настоящем документе способах элюируют из колонки после удаления магнитного поля и собирают в пакет для сбора клеток.

[0534] В некоторых вариантах осуществления разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Система CliniMACS Prodigy в некоторых аспектах оснащена блоком обработки клеток, который позволяет автоматически промывать и фракционировать клетки центрифугированием. Система CliniMACS Prodigy может также включать в себя встроенную камеру и программное обеспечение для распознавания изображений, которое определяет оптимальную конечную точку фракционирования клеток путем определения макроскопических слоев исходного клеточного продукта. Например, периферическая кровь может быть автоматически разделена на эритроциты, лейкоциты и слои плазмы. Система CliniMACS Prodigy также может включать в себя интегрированную камеру для культивирования клеток, которая выполняет протоколы культивирования клеток, такие как, например, дифференцировка и экспансия клеток, загрузка антигена и продолжительное культивирование клеток. Входные порты могут обеспечить стерильное удаление и пополнение среды, и клетки можно контролировать с помощью встроенного микроскопа. Смотри, например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82, и Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

[0535] В некоторых вариантах осуществления описанную в настоящем документе популяцию клеток собирают и обогащают (или истощают) с помощью проточной цитометрии, в которой клетки, окрашенные по множеству маркеров клеточной поверхности, переносятся в жидком потоке. В некоторых вариантах осуществления описанную в настоящем документе популяцию клеток собирают и обогащают (или истощают) посредством сортировки в препаративном масштабе (FACS). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) путем использования чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системой детектирования на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; и Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5): 355-376. В обоих случаях клетки могут быть помечены несколькими маркерами, что позволяет выделить четко определенные субпопуляции Т-клеток с высокой степенью чистоты.

[0536] В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры связывания помечены одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения для положительного и/или отрицательного отбора. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно меченными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров связывания, специфичных для одного или более маркеров клеточной поверхности, осуществляется в жидком потоке, таком как сортировка активированных флуоресценцией клеток (FACS), включая препаративный масштаб (FACS) и/или чипы микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с проточной цитометрической системой детектирования. Такие методы допускают положительный и отрицательный отбор на основе множества маркеров одновременно.

[0537] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии замораживания, например, криоконсервации клеток, до или после выделения, инкубации и/или конструирования. В некоторых вариантах осуществления стадия замораживания и последующего оттаивания удаляет гранулоциты и, в некоторой степени, моноциты в клеточной популяции. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в замораживающем растворе, например, после стадии промывания для удаления плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах может использоваться любое из множества известных решений и параметров замораживания. Один пример включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% человеческого сывороточного альбумина (HSA), или другие подходящие среды для замораживания клеток. Затем его разбавляют 1:1 средой, так что конечная концентрация DMSO и HSA составляет 10% и 4%, соответственно. Затем клетки замораживают до -80°С со скоростью 1°С в минуту и хранят в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота.

[0538] В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают стадии культивирования, инкубации, культивации и/или генетического конструирования. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены способы инкубации и/или конструирования истощенных клеточных популяций и композиций, инициирующих культивирование.

[0539] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клеточные популяции инкубируют в инициирующей культуру композиции. Инкубацию и/или конструирование можно проводить в культуральном сосуде, таком как блок, камера, лунка, колонка, пробирка, набор трубок, клапан, флакон, культуральная чашка, пакет или другой контейнер для культивирования или культивации клеток.

[0540] В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или в связи с генетическим конструированием. Стадии инкубации могут включать культивирование, культивацию, стимуляцию, активацию и/или размножение. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего агента. Такие условия включают условия, предназначенные для того, чтобы индуцировать пролиферацию, экспансию, активацию и/или выживание клеток в популяции, имитировать воздействие антигена и/или праймировать клетки для генетического конструирования, как например для введения антигенного рецептора.

[0541] Условия могут включать одно или более из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, агентов, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, связывание партнеры, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие агенты, предназначенные для активации клеток.

[0542] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или агенты включают один или более агентов, например лиганд, который способен активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах агент включает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в Т-клетке. Такие агенты могут включать антитела, такие как антитела, специфичные для компонента TCR и/или костимулирующего рецептора, например, антитело против CD3. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают один или более агентов, например, лиганд, который способен стимулировать костимулирующий рецептор, например антитело против CD28. В некоторых вариантах осуществления такие агенты и/или лиганды могут быть связаны с твердой подложкой, такой как гранула, и/или одним или более цитокинами. Необязательно, способ экспансии может дополнительно включать стадию добавления антитела против CD3 и/или антитела против CD28 к культуральной среде (например, в концентрации, по меньшей мере, примерно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие агенты включают IL-2, IL-15 и/или IL-7. В некоторых аспектах концентрация IL-2 составляет, по меньшей мере, примерно 10 единиц/мл.

[0543] В некоторых аспектах инкубацию проводят в соответствии с методиками, такими как описанные в патенте США № 6040177, выданном Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

[0544] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки наращивают путем добавления композиции фидерных клеток, инициирующей культуру, таких как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) (например, так, чтобы полученная популяция клеток содержала, по меньшей мере, примерно 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток РВМС для каждого Т-лимфоцита в исходной популяции, которая подлежит наращиванию); и путем инкубации культуры (например, в течение времени, достаточного для наращивания количества Т-клеток). В некоторых аспектах неделящиеся фидерные клетки могут содержать гамма-облученные фидерные клетки РВМС. В некоторых вариантах осуществления РВМС облучают гамма-излучением в диапазоне от примерно 3000 до 3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах фидерные клетки добавляют в культуральную среду до добавления популяций Т-клеток.

[0545] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста человеческих Т-лимфоцитов, например, по меньшей мере, примерно 25 градусов Цельсия, обычно, по меньшей мере, примерно 30 градусов и, как правило или примерно 37 градусов Цельсия. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление неделящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL можно облучать гамма-излучением в диапазоне от 6000 до 10000 рад. Фидерные клетки LCL в некоторых аспектах представлены в любом подходящем количестве, таком как отношение фидерных клеток LCL к исходным Т-лимфоцитам, по меньшей мере, примерно 10:1.

[0546] В вариантах осуществления антиген-специфические Т-клетки, такие как антиген-специфические CD4+ и/или CD8+ Т-клетки, получают путем стимуляции наивных или антиген-специфических Т-лимфоцитов антигеном. Например, антигенспецифические линии или клоны Т-клеток могут генерироваться для антигенов цитомегаловируса путем выделения Т-клеток от инфицированных пациентов и путем стимуляции клеток in vitro тем же антигеном.

B. Векторы и методы для генетического конструирования

[0547] Также предложены способы, нуклеиновые кислоты, композиции и наборы для экспрессии связывающих молекул и для получения генетически сконструированных клеток, экспрессирующих такие связывающие молекулы. Генетическое конструирование обычно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, например, TCR или CAR, например TCR-подобного CAR, в клетку, как например путем ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.

[0548] В некоторых вариантах осуществления перенос гена осуществляется сначала путем стимуляции клетки, например, путем объединения ее со стимулом, который индуцирует ответ, такой как пролиферация, выживание и/или активация, например, как измеряется экспрессией цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и экспансией в культуре до количества, достаточного для клинического применения.

[0549] В некоторых случаях избыточная экспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для пациента. Таким образом, в некоторых контекстах сконструированные клетки включают генные сегменты, которые вызывают восприимчивость клеток к отрицательному отбору in vivo, например, при введении в адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах клетки сконструированы таким образом, что они могут быть удалены в результате изменения состояния in vivo пациента, которому их вводят. Отрицательный селектируемый фенотип может быть результатом включения гена, который придает чувствительность к вводимому агенту, например, соединению. Отрицательные селектируемые гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2: 223, 1977), который придает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфрибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), бактериальная цитозиндеаминаза (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

[0550] В некоторых аспектах клетки дополнительно сконструированы для стимулирования экспрессии цитокинов или других факторов. Различные способы введения генетически сконструированных компонентов хорошо известны и могут использоваться с предложенными способами и композициями. Примеры способов включают способы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы, в том числе с помощью вируса, например ретровируса или лентивируса, трансдукции, транспозонов и электропорации.

[0551] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.

[0552] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинного концевого повтора (LTR), например ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), мышиного вируса стволовых клеток (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV). Большинство ретровирусных векторов происходят из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые получены из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотропными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая человека. В одном варианте осуществления ген, подлежащий экспрессии, заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Был описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, Патенты США No. 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.

[0553] Методы лентивирусной трансдукции известны. Иллюстративные способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[0554] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al., (2013) PLoS ONE8 (3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие способы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, катионную липосомопосредованную трансфекцию; бомбардировку микрочастицами частиц вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копрециапитация ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[0555] Другими подходами и векторами для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы или рекомбинантные продукты, являются те, которые описаны, например, в международной заявке на патент, публикация №: WO2014/055668 и в Патенте США № 7446190.

[0556] Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, гены для введения - это гены, которые улучшают эффективность терапии, например, путем повышения жизнеспособности и/или функции перенесенных клеток; гены, обеспечивающие генетический маркер для отбора и/или оценки клеток, например, для оценки выживаемости или локализации in vivo; гены для повышения безопасности, например, делая клетку восприимчивой к отрицательному отбору in vivo, как описано в Lupton S. D. et al., Mol. и Cell Biol., 11: 6 (1991); and Riddell et al. Human Human Therapy 3: 319-338 (1992); см. также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 Lupton et al., описывающие использования бифункциональных селектируемых слитых генов, полученных в результате слияния доминантного положительного селектируемого маркера с отрицательным селектируемым маркером. См., например, Riddell et al., Патент США № 6040177, в столбцах 14-17.

[0557] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предложены сконструированные клетки, такие как клетки, содержащие связывающую молекулу (такую как TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), нуклеиновую кислоту или вектор, как описано в настоящем документе. В некоторых аспектах клетку получают путем трансформации клетки in vitro или ex vivo вектором, описанным в настоящем документе. В некоторых аспектах клетка представляет собой Т-клетку, такую как CD8+ или CD4+ Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула является гетерологичной для клетки.

[0558] В некоторых случаях сконструированная клетка содержит гетерологичный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E6 HPV16. В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент не распознает или не связывается с эпитопом E6 (29-38), содержащим аминокислотную последовательность TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233). В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E6 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 234.

[0559] В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка содержит гетерологичный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E7 HPV 16. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент не распознает или не связывается с эпитопом E7 (11-19), содержащим аминокислотную последовательность YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236). В некоторых случаях TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает или связывается с пептидным эпитопом, полученным из E7 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 235-239. В некоторых случаях пептид, полученный из E7 HPV16, представляет собой или содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235.

V. СПОСОБЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ ЭНДОГЕННЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ T-КЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР (TCR), И КОНСТРУИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ СВЯЗЫВАЮЩИХ МОЛЕКУЛ ПУТЕМ НАПРАВЛЕННОЙ ИНТЕГРАЦИИ

[0560] В некоторых аспектах предложенные связывающие молекулы, например рекомбинантный T-клеточный рецептор (TCR) или его фрагмент или цепь, экспрессируются в сконструированной клетке, например, сконструированной T-клетке. В некоторых вариантах осуществления предложены генетически сконструированные Т-клетки, экспрессирующие любую из описанных связывающих молекул, например рекомбинантные TCR или их фрагмент или цепь, предложенные в настоящем документе, например, для адоптивной клеточной терапии, и соответствующие композиции, способы, применения и наборы и изделия производства, используемые для осуществления способов. В некоторых аспектах один или более эндогенных генов и/или генных продуктов (и/или их экспрессия) в сконструированных клетках модифицируются, например, путем редактирования генов. В некоторых аспектах редактирование генов приводит к уменьшению, удалению, устранению, нокауту или нарушению одного или более эндогенных генных продуктов (и/или их экспрессии) и/или направленной интеграции экзогенных, гетерологичных или трансгенных последовательностей, например последовательностей, кодирующих связывающую молекулу, например, рекомбинантный TCR, с помощью таких методов, как направляемая гомологией репарация (HDR). В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки сконструированы для экспрессии любой из связывающих молекул, например, рекомбинантных TCR, и последовательности, кодирующие связывающую молекулу, например, рекомбинантный TCR, могут быть нацелены на конкретный локус с помощью методов редактирования генов, таких как HDR.

[0561] В некоторых вариантах осуществления один или более эндогенных генов и/или генных продуктов (и/или их экспрессия) в предложенных клетках и/или композициях, содержащих такие клетки, уменьшают, удаляют, устраняют, нокаутируют или нарушают, например, путем введение генетического нарушения, такого как разрыв ДНК. В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты уменьшают, удаляют, устраняют, нокаутируют или нарушают в любой из клеток, сконструированных для экспрессии любой из связывающих молекул, например рекомбинантных TCR, предложенных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления предложены клетки, которые были сконструированы для экспрессии связывающей молекулы, например, рекомбинантного TCR, описанного в настоящем документе, популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками.

[0562] В некоторых вариантах осуществления один или более эндогенных генов и/или генных продуктов (и/или их экспрессия) в предложенных клетках и/или композициях, содержащих такие клетки, уменьшают, удаляют, устраняют, нокаутируют или нарушают, включая один или более генов, кодирующих (или их продукты) константную область TCR альфа (TRAC) и/или константную область TCR бета (TRBC; кодируется у человека TRBC1 или TRBC2), например, для уменьшения или предотвращения экспрессии эндогенного TCR и/или его цепи в клетке например, Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты, такие как TRAC и/или TRBC, уменьшены, удалены, утсранены, нокаутированы или нарушены в любой из сконструированных клеток, предложенных в настоящем описании, и/или в любом из способов получения сконструированных клеток, предложенных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки и/или сконструированные клетки, полученные способами, представляют собой клетки, которые были сконструированы для экспрессии связывающей молекулы, описанной в настоящем документе, популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками. В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты, такие как TRAC и/или TRBC, уменьшены, удалены, устранены, нокаутированы или нарушены в первичных Т-клетках, чтобы уменьшить, удалить, устранить, нокаутировать или нарушить экспрессию эндогенного TCR в первичных Т-клетках, например, сконструированных для экспрессии любого из Т-клеточных рецепторов, описанных в настоящем документе.

[0563] В некоторых вариантах осуществления редактирование генов, например, с помощью HDR, включает: i) введение в иммунную клетку одного или более агентов, способных индуцировать генетическое нарушение одного или более сайтов-мишеней в гене, кодирующем домен, или область альфа-цепи (TCRα) Т-клеточного рецептора и/или один или более генов, кодирующих домен или область бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCRβ); и ii) введение в иммунную клетку полинуклеотида, например матричного полинуклеотида, содержащего трансген, кодирующий связывающую молекулу, например рекомбинантный TCR или его цепь, такой как любой из предложенных рекомбинантных TCR, где трансген, кодирующий связывающую молекулу, например рекомбинантный TCR или его цепь, нацелен на один или примерно один из по меньшей мере одного сайта-мишени с помощью направляемой гомологией репарации (HDR).

[0564] В некоторых аспектах полинуклеотиды, например матричные полинуклеотиды, содержащие трансгенную последовательность (также называемую в настоящем документе экзогенной или гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты), кодирующую связывающую молекулу, например рекомбинантный TCR или его цепь, и последовательности, гомологичные области генетического нарушения, могут быть введены в клетку, содержащую генетическое нарушение в эндогенных локусах TRAC и/или TRBC. В некоторых аспектах при наличии целевого генетического нарушения, например, разрыва ДНК, последовательности нуклеиновой кислоты могут использоваться в качестве матрицы для репарации ДНК, чтобы эффективно копировать и интегрировать последовательность трансгена, например последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие связывающую молекулу, например, рекомбинантный TCR или его цепь, в сайт или примерно в сайт целевого генетического нарушения с помощью HDR, на основе гомологии между последовательностью эндогенного гена, окружающей сайт-мишень, и 5'- и/или 3'-плечами гомологии, включенными в матричный полинуклеотид.

[0565] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные клетки модифицированы так, чтобы они содержали локус TRAC и/или TRBC, который содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из предложенных связывающих молекул, например, рекомбинантный TCR или его фрагмент. В некоторых аспектах локус TRAC и/или TRBC в генетически сконструированной клетке модифицируется, например, путем редактирования генов, чтобы включать последовательность трансгена, кодирующую связывающую молекулу, например, рекомбинантный TCR или его цепь, которые интегрированы в эндогенный локус TRAC и/или TRBC, который обычно кодирует константные домены TCRα или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления редактирование генов включает в себя индукцию целевого генетического нарушения в одном или более эндогенных генах, кодирующих константные домены TCRα или TCRβ, и направляемую гомологичной репарацией (HDR) с использованием одного или более матричных полинуклеотидов, содержащих трансген, кодирующий связывающую молекулу, например, рекомбинантный TCR или его цепь, таким образом направляя интеграцию трансгена в локус TRAC и/или TRBC. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует часть рекомбинантного TCR и интегрируется в рамке в открытую рамку считывания TCR и/или в локус гена. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует часть рекомбинантного TCR и встраивается в рамке внутрь эндогенной открытой рамки считывания, кодирующей константный домен TCR. В некоторых вариантах осуществления интеграция трансгена в локус модифицирует и/или приводит к получению модифицированного локуса, который кодирует полный рекомбинантный TCR.

A. Генетическое нарушение эндогенных генов, кодирующих TCR

[0566] В некоторых вариантах осуществления направленное генетическое нарушение происходит в эндогенных генах, которые кодируют один или более доменов, областей и/или цепей эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение является мишенью в эндогенных генных локусах, которые кодируют TCRα и/или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления мишенью генетического нарушения является ген, кодирующий константный домен TCRα (TRAC у людей) и/или константный домен TCRβ (TRBC1 или TRBC2 у человека).

[0567] В некоторых вариантах осуществления гены и/или генные продукты, являющиеся мишенью для уменьшения, делеции, исключения, нокаута или нарушения, представляют собой эндогенные гены, кодирующие TCR или цепь, домен и/или его область. В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень для нарушения находится в гене константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC). В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень для нарушения находится в гене константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2). В некоторых вариантах осуществления один или более сайтов-мишеней находятся в гене TRAC и в одном или в обоих из генов TRBC1 и TRBC2.

[0568] В некоторых вариантах осуществления эндогенный TCR Cα кодируется геном TRAC (номенклатура IMGT). Иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена константной области Т-клеточного рецептора альфа человека (TRAC) представлена в SEQ ID NO: 348 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001332.3, TRAC). В некоторых вариантах осуществления эндогенный TCR Cβ кодируется генами TRBC1 или TRBC2 (номенклатура IMGT). Иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена константной области 1 Т-клеточного рецептора бета человека (TRBC1) представлена в SEQ ID NO: 349 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC1); и иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена константной области 2 Т-клеточного рецептора бета человека (TRBC2) представлена в SEQ ID NO: 1047 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC2).

[0569] В некоторых вариантах осуществления эндогенный TCR Cα кодируется геном TRAC (номенклатура IMGT). Иллюстративная последовательность локуса гена константного домена альфа-цепи Т-клеточного рецептора человека (TRAC) представлена в SEQ ID NO: 348 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001332.3, TRAC). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или в пределах локуса TRAC. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или в пределах открытой рамки считывания локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри открытой рамки считывания, которая кодирует константный домен TCRα. В некоторых вариантах осуществления генетическое разрушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри локуса, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 348, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентичности последовательностей со всей или частью этой последовательности, например, по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, или 4000 непрерывно расположенных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 348.

[0570] У людей иллюстративный геномный локус TRAC содержит открытую рамку считывания, которая содержит 4 экзона и 3 интрона. Иллюстративный транскрипт мРНК TRAC может охватывать последовательность, соответствующую координатам хромосомы 14: 22,547,506-22,552,154, на прямой цепи на основании версии генома человека GRCh38 (UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly). В Таблице 13 приведены координаты экзонов и интронов открытых рамок считывания и нетранслируемых областей транскрипта иллюстративного локуса TRAC человека.

Таблица 13 Координаты экзонов и интронов иллюстративного локуса TRAC человека (GRCh38, хромосома 14, прямая цепь).

Старт (GrCh38) Конец (GrCh38) Длина 5' UTR и Экзон 1 22547506 22547778 273 Интрон 1-2 22547779 22549637 1859 Экзон 2 22549638 22549682 45 Интрон 2-3 22549683 22550556 874 Экзон 3 22550557 22550664 108 Интрон 3-4 22550665 22551604 940 Экзон 4 и 3' UTR 22551605 22552154 550

[0571] В некоторых вариантах осуществления эндогенный TCR Cβ кодируется генами TRBC1 или TRBC2 (номенклатура IMGT). Иллюстративная последовательность локуса гена константного домена 1 (TRBC1) бета-цепи Т-клеточного рецептора человека представлена в SEQ ID NO: 349 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC1); и иллюстративная последовательность локуса гена константного домена 2 бета-цепи Т-клеточного рецептора человека (TRBC2) представлена в SEQ ID NO: 1047 (Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC2). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри локуса гена TRBC1. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри открытой рамки считывания локуса TRBC1. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри открытой рамки считывания, которая кодирует константный домен TCRβ. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри локуса, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 349, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентичности последовательностей со всей или частью этой последовательности, например, по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, или 4000 последовательно расположенных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 349.

[0572] У человека иллюстративный геномный локус TRBC1 содержит открытую рамку считывания, которая содержит 4 экзона и 3 интрона. Иллюстративный транскрипт мРНК TRBC1 может охватывать последовательность, соответствующую координатам хромосомы 7: 142,791,694-142,793,368, на прямой цепи на основании версии генома человека GRCh38 (UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly). В Таблице 14 приведены координаты экзонов и интронов открытых рамок считывания и нетранслируемых областей транскрипта иллюстративного локуса TRBC1 человека.

Таблица 14 Координаты экзонов и интронов иллюстративного локуса TRBC1 человека (GRCh38, хромосома 7, прямая цепь).

Старт (GrCh38) Конец (GrCh38) Длина 5'-UTR и Экзон 1 142791694 142792080 387 Интрон 1-2 142792081 142792521 441 Экзон 2 142792522 142792539 18 Интрон 2-3 142792540 142792691 152 Экзон 3 142792692 142792798 107 Интрон 3-4 142792799 142793120 322 Экзон 4 и 3'-UTR 142793121 142793368 248

[0573] В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри локуса TRBC2. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри открытой рамки считывания локуса TRBC2. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри открытой рамки считывания, которая кодирует константный домен TCRβ. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в, вблизи или внутри локуса, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1047, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентичности последовательностей со всей или частью этой последовательности, например, по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, или 4000 последовательно расположенных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1047.

[0574] У человека иллюстративный геномный локус TRBC2 содержит открытую рамку считывания, которая содержит 4 экзона и 3 интрона. Иллюстративный транскрипт мРНК TRBC2 может охватывать последовательность, соответствующую координатам хромосомы 7: 142,801,041-142,802,748, на прямой цепи на основании версии генома человека GRCh38 (UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly). В Таблице 15 приведены координаты экзонов и интронов открытых рамок считывания и нетранслируемых областей транскрипта иллюстративного локуса TRBC2 человека.

Таблица 15 Координаты экзонов и интронов прмерного локуса TRBC2 человека (GRCh38, хромосома 7, прямая цепь).

Старт (GrCh38) Конец (GrCh38) Длина 5' UTR и Экзон 1 142801041 142801427 387 Интрон 1-2 142801428 142801943 516 Экзон 2 142801944 142801961 18 Интрон 2-3 142801962 142802104 143 Экзон 3 142802105 142802211 107 Интрон 3-4 142802212 142802502 291 Экзон 4 и 3' UTR 142802503 142802748 246

[0575] В некоторых вариантах осуществления ген(гены), являющиеся мишенью для нарушения или нокаута, находятся в одном или вблизи одного или более из локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления ген TRAC нокаутирован. В некоторых вариантах осуществления ген TRBC1 нокаутирован. В некоторых вариантах осуществления ген TRBC2 нокаутирован. В некоторых вариантах осуществления нокаутированы гены TRAC и TRBC1. В некоторых вариантах осуществления нокаутированы ген TRAC и ген TRBC2. В некоторых вариантах осуществления ген TRAC и оба гена TRBC1 и TRBC2 нокаутируют, например, направленно воздействуя на последовательность, которая является консервативной между TRBC1 и TRBC2.

[0576] В некоторых вариантах осуществления уменьшение или предотвращение экспрессии эндогенного TCR может привести к снижению риска или вероятности неправильного связывания между цепями сконструированного TCR и эндогенного TCR, создавая тем самым новый TCR, который потенциально может привести к более высокому риску нежелательного или непреднамеренного распознавания антигена и/или к побочным эффектам, и/или может снизиться уровень экспрессии целевого экзогенного TCR. В некоторых аспектах уменьшение или предотвращение эндогенной экспрессии TCR может увеличивать экспрессию сконструированного TCR в клетках по сравнению с клетками, в которых экспрессия TCR не снижается или не предотвращается, например, увеличивается в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз или более. Например, в некоторых случаях субоптимальная экспрессия сконструированного или рекомбинантного TCR может происходить из-за конкуренции с эндогенным TCR и/или с TCR, содержащим неправильно спаренные цепи, за инвариантные сигнальные молекулы CD3, которые участвуют в обеспечении возможности экспрессии комплекса на клеточной поверхности.

[0577] В некоторых вариантах осуществления уменьшение, удаление, устранение, нокаут или нарушение включают использование одного или более агентов, способных вводить генетическое нарушение, расщепление, двухцепочечный разрыв (DSB) и/или одноцепочечный разрыв в сайте-мишени в геномной ДНК, что приводит к уменьшению, удалению, устранению, нокауту или нарушению после репарации различными механизмами репарации клеточной ДНК.

[0578] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов, способных к введению расщепления, включают ДНК-связывающий белок или ДНК-связывающую нуклеиновую кислоту, которая специфически связывается или гибридизуется с сайтом-мишенью в геноме, например, в генах TRAC и/или TRBC. В некоторых аспектах направленное расщепление, например разрыв ДНК, эндогенных генов, кодирующих TCR, достигается с использованием белка или нуклеиновой кислоты, связанных или образующих комплекс с нуклеазой для редактирования гена, как например в химерном или гибридном белке. В некоторых вариантах осуществления один или более агентов, способных к введению расщепления, включают слитый белок, содержащий белок, нацеленный на ДНК, и нуклеазу или РНК-направляемую нуклеазу.

[0579] В некоторых вариантах осуществления восстановление, удаление, устранение, нокаут или нарушение осуществляются методами редактирования генов, такими как использование нуклеазы цинкового пальца (ZFN), TALEN или системы CRISPR/Cas вместе со сконструированной одиночной гид-РНК, которая расщепляет ген TCR. В некоторых вариантах осуществления снижение экспрессии эндогенного TCR осуществляют с использованием ингибирующей молекулы нуклеиновой кислоты против нуклеиновых кислот-мишеней, кодирующих специфические TCR (например, TCR-α и TCR-β). В некоторых вариантах осуществления ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой или содержит или кодирует короткую интерферирующую РНК (киРНК), микроРНК-адаптированную кшРНК, короткую шпилечную РНК (кшРНК), шпилечную киРНК, микроРНК (миРНК-предшественник) или микроРНК (миРНК). Иллюстративные способы снижения или предотвращения эндогенной экспрессии TCR известны в данной области, см., например, Патент США № 9273283; публикацию США № US2014/0301990; и публикацию PCT № WO2015/161276.

[0580] В некоторых вариантах осуществления агент, способный к введению направленного расщепления, включает различные компоненты, такие как слитый белок, содержащий ДНК-нацеленный белок и нуклеазу или РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых вариантах осуществления направленное расщепление осуществляют с использованием молекулы, нацеленной на ДНК, которая включает ДНК-связывающий белок, такой как один или более белков цинкового пальца (ZFP), или эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE), слитые с нуклеазой, такой как как эндонуклеаза. В некоторых вариантах осуществления направленное расщепление осуществляют с использованием РНК-направляемых нуклеаз, таких как система нуклеазы Cas (включая Cas и/или Cfp1), ассоциированной с нуклеиновой кислотой CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). В некоторых вариантах осуществления направленное расщепление осуществляют с использованием агентов, способных вводить расщепление, таких как специфичные для последовательности или направленные нуклеазы, включая ДНК-связывающие направленные нуклеазы и нуклеазы редактирования генов, такие как нуклеазы цинкового пальца (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN) и РНК-направляемые нуклеазы, такие как система CRISPR-ассоциированной нуклеазы (Cas), специально сконструированная и/или предназначенная для нацеливания по меньшей мере на один сайт-мишень (сайты), последовательность гена или его часть.

1. Сконструированные нуклеазы

[0581] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов специфически нацелены по меньшей мере на один сайт-мишень (сайты), например, на последовательности или вблизи генов TRAC и/или TRBC. В некоторых вариантах осуществления агент содержит комбинацию ZFN, TALEN или CRISPR/Cas9, которая специфически связывается, распознает или гибридизуется с сайтом-мишенью (сайтами). В некоторых вариантах осуществления система CRISPR/Cas9 включает сконструированную crРНК/tracr РНК («одиночная направляющая РНК») для направления специфического расщепления. В некоторых вариантах осуществления агент содержит нуклеазы на основе системы Argonaute (например, из T. thermophilus, известного как TtAgo) (Swarts et al. (2014) Nature 507 (7491): 258-261).

[0582] Белки цинкового пальца (ZFP), эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE), и домены, связывающие систему CRISPR, могут быть «сконструированы» для связывания с предварительно определенной нуклеотидной последовательностью, например, посредством конструирования (изменения одной или более аминокислот) спиральной области распознавания природного белка ZFP или TALE. Сконструированные ДНК-связывающие белки (ZFP или TALE) представляют собой белки, которые не встречаются в природе. Рациональные критерии для проектирования включают применение правил замещения и компьютеризированных алгоритмов для обработки информации в базе данных, хранящей информацию о существующих конструкциях ZFP и/или TALE и данных о связывании. Смотри, например, Патенты США No. 6140081; 6453242; и 6534261; см. также WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496 и Публикацию США № 20110301073. Иллюстративные ZFN, TALE и TALEN описаны, например, в Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4 (221): 1-7 (2013).

[0583] В некоторых вариантах осуществления сконструированный белок цинкового пальца, белок TALE или система CRISPR/Cas не присутствуют в природе и продукция которых обусловлена главным образом эмпирическим процессом, таким как фаговый дисплей, ловушка взаимодействия или гибридный отбор. См., например, Патенты США № 5789538; Патенты США 5925523; Патенты США № 6007988; Патенты США № 6013453; Патенты США № 6200759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 и WO 02/099084.

[0584] В некоторых вариантах осуществления гены TRAC и/или TRBC могут подвергаться направленному воздействию расщепления с помощью сконструированных ZFN. Иллюстративные ZFN, которые нацелены на эндогенные гены Т-клеточных рецепторов (TCR), включают те, которые описаны, например, в US 2015/0164954, US 2011/0158957, US 2015/0056705, US 8956828 и Torikawa et al. (2012) Blood 119: 5697-5705, раскрытия которых включены в качестве ссылки в полном объеме.

[0585] В некоторых вариантах осуществления гены TRAC и/или TRBC могут подвергаться направленному воздействию расщепления с помощью сконструированных TALEN. Иллюстративные TALEN, которые нацелены на эндогенные гены Т-клеточных рецепторов (TCR), включают гены, описанные, например, в WO 2017/070429, WO 2015/136001, US20170016025 и US20150203817, раскрытия которых включены в качестве ссылки в полном объеме.

2. CRISPR-связанные методы

[0586] В некоторых вариантах осуществления гены TRAC и/или TRBC могут подвергаться направленному воздействию расщепления с использованием коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) и CRISPR-ассоциированных (Cas) белков. См. Sander and Joung, (2014) Nature Biotechnology, 32 (4): 347-355. В некоторых вариантах осуществления «система CRISPR» в совокупности относится к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или управлении активностью CRISPR-ассоциированных («Cas») генов, включая последовательности, кодирующие ген Cas, tracr (трансактивирующий CRISPR) последовательность (например, tracrРНК или активная частичная tracrРНК), последовательность tracr-mate (включающая «прямой повтор» и tracrРНК-процессированный частичный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), направляющая последовательность (также называемая «спейсер» в контексте эндогенной системы CRISPR) и/или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR.

[0587] В некоторых аспектах нуклеаза CRISPR/Cas или система нуклеазы CRISPR/Cas включает некодирующую гид-РНК (гРНК), которая специфически связывается с ДНК, и белок Cas (например, Cas9) с функциональностью нуклеазы.

[0588] В некоторых вариантах осуществления редактирование гена приводит к вставке или удалению в целевом локусе или «нокауту» целевого локуса и устранению экспрессии кодируемого белка. В некоторых вариантах осуществления редактирование гена достигается посредством негомологичного концевого присоединения (NHEJ) с использованием системы CRISPR/Cas9. В некоторых вариантах осуществления одну или более молекул гид-РНК (гРНК) можно использовать с одной или более нуклеазой Cas9, никазой Cas9, ферментативно неактивной Cas9 или их вариантами. Иллюстративные особенности молекулы (молекул) гРНК и молекулы (молекул) Cas9 описаны ниже.

[0589] В некоторых вариантах осуществления система нуклеазы CRISPR/Cas содержит, по меньшей мере, одно из: гид-РНК (гРНК), имеющую нацеливающий домен, который комплементарен сайту-мишени гена TRAC; гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен сайту-мишени одного или обоих из генов TRBC1 и TRBC2; или, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую гРНК.

[0590] В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность, например гид-РНК, представляет собой любые полинуклеотидные последовательности, содержащие по меньшей мере часть последовательности, например, нацеливающий домен, который обладает достаточной комплементарностью с последовательностью сайта-мишени, такой как сайт-мишень в TRAC, TRBC1 и/или генах TRBC2 у человека для гибридизации с последовательностью-мишенью в сайте-мишени и специфического связывания прямой последовательности комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления в контексте образования комплекса CRISPR «сайт-мишень» (также известный как «положение-мишень», «ДНК-последовательность-мишень» или «локализация-мишень») может относиться к последовательности, для которой сконструирована направляющая последовательность, обладающая комплементарностью, где гибридизация между последовательностью-мишенью и доменом, например, нацеливающим доменом гид-РНК способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не обязательно требуется при условии, что существует достаточная комплементарность, чтобы вызвать гибридизацию и способствовать образованию комплекса CRISPR. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность выбирается для уменьшения степени вторичной структуры в направляющей последовательности. Вторичная структура может быть определена с помощью любого подходящего алгоритма сворачивания полинуклеотидов.

[0591] В некоторых аспектах фермент CRISPR (например, нуклеаза Cas9) в комбинации с (и необязательно в комплексе с) направляющей последовательностью доставляется в клетку. Например, один или более элементов системы CRISPR являются производными от системы CRISPR типа I, типа II или типа III. Например, один или более элементов системы CRISPR происходят из конкретного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, такого как Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus или Neisseria meningitides.

[0592] В некоторых вариантах осуществления гид-РНК (гРНК), специфичная для сайта-мишени (например, TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 у человека), используется РНК-управляемыми нуклеазами, например, Cas, для введения ДНК-разрыва в сайте-мишени или положении-мишени. Способы конструирования гРНК и иллюстративных нацеливающих доменов могут включать методы, описанные, например, в международной публикации PCT №. WO2015/161276. Нацеливающие домены могут быть включены в гРНК, которая используется для нацеливания нуклеаз Cas9 на сайт-мишень или положение-мишень.

[0593] Способы выбора и проверки последовательностей-мишеней, а также анализы ошибочного нацеливания описаны, например, в Mali et al., 2013 Science 339 (6121): 823-826; Hsu et al. Nat Biotechnol, 31 (9): 827-32; Fu et al., 2014, Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11 (2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662. Поногеномная база данных гРНК для редактирования генома CRISPR, которая содержит иллюстративные последовательности одиночных гид-РНК (sgРНК), нацеленные на конститутивные экзоны генов в геноме человека или геноме мыши (см., например, genescript.com/gRNA-database.html; см. также Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11: 783-4). В некоторых аспектах последовательность гРНК представляет собой или включает последовательность с минимальным нецелевым связыванием с нецелевым сайтом или положением.

a. Молекулы гид-РНК (гРНК)

[0594] В некоторых вариантах осуществления агент содержит гРНК, которая нацелена на область локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. «Молекула гРНК» относится к нуклеиновой кислоте, которая способствует специфическому нацеливанию или возвращению комплекса молекула гРНК/молекула Cas9 к нуклеиновой кислоте-мишени, такой как локус в геномной ДНК клетки. Молекулы гРНК могут быть мономолекулярными (имеют одну молекулу РНК), иногда называемыми в настоящем описании «химерными» гРНК, или модульными (содержат более чем одну и, как правило, две, отдельные молекулы РНК).

[0595] Несколько иллюстративных структур гРНК с указанными на них доменами представлены на ФИГ. 14А-14G. Не желая быть связанными теорией, касающейся трехмерной формы или внутри- или межцепочечных взаимодействий активной формы гРНК, области высокой комплементарности иногда показаны в виде дуплексов на ФИГ. 14A-14G и других изображениях, представленных в настоящем описании.

[0596] В некоторых случаях гРНК представляет собой мономолекулярную или химерную гРНК, содержащую от 5' к 3': нацеливающий домен, который комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, такой как последовательность из генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 (кодирующие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 348, 349 и 1047, соответственно); первый домен комплементарности; связывающий домен; второй домен комплементарности (который комплементарен первому домену комплементарности); проксимальный домен; и, необязательно, хвостовой домен.

[0597] В других случаях гРНК представляет собой модульную гРНК, содержащую первую и вторую цепи. В этих случаях первая цепь предпочтительно включает от 5' к 3': нацеливающий домен (который комплементарен нуклеиновой кислоте-мишени, такой как последовательность из генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, кодирующая последовательность, представленная в SEQ ID NO: 348, 349 и 1047, соответственно) и первый домен комплементарности. Вторая цепь обычно включает от 5' к 3': необязательно, 5'-домен удлинения; второй домен комплементарности; проксимальный домен; и, необязательно, хвостовой домен.

[0598] В некоторых случаях эта гРНК представляет собой мономолекулярную или химерную гРНК, содержащую от 5' к 3': нацеливающий домен, который нацелен на сайт-мишень или положение-мишень, например последовательность из локуса TRAC (иллюстративная нуклеотидная последовательность гена TRAC человека локус представлена в SEQ ID NO: 348; Эталонная последовательность NCBI: NG_001332.3, TRAC; иллюстративная геномная последовательность, описанная в Таблице 13 настоящего документа); первый домен комплементарности; связывающий домен; второй домен комплементарности (который комплементарен первому домену комплементарности); проксимальный домен; и, необязательно, хвостовой домен. В некоторых случаях эта гРНК представляет собой мономолекулярную или химерную гРНК, содержащую от 5' к 3': нацеливающий домен, который нацелен на сайт-мишень или положение-мишень, например последовательность из локуса TRBC1 или TRBC2 (иллюстративная нуклеотидная последовательность локус гена TRBC1 человека, представленная в SEQ ID NO: 349; Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC1; иллюстративная геномная последовательность, описанная в Таблице 14 настоящего документа; иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена TRBC2 человека, представленная в SEQ ID NO: 1047; NCBI Эталонная последовательность: NG_001333.2, TRBC2; иллюстративная геномная последовательность описана в Таблице 15 настоящего документа); первый домен комплементарности; связывающий домен; второй домен комплементарности (который комплементарен первому домену комплементарности); проксимальный домен; и, необязательно, хвостовой домен.

[0599] В других случаях гРНК представляет собой модульную гРНК, содержащую первую и вторую цепи. В этих случаях первая цепь предпочтительно включает от 5' к 3': нацеливающий домен (который нацелен на сайт-мишень или положение-мишень, например, в последовательности из локуса TRAC (иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена TRAC человека, представленная в SEQ ID NO: 348; Эталонная последовательность NCBI: NG_001332.3, TRAC; иллюстративная геномная последовательность, описанная в Таблице 13 настоящего документа), или локуса TRBC1 или TRBC2 (иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена TRBC1 человека, представленная в SEQ ID NO: 349; эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC11; иллюстративная геномная последовательность, описанная в Таблице 14 настоящего документа; иллюстративная нуклеотидная последовательность локуса гена TRBC2 человека, представленная в SEQ ID NO: 1047; Эталонная последовательность NCBI: NG_001333.2, TRBC2), и первая домен комплементарности. Вторая цепь обычно включает от 5' к 3': необязательно, 5'-домен удлинения; второй домен комплементарности; проксимальный домен; и, необязательно, хвостовой домен.

[0600] Эти домены кратко обсуждаются ниже:

(1) Нацеливающий Домен

[0601] На ФИГ. 14A-14G приведены примеры размещения нацеливающих доменов.

[0602] Нацеливающий домен содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна, например, по меньшей мере, на 80, 85, 90, 95, 98 или 99%, например полностью комплементарна, последовательности-мишени нуклеиновой кислоты-мишени. Цепь нуклеиновой кислоты-мишени, содержащая последовательность-мишень, называется в настоящем описании «комплементарной цепью» нуклеиновой кислоты-мишени. Руководство по выбору нацеливающих доменов можно найти, например, в Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808) и Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011).

[0603] Нацеливающий домен является частью молекулы РНК и, следовательно, будет содержать основание урацил (U), в то время как любая ДНК, кодирующая молекулу гРНК, будет содержать основание тимин (Т). Не желая быть связанными теорией, в одном варианте осуществления полагают, что комплементарность нацеливающего домена с последовательностью-мишенью вносит вклад в специфичность взаимодействия комплекса молекулы гРНК/молекулы Cas9 с нуклеиновой кислотой-мишенью. Понятно, что в паре нацеливающего домена и последовательности-мишени основания урацила в нацеливающем домене будут спариваться с основаниями аденина в последовательности-мишени. В одном варианте осуществления домен-мишень сам по себе содержит в направлении от 5' к 3' необязательный вторичный домен и коровый домен. В одном варианте осуществления коровый домен полностью комплементарен последовательности-мишени. В одном варианте осуществления нацеливающий домен имеет длину от 5 до 50 нуклеотидов. Цепь нуклеиновой кислоты-мишени, которой нацеливающий домен является комплементарным, называется в настоящем описании комплементарной цепью. Некоторые или все нуклеотиды домена могут иметь модификацию, например сделать ее менее восприимчивой к деградации, улучшить биосовместимость и т. д. В качестве неограничивающего примера, остов домена-мишени может быть модифицирован с помощью фосфоротиоат или другой модификации (модификаций). В некоторых случаях нуклеотид нацеливающего домена может содержать 2'-модификацию, например, 2-ацетилирование, например, 2'-метилирование, или другие модификации.

[0604] В различных вариантах осуществления нацеливающий домен имеет длину 16-26 нуклеотидов (т. е. он имеет длину 16 нуклеотидов или длину 17 нуклеотидов, или длину 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов).

(2) Иллюстративные нацеливающие домены

[0605] В некоторых вариантах осуществления, когда нокаутным положением-мишенью T-клеток является кодирующая область TRAC, например, ранняя кодирующая область, и более чем одна гРНК используется для разрывов положений, например, двух одноцепочечных разрывов или двух двухцепочечных разрывов, или комбинации из одноцепочечных и двухцепочечных разрывов, например, для создания одной или более вставок/делеций в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, каждая гид-РНК независимо выбрана из одной из, представленных в Таблицах 25A-G или Таблице 29 международной публикации PCT No. WO2015161276.

[0606] В другом варианте осуществления, когда нокаутным положением-мишенью T-клеток является кодирующая область TRAC, например, ранняя кодирующая область, и более чем одна гРНК используется для разрывов положений, например, двух одноцепочечных разрывов или двух двухцепочечных разрывов, или комбинации из одноцепочечных и двухцепочечных разрывов, например, для создания одной или более вставок/делеций в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, каждая гид-РНК независимо выбрана из одной из, представленных в Таблицах 25A-G или Таблице 29 международной публикации PCT No. WO2015161276, так что разрыв создается с эффективностью более 10%.

[0607] В другом варианте осуществления, когда нокаутным положением-мишенью T-клеток является кодирующая область TRBC, например, ранняя кодирующая область, и более чем одна гРНК используется для разрывов положений, например, двух одноцепочечных разрывов или двух двухцепочечных разрывов, или комбинации из одноцепочечных и двухцепочечных разрывов, например, для создания одной или более вставок/делеций в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, каждая гид-РНК независимо выбрана из одной из, представленных в Таблицах 26A-G или Таблице 27 международной публикации PCT No. WO2015161276.

[0608] В другом варианте осуществления, когда нокаутным положением-мишенью T-клеток является кодирующая область TRBC, например, ранняя кодирующая область, и более чем одна гРНК используется для разрывов положений, например, двух одноцепочечных разрывов или двух двухцепочечных разрывов, или комбинации из одноцепочечных и двухцепочечных разрывов, например, для создания одной или более вставок/делеций в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, каждая гид-РНК независимо выбрана из одной из, представленных в Таблицах 26A-G или Таблице 27 международной публикации PCT No. WO2015161276, так что разрыв создается с эффективностью более 10%.

[0609] В некоторых вариантах осуществления иллюстративная последовательность нацеливающего домена гид-РНК включает любую из описанных в международной публикации PCT No. WO2015161276. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные последовательности гид-РНК описаны ниже со ссылкой на Таблицы, представленные в международной публикации PCT No. WO2015161276, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[0610] В Таблице 25А международной публликации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием S. pyogenes Cas9, выбранной в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона и имеют хорошую ортогональность. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. pyogenes Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. pyogenes Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н. В одном варианте осуществления две гРНК используются для нацеливания двух нуклеаз Cas9 или двух никаз Cas9, например, гРНК с нацеливающим доменом из группы A может быть спарена с гРНК с нацеливающим доменом из группы B, как показано в Таблице 25-1 Международной публикации РСТ No. WO2015161276.

[0611] В Таблице 25B Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием S. pyogenes Cas9, выбранной в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона, и хорошая ортогональность не требуется. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. pyogenes Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. pyogenes Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0612] В Таблице 25C Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием S. aureus Cas9, выбранные в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены были отобраны в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности, имели высокий уровень ортогональности и содержали NNGRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н. В одном варианте осуществления две гРНК используются для нацеливания двух нуклеаз Cas9 или двух никаз Cas9, например, гРНК с нацеливающим доменом из группы A может быть спарена с гРНК с нацеливающим доменом из группы B, как показано в Таблице 25-2 Международной публикации РСТ No. WO201516127.

[0613] В Таблице 25D Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием S. aureus Cas9, выбранного в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены были выбраны в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности, уровень ортогональности не требовался, и содержали NNGRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0614] В Таблице 25E Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием S. aureus Cas9, выбранного в соответствии с параметрами третьего выбора. Нацеливающие домены были выбраны в оставшейся части кодирующей последовательности в 3'-области и содержали NNGRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0615] В Таблице 25F Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием N.meningitides Cas9, выбранные в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона и имеют хорошую ортогональность. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой N. meningitidis Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы N. meningitidis с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0616] В Таблице 25G Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRAC с использованием N. meningitidis Cas9, выбранные в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона, и хорошая ортогональность не требуется. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой N. meningitidis Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы N. meningitidis Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0617] В Таблице 26А Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием S. pyogenes Cas9, выбранные в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона и имеют хорошую ортогональность. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. pyogenes Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. pyogenes Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н. В одном варианте осуществления две гРНК используются для нацеливания двух нуклеаз Cas9 или двух никаз Cas9, например, гРНК с нацеливающим доменом из группы A может быть спарена с гРНК с нацеливающим доменом из группы B, как показано в Таблице 26-1 Международной публикации РСТ No. WO201516127.

[0618] В Таблице 26B Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием S. pyogenes Cas9, выбранные в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона, и хорошая ортогональность не требуется. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. pyogenes Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. pyogenes Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0619] В Таблице 26C Международной публикации PCT No. В WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием S. aureus Cas9, выбранные в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены были отобраны в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности, имели высокий уровень ортогональности и содержали N GRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н. В одном варианте осуществления две гРНК используются для нацеливания двух нуклеаз Cas9 или двух никаз Cas9, например, гРНК с нацеливающим доменом из группы A может быть спарена с гРНК с нацеливающим доменом из группы B, как показано в Таблице 26-2 Международной публикации РСТ No. WO201516127.

[0620] В Таблице 26D Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием S. aureus Cas9, выбранные в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены были выбраны в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности, уровень ортогональности не требовался, и содержали NNGRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0621] В Таблице 26E Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием S. aureus Cas9, выбранные в соответствии с параметрами третьего выбора. Нацеливающие домены были выбраны в оставшейся части кодирующей последовательности в 3'-области и содержали NNGRRT PAM. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой S. aureus Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. aureus Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0622] В Таблице 26F Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием N. meningitidis Cas9, выбранные в соответствии с параметрами первого выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона и имеют хорошую ортогональность. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой N. meningitidis Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы N. meningitidis с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0623] В Таблице 26G Международной публикации РСТ No. WO2015161276 представлены нацеливающие домены для нокаутирования гена TRBC с использованием N.meningitides Cas9, выбранные в соответствии с параметрами второго выбора. Нацеливающие домены связываются в пределах первых 500 п.н. кодирующей последовательности в 3'-области относительно исходного кодона, и хорошая ортогональность не требуется. Здесь предполагается, что нацеливающий домен гибридизуется с доменом-мишенью путем комплементарного спаривания оснований. Любой из нацеливающих доменов в таблице можно использовать с молекулой N. meningitidis Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9). В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы N. meningitidis Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи, при условии, что две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н.

[0624] В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень (домен-мишень) находится в или вблизи локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, например, в любой части кодирующей последовательности TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, представленной в SEQ ID NO: 348, 349 и 1047, соответственно. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень, комплементарная нацеливающему домену, расположена в ранней кодирующей области представляющего интерес гена, такого как TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. Нацеливание на раннюю кодирующую область может быть использовано для нокаутирования (то есть устранения экспрессии) представляющего интерес гена. В некоторых вариантах осуществления ранняя кодирующая область представляющего интерес гена включает в себя последовательность, следующую непосредственно за стартовым кодоном (например, ATG), или в пределах 500 п.н. стартового кодона (например, менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250). 200, 150, 100, 50 п.н., 40 п.н., 30 п.н., 20 п.н. или 10 п.н.). В конкретных примерах нуклеиновая кислота-мишень находится в пределах 200 п.н., 150 п.н., 100 п.н., 50 п.н., 40 п.н., 30 п.н., 20 п.н. или 10 п.н. относительно стартового кодона. В некоторых примерах нацеливающий домен гРНК комплементарен, например, по меньшей мере, на 80, 85, 90, 95, 98 или 99%, например, полностью комплементарен последовательности-мишени на нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота-мишень в локусах TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

[0625] В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в или в непосредственной близости от начала кодирующей области (например, в ранней кодирующей оласти, например, в пределах 500 п.н. от стартового кодона или оставшейся кодирующей последовательности, например в 3'-области первых 500 п.н. от стартового кодона). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в ранней кодирующей области представляющего интерес гена, например TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, включая последовательность, следующую непосредственно за сайтом старта транскрипции, в пределах первого экзона кодирующей последовательности или в пределах 500 п.н. от сайта старта транскрипции (например, менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.) или в пределах 500 п.н. от старт-кодона (например, менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.).

[0626] В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень находится в экзоне эндогенного локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень находится в интроне эндогенного локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых аспектах сайт-мишень находится в регуляторном или контрольном элементе, например, промоторе, 5 'нетранслируемой области (UTR) или 3' UTR, локусе TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень находится в открытой рамке считывания эндогенного локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В конкретных вариантах осуществления сайт-мишень находится в пределах экзона в открытой рамке считывания локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

[0627] В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в области или внутри открытой рамки считывания интересующего гена или локуса, например, TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию в области или внутри интрона в открытой рамке считывания гена или локуса, представляющего интерес. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение подвергается направленному воздействию внутри экзона в открытой рамке считывания гена или локуса, представляющего интерес.

[0628] В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в области интрона или внутри него. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в области экзона или внутри него. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию в области или внутри экзона представляющего интерес гена, например TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

[0629] В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию внутри экзона гена TRAC, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение происходит внутри первого экзона, второго экзона, третьего экзона или четвертого экзона гена TRAC, открытой рамки считывания или локуса. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение находится в первом экзоне гена TRAC, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится внутри 500 пар оснований (п.н.) в 3'-области от 5'-конца первого экзона в гене TRAC, открытой рамке считывания или локусе. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение находится между крайним 5'-нуклеотидом экзона 1 и в 5'-области от крайнего 3'-нуклеотида экзона 1. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится в пределах 400 п.н., 350 п.н., 300 п.н., 250 п.н., 200 п.н., 150 п.н., 100 п.н. или 50 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона в гене TRAC, открытой рамки считывания или локуса. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение находится от 1 п.н. до 400 п.н., от 50 до 300 п.н., от 100 до 200 п.н. или от 100 до 150 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона в гене TRAC, открытой рамке считывания, или локусе, каждое включительно. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится в области между 100 п.н. и 150 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона в гене TRAC, открытой рамке считывания или локусе, включительно.

[0630] В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение, например разрыв ДНК, подвергается направленному воздействию внутри экзона гена TRBC, открытой рамки считывания или локуса, например TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится внутри первого экзона, второго экзона, третьего экзона или четвертого экзона гена TRBC1 и/или TRBC2, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится внутри первого экзоне гена TRBC1 и/или гена TRBC2, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится внутри первого экзона, второго экзона, третьего экзона или четвертого экзона гена TRBC1 и/или TRBC2, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится между крайним 5'-нуклеотидом экзона 1 и в 5'-области от крайнего 3'-нуклеотида экзона 1. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение находится в первом экзоне гена TRBC, открытой рамки считывания или локуса. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится в пределах 400 п.н., 350 п.н., 300 п.н., 250 п.н., 200 п.н., 150 п.н., 100 п.н. или 50 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона гена TRBC1 и/или TRBC2, открытой рамки считывания или локуса. В конкретных вариантах осуществления генетическое нарушение составляет от 1 до 400 п.н., от 50 до 300 п.н., от 100 до 200 п.н. или от 100 до 150 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона гена TRBC1 и/или TRBC2, открытой рамки считывания или локуса, каждый включительно. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение находится между 100 п.н. и 150 п.н. в 3'-области от 5'-конца первого экзона в гене TRBC1 и/или TRBC2, в открытой рамке считывания или локусе, включительно.

[0631] В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен для нокаута или нокдауна TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 представляет собой или содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1048, 1053, 1229-1315.

[0632] Иллюстративные нацеливающие домены, содержащиеся в гРНК для нацеливания на генетическое нарушение человеческого TRAC, TRBC1 или TRBC2, включают в себя те, которые описаны, например, в WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, US2016/272999 и US2015/056705 или нацеливающий домен, который может связываться с нацеливающими последовательностями, описанными выше. Иллюстративные нацеливающие домены, содержащиеся в гРНК, для нацеливания на генетическое нарушение локуса TRAC человека с использованием нуклеазы Cas9, такой как S. pyogenes или S. aureus Cas9, могут включать любые из доменов, прдставленных в Таблице 16 ниже.

Таблица 16 Иллюстративные последовательности нацеливающего домена гРНК TRAC

Название гРНК Нацеливающий домен Виды Cas9 SEQ ID NO: TRAC-10 UCUCUCAGCUGGUACACGGC S. pyogenes 1229 TRAC-110 UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC S. pyogenes 1230 TRAC-116 ACACGGCAGGGUCAGGGUUC S. pyogenes 1231 TRAC-16 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU S. pyogenes 1048 TRAC-4 GCUGGUACACGGCAGGGUCA S. pyogenes 1232 TRAC-49 CUCAGCUGGUACACGGC S. pyogenes 1233 TRAC-2 UGGUACACGGCAGGGUC S. pyogenes 1234 TRAC-30 GCUAGACAUGAGGUCUA S. pyogenes 1235 TRAC-43 GUCAGAUUUGUUGCUCC S. pyogenes 1236 TRAC-23 UCAGCUGGUACACGGCA S. pyogenes 1237 TRAC-34 GCAGACAGACUUGUCAC S. pyogenes 1238 TRAC-25 GGUACACGGCAGGGUCA S. pyogenes 1239 TRAC-128 CUUCAAGAGCAACAGUGCUG S. pyogenes 1240 TRAC-105 AGAGCAACAGUGCUGUGGCC S. pyogenes 1241 TRAC-106 AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC S. pyogenes 1242 TRAC-123 ACAAAACUGUGCUAGACAUG S. pyogenes 1243 TRAC-64 AAACUGUGCUAGACAUG S. pyogenes 1244 TRAC-97 UGUGCUAGACAUGAGGUCUA S. pyogenes 1245 TRAC-148 GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC S. aureus 1246 TRAC-147 GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC S. aureus 1247 TRAC-234 GGGGAAGAAGGUGUCUUC S. aureus 1248 TRAC-167 GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU S. aureus 1249 TRAC-177 GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU S. aureus 1250 TRAC-176 GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU S. aureus 1251 TRAC-257 GACAGACUUGUCACUGGAUU S. aureus 1252 TRAC-233 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA S. aureus 1253 TRAC-231 GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA S. aureus 1254 TRAC-163 GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG S. aureus 1255 TRAC-241 GUCUCUCAGCUGGUACACGG S. aureus 1256 TRAC-179 GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU S. aureus 1257 TRAC-178 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU S. aureus 1258

[0633] Иллюстративные нацеливающие домены, содержащиеся в гРНК, для нацеливания на генетическое нарушение локуса TRBC1 или TRBC2 человека с использованием нуклеазы Cas9, такой как S. pyogenes или S. aureus Cas9, могут включать любые из доменов, представленных в Таблице 17 ниже.

Таблица 17 Иллюстративные последовательности нацеливающих доменов гРНК TRBC1 или TRBC2

Название гРНК Нацеливающий домен Виды Cas9 SEQ ID NO: TRBC-40 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG S. pyogenes 1259 TRBC-52 CAAACACAGCGACCUCGGGU S. pyogenes 1260 TRBC-25 UGACGAGUGGACCCAGGAUA S. pyogenes 1261 TRBC-35 GGCUCUCGGAGAAUGACGAG S. pyogenes 1262 TRBC-50 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU S. pyogenes 1053 TRBC-39 GAAAAACGUGUUCCCACCCG S. pyogenes 1263 TRBC-49 AUGACGAGUGGACCCAGGAU S. pyogenes 1264 TRBC-51 AGUCCAGUUCUACGGGCUCU S. pyogenes 1265 TRBC-26 CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA S. pyogenes 1266 TRBC-47 AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG S. pyogenes 1267 TRBC-45 UCAAACACAGCGACCUCGGG S. pyogenes 1268 TRBC-34 CGUAGAACUGGACUUGACAG S. pyogenes 1269 TRBC-227 AGGCCUCGGCGCUGACGAUC S. pyogenes 1270 TRBC-41 UGACAGCGGAAGUGGUUGCG S. pyogenes 1271 TRBC-30 UUGACAGCGGAAGUGGUUGC S. pyogenes 1272 TRBC-206 UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC S. pyogenes 1273 TRBC-32 CGGGUGGGAACACGUUUUUC S. pyogenes 1274 TRBC-276 GACAGGUUUGGCCCUAUCCU S. pyogenes 1275 TRBC-274 GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU S. pyogenes 1276 TRBC-230 GGCUCAAACACAGCGACCUC S. pyogenes 1277 TRBC-235 UGAGGGUCUCGGCCACCUUC S. pyogenes 1278 TRBC-38 AGGCUUCUACCCCGACCACG S. pyogenes 1279 TRBC-223 CCGACCACGUGGAGCUGAGC S. pyogenes 1280 TRBC-221 UGACAGGUUUGGCCCUAUCC S. pyogenes 1281 TRBC-48 CUUGACAGCGGAAGUGGUUG S. pyogenes 1282 TRBC-216 AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC S. pyogenes 1283 TRBC-210 GCGCUGACGAUCUGGGUGAC S. pyogenes 1284 TRBC-268 UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG S. pyogenes 1285 TRBC-193 GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA S. pyogenes 1286 TRBC-246 AGCUCAGCUCCACGUGGUCG S. pyogenes 1287 TRBC-228 GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC S. pyogenes 1288 TRBC-43 GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG S. pyogenes 1289 TRBC-272 UGGCUCAAACACAGCGACCU S. pyogenes 1290 TRBC-33 ACUGGACUUGACAGCGGAAG S. pyogenes 1291 TRBC-44 GACAGCGGAAGUGGUUGCGG S. pyogenes 1292 TRBC-211 GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC S. pyogenes 1293 TRBC-253 GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG S. pyogenes 1294 TRBC-18 CUCGGCGCUGACGAUCU S. pyogenes 1295 TRBC-6 CCUCGGCGCUGACGAUC S. pyogenes 1296 TRBC-85 CCGAGAGCCCGUAGAAC S. pyogenes 1297 TRBC-129 CCAGAUCGUCAGCGCCG S. pyogenes 1298 TRBC-93 GAAUGACGAGUGGACCC S. pyogenes 1299 TRBC-415 GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC S. aureus 1300 TRBC-414 GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC S. aureus 1301 TRBC-310 GUGACAGGUUUGGCCCUAUC S. aureus 1302 TRBC-308 GACAGGUUUGGCCCUAUC S. aureus 1303 TRBC-401 GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU S. aureus 1304 TRBC-468 GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG S. aureus 1305 TRBC-462 GUGGAGCUGAGCUGGUGG S. aureus 1306 TRBC-424 GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1307 TRBC-423 GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1308 TRBC-422 GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1309 TRBC-420 GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1310 TRBC-419 GGCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1311 TRBC-418 GCUGCUCCUUGAGGGGCU S. aureus 1312 TRBC-445 GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG S. aureus 1313 TRBC-444 GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG S. aureus 1314 TRBC-442 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG S. aureus 1315

[0634] В некоторых вариантах осуществления гРНК для нацеливания на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 может быть любой, которая описана в данном документе, или описана в другом месте, например, в WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, US2016/272999 и US2015/056705, или нацеливающий домен, который может связываться с нацеливающими последовательностями, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления последовательность, на которую нацелена гРНК CRISPR/Cas9 в локусе гена TRAC, представляет собой GAGAATCAAAATCGGTGAAT (SEQ ID NO: 1348) или ATTCACCGATTTTGATTCTC (SEQ ID NO: 1182). В некоторых вариантах осуществления последовательность, на которую нацелена гРНК CRISPR/Cas9 в локусах гена TRBC1 и/или TRBC2, представляет собой GGCCTCGGCGCTGACGATCT (SEQ ID NO: 1349) или AGATCGTCAGCGCCGAGGCC (SEQ ID NO: 1054). В некоторых вариантах осуществления последовательность нацеливающего домена гРНК для нацеливания на сайт-мишень в локусе гена TRAC представляет собой GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO: 1048). В некоторых вариантах осуществления последовательность нацеливающего домена гРНК для нацеливания на сайт-мишень в локусах гена TRBC1 и/или TRBC2 представляет собой GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO: 1053).

[0635] В некоторых вариантах осуществления гРНК для нацеливания на локус гена TRAC может быть получена in vitro транскрипцией последовательности AGCGCTCTCGTACAGAGTTGGCATTATAATACGACTCACTATAGGGGAGAATCAAAATCGGTGAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT (представленной в SEQ ID NO: 1350; выделена жирным шрифтом и подчеркнута часть, комплементарная сайту-мишени в локусе TRAC), или химически синтезирована, где гРНК имеет последовательность 5'- GAG AAU CAA AAU CGG UGA AUG UUU UAG AGC UAG AAA UAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3 '(представленную в SEQ ID NO: 1351, см. Osborn et al., Mol Ther. 24 (3): 570-581 (2016). Другие иллюстративные последовательности гРНК или нацеливающие домены, содержащиеся в гРНК, и/или другие способы редактирования генов и/или нокаут, нацеленные на эндогенные гены TCR, например гены TRAC и/или TRBC, включают любые, описанные, например, в публикациях США № US2011/0158957, US2014/0301990, US2015/0098954, US2016/0208243; US2016/272999 и US2015/056705; Международной публикации PCT №. WO2014/191128, WO2015/136001, WO2015/161276, WO2016/069283, WO2016/016341, WO2017/193107 и WO2017/093969; и в Osborn et al. (2016) Mol. Ther. 24 (3): 570-581. Любой из известных способов может быть использован для генерации расщепления эндогенных генов, кодирующих домены или области TCR, и может быть использован в вариантах осуществления, предложенных в настоящем описании, например, для конструирования в клеточных линиях и/или в первичных Т-клетках.

[0636] В некоторых вариантах осуществления нацеливающие домены включают домены для нокаутирования генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 с использованием S. pyogenes Cas9, S. aureus Cas9 или с использованием N. meningitidis Cas9.

[0637] В некоторых вариантах осуществления нацеливающие домены включают домены для нокаутирования генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 с использованием S. pyogenes Cas9. Любой из нацеливающих доменов можно использовать с молекулой S. pyogenes Cas9, которая генерирует двухцепочечный разрыв (нуклеаза Cas9) или одноцепочечный разрыв (никаза Cas9).

[0638] В одном варианте осуществления двойное нацеливание используется для создания двух одноцепочечных разрывов на противоположных цепях ДНК с использованием никазы S. pyogenes Cas9 с двумя нацеливающими доменами, которые комплементарны противоположным цепям ДНК, например, гРНК, содержащая любой нацеливающий домен минус-цепи, может быть спарена с любой гРНК, содержащей нацеливающий домен плюс-цепи. В некоторых вариантах осуществления две гРНК ориентированы на ДНК так, что PAM обращены наружу, а расстояние между 5'-концами гРНК составляет 0-50 п.н. В одном варианте осуществления две гРНК используются для нацеливания двух нуклеаз Cas9 или двух никаз Cas9, например, с использованием пары комплекса молекулы Cas9/молекулы гРНК, направляемой двумя различными молекулами гРНК, для расщепления домена-мишени с двумя одноцепочечными разрывами на противоположных цепях домена-мишени. В некоторых вариантах осуществления две никазы Cas9 могут включать молекулу, обладающую активностью HNH, например молекулу Cas9, обладающую инактивированной активностью RuvC, например молекулу Cas9, имеющую мутацию в D10, например мутацию D10A, молекулу, обладающую активностью RuvC, например, молекулу Cas9, обладающую активностью HNH, например молекулу Cas9, имеющую мутацию в H840, например H840A, или молекулу, обладающую активностью RuvC, например молекулу Cas9, обладающую инактивированной активностью HNH, например молекулу Cas9, имеющую мутацию в N863, например, N863A. В некоторых вариантах осуществления каждая из двух гРНК находится в комплексе с никазой D10A Cas9.

(3) Первый домен комплементарности

[0639] На ФИГ. 14A-14G. приведены примеры первых доменов комплементарности. Первый домен комплементарности является комплементарным второму домену комплементарности, описанному ниже, и, как правило, обладает достаточной комплементарностью ко второму домену комплементарности для формирования дуплексной области по меньшей мере при некоторых физиологических условиях. Первый домен комплементарности обычно имеет длину от 5 до 30 нуклеотидов, и может иметь длину от 5 до 25 нуклеотидов, от 7 до 25 нуклеотидов, от 7 до 22 нуклеотидов, от 7 до 18 нуклеотидов или от 7 до 15 нуклеотидов. В различных вариантах осуществления первый домен комплементарности составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов в длину.

[0640] Как правило, первый домен комплементарности не имеет точной комплементарности со вторым целевым доменом комплементарности. В некоторых вариантах осуществления первый домен комплементарности может иметь 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов, которые не комплементарны соответствующему нуклеотиду второго домена комплементарности. Например, сегмент из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 (например, 3) нуклеотидов первого домена комплементарности может не спариваться в дуплексе и может образовывать недуплексную или беспетлевую область. В некоторых случаях неспаренная или беспетлевая область, например, беспетлевая область из 3 нуклеотидов, присутствует во втором домене комплементарности. Эта неспаренная область необязательно начинается с 1, 2, 3, 4, 5 или 6, например 4, нуклеотидов с 5'-конца второго домена комплементарности.

[0641] Первый домен комплементарности может включать в себя 3 субдомена, которые представляют собой в направлении от 5 'к 3': 5'-субдомен, центральный субдомен и 3'-субдомен. В одном варианте осуществления 5'-субдомен имеет длину 4-9, например 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов. В одном варианте осуществления длина центрального субдомена составляет 1, 2 или 3, например, 1 нуклеотид. В одном варианте осуществления 3'-субдомен имеет длину от 3 до 25 нуклеотидов, например 4-22, 4-18 или 4-10, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов.

[0642] В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены комплементарности при образовании дуплекса содержат 11 спаренных нуклеотидов, например, в последовательности гРНК (одна спаренная цепь подчеркнута, одна выделена жирным шрифтом): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1316).

[0643] В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены комплементарности при образовании дуплекса содержат 15 спаренных нуклеотидов, например, в последовательности гРНК (одна спаренная цепь подчеркнута, одна выделена жирным шрифтом): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1317).

[0644] В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены комплементарности при образовании дуплекса содержат 16 спаренных нуклеотидов, например, в последовательности гРНК (одна спаренная цепь подчеркнута, а одна выделена жирным шрифтом): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1318).

[0645] В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены комплементарности при образовании дуплекса содержат 21 спаренных нуклеотидов, например, в последовательности гРНК (одна спаренная цепь подчеркнута, одна выделена жирным шрифтом): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 1319).

[0646] В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды заменяются для удаления поли-U-трактов, например, в последовательностях гРНК (замененные нуклеотиды подчеркнуты): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1320); NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1321); и NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAUGCUGUAUUGGAAACAAUACAGCAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:1322).

[0647] Первый домен комплементарности может иметь гомологию или быть получен из природного первого домена комплементарности. В одном варианте осуществления он имеет, по меньшей мере, 50% гомологии с первым доменом комплементарности, раскрытым в настоящем описании, например, с первым доменом комплементарности S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis или S. thermophilus.

[0648] Следует отметить, что один или более или даже все нуклеотиды первого домена комплементарности могут иметь модификацию в соответствии с обсуждаемым выше для нацеливающего домена.

(4) Связывающий домен

[0649] На ФИГ. 14A-14G приведены примеры связывающих доменов.

[0650] В мономолекулярной или химерной гРНК связывающий домен служит для связывания первого домена комплементарности со вторым доменом комплементарности мономолекулярной гРНК. Связывающий домен может связывать первый и второй домены комплементарности ковалентно или нековалентно. В одном варианте осуществления связь является ковалентной. В одном варианте осуществления связывающий домен ковалентно связывает первый и второй домены комплементарности, см., например, ФИГ. 14B-14E. В одном варианте осуществления связывающий домен представляет собой или содержит ковалентную связь, расположенную между первым доменом комплементарности и вторым доменом комплементарности. Обычно связывающий домен содержит один или более, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, но в различных вариантах осуществления линкер может содержать 20, 30, 40, 50 или даже 100 нуклеотидов в длину.

[0651] В модульных молекулах гРНК эти две молекулы ассоциированы в результате гибридизации доменов комплементарности, и связывающий домен может отсутствовать. Смотрите, например, ФИГ. 14А.

[0652] Широкий спектр связывающих доменов подходит для использования в мономолекулярных молекулах гРНК. Связывающие домены могут состоять из ковалентной связи или быть такими короткими, как один или более нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов в длину. В одном варианте осуществления связывающий домен имеет длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 или более нуклеотидов. В одном варианте осуществления длина связывающего домена составляет от 2 до 50, от 2 до 40, от 2 до 30, от 2 до 20, от 2 до 10 или от 2 до 5 нуклеотидов. В одном варианте осуществления связывающий домен гомологичен или происходит из встречающейся в природе последовательности, например, последовательности tracrРНК, которая находится в 5'-области относительно второго домена комплементарности. В одном варианте осуществления связывающий домен имеет по меньшей мере 50% гомологию со связывающим доменом, раскрытым в настоящем описании.

[0653] Как обсуждалось выше в связи с первым доменом комплементарности, некоторые или все нуклеотиды связывающего домена могут включать модификацию.

(5) 5'-Домен удлинения

[0654] В некоторых случаях модульная гРНК может содержать дополнительную последовательность в 5'-области относительно второго домена комплементарности, называемую здесь как 5'-домен удлинения, см., например, ABU. 14А. В одном варианте осуществления 5'-домен удлинения имеет длину 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5 или 2-4 нуклеотида. В одном варианте осуществления 5'-домен удлинения имеет длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более нуклеотидов.

(6) Второй домен комплементарности

[0655] На ФИГ. 14А-14G приведены примеры вторых доменов комплементарности. Второй домен комплементарности является комплементарным первому домену комплементарности и, как правило, обладает достаточной комплементарностью ко второму домену комплементарности для формирования дуплексной области по меньшей мере при некоторых физиологических условиях. В некоторых случаях, например, как показано на ФИГ. 14A-14B, второй домен комплементарности может включать в себя последовательность, в которой отсутствует комплементарность с первым доменом комплементарности, например последовательность, которая не образует петли в дуплексной области.

[0656] Второй домен комплементарности может иметь длину от 5 до 27 нуклеотидов, а в некоторых случаях может быть длиннее, чем первая область комплементарности. Например, второй комплементарный домен может иметь длину от 7 до 27 нуклеотидов, длину от 7 до 25 нуклеотидов, длину от 7 до 20 нуклеотидов или длину от 7 до 17 нуклеотидов. В более общем случае, комплементарный домен может составлять 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов в длину.

[0657] В одном варианте осуществления второй домен комплементарности содержит 3 субдомена, которые в направлении от 5' к 3' представляют собой: 5'-субдомен, центральный субдомен и 3'-субдомен. В одном варианте осуществления 5'-субдомен составляет от 3 до 25, например, от 4 до 22, от 4 до 18, или от 4 до 10, или от 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов в длину. В одном варианте осуществления длина центрального субдомена составляет 1, 2, 3, 4 или 5, например 3 нуклеотида. В одном варианте осуществления 3'-субдомен имеет длину от 4 до 9, например, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов.

[0658] В одном варианте осуществления 5'-субдомен и 3'-субдомен первого домена комплементарности, соответственно, являются комплементарными, например полностью комплементарными, с 3'-субдоменом и 5'-субдоменом второго домена комплементарности.

[0659] Второй домен комплементарности может быть гомологичен или может быть получен из встречающегося в природе второго домена комплементарности. В одном варианте осуществления он имеет по меньшей мере 50% гомологию со вторым доменом комплементарности, раскрытым в настоящем описании, например, с первым доменом комплементарности S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis или S. thermophilus.

[0660] Некоторые или все нуклеотиды второго домена комплементарности могут иметь модификацию, например модификацию, раскрытую в разделе VIII настоящего описания.

(7) Проксимальный домен

[0661] На ФИГ. 14А-14G приведены примеры проксимальных доменов.

[0662] В одном варианте осуществления проксимальный домен имеет длину от 5 до 20 нуклеотидов. В одном варианте осуществления проксимальный домен может иметь гомологию с природным проксимальным доменом или может быть получен из него. В одном варианте осуществления он имеет, по меньшей мере, 50% гомологии с проксимальным доменом, раскрытым в настоящем описании, например, с проксимальным доменом S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis или S. thermophilus.

[0663] Некоторые или все нуклеотиды проксимального домена могут иметь модификацию в соответствии с описанным выше.

(8) Хвостовой домен

[0664] На ФИГ. 14А-14G приведены примеры хвостовых доменов.

[0665] Как видно из осмотра хвостовых доменов на ФИГ. 14А и ФИГ. 14B-14F, широкий спектр хвостовых доменов подходит для использования в молекулах гРНК. В различных вариантах осуществления хвостовой домен имеет длину 0 (отсутствует), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды хвостового домена получены из или являются гомологичными последовательности из 5'-конца природного хвостового домена, см., например, ФИГ. 14D или 14E. Хвостовой домен также необязательно включает последовательности, которые комплементарны друг другу и которые, по меньшей мере, в некоторых физиологических условиях образуют дуплексную область.

[0666] Хвостовые домены могут иметь гомологию с природными проксимальными хвостовыми доменами или могут быть получены из них. В качестве неограничивающего примера, данный хвостовой домен в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения может иметь по меньшей мере 50% гомологии с встречающимся в природе хвостовым доменом, раскрытым в настоящем описании, например, с хвостовым доменом S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis. или S. thermophilus.

[0667] В некоторых случаях хвостовой домен включает нуклеотиды на 3'-конце, которые связаны с методом in vitro или in vivo транскрипции. Когда промотор Т7 используется для in vitro транскрипции гРНК, этими нуклеотидами могут быть любые нуклеотиды, присутствующие до 3'-конца ДНК-матрицы. Когда промотор U6 используется для in vivo транскрипции, эти нуклеотиды могут представлять собой последовательность UUUUUU. Когда используются альтернативные промоторы pol-III, эти нуклеотиды могут представлять собой различное количество или основания урацила или могут включать альтернативные основания.

[0668] В качестве неограничивающего примера в различных вариантах осуществления проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, включают следующие последовательности:

AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (SEQ ID NO: 1323), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC (SEQ ID NO: 1324), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAUC (SEQ ID NO: 1325), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG (SEQ ID NO: 1326), AAGGCUAGUCCGUUAUCA (SEQ ID NO: 1327), или AAGGCUAGUCCG (SEQ ID NO: 1328).

[0669] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит 3'-последовательность UUUUUU, например, если для транскрипции используется промотор U6.

[0670] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит 3'-последовательность UUUU, например, если для транскрипции используется промотор H1.

[0671] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит переменное количество 3'-U в зависимости, например, от сигнала терминации используемого промотора pol-III.

[0672] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит вариабельную 3'-последовательность, полученную из ДНК-матрицы, если используется промотор T7.

[0673] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит вариабельную 3'-последовательность, полученную из ДНК-матрицы, например, если используется в in vitro транскрипции для генерирования молекулы РНК.

[0674] В одном варианте осуществления хвостовой домен содержит вариабельную 3'-последовательность, полученную из ДНК-матрицы, например, если для управления транскрипцией используется промотор pol-II.

[0675] В одном варианте осуществления гРНК имеет следующую структуру:

5'[нацеливающий домен] - [первый домен комплементарности] - [связывающий домен] - [второй домен комплементарности] - [проксимальный домен] - [хвостовой домен] -3'

где нацеливающий домен содержит коровый домен и, необязательно, вторичный домен, и имеет длину от 10 до 50 нуклеотидов, первый домен комплементарности имеет длину от 5 до 25 нуклеотидов и, в одном варианте осуществления, имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% гомологии с эталонным первым доменом комплементарности, раскрытым в настоящем описании, связывающий домен имеет длину от 1 до 5 нуклеотидов;

проксимальный домен имеет длину от 5 до 20 нуклеотидов и в одном варианте осуществления имеет гомологию по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% с раскрытым в настоящем описании эталонным проксимальным доменом; и

хвостовой домен отсутствует или нуклеотидная последовательность имеет длину от 1 до 50 нуклеотидов и в одном варианте осуществления имеет гомологию по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% с раскрытым в настоящем описании эталонным хвостовым доменом.

(9) Иллюстративные химерные гРНК

[0676] В одном из вариантов осуществления мономолекулярная или химерная гРНК содержит, предпочтительно от 5' к 3': нацеливающий домен, например, содержащий 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, или 26 нуклеотидов (которые комплементарны нуклеиновой кислоте-мишени); первый домен комплементарности; связывающий домен; второй домен комплементарности (который комплементарен первому домену комплементарности); проксимальный домен; и хвостовой домен, где (а) проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида; (b) имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности; или (c) имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, который комплементарен его соответствующему нуклеотиду первого домена комплементарности.

[0677] В одном варианте осуществления последовательность из (а), (b) или (с) имеет по меньшей мере 60, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% гомологии с соответствующей последовательностью встречающейся в природе гРНК, или с гРНК, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида. В одном варианте осуществления имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности. [0684] В одном варианте осуществления имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, который комплементарен его соответствующему нуклеотиду первого домена комплементарности. В одном варианте осуществления нацеливающий домен содержит, имеет или состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов (например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 последовательных нуклеотидов), имеющих комплементарность с доменом-мишенью, например, нацеливающий домен составляет 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов в длину.

[0678] В одном варианте осуществления мономолекулярная или химерная молекула гРНК (содержащая нацеливающий домен, первый комплементарный домен, связывающий домен, второй комплементарный домен, проксимальный домен и, необязательно, хвостовой домен) содержит следующую последовательность, в которой нацеливающий домен обозначен как 20 N, но может быть любой последовательностью и длиной от 16 до 26 нуклеотидов, в которой за последовательностью гРНК следует 6 U, которые служат в качестве сигнала терминации для промотора U6, но которые могут отсутствовать или их может быть меньше: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (SEQ ID NO 1329). В одном варианте осуществления мономолекулярная или химерная молекула гРНК представляет собой молекулу гРНК S. pyogenes.

[0679] В некоторых вариантах осуществления мономолекулярная или химерная молекула гРНК (содержащая нацеливающий домен, первый комплементарный домен, связывающий домен, второй комплементарный домен, проксимальный домен и, необязательно, хвостовой домен) содержит следующую последовательность, в которой нацеливающий домен обозначен как 20 N, но может быть любой последовательностью и длиной от 16 до 26 нуклеотидов, в которой за последовательностью гРНК следуют 6 U, которые служат в качестве сигнала терминации для промотора U6, но которые могут отсутствовать или их может быть меньше: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGCAGAGUUUUUUUU (SEQ ID NO: 1330). В одном варианте осуществления мономолекулярная или химерная молекула гРНК представляет собой молекулу гРНК S. aureus.

[0680] В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен в иллюстративной химерной гРНК представляет собой или содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1048, 1053, 1229-1315. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен в иллюстративной химерной гРНК представляет собой или содержит последовательность, выбранную из любой из представленных в Таблице 16 или 17.

[0681] Последовательности и структуры иллюстративных химерных гРНК также показаны на ФИГ. 14А-14В.

(10) Иллюстративные Модульные гРНК

[0682] В одном варианте осуществления модульная гРНК содержит первую и вторую цепи. Первая цепь содержит, предпочтительно, от 5' к 3'; нацеливающий домен, например, содержащий 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов; первый домен комплементарности. Вторая цепь содержит, предпочтительно от 5' к 3': необязательно 5'-домен удлинения; второй домен комплементарности; проксимальный домен; и хвостовой домен, где: (а) проксимальный и хвостовой домен, взятые вместе, содержат по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида; (b) имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности; или (c) имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, который комплементарен его соответствующему нуклеотиду первого домена комплементарности.

[0683] В одном варианте осуществления последовательность из (а), (b) или (с) имеет по меньшей мере 60, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% гомологии с соответствующей последовательностью встречающейся в природе гРНК, или с гРНК, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида. В одном варианте осуществления имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности.

[0684] В одном варианте осуществления имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области относительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, который комплементарен его соответствующему нуклеотиду первого домена комплементарности.

[0685] В одном варианте осуществления нацеливающий домен имеет или состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов (например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 последовательных нуклеотидов), имеющих комплементарность с доменом-мишенью, например, нацеливающий домен имеет длину 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов.

[0686] В некоторых вариантах осуществления домен-мишень в иллюстративной модульной гРНК представляет собой или содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1048, 1053, 1229-1315. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен в иллюстративной химерной гРНК представляет собой или содержит последовательность, выбранную из любой из представленных в Таблице 16 или 17.

b) Cas9

[0687] Молекулы Cas9 различных видов можно использовать в способах и композициях, описанных в настоящем документе. В то время как молекулы Cas9 S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis и S. thermophilus являются предметом большей части раскрытия настоящего описания, молекулы Cas9, полученные из или основанные на белках Cas9 других видов, перечисленных в настоящем описании, также могут быть использованы. Другими словами, хотя в большей части настоящего описания используются молекулы Cas9 S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis и S. thermophilus, молекулы Cas9 из других видов могут их заменить. Такие виды включают в себя: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., или Verminephrobacter eiseniae.

[0688] Молекула Cas9 или полипептид Cas9, как этот термин используется в настоящем описании, относится к молекуле или полипептиду, которые могут взаимодействовать с молекулой гРНК и, совместно с молекулой гРНК, располагается или локализуется в сайте, который содержит домен-мишень и PAM-последовательность. Молекула Cas9 и полипептид Cas9, как эти термины используются в настоящем описании, относятся к встречающимся в природе молекулам Cas9 и к сконструированным, измененным или модифицированным молекулам Cas9 или полипептидам Cas9, которые отличаются, например, по меньшей мере одним аминокислотным остатком, от эталонной последовательности, например, от наиболее сходной встречающейся в природе молекулы Cas9 или последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 1331-1336, 1338, 1340 и 1341.

(1) Cas9 Домены

[0689] Кристаллические структуры были определены для двух различных встречающихся в природе бактериальных молекул Cas9 (Jinek et al., Science, 343 (6176): 1247997, 2014) и для Cas9 S. pyogenes с гид-РНК (например, синтетическое слияние crРНК и tracrРНК).) (Nishimasu et al., Cell, 156: 935-949, 2014; и Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579).

[0690] Встречающаяся в природе молекула Cas9 состоит из двух долей: доли распознавания (REC) и доли нуклеазы (NUC); каждая из которых дополнительно содержит домены, описанные в настоящем документе. Номенклатура доменов и нумерация аминокислотных остатков, охватываемых каждым доменом, используемым в этом раскрытии, являются такими, как описано в Nishimasu et al. Нумерация аминокислотных остатков относится к Cas9 из S. pyogenes.

[0691] Доля REC содержит богатую аргинином мостиковую спираль (BH), домен REC1 и домен REC2. Доля REC не имеет структурного сходства с другими известными белками, что указывает на то, что это специфический для Cas9 функциональный домен. Домен BH представляет собой длинную α-спиральную и богатую аргинином область, и содержит аминокислоты 60-93 последовательности Cas9 S. pyogenes. Домен REC1 важен для распознавания дуплекса повтор:антиповтр, например, гРНК или tracrРНК, и поэтому является критическим для активности Cas9 путем распознавания последовательности-мишени. Домен REC1 содержит два мотива REC1 в аминокислотах от 94 до 179 и от 308 до 717 последовательности Cas9 S. pyogenes. Эти два домена REC1, хотя и разделены доменом REC2 в линейной первичной структуре, собираются в третичную структуру, образуя домен REC1. Домен REC2 или его части также могут играть роль в распознавании дуплексов повтор:антиповтор. Домен REC2 содержит аминокислоты 180-307 последовательности Cas9 S. pyogenes.

[0692] Доля NUC содержит домен RuvC (также называемый в настоящем описании как RuvC-подобный домен), домен HNH (также называемый в настоящем описании как HNH-подобный домен) и PAM-взаимодействующий (PI) домен. Домен RuvC имеет структурное сходство с членами суперсемейства ретровирусных интеграз и расщепляет одну цепь, например некомплементарную цепь молекулы нуклеиновой кислоты-мишени. Домен RuvC собран из трех расщепленных мотивов RuvC (RuvC I, RuvCII и RuvCIII, которые часто обозначают в данной области доменом RuvCI или N-концевым доменом RuvC, доменом RuvCII и доменом RuvCIII) в аминокислотах 1-59, 718-769 и 909-1098, соответственно, последовательности Cas9 S. pyogenes. Подобно домену REC1, три мотива RuvC линейно разделены другими доменами в первичной структуре, однако в третичной структуре три мотива RuvC собираются и образуют домен RuvC. Домен HNH имеет структурное сходство с эндонуклеазами HNH и расщепляет одну цепь, например, комплементарную цепь молекулы нуклеиновой кислоты-мишени. Домен HNH находится между мотивами RuvC II-III и содержит аминокислоты 775-908 последовательности Cas9 S. pyogenes. Домен PI взаимодействует с PAM молекулы нуклеиновой кислоты-мишени и содержит аминокислоты 1099-1368 последовательности Cas9 S. pyogenes.

(a) RuvC-подобный домен и HNH-подобный домен

[0693] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат HNH-подобный домен и RuvC-подобный домен. В одном варианте осуществления активность расщепления зависит от RuvC-подобного домена и HNH-подобного домена. Молекула Cas9 или полипептид Cas9, например, молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, могут содержать один или более из следующих доменов: RuvC-подобный домен и HNH-подобный домен. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, а молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат RuvC-подобный домен, например, RuvC-подобный домен, описанный ниже, и/или HNH-подобный домен, например, HNH-подобный домен, описанный ниже.

(b) RuvC-подобные домены

[0694] В одном варианте осуществления RuvC-подобный домен расщепляет одну цепь, например некомплементарную цепь молекулы нуклеиновой кислоты-мишени. Молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут включать более чем один RuvC-подобный домен (например, один, два, три или более RuvC-подобных домена). В одном варианте осуществления RuvC-подобный домен имеет длину по меньшей мере 5, 6, 7, 8 аминокислот, но не более чем 20, 19, 18, 17, 16 или 15 аминокислот. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат N-концевой RuvC-подобный домен, составляющий примерно 10-20 аминокислот, например, примерно 15 аминокислот в длину.

(c) N-концевые RuvC-подобные домены

[0695] Некоторые встречающиеся в природе молекулы Cas9 содержат более чем один RuvC-подобный домен, причем расщепление зависит от N-концевого RuvC-подобного домена. Соответственно, молекулы Cas9 или полипептид Cas9 могут содержать N-концевой RuvC-подобный домен.

(d) Дополнительные RuvC-подобные домены

[0696] В дополнение к N-концевому RuvC-подобному домену молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, могут содержать один или более дополнительных RuvC-подобных доменов. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут содержать два дополнительных RuvC-подобных домена. Предпочтительно дополнительный RuvC-подобный домен имеет длину, составляющую по меньшей мере 5 аминокислот и, например, менее чем 15 аминокислот, например 5-10 аминокислот, например 8 аминокислот.

(e) HNH-подобные домены

[0697] В одном варианте осуществления HNH-подобный домен расщепляет одноцепочечный комплементарный домен, например, комплементарную цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления HNH-подобный домен имеет длину, составляющую по меньшей мере 15, 20, 25 аминокислот, но не более чем 40, 35 или 30 аминокислот, например, от 20 до 35 аминокислот, например, от 25 до 30 аминокислот. Иллюстративные HNH-подобные домены описаны ниже.

[0698] В одном варианте осуществления HNH-подобный домен является способным к расщеплению.

[0699] В одном варианте осуществления HNH-подобный домен является неспособным к расщеплению.

(2) Активности Cas9

(a) Нуклеазная и хеликазная активности

[0700] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 способны расщеплять молекулу нуклеиновой кислоты-мишени. Обычно молекулы Cas9 дикого типа расщепляют обе цепи молекулы нуклеиновой кислоты-мишени. Молекулы Cas9 и полипептиды Cas9 могут быть сконструированы для изменения нуклеазного расщепления (или других свойств), например, для получения молекулы Cas9 или пептида Cas9, которые представляют собой никазу, или которые не обладают способностью расщеплять нуклеиновую кислоту-мишень. Молекула Cas9 или полипептид Cas9, которые способны расщеплять молекулу нуклеиновой кислоты-мищщени, обозначается в настоящем описании как молекула eaCas9 или полипептид eaCas9.

[0701] В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 включают одну или более из следующих активностей:

активность никазы, то есть способность расщеплять одну цепь, например некомплементарную цепь или комплементарную цепь молекулы нуклеиновой кислоты;

двухцепочечную нуклеазную активность, то есть способность расщеплять обе цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты и создавать двухцепочечный разрыв, что в одном варианте осуществления представляет собой наличие двух никазных активностей;

эндонуклеазную активность;

экзонуклеазную активность; и

хеликазную активность, то есть способность раскручивать спиральную структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

[0702] В одном варианте осуществления ферментативно активная молекула или молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 расщепляют обе цепи и приводят к двухцепочечному разрыву. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 расщепляет только одну цепь, например, цепь, с которой гибридизуется гРНК, или цепь, комплементарную цепи, с которой гибридизуется гРНК. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 обладают активностью расщепления, ассоциированную с HNH-подобным доменом. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 обладают активностью расщепления, связанной с N-концевым RuvC-подобным доменом. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 обладают активностью расщепления, ассоциированную с HNH-подобным доменом, и активностью расщепления, ассоцциированную с N-концевым RuvC-подобным доменом. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат активный или способный к расщеплению HNH-подобный домен и неактивный или неспособный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат неактивный или неспособный к расщеплению HNH-подобный домен и активный или способный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен.

[0703] Некоторые молекулы Cas9 или полипептиды Cas9 обладают способностью взаимодействовать с молекулой гРНК и совместно с молекулой гРНК локализуются в коровом домене-мишени, но неспособны расщеплять нуклеиновую кислоту-мишень или неспособны расщеплять в эффективной степени. Молекулы Cas9, не имеющие или не обладающие существенной активностью расщепления, обозначаются в настоящем описании как молекула eiCas9 или полипептид eiCas9. Например, молекула eiCas9 или полипептид eiCas9 могут не обладать активностью расщепления или иметь существенно меньшую, например, менее 20, 10, 5, 1 или 0,1% активности расщепления эталонной молекулы Cas9 или полипептида eiCas9, как измерено анализом, описанным в настоящем документе.

(b) Нацеливание и PAM

[0704] Молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляет собой полипептид, который может взаимодействовать с молекулой гид-РНК (гРНК) и, совместно с молекулой гРНК, локализуется в сайте, который содержит домен-мишень и последовательность PAM.

[0705] В одном варианте осуществления способность молекулы eaCas9 или полипептида eaCas9 взаимодействовать и расщеплять нуклеиновую кислоту-мишень зависит от последовательности PAM. Последовательность PAM представляет собой последовательность в нуклеиновой кислоте-мишени. В варианте осуществления расщепление нуклеиновой кислоты-мишени происходит в 5'-области от последовательности PAM. Молекулы eaCas9 из разных видов бактерий могут распознавать разные последовательности мотивов (например, последовательности PAM). В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. pyogenes распознает последовательность мотива NGG, NAG, NGA и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. См., например, Mali et al., Science 2013; 339 (6121): 823-826. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. thermophilus распознает последовательность мотива NGGNG и/или NNAGAAW (W=A или T) и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этих последовательностей. См., например, Horvath et al., Science 2010; 327 (5962): 167-170 и Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190 (4): 1390-1400. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. mutans распознает последовательность мотива NGG и/или NAAR (R=A или G)) и направляет расщепление коровой последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. См., например, Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190 (4): 1390-1400. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. aureus распознает последовательность мотива NNGRR (R=A или G) и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. aureus распознает последовательность мотива NNGRRT (R=A или G) и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 S. aureus распознает последовательность мотива NNGRRV (R=A или G) и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 N. meningitidis распознает последовательность мотива NNNNGATT или NNNGCTT (R=A или G, V=A, G или C) и направляет расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени от 1 до 10, например от 3 до 5 пар оснований в 5'-области от этой последовательности. См., например, Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6. Способность молекулы Cas9 распознавать последовательность PAM может быть определена, например, с использованием анализа трансформации, описанного в Jinek et al., Science 2012 337: 816. В вышеупомянутых вариантах осуществления N может представлять собой любой нуклеотидный остаток, например, любой из A, G, C или T.

[0706] Как обсуждается в настоящем описании, молекулы Cas9 могут быть сконструированы для изменения специфичности PAM молекулы Cas9.

[0707] Иллюстративные природные молекулы Cas9 описаны в Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737. Такие молекулы Cas9 включают молекулы Cas9 бактериального семейства кластера 1-78.

[0708] Иллюстративные природные молекулы Cas9 включают молекулу Cas9 бактериального семейства кластера 1. Примеры включают молекулу Cas9: S. pyogenes (например, штамм SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 и SSI-1), S. thermophilus (например, штамм LMD-9), S pseudoporcinus (например, штамм SPIN 20026), S. mutans (например, штамм UA159, NN2025), S. macacae (например, штамм NCTC11558), S. gallolyticus (например, штамм UCN34, ATCC BAA-2069), S. equines (например, штамм ATCC 9812, MGCS 124), S. dysdalactiae (например, штамм GGS 124), S. bovis (например, штамм ATCC 700338), S. anginosus (например, штамм F0211), S. agalactiae (например, штамм NEM316, A909), Listeria monocytogenes (например, штамм F6854), Listeria innocua (L. innocua, например, штамм Clip11262), Enterococcus italicus (например, штамм DSM 15952) или Enterococcus faecium (например, штамм 1,231,408). Другой иллюстративной молекулой Cas9 является молекула Cas9 Neisseria meningitidis (Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6).

[0709] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность:

которая имеет 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии; отличается не более чем на 2, 5, 10 15, 20, 30 или 40% аминокислотных остатков при сравнении;

отличается по меньшей мере на 1, 2, 5, 10 или 20 аминокислот, но не более чем на 100, 80, 70, 60, 50, 40 или 30 аминокислот; или идентична любой последовательности молекулы Cas9, описанной в настоящем документе, или последовательности молекулы Cas9 природного происхождения, например молекулы Cas9 из видов, перечисленных в настоящем описании или описанных в Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6; SEQ ID NO: 1331-1334 (S. mutans (SEQ ID NO:1331); S. pyogenes (SEQ ID NO:1332); S. thermophilus (SEQ ID NO:1333); L. innocua (SEQ ID NO:1334)). В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат одну или более из следующих активностей: активность никазы; активность двухцепочечного расщепления (например, эндонуклеазная и/или экзонуклеазная активность); хеликазная активность; или способность вместе с молекулой гРНК локализоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью.

[0710] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат аминокислотную последовательность консенсусной последовательности ФИГ. 15A-15G, где «*» обозначает любую аминокислоту, присутствующую в соответствующем положении в аминокислотной последовательности молекулы Cas9 S. mutans (SEQ ID NO: 1331); S. pyogenes (SEQ ID NO: 1332); S. thermophilus (SEQ ID NO: 1333); L. innocua (SEQ ID NO: 1334), а «-» обозначает любую аминокислоту. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 отличаются от последовательности консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, по меньшей мере, на 1, но не более чем на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1336 ФИГ. 16A-16C, где «*» обозначает любую аминокислоту, присутствующую в соответствующем положении в аминокислотной последовательности молекулы Cas9 S. pyogenes (SEQ ID NO: 1336) или N. meningitides (SEQ ID NO: 1335), «-» обозначает любую аминокислоту или ее отсутствие. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 отличаются от последовательности SEQ ID NO: 1335 или 1336, раскрытой на ФИГ. 16A-16C по меньшей мере на 1, но не более чем на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков.

[0711] Сравнение последовательности ряда молекул Cas9 показывает, что определенные области являются консервативными. Они идентифицированы ниже как:

область 1 (остатки от 1 до 180, или в случае области 1' остатки от 120 до 180)

область 2 (остатки от 360 до 480);

область 3 (остатки от 660 до 720);

область 4 (остатки от 817 до 900); и

область 5 (остатки от 900 до 960);

[0712] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат области 1-5 вместе с достаточной дополнительной последовательностью молекулы Cas9 для обеспечения биологически активной молекулы, например молекулы Cas9, обладающей по меньшей мере одной активностью, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления каждая из областей 1-6 независимо имеет 50%, 60%, 70% или 80% гомологии с соответствующими остатками молекулы Cas9 или полипептида Cas9, описанными в настоящем документе, например, последовательностью из ФИГ. 15A-15G или из ФИГ. 16A-16C.

[0713] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 1: имеющую 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 1-180 (нумерация соответствует последовательности мотивов на ФИГ. 15A-15G; 52% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 15A-15G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes; которая отличается по меньшей мере на 1, 2, 5, 10 или 20 аминокислот, но не более чем на 90, 80, 70, 60, 50, 40 или 30 аминокислот от аминокислот 1-180 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислотам 1-180 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

[0714] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 1': имеющую 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 120-180 (55% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 15A-15G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; которая отличается по меньшей мере на 1, 2 или 5 аминокислот, но не более чем на 35, 30, 25, 20 или 10 аминокислот от аминокислот 120-180 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислотам 120-180 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

[0715] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 2: имеющую 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 360-480 (52% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 11A-11G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; которая отличается по меньшей мере на 1, 2 или 5 аминокислот, но не более чем на 35, 30 25, 20 или 10 аминокислот от аминокислот 360-480 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислоам 360-480 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

[0716] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 3: имеющую 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 660-720 (56% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 15A-15G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; которая отличается по меньшей мере на 1, 2 или 5 аминокислот, но не более чем на 35, 30, 25, 20 или 10 аминокислот от аминокислот 660-720 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислоам 660-720 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

[0717] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 4: имеющую 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 817-900 (55% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 11A-11G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; которая отличается по меньшей мере на 1, 2 или 5 аминокислот, но не более чем на 35, 30, 25, 20 или 10 аминокислот от аминокислот 817-900 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислотам 817-900 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

[0718] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9 или полипептид eaCas9, содержат аминокислотную последовательность, обозначенную как область 5: имеющую 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии с аминокислотами 900-960 (60% остатков в четырех последовательностях Cas9 на ФИГ. 15A-15G консервативны) аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; которая отличается по меньшей мере на 1, 2 или 5 аминокислот, но не более чем на 35, 30, 25, 20 или 10 аминокислот от аминокислот 900-960 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua; или которая идентична аминокислотам 900-960 аминокислотной последовательности Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans или L. innocua.

(3) Сконструированные или измененные молекулы Cas9 и полипептиды Cas9

[0719] Молекулы Cas9 и полипептиды Cas9, описанные в настоящем документе, например встречающиеся в природе молекулы Cas9, могут обладать любым из ряда свойств, включая: активность никазы, активность нуклеазы (например, активность эндонуклеазы и/или экзонуклеазы); хеликазнаяую активность; способность функционально связываться с молекулой гРНК; и способность нацеливаться (или локализоваться) на сайт на нуклеиновой кислоте (например, распознавание и специфичность PAM). В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут включать все или часть этих свойств. В иллюстративных вариантах осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 обладают способностью взаимодействовать с молекулой гРНК и совместно с молекулой гРНК локализоваться в сайте на нуклеиновой кислоте. Другие активности, например, специфичность PAM, активность расщепления или хеликазная активность, могут варьироваться более широко в молекулах Cas9 и полипептидах Cas9.

[0720] Молекулы Cas9 включают сконструированные молекулы Cas9 и сконструированные полипептиды Cas9 («сконструированный», при использовании в данном контексте, означает лишь то, что молекула Cas9 или полипептид Cas9 отличаются от эталонных последовательностей и не предполагают никаких ограничений по способу или их происхождению). Сконструированная молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут обладать измененными ферментативными свойствами, например, измененной нуклеазной активностью (по сравнению с природной или другой эталонной молекулой Cas9) или измененной хеликазной активностью. Как обсуждалось в настоящем документе, сконструированная молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут обладать никазной активностью (в отличие от двухцепочечной нуклеазной активности). В одном варианте осуществления сконструированная молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут иметь изменение, которое изменяет их размер, например делецию аминокислотной последовательности, которая уменьшает ее размер, например, без значительного влияния на одну или более или на любую активность Cas9. В одном варианте осуществления сконструированная молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут иметь изменение, которое влияет на распознавание PAM. Например, сконструированная молекула Cas9 может быть изменена для распознавания последовательности PAM, отличной от той, которая распознается эндогенным PI-доменом дикого типа. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут отличаться по последовательности от встречающейся в природе молекулы Cas9, но не имеют пр этом значительного изменения в одной или более активностях Cas9.

[0721] Молекулы Cas9 или полипептиды Cas9 с желаемыми свойствами могут быть получены различными способами, например, путем изменения родительских, например, встречающихся в природе молекул Cas9 или полипептидов Cas9, для получения измененной молекулы Cas9 или полипептида Cas9, обладающих желаемым свойством. Например, может быть введена одна или более мутаций или различий относительно родительской молекулы Cas9, например, природной или сконструированной молекулы Cas9. Такие мутации и различия включают: замены (например, консервативные замены или замены несущественных аминокислот); вставки; или делеции. В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 может содержать одну или более мутаций или различий, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мутаций, но менее чем 200, 100 или 80 мутаций относительно эталонной, например, родительской молекулы Cas9.

[0722] В одном варианте осуществления мутация или мутации не оказывают существенного влияния на активность Cas9, например активность Cas9, описанной в настоящем документе. В одном варианте осуществления мутация или мутации оказывают существенное влияние на активность Cas9, например активность Cas9, описанную в настоящем документе.

(a) Не расщепляющие молекулы и полипептиды Cas9 и обладающие свойствами модифицированного расщепления

[0723] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 обладают свойством расщепления, которое отличается от встречающихся в природе молекул Cas9, например, которое отличается от встречающейся в природе молекулы Cas9, имеющей наиболее близкую гомологию. Например, молекула Cas9 или полипептид Cas9 может отличаться от встречающихся в природе молекул Cas9, например молекулы Cas9 S. pyogenes, следующим образом: ее способностью модулировать, например, уменьшать или увеличивать расщепление двухцепочечной нуклеиновой кислоты (эндонуклеазная и/или экзонуклеазная активность), например, по сравнению с природной молекулой Cas9 (например, молекулой Cas9 S. pyogenes); ее способностью модулировать, например, уменьшать или увеличивать расщепление одной цепи нуклеиновой кислоты, например некомплементарной цепи молекулы нуклеиновой кислоты или комплементарной цепи молекулы нуклеиновой кислоты (активность никазы), например, по сравнению с природной молекулой Cas9 (например, молекулой Cas9 S. pyogenes); или способность расщеплять молекулу нуклеиновой кислоты, например, двухцепочечной или одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, может быть устранена.

(b) Модифицированное расщепление молекул eaCas9 и полипептидов eaCas9

[0724] В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 включает одну или более из следующих активностей: активность расщепления, ассоциированную с N-концевым RuvC-подобным доменом; активность расщепления, ассоциированную с HNH-подобным доменом; активность расщепления, ассоциированную с HNH-подобным доменом, и активность расщепления, ассоциированную с N-концевым RuvC-подобным доменом.

[0725] В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат активный или способный к расщеплению HNH-подобный домен и неактивный или неспособный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен. Иллюстративный неактивный или неспособный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен может иметь мутацию аспарагиновой кислоты в N-концевом RuvC-подобном домене, например аспарагиновой кислоты в положении 9 консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, или аспарагиновая кислота в положении 10 SEQ ID NO: 1336, например, может быть заменена аланином. В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 отличаются от дикого типа в N-концевом RuvC-подобном домене и не расщепляют нуклеиновую кислоту-мишень или расщепляют со значительно меньшей эффективностью, например с эффективностью менее чем 20, 10, 5, 1 или 0,1% активности расщепления эталонной молекулы Cas9, например, как измерено анализом, описанным в настоящем документе. Эталонная молекула Cas9 может быть природной немодифицированной молекулой Cas9, например, природной молекулой Cas9, такой как молекула Cas9 S. pyogenes или S. thermophilus. В одном варианте осуществления эталонная молекула Cas9 представляет собой природную молекулу Cas9, имеющую наиболее близкую идентичность или гомологию последовательности.

[0726] В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат неактивный или неспособный к расщеплению домен HNH и активный или способный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен. Иллюстративные неактивные или неспособные к расщеплению HNH-подобные домены могут иметь мутацию в одном или более из: гистидина в HNH-подобном домене, например гистидин, представленный в положении 856 на ФИГ. 15A-15G, например, может быть заменен аланином; и один или более аспарагинов в HNH-подобном домене, например аспарагин, представленный в положении 870 на ФИГ. 15A-15G и/или в положении 879 на ФИГ. 15A-15G, например, может быть заменен аланином. В одном варианте осуществления eaCas9 отличается от дикого типа в HNH-подобном домене и не расщепляет нуклеиновую кислоту-мишень, или расщепляет со значительно меньшей эффективностью, например, с эффективностью менее чем 20, 10, 5, 1 или 0,1% от активности расщепления эталонной молекулы Cas9, например, как измерено анализом, описанным в настоящем документе. Эталонная молекула Cas9 может быть природной немодифицированной молекулой Cas9, например, природной молекулой Cas9, такой как молекула Cas9 S. pyogenes или S. thermophilus. В одном варианте осуществления эталонная молекула Cas9 представляет собой природную молекулу Cas9, имеющую наиболее близкую идентичность или гомологию последовательности.

[0727] В одном варианте осуществления молекула eaCas9 или полипептид eaCas9 содержат неактивный или неспособный к расщеплению домен HNH и активный или способный к расщеплению N-концевой RuvC-подобный домен. Иллюстративные неактивные или неспособные к расщеплению HNH-подобные домены могут иметь мутацию в одном или более из: гистидина в HNH-подобном домене, например гистидин, представленный в положении 856 на ФИГ. 15A-15G, например, может быть заменен аланином; и один или более аспарагинов в HNH-подобном домене, например аспарагин, представленный в положении 870 на ФИГ. 15A-15G и/или в положении 879 на ФИГ. 15A-15G, например, может быть заменен аланином. В одном варианте осуществления eaCas9 отличается от дикого типа в HNH-подобном домене и не расщепляет нуклеиновую кислоту-мишень, или расщепляет со значительно меньшей эффективностью, например, с эффективностью менее чем 20, 10, 5, 1 или 0,1% от активности расщепления эталонной молекулы Cas9, например, как измерено анализом, описанным в настоящем документе. Эталонная молекула Cas9 может быть природной немодифицированной молекулой Cas9, например, природной молекулой Cas9, такой как молекула Cas9 S. pyogenes или S. thermophilus. В одном варианте осуществления эталонная молекула Cas9 представляет собой природную молекулу Cas9, имеющую наиболее близкую идентичность или гомологию последовательности.

(c) Изменения в способности расщеплять одну или обе цепи нуклеиновой кислоты-мишени

[0728] В одном варианте осуществления иллюстративные активности Cas9 включают одну или более из специфичности PAM, активности расщепления и хеликазной активности. Мутация (мутации) может присутствовать, например, в: одном или более RuvC-подобных доменах, например, N-концевом RuvC-подобном домене; HNH-подобном домене; в области вне RuvC-подобных доменов и HNH-подобного домена. В некоторых вариантах осуществления мутация (мутации) присутствует в RuvC-подобном домене, например, в N-концевом RuvC-подобном домене. В некоторых вариантах осуществления мутация (мутации) присутствует в HNH-подобном домене. В некоторых вариантах осуществления мутации присутствуют как в RuvC-подобном домене, например, в N-концевом RuvC-подобном домене, так и в HNH-подобном домене.

[0729] Иллюстративные мутации, которые могут быть сделаны в домене RuvC или домене HNH относительно последовательности S. pyogenes, включают: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A и/или D986A.

[0730] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eiCas9 или полипептид eiCas9, имеющие одно или более различий в домене RuvC и/или в домене HNH по сравнению с эталонной молекулой Cas9, и молекула eiCas9 или полипептид eiCas9 не расщепляют нуклеиновую кислоту или расщепляют со значительно меньшей эффективностью, чем дикий тип, например, по сравнению с диким типом в анализе расщепления, например, как описано в настоящем документе, расщепляют с эффективностью менее чем 50, 25, 10 или 1% от эталонной Cas9 молекулы, как измерено анализом, описанным в настоящем документе.

[0731] Может ли конкретная последовательность, например замена, повлиять на одну или более активностей, таких как активность нацеливания, активность расщепления и т. д., можно оценить или предсказать, например, путем оценки того, является ли мутация консервативной, или с помощью способа, описанного в Разделе IV. В одном варианте осуществления «несущественный» аминокислотный остаток, используемый в контексте молекулы Cas9, представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности дикого типа молекулы Cas9, например, встречающейся в природе молекулы Cas9, например, молекулы eaCas9, без аннулирования или, более предпочтительно, без существенного изменения активности Cas9 (например, активности расщепления), тогда как изменение «незаменимого» аминокислотного остатка приводит к значительной потере активности (например, активности расщепления).

[0732] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 обладают свойством расщепления, которое отличается от встречающихся в природе молекул Cas9, например, которое отличается от встречающейся в природе молекулы Cas9, имеющей наиболее близкую гомологию. Например, молекула Cas9 или полипептид Cas9 могут отличаться от встречающихся в природе молекул Cas9, например молекулы Cas9 S aureus, S. pyogenes или C. jejuni, следующим образом: их способностью модулировать, например, уменьшать или увеличивать расщепление двухцепочечного разрыва (эндонуклеазная и/или экзонуклеазная активность), например, по сравнению с природной молекулой Cas9 (например, молекулой Cas9 S aureus, S. pyogenes или C. jejuni); их способностью модулировать, например, уменьшать или увеличивать расщепление одной цепи нуклеиновой кислоты, например некомплементарной цепи молекулы нуклеиновой кислоты или комплементарной цепи молекулы нуклеиновой кислоты (активность никазы), например, как по сравнению с природной молекулой Cas9 (например, молекулой Cas9 S aureus, S. pyogenes или C. jejuni); или способность расщеплять молекулу нуклеиновой кислоты, например, двухцепочечную или одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, может быть устранена.

[0733] В одном варианте осуществления измененные молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, обладающие одной или более из следующих активностей: активностью расщепления, ассоциированной с доменом RuvC; активностью расщепления, ассоциированной с доменом HNH; активностью расщепления, ассоциированной с доменом HNH, и активностью расщепления, ассоциированной с доменом RuvC.

[0734] В одном варианте осуществления измененные молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eiCas9 или полипептид eaCas9, которые не расщепляют молекулу нуклеиновой кислоты (ни двухцепочечную, ни одноцепочечную молекулы нуклеиновой кислоты) или расщепляют молекулу нуклеиновой кислоты со значительно меньшей эффективностью, например, с эффективностью менее чем 20, 10, 5, 1 или 0,1% от активности расщепления эталонной молекулы Cas9, например, как измерено анализом, описанным в настоящем документе. Эталонная молекула Cas9 может быть природной немодифицированной молекулой Cas9, например, природной молекулой Cas9, такой как молекула Cas9 S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, C. jejuni или N. meningitidis. В одном варианте осуществления эталонная молекула Cas9 является природной молекулой Cas9, имеющей наиболее близкую идентичность или гомологию последовательности. В одном варианте осуществления молекула eiCas9 или полипептид eiCas9 не обладают значительной активностью расщепления, ассоциированной с доменом RuvC, и активностью расщепления, ассоциированной с доменом HNH.

[0735] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, содержащие фиксированные аминокислотные остатки S. pyogenes, представленные в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, и имеют одну или более аминокислот, которые отличаются от аминокислотной последовательности S. pyogenes (например, имеют замену) в одном или более остатках (например, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 200 аминокислотных остатков), обозначенных «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G или в SEQ ID NO: 1336.

[0736] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат последовательность, в которой:

[0737] последовательность, соответствующая фиксированной последовательности консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20% фиксированных остатков в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G;

[0738] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «*» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40% остатков «*» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например, молекулы Cas9 S. pyogenes; и,

[0739] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55 или 60% остатков «-» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например молекулы Cas9 S. Pyogenes.

[0740] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляет собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, содержащие фиксированные аминокислотные остатки S. thermophilus, представленные в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, и имеют одну или более аминокислот, которые отличаются от аминокислотной последовательности S. thermophilus (например, имеют замену) в одном или более остатках (например, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30). 50, 70, 80, 90, 100, 200 аминокислотных остатков), обозначенных «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15А-15G.

[0741] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат последовательность, в которой:

[0742] последовательность, соответствующая фиксированной последовательности консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20% фиксированных остатков в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G;

[0743] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «*» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40% остатков «*» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например, молекулы Cas9 S. thermophilus; и,

[0744] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55 или 60% остатков «-» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например молекулы Cas9 S. thermophilus.

[0745] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, содержащие фиксированные аминокислотные остатки S. mutans, представленные в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, и имеют одну или более аминокислот, которые отличаются от аминокислотной последовательности S. mutans (например, имеют замену) в одном или более остатках (например, в 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 200 аминокислотных остатках), обозначенных «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15А-15G.

[0746] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат последовательность, в которой:

[0747] последовательность, соответствующая фиксированной последовательности консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20% фиксированных остатков в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G;

[0748] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «*» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40% остатков «*» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например, молекулы Cas9 S. mutans; и,

[0749] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55 или 60% остатков «-» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например молекулы Cas9 S. mutans.

[0750] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 представляют собой молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9, содержащие фиксированные аминокислотные остатки L. innocula, представленные в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, и имеет одну или более аминокислот, которые отличаются от аминокислотной последовательности L. innocula (например, имеют замену) в одном или более остатках (например, в 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 200 аминокислотных остатках), обозначенных «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15А-15G.

[0751] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9 содержат последовательность, в которой:

[0752] последовательность, соответствующая фиксированной последовательности консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20% фиксированных остатков в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G;

[0753] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «*» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличаются не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40% остатков «*» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например, молекулы Cas9 L. innocula; и,

[0754] последовательность, соответствующая остаткам, обозначенным «-» в консенсусной последовательности, раскрытой на ФИГ. 15A-15G, отличаются не более чем на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55 или 60% остатков «-» из соответствующей последовательности встречающейся в природе молекулы Cas9, например молекулы Cas9 L. Innocula.

[0755] В одном варианте осуществления измененная молекула Cas9 или полипептид Cas9, например молекула eaCas9, могут быть слиянием, например, двух или более различных молекул Cas9 или полипептидов Cas9, например, двух или более встречающихся в природе молекул Cas9 разных видов. Например, фрагмент встречающейся в природе молекулы Cas9 одного вида может быть слит с фрагментом молекулы Cas9 второго вида. Например, фрагмент молекулы Cas9 S. pyogenes, содержащий N-концевой RuvC-подобный домен, может быть слит с фрагментом молекулы Cas9 вида, отличного от S. pyogenes (например, S. thermophilus), содержащего HNH-подобный домен.

(d) Молекулы Cas9 с измененным распознаванием PAM или без распознавания PAM

[0756] Встречающиеся в природе молекулы Cas9 могут распознавать конкретные последовательности PAM, например, последовательности распознавания PAM, описанные выше, например, для S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans, S. aureus и N. meningitidis.

[0757] В одном варианте осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 обладают такими же специфичностями PAM, что и встречающаяся в природе молекула Cas9. В других вариантах осуществления молекула Cas9 или полипептид Cas9 имеет специфичность PAM, не связанную с природной молекулой Cas9, или специфичность PAM, не связанную с природной молекулой Cas9, с которой она имеет наиболее близкую гомологию последовательности. Например, встречающаяся в природе молекула Cas9 может быть изменена, например, для изменения распознавания PAM, например, для изменения последовательности PAM, которую распознает молекула Cas9 или полипептид Cas9, чтобы уменьшить ошибочные сайты и/или улучшить специфичность; или исключить условия распознавания PAM. В одном варианте осуществления молекула Cas9 может быть изменена, например, для увеличения длины последовательности распознавания PAM и/или улучшения специфичности Cas9 до высокого уровня идентичности, например, для уменьшения ошибочных сайтов и увеличения специфичности. В одном варианте осуществления длина последовательности распознавания PAM составляет по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 аминокислот.

[0758] Молекулы Cas9 или полипептиды Cas9, которые распознают различные последовательности PAM и/или имеют пониженную ошибочную активность, могут быть получены с использованием направленной эволюции. Иллюстративные способы и системы, которые можно использовать для направленной эволюции молекул Cas9, описаны, например, в Esvelt et al. Nature 2011, 472 (7344): 499-503. Молекулы-кандидаты Cas9 могут быть подвергнуты оценке.

(4) Нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы Cas9

[0759] В настоящем описании представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы Cas9 или полипептиды Cas9, например молекулу eaCas9 или полипептид eaCas9.

[0760] Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы Cas9 или полипептиды Cas9, описаны в Cong et al., Science 2013, 399 (6121): 819-823; Wang et al., Cell 2013, 153 (4): 910-918; Mali et al., Science 2013, 399 (6121): 823-826; Jinek et al., Science 2012, 337 (6096): 816-821. Другая иллюстративная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу Cas9 или полипептид Cas9, показана черным на ФИГ. 8 WO2015161276.

[0761] В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу Cas9 или полипептид Cas9, может представлять собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты. Например, синтетическая молекула нуклеиновой кислоты может быть химически модифицирована. В одном варианте осуществления мРНК Cas9 обладает одним или более (например, всеми из следующих свойств: она кэппирована, полиаденилирована, замещена 5-метилцитидином и/или псевдоуридином.

[0762] Кроме того, или альтернативно, последовательность синтетической нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована по кодонам, например, по меньшей мере один редкий кодон или менее распространенный кодон был заменен обычным кодоном. Например, синтетическая нуклеиновая кислота может направлять синтез оптимизированной матричной мРНК, например, оптимизированной для экспрессии в системе экспрессии млекопитающего, например, описанной в настоящем документе.

[0763] Кроме того, или альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу Cas9 или полипептид Cas9, может содержать последовательность ядерной локализации (NLS). Последовательности ядерной локализации известны в данной области.

[0764] SEQ ID NO: 1337 представляет собой пример оптимизированной по кодонам последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу Cas9 S. pyogenes. SEQ ID NO: 1338 представляет собой соответствующую аминокислотную последовательность молекулы Cas9 S. pyogenes. SEQ ID NO: 1339 представляет собой пример оптимизированной по кодонам последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу Cas9 N. meningitidis. SEQ ID NO: 1340 представляет собой соответствующую аминокислотную последовательность молекулы Cas9 N. meningitidis. SEQ ID NO: 1341 представляет собой пример оптимизированной по кодонам последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу Cas9 S. aureus. SEQ ID NO: 1342 представляет собой соответствующую аминокислотную последовательность молекулы Cas9 S. aureus.

[0765] Если какая-либо из указанных выше последовательностей Cas9 слита с пептидом или полипептидом на С-конце, подразумевается, что стоп-кодон будет удален.

(5) Другие молекулы Cas и полипептиды Cas

[0766] Различные типы молекул Cas или полипептидов Cas могут быть использованы для практического использования раскрытого в настоящем описании изобретения. В некоторых вариантах осуществления используются молекулы Cas систем Cas типа II. В других вариантах осуществления используются молекулы Cas других систем Cas. Например, могут использоваться молекулы Cas типа I или типа III. Примеры молекул Cas (и систем Cas) описаны, например, в Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1 (6): e60 и Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9: 467-477, содержание обеих ссылок включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Примеры молекул Cas (и систем Cas) также представлены в Таблице 18.

Таблица 18 Системы Cas

Название гена Системный тип или подтип Название от Haft et al.^§ Структура кодируемого белка (регистрация в PDB)^¶ Семейства (и суперсемейство) кодируемого белка^#** Представители cas1 Тип I
Тип II
Тип III cas1 3GOD, 3LFX и 2YZS COG1518 SERP2463, SPy1047 и ygbT cas2 Тип I
Тип II
Тип III cas2 2IVY, 2I8E и 3EXC COG1343 и COG3512 SERP2462, SPy1048, SPy1723 (N-концевой домен) и ygbF cas3′ Тип I^‡‡ cas3 NA COG1203 APE1232 и ygcB cas3′′ •Подтип I-A
• Подтип I-B NA NA COG2254 APE1231 и BH0336 cas4 • Подтип I-A
• Подтип I-B
• Подтип I-C
• Подтип I-D
• Подтип II-B cas4 и csa1 NA COG1468 APE1239 и BH0340 cas5 • Подтип I-A
• Подтип I-B
•Подтип I-C
• Подтип I-E cas5a, cas5d, cas5e, cas5h, cas5p, cas5t и cmx5 3KG4 COG1688 (RAMP) APE1234, BH0337, devS и ygcI cas6 • Подтип I-A
•Подтип I-B
•Подтип I-D
•Подтип III-A
• Подтип III-B cas6 и cmx6 3I4H COG1583 и COG5551 (RAMP) PF1131 и slr7014 cas6e • Подтип I-E cse3 1WJ9 (RAMP) ygcH cas6f • Подтип I-F csy4 2XLJ (RAMP) y1727 cas7 • Подтип I-A
• Подтип I-B
• Подтип I-C
• Подтип I-E csa2, csd2, cse4, csh2, csp1 и cst2 NA COG1857 и COG3649 (RAMP) devR и ygcJ cas8a1 • Подтип I-A^‡‡ cmx1, cst1, csx8, csx13 и CXXC-CXXC NA BH0338-like LA3191^§§ и PG2018^§§ cas8a2 • Подтип I-A^‡‡ csa4 и csx9 NA PH0918 AF0070, AF1873, MJ0385, PF0637, PH0918 и SSO1401 cas8b • Подтип I-B^‡‡ csh1 и TM1802 NA BH0338-like MTH1090 и TM1802 cas8c • Подтип I-C^‡‡ csd1 и csp2 NA BH0338-like BH0338 cas9 • Тип II^‡‡ csn1 и csx12 NA COG3513 FTN_0757 и SPy1046 cas10 • Тип III^‡‡ cmr2, csm1 и csx11 NA COG1353 MTH326, Rv2823c^§§ и TM1794^§§ cas10d • Подтип I-D^‡‡ csc3 NA COG1353 slr7011 csy1 • Подтип I-F^‡‡ csy1 NA y1724-like y1724 csy2 • Подтип I-F csy2 NA (RAMP) y1725 csy3 • Подтип I-F csy3 NA (RAMP) y1726 cse1 • Подтип I-E^‡‡ cse1 NA YgcL-like ygcL cse2 • Подтип I-E cse2 2ZCA YgcK-like ygcK csc1 • Подтип I-D csc1 NA alr1563-like (RAMP) alr1563 csc2 • Подтип I-D csc1 и csc2 NA COG1337 (RAMP) slr7012 csa5 • Подтип I-A csa5 NA AF1870 AF1870, MJ0380, PF0643 и SSO1398 csn2 • Подтип II-A csn2 NA SPy1049-like SPy1049 csm2 • Подтип III-A^‡‡ csm2 NA COG1421 MTH1081 и SERP2460 csm3 • Подтип III-A csc2 и csm3 NA COG1337 (RAMP) MTH1080 и SERP2459 csm4 • Подтип III-A csm4 NA COG1567 (RAMP) MTH1079 и SERP2458 csm5 • Подтип III-A csm5 NA COG1332 (RAMP) MTH1078 и SERP2457 csm6 • Подтип III-A APE2256 и csm6 2WTE COG1517 APE2256 и SSO1445 cmr1 • Подтип III-B cmr1 NA COG1367 (RAMP) PF1130 cmr3 • Подтип III-B cmr3 NA COG1769 (RAMP) PF1128 cmr4 • Подтип III-B cmr4 NA COG1336 (RAMP) PF1126 cmr5 • Подтип III-B^‡‡ cmr5 2ZOP и 2OEB COG3337 MTH324 и PF1125 cmr6 • Подтип III-B cmr6 NA COG1604 (RAMP) PF1124 csb1 • Подтип I-U GSU0053 NA (RAMP) Balac_1306 и GSU0053 csb2 • Подтип I-U^§§ NA NA (RAMP) Balac_1305 и GSU0054 csb3 • Подтип I-U NA NA (RAMP) Balac_1303^§§ csx17 • Подтип I-U NA NA NA Btus_2683 csx14 • Подтип I-U NA NA NA GSU0052 csx10 • Подтип I-U csx10 NA (RAMP) Caur_2274 csx16 • Подтип III-U VVA1548 NA NA VVA1548 csaX • Подтип III-U csaX NA NA SSO1438 csx3 • Подтип III-U csx3 NA NA AF1864 csx1 • Подтип III-U csa3, csx1, csx2, DXTHG, NE0113 и TIGR02710 1XMX и 2I71 COG1517 и COG4006 MJ1666, NE0113, PF1127 и TM1812 csx15 • Неизвестно NA NA TTE2665 TTE2665 csf1 • Тип U csf1 NA NA AFE_1038 csf2 • Тип U csf2 NA (RAMP) AFE_1039 csf3 • Тип U csf3 NA (RAMP) AFE_1040 csf4 • Тип U csf4 NA NA AFE_1037

c) Cpf1

[0767] В некоторых вариантах осуществления гид-РНК или гРНК стимулирует специфическое нацеливание ассоциации РНК-управляемой нуклеазы, такой как Cas9 или Cpf1, на последовательность-мишень, такую как геномная или эписомная последовательность в клетке. В целом, гРНК могут быть мономолекулярными (содержащими одну молекулу РНК и альтернативно называются химерными) или модульными (содержащими более чем одну и обычно две отдельные молекулы РНК, такие как crРНК и tracrРНК, которые обычно связаны друг с другом, например, путем образования дуплекса). гРНК и их составные части описаны в литературе, например, в Briner et al. (Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner), которая включена в качестве ссылки), и у Cotta-Ramusino.

[0768] гид-РНК, будь то мономолекулярные или модульные, обычно включают нацеливающий домен, который полностью или частично комплементарен мишени, и обычно имеет длину 10-30 нуклеотидов, а в некоторых вариантах осуществления длина составляет 16-24 нуклеотида (например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида в длину). В некоторых аспектах нацеливающие домены находятся на или вблизи 5'-конца гРНК в случае с Cas9 гРНК, и на или примерно в близи 3'-конца в случае Cpf1 гРНК. Хотя вышеприведенное описание было сфокусировано на гРНК для использования с Cas9, следует понимать, что были обнаружены или изобретены другие РНК-направляемые нуклеазы, которые используют гРНК, которые в некоторых отношениях отличаются от описанных к настоящему моменту. Например, Cpf1 («CRISPR от Prevotella и Franciscella 1») является недавно обнаруженной РНК-управляемой нуклеазой, для функционирования которой не требуется tracrРНК. (Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771, October 22, 2015 (Zetsche I), включено в настоящее описание в качестве ссылки). гРНК для использования в системе редактирования генома Cpf1 обычно включает нацеливающий домен и домен комплементарности (поочередно называемый «handle»). Следует также отметить, что в гРНК для использования с Cpf1 нацеливающий домен обычно присутствует на 3'-конце или вблизи него, а не на 5'-конце, как описано выше в связи с гРНК Cas9 («handle» находится на 5'-конце гРНК Cpf1 или вблизи него).

[0769] Хотя структурные различия могут существовать между гРНК из разных прокариотических видов или между гРНК Cpf1 и Cas9, принципы, с помощью которых действуют эти гРНК, в целом согласуются. Благодаря этой последовательности действий, гРНК могут быть определены, в широком смысле, по их последовательностям нацеливающих доменов, и квалифицированные специалисты поймут, что данная последовательность нацеливающих доменов может быть включена в любую подходящую гРНК, включая мономолекулярную или химерную гРНК, или гРНК, которая включает одну или более химических модификаций и/или последовательных модификаций (замены, дополнительные нуклеотиды, укорачивания и т. д.). Таким образом, в некоторых аспектах в настоящем раскрытии, гРНК могут быть описаны исключительно в терминах их последовательностей нацеливающих доменов.

[0770] В более общем смысле, некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к системам, способам и композициям, которые могут быть реализованы с использованием множества РНК-управляемых нуклеаз. Если не указано иное, термин «гРНК» следует понимать как охватывающий любую подходящую гРНК, которая может использоваться с любой РНК-управляемой нуклеазой, а не только те гРНК, которые совместимы с конкретным видом Cas9 или Cpf1. В качестве иллюстрации, термин «гРНК» может в некоторых вариантах осуществления включать в себя гРНК для использования с любой РНК-управляемой нуклеазой, встречающейся в системе CRISPR класса 2, такой как система типа II или типа V или CRISPR, или в системе с РНК-управляемой нуклеазой, полученной или адаптированной из них.

[0771] Некоторые иллюстративные модификации, обсуждаемые в этом разделе, могут быть включены в любом положении в последовательности гРНК, включая, без ограничения, на 5'-конце или вблизи него (например, в пределах 1-10, 1-5 или 1-2 нуклеотидов от 5'-конца) и/или на 3'-конце или вблизи него (например, в пределах 1-10, 1-5 или 1-2 нуклеотидов от 3'-конца). В некоторых случаях модификации располагаются в пределах функциональных мотивов, таких как дуплекс повтор-анти-повтор гРНК Cas9, структура стебель-петля гРНК Cas9 или Cpf1 и/или нацеливающий домен гРНК.

[0772] РНК-направляемые нуклеазы включают, но не ограничиваются ими, природные нуклеазы CRISPR класса 2, такие как Cas9 и Cpf1, а также другие нуклеазы, выделенные или полученные из них. С функциональной точки зрения РНК-направляемые нуклеазы определяются как нуклеазы, которые: (a) взаимодействуют (например, образуют комплекс) с гРНК; и (b) вместе с гРНК связываются и необязательно расщепляют или модифицируют область-мишень ДНК, которая включает (i) последовательность, комплементарную нацеливающему домену гРНК, и, необязательно, (ii) дополнительную последовательность, обозначенную как «мотив, смежный с протоспейсером» или «PAM», который более подробно описан ниже. Как проиллюстрированы следующие примеры, РНК-направляемые нуклеазы могут быть определены в широком смысле их специфичностью к PAM и активностью расщепления, даже если могут существовать различия между отдельными РНК-управляемыми нуклеазами, которые обладают одинаковой специфичностью к PAM или активностью расщепления. Специалистам в данной области техники будет понятно, что некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к системам, способам и композициям, которые могут быть реализованы с использованием любой подходящей РНК-управляемой нуклеазы, обладающей определенной специфичностью к PAM и/или активностью расщепления. По этой причине, если не указано иное, термин «РНК-управляемая нуклеаза» следует понимать как общий термин, и не ограничивается каким-либо конкретным типом (например, Cas9 по сравнению с Cpf1), видами (например, S. pyogenes по сравнению с S. aureus) или вариация (например, полная длина по сравнению с укороченной или расщепленной; прродная специфичность PAM по сравнению со сконструированной специфичностью к PAM и т. д.) РНК-управляемой нуклеазы.

[0773] В дополнение к распознаванию специфических последовательных ориентаций PAM и протоспейсеров, РНК-направляемые нуклеазы в некоторых вариантах осуществления также могут распознавать специфические последовательности PAM. Например, Cas9 S. aureus, как правило, распознает последовательность PAM NNGRRT или NNGRRV, где N остатков находятся непосредственно в 3'-области относительно области, распознаваемой нацеливающим доменом гРНК. Cas9 S. pyogenes обычно распознает последовательности NGG PAM. И Cpf1 F. novicida обычно распознает последовательность TTN PAM.

[0774] Кристаллическая структура Cpf1 Acidaminococcus sp. в комплексе с crРНК и двухцепочечной (ds) ДНК-мишенью, включающей последовательность TTTN PAM, была разрешена Yamano et al. (Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962 (Yamano), включено в настоящее описание в качестве ссылки). Cpf1, как и Cas9, имеет две доли: долю REC (распознавания) и долю NUC (нуклеазы). Доля REC включает в себя домены REC1 и REC2, которые не имеют сходства с какими-либо известными белковыми структурами. В то же время доля NUC включает три домена RuvC (RuvC-I, -II и -III) и домен BH. Однако, в отличие от Cas9, доля REC Cpf1 не имеет домена HNH и включает в себя другие домены, которые также не имеют сходства с известными белковыми структурами: структурно уникальный домен PI, три клиновидных домена (Wedge) (WED) (WED-I, -II и - III) и нуклеазный (Nuc) домен.

[0775] Хотя Cas9 и Cpf1 имеют сходные структуры и функции, следует понимать, что определенные активности Cpf1 опосредуются структурными доменами, которые не аналогичны каким-либо доменам Cas9. Например, расщепление комплементарной цепи ДНК-мишени, по-видимому, опосредовано доменом Nuc, который по последовательности и пространственно отличается от домена HNH в Cas9. Кроме того, не нацеливающая часть гРНК Cpf1 (handle) принимает структуру псевдоузла, а не структуру стебель-петля, образованную дуплексом повтор:антиповтр в гРНК Cas9.

[0776] Нуклеиновые кислоты, кодирующие РНК-направляемые нуклеазы, например Cas9, Cpf1 или их функциональные фрагменты, предложены в настоящем описании. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие РНК-направляемые нуклеазы, были описаны ранее (см., например, Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012).

3. Методы редактирования генома и методы доставки

a) Подходы к редактированию генома

[0777] В общем, следует понимать, что изменение любого гена в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, может быть опосредовано любым механизмом, и что любые способы не ограничиваются конкретным механизмом. Иллюстративные механизмы, которые могут быть связаны с изменением гена, включают, но не ограничиваются этим, негомологичное соединение концов (например, классическое или альтернативное), микрогомологичное соединение концов (MMEJ), направляемая гомологией репарация (например, опосредованная эндогенной донорной матрицей), синтез-зависимый отжиг цепи (SDSA), отжиг одной цепи, инвазия одной цепи, репарация одноцепочечного разрыва (SSBR), репарация ошибочного спаривания (MMR), эксцизионная репарация оснований (BER), межцепочечная сшивка (ICL), синтез ДНК «через повреждения» (TLS), или безошибочная пострепликативная репарация (PRR). В настоящем документе описаны иллюстративные способы направленного нокаута одного или обоих аллелей одного или всех TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

(1) Подходы NHEJ для направленного воздействия на гены

[0778] Как описано в настоящем документе, индуцированное нуклеазой негомологичное соединение концов (NHEJ) может использоваться для нацеливания на ген-специфические нокауты. Индуцированное нуклеазой NHEJ также можно использовать для удаления (например, делеции) вставок последовательности в представляющем интерес гене.

[0779] Не желая быть связанными теорией, полагают, что в одном варианте осуществления геномные изменения, связанные с описанными в настоящем документе способами, основаны на индуцированном нуклеазой NHEJ и характере пониженной точности пути репарации NHEJ. NHEJ восстанавливает двухцепочечный разрыв в ДНК, соединяя вместе два конца; однако, как правило, исходная последовательность восстанавливается только в том случае, если два совместимых конца, точно так же, как они были образованы двухцепочечным разрывом, идеально лигируются. Концы ДНК двухцепочечного разрыва часто подвергаются ферментативной обработке, приводящей к добавлению или удалению нуклеотидов в одной или обеих цепях до соединения концов. Это приводит к наличию вставочных и/или делеционных (независимых) мутаций в последовательности ДНК в месте репарации NHEJ. Две трети этих мутаций обычно изменяют рамку считывания и, следовательно, производят нефункциональный белок. Кроме того, мутации, которые поддерживают рамку считывания, но которые вставляют или удаляют значительное количество последовательности, могут разрушать функциональность белка. Это зависит от локуса, поскольку мутации в критических функциональных доменах, вероятно, менее переносимы, чем мутации в некритических областях белка. Мутации вставок-делеций, генерируемые NHEJ, непредсказуемы по своей природе; однако в данном сайте разрыва определенные последовательности вставок-делеций являются предпочтительными и чрезмерно представлены в популяции, вероятно, из-за небольших областей микрогомологии. Длина делеций может широко варьироваться; чаще всего в диапазоне 1-50 п.н., но они могут легко достигать более 100-200 п.н. Вставки, как правило, короче и часто включают короткие дубликаты последовательности, непосредственно окружающие сайт разрыва. Однако возможно получить большие вставки, и в этих случаях встроенная последовательность часто прослеживается в других областях генома или в плазмидной ДНК, присутствующей в клетках.

[0780] Поскольку NHEJ является мутагенным процессом, его также можно использовать для делеции небольших мотивов последовательности, если генерация конкретной конечной последовательности не требуется. Если двухцепочечный разрыв подвергается направленному воздействию вблизи короткой последовательности-мишени, делеционные мутации, вызванные репарацией NHEJ, часто охватывают и, следовательно, удаляют нежелательные нуклеотиды. Для удаления более крупных сегментов ДНК введение двух двухцепочечных разрывов, по одному на каждой стороне последовательности, может привести к NHEJ между концами с удалением всей промежуточной последовательности. В некоторых вариантах осуществления пара гРНК может использоваться для введения двух двухцепочечных разрывов, что приводит к удалению промежуточных последовательностей между двумя разрывами.

[0781] Оба этих подхода могут использоваться для удаления определенных последовательностей ДНК; однако характер пониженной точности NHEJ может все еще вызывать мутации в сайте репарации.

[0782] В способах и композициях, описанных в настоящем документе, для получения NHEJ-опосредованных вставок-делеций могут быть использованы как молекулы eaCas9, осуществляющие двухцепочечное расщепление, так и никазы, молекулы eaCas9, осуществляющие одноцепочечное расщепление. NHEJ-опосредованные вставки-делеции, нацеленные на ген, например кодирующую область, например, раннюю кодирующую область гена, представляющего интерес, могут быть использованы для нокаута (то есть, устранения экспрессии) представляющего интерес гена. Например, ранняя кодирующая область представляющего интерес гена включает последовательность, следующую непосредственно за стартовым сайтом транскрипции, в пределах первого экзона кодирующей последовательности или в пределах 500 п.н. от стартового сайта транскрипции (например, менее чем 500, 450, 400, 350 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.).

[0783] В одном варианте осуществления NHEJ-опосредованные вставки-делеции вводят в один или более генов, экспрессируемых T-клетками, таких как TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. Индивидуальные гРНК или пары гРНК, нацеленные на ген, предоставляются вместе с двухцепочечной нуклеазой Cas9 или одноцепочечной никазой.

(2) Расположение двухцепочечных или одноцепочечных разрывов относительно положения-мишени

[0784] В одном варианте осуществления, в котором гРНК и нуклеаза Cas9 генерируют двухцепочечный разрыв с целью индукции NHEJ-опосредованных вставок-делеций, гРНК, например, мономолекулярная (или химерная) или модульная молекула гРНК, сконфигурирована для расположения одного двухцепочечного разрыва в непосредственной близости от нуклеотида положения-мишени. В одном варианте осуществления сайт расщепления находится на расстоянии 0-30 п.н. от положения-мишени (например, на расстоянии менее чем 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 п.н от положения-мишени).

[0785] В варианте осуществления, в котором две гРНК, образующие комплекс с никазами Cas9, индуцируют два одноцепочечных разрыва с целью индукции NHEJ-опосредованных вставок-делеций, две гРНК, например, независимо, мономолекулярная (или химерная) или модульная гРНК, сконфигурированы для расположения двух одноцепочечных разрывов, чтобы обеспечить NHEJ-репарацию нуклеотида в положении-мишени. В одном варианте осуществления, гРНК сконфигурированы для расположения разрезов в одном и том же положении или в пределах нескольких нуклеотидов друг от друга на разных цепях, по существу имитируя двухцепочечный разрыв. В одном варианте осуществления более близкий одноцепочечный разрыв находится на расстоянии 0-30 п.н. от положения-мишени (например, на расстоянии менее чем 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 п.н. от положения-мишени), и два одноцепочечных разрыва находятся в пределах 25-55 п.н. друг от друга (например, на расстоянии от 25 до 50, от 25 до 45, от 25 до 40, от 25 до 35, от 25 до 30, от 50 до 55, от 45 до 55, от 40 до 55, от 35 до 55, от 30 до 55, от 30 до 50, от 35 до 50, от 40 до 50, от 45до 50, от 35 до 45 или от 40 до 45 п.н.) и не более чем 100 п.н. друг от друга (например, не более чем 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 п.н.). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурированы для расположения одноцепочечного разрыва по обе стороны от нуклеотида в положении-мишени.

[0786] В способах и композициях, описанных в настоящем документе, для генерации разрывов обеих сторон положения-мишени могут быть использованы как молекулы eaCas9, осуществляющие двухцепочечное расщепление, так и никазы, молекулы eaCas9, осуществляющие одноцепочечное расщепление. Двухцепочечные или спаренные одноцепочечные разрывы могут генерироваться на обеих сторонах положения-мишени для удаления последовательности нуклеиновой кислоты между двумя разрезами (например, область между двумя разрывами делетируется). В одном варианте осуществления две гРНК, например независимо, мономолекулярная (или химерная) или модульная гРНК, сконфигурированы для расположения двухцепочечного разрыва с обеих сторон положения-мишени. В альтернативном варианте осуществления три гРНК, например, независимо, мономолекулярная (или химерная) или модульная гРНК, сконфигурированы для расположения двухцепочечного разрыва (то есть, одна гРНК образует комплекс с нуклеазой cas9) и двух одноцепочечных разрывов или спаренных одноцепочечных разрывов (т. е. две гРНК образуют комплекс с никазами Cas9) по обе стороны от положения-мишени. В другом варианте осуществления четыре гРНК, например, независимо, мономолекулярная (или химерная) или модульная гРНК, сконфигурированы для генерации двух пар одноцепочечных разрывов (то есть две пары из двух гРНК образуют комплекс с никазами Cas9) по обе стороны от положения-мишени. Двухцепочечный разрыв (разрывы) или более близкий из двух одноцепочечных разрывов в паре в идеале должен располагаться в пределах 0-500 п.н. от положения-мишени (например, на расстоянии не более чем 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150). 100, 50 или 25 п.н. от положения-мишени). Когда используются никазы, два одноцепочечных разрыва в паре находятся в пределах 25-55 п.н. друг от друга (например, на расстоянии от 25 до 50, от 25 до 45, от 25 до 40, от 25 до 35, от 25 до 30, от 50 до 55, от 45 до 55, от 40 до 55, от 35 до 55, от 30 до 55, от 30 до 50, от 35 до 50, от 40 до 50, от 45 до 50, от 35 до 45 или от 40 до 45 п.н.) и не более чем 100 п.н. друг от друга (например, не более чем 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 п.н.).

(3) Направленный нокдаун

[0787] В отличие от CRISPR/Cas-опосредованного нокаута гена, который надолго устраняет или уменьшает экспрессию путем мутации гена на уровне ДНК, CRISPR/Cas нокдаун позволяет временно уменьшить экспрессию гена с помощью искусственных факторов транскрипции. Мутация ключевых остатков в обоих доменах расщепления ДНК белка Cas9 (например, мутации D10A и H840A) приводит к образованию каталитически неактивного Cas9 (eiCas9, который также известен как мертвый Cas9 или dCas9). Каталитически неактивный Cas9 образует комплексы с гРНК и локализуется в последовательности ДНК, определяемой нацеливающим доменом этой гРНК, однако он не расщепляет ДНК-мишень. Слияние dCas9 с эффекторным доменом, например с доменом транскрипционной репрессии, позволяет рекрутировать эффектор в любой сайт ДНК, определяемую гРНК. Хотя было показано, что сам eiCas9 может блокировать транскрипцию при рекрутировании в ранние области в кодирующей последовательности, более надежная репрессия может быть достигнута путем слияния домена транскрипционной репрессии (например, KRAB, SID или ERD) с Cas9 и рекрутирования его в промоторную область гена. Вполне вероятно, что нацеливание ДНК-азы I на гиперчувствительные области промотора может привести к более эффективной репрессии или активации генов, поскольку эти области, более вероятно, будут доступны белку Cas9, а также с большей вероятностью содержат сайты для эндогенных факторов транскрипции. В частности, для репрессии генов здесь предусматривается, что блокирование сайта связывания эндогенного фактора транскрипции будет способствовать подавлению экспрессии гена. В другом варианте осуществления eiCas9 может быть слит с белком, модифицирующим хроматин. Изменение статуса хроматина может привести к снижению экспрессии гена-мишени.

[0788] В одном варианте осуществления молекула гРНК может быть нацелена на известные транскрипционные респонсивные элементы (например, промоторы, энхансеры и т. д.), известные последовательности активации UAS и/или последовательности неизвестной или известной функции, которые предположительно способны контролировать экспрессию ДНК-мишени.

[0789] В одном варианте осуществления CRISPR/Cas-опосредованный нокдаун гена может быть использован для снижения экспрессии одного или более генов, экспрессируемых T-клетками. В одном варианте осуществления, в котором слитый белок eiCas9 или eiCas9, описанный в настоящем документе, используется для нокдауна двух генов, экспрессируемых T-клетками, например любых двух или более генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, отдельные пары гРНК или гРНК, нацеленные на оба или на все гены, обеспечиваются вместе с eiCas9 или со слитым белком eiCas9.

(4) Одноцепочечный отжиг

[0790] Рдноцепочечный отжиг (SSA) представляет собой еще один процесс репарации ДНК, который восстанавливает двухцепочечный разрыв между двумя повторяющимися последовательностями, присутствующими в нуклеиновой кислоте-мишени. Повторяющиеся последовательности, используемые SSA, обычно имеют длину более чем 30 нуклеотидов. Разрез на концах разрыва происходит для выявления повторяющихся последовательностей на обеих цепях нуклеиновой кислоты-мишени. После разреза одноцепочечные выступы, содержащие повторяющиеся последовательности, покрывают белком RPA для предотвращения несоответствующего отжига повторяющихся последовательностей, например, сами на себя. RAD52 связывается с каждой из повторяющихся последовательностей на выступающих концах и выравнивает их, чтобы обеспечить отжиг комплементарных повторяющихся последовательностей. После отжига одноцепочечные фрагменты выступающих концов отщепляются. Новый синтез ДНК заполняет любые пробелы, а лигирование восстанавливает дуплекс ДНК. В результате обработки последовательность ДНК между двумя повторами удаляется. Длина делеции может зависеть от многих факторов, включая расположение двух использованных повторов и путь или процессивность разреза.

[0791] В отличие от путей HDR, SSA не требуется матричная нуклеиновая кислота для изменения или коррекции последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Вместо этого используется комплементарная повторяющаяся последовательность.

(5) Другие пути репарации ДНК

(a) SSBR (репарация одноцепочечного разрыва)

[0792] Одноцепочечные разрывы (SSB) в геноме подвергаются репарации путем SSBR, который является механизмом, отличным от механизмов репарации DSB, которые обсуждались выше. Путь SSBR имеет четыре основные стадии: детектирование SSB, обработка концов ДНК, заполнение пробела ДНК и лигирование ДНК. Более подробное объяснение дано в Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (август 2008 г.), а краткое изложение приведено в настоящем описании.

[0793] На первой стадии, когда формируется SSB, PARP1 и/или PARP2 распознают разрыв и рекрутируют аппарат репарации. Связывание и активность PARP1 при разрывах ДНК являются временными, и, по-видимому, они ускоряют SSBr, стимулируя очаговое накопление или стабильность белковых комплексов SSBr в очаге поражения. Возможно, наиболее важным из этих белков SSBr является XRCC1, который функционирует в качестве молекулярного каркаса, который взаимодействует, стабилизирует и стимулирует множество ферментативных компонентов процесса SSBr, включая белок, ответственный за очистку 3'- и 5'-концов ДНК. Например, XRCC1 взаимодействует с несколькими белками (ДНК-полимераза бета, PNK и тремя нуклеазами, APE1, APTX и APLF), которые способствуют процессированию концов. APE1 обладает эндонуклеазной активностью. APLF проявляет эндонуклеазную и 3'-5'-экзонуклеазную активность. APTX обладает эндонуклеазной и 3'-5'-экзонуклеазной активностью.

[0794] Это концевое процессирование является важной стадией SSBR, поскольку 3'- и/или 5'-концы большинства, если не всех, SSB «повреждены». Процессирование концов обычно включает восстановление поврежденного 3'-конца до гидроксилированного состояния и/или поврежденного 5'-конца до фосфатного фрагмента, так что концы становятся пригодными для лигирования. Ферменты, которые могут процессировать поврежденные 3'-концы, включают PNKP, APE1 и TDP1. Ферменты, которые могут процессировать поврежденные 5'-концы, включают PNKP, бета-ДНК-полимеразу и APTX. LIG3 (ДНК-лигаза III) также может участвовать в процессировании концов. Как только концы очищены, может произойти заполнение пробела.

[0795] На стадии заполнения пробела ДНК обычно присутствуют белки PARP1, ДНК-полимераза бета, XRCC1, FEN1 (флэп-эндонуклеаза 1), ДНК-полимераза дельта/эпсилон, PCNA и LIG1. Существует два способа заполнения пробелов: репарация короткими и длинными последовательностями. Репарация короткими последовательностями включает вставку единственного нуклеотида, который отсутствует. В некоторых SSB «заполнение пробелов» может продолжать вытеснять два или более нуклеотидов (сообщалось о смещении до 12 оснований). FEN1 является эндонуклеазой, которая удаляет смещенные 5'-остатки. Множество ДНК-полимераз, включая Pol β, участвуют в репарации SSB, причем выбор ДНК-полимеразы зависит от источника и типа SSB.

[0796] На четвертой стадии ДНК-лигаза, такая как LIG1 (Лигаза I) или LIG3 (Лигаза III), катализирует соединение концов. Репарация короткими последовательностями использует Лигазу III, а репарация длинными последовательностями использует Лигазу I.

[0797] Иногда SSBR связан с репликацией. Этот путь может включать один или более из CtIP, MRN, ERCC1 и FEN1. Дополнительные факторы, которые могут стимулировать SSBR, включают: aPARP, PARP1, PARP2, PARG, XRCC1, ДНК-полимеразу b, ДНК-полимеразу d, ДНК-полимеразу e, PCNA, LIG1, PNK, PNKP, APE1, APTX, APLF, TDP1, LIG3, FEN1, CtIP, MRN и ERCC1.

(b) MMR (репарация ошибочного спаривания)

[0798] Клетки содержат три пути эксцизионной репарации: MMR, BER и NER. Пути эксцизионной репарации имеют общую особенность в том, что они обычно распознают поражение на одной цепи ДНК, затем экзо/эндонуклеазы удаляют поражение и оставляют 1-30-нуклеотидный прбел, который последовательно заполняются ДНК-полимеразой и, наконец, запечатывается лигазой. Более полная картина дана в Li, Cell Research (2008) 18: 85-98, а краткое изложение представлено в настоящем описании.

[0799] Репарация ошибочного спаривания (MMR) работает с ошибочными основаниями ДНК.

[0800] Оба комплекса MSH2/6 или MSH2/3 обладают активностью АТФаз, которая играет важную роль в распознавании ошибочного спаривания и инициации репарации. MSH2/6 предпочтительно распознает ошибочное спаривание оснований и идентифицирует ошибочные пары из 1 или 2 нуклеотидов, в то время как MSH2/3 преимущественно распознает ошибочные пары более крупных ID.

[0801] hMLH1 гетеродимеризуется с hPMS2 с образованием hMutLα, который обладает активностью АТФазы и важен для нескольких стадий MMR. Он обладает PCNA/фактор репликации C (RFC)-зависимой эндонуклеазной активностью, которая играет важную роль в 3'-ник-направленной MMR с участием EXO1. (EXO1 является участником как HR, так и MMR.) Он регулирует терминацию вызванного ошибочным спариванием удаления. Лигаза I является соответствующей лигазой для этого пути. Дополнительные факторы, которые могут способствовать MMR, включают: EXO1, MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2, MLH3, ДНК Pol d, RPA, HMGB1, RFC и ДНК-лигазу I.

(c) Эксцизионная репарация оснований (BER)

[0802] Путь эксцизионной репарации оснований (BER) активен на протяжении всего клеточного цикла; он отвечает прежде всего за удаление небольших, не искажающих спираль повреждений оснований из генома. Напротив, связанный с этим путь эксцизионной репарации нуклеотидов (обсуждаемый в следующем разделе) восстанавливает объемные повреждения, повреждающие спираль. Более подробное объяснение дано в Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (август 2008 г.), а краткое изложение приведено в настоящем описании.

[0803] При повреждении основания ДНК инициируется эксцизионная репарация оснований (BER), и процесс может быть упрощен до пяти основных стадий: (a) удаление поврежденного основания ДНК; (b) разрез последующего основного сайта; (c) зачистка концов ДНК; (d) вставка корректного нуклеотида в восстанавливаемый пробел; и (e) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва в остове ДНК. Эти последние стадии похожи на SSBR.

[0804] На первой стадии ДНК-гликозилаза, специфичная для повреждения, иссекает поврежденное основание посредством расщепления N-гликозидной связи, связывающей основание с сахарофосфатным остовом. Затем AP-эндонуклеаза-1 (APE1) или бифункциональные ДНК-гликозилазы с ассоциированной лиазной активностью разрезают фосфодиэфирный остов для создания одноцепочечного разрыва ДНК (SSB). Третья стадия BER включает зачистку концов ДНК. Четвертая стадия в BER проводится с помощью Pol β, которая добавляет новый комплементарный нуклеотид в восстанавливаемый пробел, а на последней стадии XRCC1/Лигаза III запечатывает оставшийся одноцепочечный разрыв в остове ДНК. Это завершает путь репарации короткими последовательностями BER, в котором восстанавливается большинство (~ 80%) поврежденных оснований ДНК. Однако, если 5'-концы на стадии 3 устойчивы к активности процессинга концов, после одной вставки нуклеотида с помощью Pol β происходит переключение полимеразы на репликативные ДНК-полимеразы, Pol δ/ɛ, которые затем добавляют еще ~ 2-8 нуклеотидов в пробел репарации ДНК. Это создает 5'-флэп структуру, которая распознается и иссекается флэп-эндонуклеазой-1 (FEN-1) в ассоциации с фактора процессивности в виде ядерного антигена клеточной пролиферации (PCNA). Затем ДНК-лигаза I запечатывает оставшийся одноцепочечный разрыв в остове ДНК и завершает BER длинными последовательностями. Дополнительные факторы, которые могут способствовать пути BER, включают: ДНК-гликозилазу, APE1, Polb, Pold, Pole, XRCC1, Лигазу III, FEN-1, PCNA, RECQL4, WRN, MYH, PNKP и APTX.

(d) Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER)

[0805] Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) является важным эксцизионным механизмом, который удаляет объемные повреждения, нарушающие спираль, из ДНК. Дополнительные подробности о NER приведены в Marteijn et al., Nature Reviews, Molecular Cell Biology 15, 465-481 (2014), а краткое изложение приведено в настоящем описании. NER - расширенный путь, охватывающий два меньших пути: глобальный геномный NER (GG-NER) и связанная с транскрипцией репарация NER (TC-NER). GG-NER и TC-NER используют разные факторы для распознавания повреждений ДНК. Однако, они используют один и тот же аппарат для разреза поражения, репарации и лигирования.

[0806] Как только повреждение распознано, клетка удаляет короткий одноцепочечный сегмент ДНК, содержащий повреждение. Эндонуклеазы XPF/ERCC1 и XPG (кодируемые ERCC5) удаляют поражение, разрезая поврежденную цепь с обеих сторон поражения, что приводит к одноцепочечному пробелу из 22-30 нуклеотидов. Затем клетка выполняет синтез, заполняющий пробел ДНК и лигирование. В этом процессе участвуют: PCNA, RFC, ДНК Пол. δ, ДНК Пол. ε или ДНК Пол. κ и ДНК-лигаза I или XRCC1/Лигаза III. Реплицирующиеся клетки имеют тенденцию использовать ДНК пол. ε и ДНК-лигазу I, в то время как нереплицирующиеся клетки имеют тенденцию использовать ДНК пол. δ, ДНК пол. κ и комплекс XRCC1/Лигазы III для выполнения стадии лигирования.

[0807] NER может включать следующие факторы: XPA-G, POLH, XPF, ERCC1, XPA-G и LIG1. NER, связанная с транскрипцией, (TC-NER), может включать следующие факторы: CSA, CSB, XPB, XPD, XPG, ERCC1 и TTDA. Дополнительные факторы, которые могут способствовать пути репарации NER, включают XPA-G, POLH, XPF, ERCC1, XPA-G, LIG1, CSA, CSB, XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, TTDA, UVSSA, USP7, CETN2, RAD23B, UV-DDB, подкомплекс CAK, RPA и PCNA.

(e) Внутрицепочечная поперечная сшивка (ICL)

[0808] Специальный путь, называемый ICL, восстанавливает межцепочечные поперечные сшивки. Межцепочечные поперечные сшивки или ковалентные поперечные сшивки между основаниями в разных цепях ДНК могут происходить во время репликации или транскрипции. Репарация ICL включает в себя координацию множества процессов репарации, в частности, нуклеолитическую активность, синтеза «чрез/сквозь» повреждения (TLS) и HDR. Нуклеазы рекрутируют для удаления ICL с обеих сторон поперечно сшитых оснований, в то время как TLS и HDR координируют для репарации разрезанных цепей. Репарация ICL может включать следующие факторы: эндонуклеазы, например, XPF и RAD51C, эндонуклеазы, такие как RAD51, полимеразы "чрез/сквозь" повреждение, например, ДНК-полимераза дзета и Rev1), и белки анемии Фанкони (FA), например, FancJ.

(f) Другие пути

[0809] У млекопитающих существует несколько других путей репарации ДНК.

[0810] Синтез «чрез/сквозь» повреждение (TLS) представляет собой путь для репарации одноцепочечного разрыва, оставшегося после дефектного события репликации, и включает в себя полимеразы "чрез/сквозь" повреждение, например, ДНК пол. ζ и Rev1.

[0811] Безошибочная пострепликативная репарация (PRR) - это еще один путь репарации одноцепочечного разрыва, оставшегося после дефектного события репликации.

(6) Примеры гРНК в методах редактирования генома

[0812] Любую из молекул гРНК, как описано в настоящем документе, можно использовать с любыми молекулами Cas9, которые генерируют двухцепочечный разрыв или одноцепочечный разрыв, для изменения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например положения-мишени или генетической сигнатуры-мишени. В некоторых примерах нуклеиновая кислота-мишень находится в локусах TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 или рядом с ними, таких как любые из описанных. В некоторых вариантах осуществления молекула рибонуклеиновой кислоты, такая как молекула гРНК, и белок, такой как белок Cas9 или его варианты, вводятся в любую из сконструированных клеток, предложенных в настоящем описании. Молекулы гРНК, используемые в этих способах, описаны ниже.

[0813] В одном из вариантов осуществления, гРНК, например химерная гРНК, имеет такую конфигурацию, что она имеет одно или более из следующих свойств;

а) она может позиционироваться, например, при нацеливании молекулы Cas9, которая делает двухцепочечные разрывы, двухцепочечный разрыв (i) в пределах 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 нуклеотидов положения-мишени или (ii) достаточно близко, чтобы положение-мишень находилось в области резекции концов;

b) она имеет нацеливающий домен по меньшей мере из 16 нуклеотидов, например, нацеливающий домен из (i) 16, (ii), 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25 или (xi) 26 нуклеотидов; и

с)

(i) проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида, например, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из встречающегося в природе S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis хвостового и проксимального домена или последовательности, которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из них;

(ii) имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis, или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iii) имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iv) хвостовой домен имеет длину, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов, например, он содержит, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов из встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis, или последовательность, которая отличается от него не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов; или

(v) хвостовой домен содержит 15, 20, 25, 30, 35, 40 нуклеотидов или все из соответствующих частей встречающегося в природе хвостового домена, например встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или Н. meningitidis.

[0814] В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (iii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (iv). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (v). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (vi). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (vii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (viii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (ix). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (x). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (xi). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и c. В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a, b и c. В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (i) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (i) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iv) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iv) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (v) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (v) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vi) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vi) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (viii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (viii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ix) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ix) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (x) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (x) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (xi) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (xi) и c (ii).

[0815] В одном варианте осуществления, гРНК, например химерная гРНК, имеет такую конфигурацию, что она имеет одно или более из следующих свойств;

а) одна или обе из гРНК могут позиционироваться, например, при нацеливании молекулы Cas9, которая делает одноцепочечные разрывы, одноцепочечный разрыв в пределах (i) 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, или 500 нуклеотидов от положения-мишени или (ii) достаточно близко, чтобы положение-мишень находилось в области резекции концов;

b) одна или обе имеют нацеливающий домен по меньшей мере из 16 нуклеотидов, например, нацеливающий домен из (i) 16, (ii), 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25 или (xi) 26 нуклеотидов; и

с)

(i) проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида, например, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из встречающегося в природе S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis хвостового и проксимального домена или последовательности, которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из них;

(ii) имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis, или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iii) имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iv) хвостовой домен имеет длину, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов, например, он содержит, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов из встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis, или последовательность, которая отличается от него не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов; или

(v) хвостовой домен содержит 15, 20, 25, 30, 35, 40 нуклеотидов или все из соответствующих частей встречающегося в природе хвостового домена, например встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или Н. meningitidis.

[0816] В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (iii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (iv). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (v). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (vi). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (vii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (viii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (ix). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (x). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и b (xi). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что она включает свойства: a и c. В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a, b и c. В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (i) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (i) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iv) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (iv) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (v) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (v) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vi) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vi) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (vii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (viii) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (viii) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ix) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (ix) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (x) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (x) и c (ii). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (xi) и c (i). В одном варианте осуществления гРНК сконфигурирована так, что включает свойства: a (i), b (xi) и c (ii).

[0817] В одном варианте осуществления гРНК используется с молекулой никазы Cas9, обладающей активностью HNH, например молекулой Cas9, обладающей инактивированной активностью RuvC, например, с молекулой Cas9, имеющей мутацию в D10, например мутацию D10A.

[0818] В одном варианте осуществления гРНК используется с молекулой никазы Cas9, обладающей активностью RuvC, например молекулой Cas9, обладающей инактивированной активностью HNH, например, с молекулой Cas9, имеющей мутацию в H840, например H840A.

[0819] В одном варианте осуществления пара гРНК, например пара химерных гРНК, содержащих первую и вторую гРНК, сконфигурирована так, что они имеют одно или более из следующих свойств;

а) одна или обе из гРНК могут позиционироваться, например, при нацеливании молекулы Cas9, которая делает одноцепочечные разрывы, одноцепочечный разрыв в пределах (i) 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, или 500 нуклеотидов от положения-мишени или (ii) достаточно близко, чтобы положение-мишень находилось в области резекции концов;

b) одна или обе имеют нацеливающий домен по меньшей мере из 16 нуклеотидов, например, нацеливающий домен из (i) 16, (ii), 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25 или (xi) 26 нуклеотидов;

c) для одной или обеих:

(i) проксимальный и хвостовой домены, взятые вместе, содержат, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида, например, по меньшей мере, 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из встречающегося в природе S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis хвостового и проксимального домена или последовательности, которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из них;

(ii) имеется по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 или 53 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis, или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iii) имеется по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида в 3'-области оносительно последнего нуклеотида второго домена комплементарности, например, по меньшей мере 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 или 54 нуклеотида из соответствующей последовательности встречающейся в природе гРНК S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis или последовательности, которая отличается от нее не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов;

(iv) хвостовой домен имеет длину, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов, например, он содержит, по меньшей мере, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов из встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus или N. meningitidis; или последовательность, которая отличается от них не более чем на 1, 2, 3, 4, 5; 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов; или

(v) хвостовой домен содержит 15, 20, 25, 30, 35, 40 нуклеотидов или все из соответствующих частей встречающегося в природе хвостового домена, например встречающегося в природе хвостового домена S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, или N. meningitidis.

d) гРНК имеют такую конфигурацию, что при гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью они разделяются на 0-50, 0-100, 0-200, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30 или, по меньшей мере, 50 нуклеотидов;

e) разрывы, сделанные первой и второй гРНК, находятся на разных цепях; и

f) PAM обращены наружу.

[0820] В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (ii). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (iii). В одном варианте осуществления одна или обе гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (iv). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (v). В одном варианте осуществления одна или обе гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (vi). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (vii). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (viii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (ix). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (x). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и b (xi). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a и c. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a, b и c. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (i) и c (i). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (i) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (i), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (i), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (i), c, d и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ii) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из этих гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ii) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ii), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ii), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ii), c, d и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iii) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iii) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iii), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iii), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iii), c, d и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iv) и c (i). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iv) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iv), c и d. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iv), c и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (iv), c, d и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (v) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (v) и c (ii). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (v), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (v), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (v), c, d и e. В одном варианте осуществления одна или обе гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vi) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из этих гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vi) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vi), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vi), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vi), c, d и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vii) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vii) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vii), c и d. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vii), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (vii), c, d и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (viii) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (viii) и c (ii). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (viii), c и d. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (viii), c и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (viii), c, d и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ix) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ix) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ix), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ix), c и e. В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (ix), c, d и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (x) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (x) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (x), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (x), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (x), c, d и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (xi) и c (i). В одном варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (xi) и c (ii). В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (xi), c и d. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (xi), c и e. В варианте осуществления одна или обе из гРНК сконфигурированы так, что они включают свойства: a (i), b (xi), c, d и e.

[0821] В одном варианте осуществления гРНК используются с молекулой никазы Cas9, обладающей активностью HNH, например молекулой Cas9, обладающей активностью RuvC, например молекулой Cas9, имеющей мутацию в D10, например мутацию D10A.

[0822] В одном варианте осуществления гРНК используются с молекулой никазы Cas9, обладающей активностью RuvC, например молекулой Cas9, обладающей инактивированной активностью HNH, например молекулой Cas9, имеющей мутацию в H840, например H840A. В одном варианте осуществления гРНК используются с молекулой никазы Cas9, обладающей активностью RuvC, например молекулой Cas9, обладающей инактивированной активностью HNH, например молекулой Cas9, имеющей мутацию в N863, например, N863A.

(7) Функциональный анализ агентов для редактирования генов

[0823] Любая из молекул Cas9, молекулы гРНК, комплексы молекулы Cas9/молекулы гРНК могут быть оценены известными в данной области способами или как описано в настоящем документе. Например, иллюстративные способы оценки эндонуклеазной активности молекулы Cas9 описаны, например, в Jinek et al., Science 2012, 337 (6096): 816-821.

(a) Анализ связывания и расщепления: тестирование эндонуклеазной активности молекулы Cas9

[0824] Способность комплекса молекула Cas9/молекула гРНК связываться и расщеплять нуклеиновую кислоту-мишень может оцениваться в анализе расщепления плазмиды. В этом анализе синтетическую или in vitro-транскрибированную молекулу гРНК предварительно отжигают перед реакцией, нагревая до 95°C и медленно охлаждая до комнатной температуры. Нативную или линеаризованную рестрикционным гидролизом плазмидную ДНК (300 нг (~ 8 нМ)) инкубируют в течение 60 мин при 37°С с очищенной молекулой белка Cas9 (50-500 нМ) и гРНК (50-500 нМ, 1:1) в буфере расщепления плазмиды Cas9 (20 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA) с или без 10 мМ MgCl2. Реакции останавливают 5-кратным ДНК-загрузочным буфером (30% глицерина, 1,2% SDS, 250 мМ EDTA), разделяют на электрофорезе в 0,8 или 1% -ном агарозном геле и визуализируют окрашиванием этидийбромидом. Полученные продукты расщепления выявляют, расщепляет ли молекула Cas9 обе цепи ДНК или только одну из двух цепей. Например, линейные продукты ДНК указывают на расщепление обеих цепей ДНК. Разорванные незамкнутые кольцевые продукты выявляют, что расщепляется только одна из двух цепей.

[0825] Альтернативно, способность комплекса молекулы Cas9/молекулы гРНК связываться и расщеплять нуклеиновую кислоту-мишень может быть оценена в анализе расщепления олигонуклеотидной ДНК. В этом анализе олигонуклеотиды ДНК (10 пмоль) радиоактивно метят путем инкубации с 5 единицами полинуклеотидкиназы T4 и ~ 3-6 пмоль (~ 20-40 мКи) [γ-32P] -АТФ в 1X реакционном буфере T4 полинуклеотидкиназы при 37°С в течение 30 мин, в объеме реакции 50 мкл. После тепловой инактивации (65°С в течение 20 мин) реакционные смеси очищают через колонку для удаления неинкорпорированной метки. Дуплексные субстраты (100 нМ) получают путем отжига меченых олигонуклеотидов с эквимолярным количеством немеченого комплементарного олигонуклеотида при 95°С в течение 3 минут с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры. Для анализа расщепления молекулы гРНК отжигают путем нагревания до 95°С в течение 30 с с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры. Cas9 (конечная концентрация 500 нМ) предварительно инкубируют с отожженными молекулами гРНК (500 нМ) в буфере для анализа расщепления (20 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 5% глицерина) в общем количестве объем 9 мкл. Реакции инициируют добавлением 1 мкл ДНК-мишени (10 нМ) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Реакции гасят добавлением 20 мкл загрузочного красителя (5 мМ ЭДТА, 0,025% SDS, 5% глицерина в формамиде) и нагревают до 95°С в течение 5 минут. Продукты расщепления разделяют на 12% денатурирующих полиакриламидных гелях, содержащих 7 М мочевины, и визуализируют путем формирования изображения на люминисцентном фосфорном покрытии. Полученные в результате продукты расщепления выявляют, расщеплена ли комплементарная цепь, некомплементарная цепь или они обе.

[0826] Один или оба из этих анализов могут быть использованы для оценки пригодности любой предложенной молекулы гРНК или молекулы Cas9.

(b) Анализ связывания: тестирование связывания молекулы Cas9 с ДНК-мишенью

[0827] Иллюстративные способы оценки связывания молекулы Cas9 с ДНК-мишенью описаны, например, в Jinek et al., Science 2012; 337 (6096): 816-821.

[0828] Например, в анализе изменения электрофоретической подвижности дуплексы ДНК-мишени образуются путем смешивания каждой цепи (10 нмоль) в деионизированной воде, нагревания до 95°С в течение 3 минут и медленного охлаждения до комнатной температуры. Все ДНК очищают на 8% нативных гелях, содержащих 1X TBE. Полосы ДНК визуализируют с помощью ультрафиолетового затенения, иссекают и элюируют путем вымачивания кусочков геля в обработанной DEPC H₂O. Элюированную ДНК осаждают этанолом и растворяют в обработанной DEPC H₂O. Образцы ДНК с 5'-конца мечены [γ-32P] -АТФ с использованием Т4-полинуклеотидкиназы в течение 30 мин при 37°С. Полинуклеотидкиназу денатурируют нагреванием при 65°С в течение 20 мин, и неинкорпорированную радиоактивную метку удаляют с использованием колонки. Анализы связывания проводят в буфере, содержащем 20 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT и 10% глицерина в общем объеме 10 мкл. Молекула белка Cas9 программируется с помощью эквимолярных количеств предварительно отожженной молекулы гРНК и титруется от 100 пМ до 1 мкМ. ДНК с радиоактивной меткой добавляют до конечной концентрации 20 пМ. Образцы инкубируют в течение 1 часа при 37°С и растворяют при 4°С в 8% нативном полиакриламидном геле, содержащем 1X TBE и 5 мМ MgCl2. Гели сушат и ДНК визуализируют путем формирования изображения на люминисцентном фосфорном покрытии.

(c) Методы измерения термостабильности комплексов Cas9/гРНК

[0829] Термостабильность комплексов рибонуклеопротеина (RNP) Cas9-гРНК можно определить с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF) и других методов. Термостабильность белка может повышаться при благоприятных условиях, таких как добавление связывающей молекулы РНК, например, гРНК. Таким образом, информация, касающаяся термостабильности комплекса Cas9/gRNA, полезна для определения стабильности комплекса.

(d) Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF)

[0830] Термостабильность комплексов рибонуклеопротеина (RNP) Cas9-гРНК может быть измерена с помощью DSF. Комплексы RNP, как описано ниже, включают последовательность рибонуклеотидов, таких как РНК или гРНК, и белок, такой как белок Cas9 или его вариант. Этот метод измеряет термостабильность белка, которая может увеличиваться при благоприятных условиях, таких как добавление молекулы связывающей РНК, например, гРНК.

[0831] Анализ может быть применен несколькими способами. Иллюстративные протоколы включают, но не ограничиваются ими, протокол для определения целевых условий раствора для образования RNP (анализ 1, см. ниже), протокол для тестирования целевого стехиометрического соотношения гРНК: белок Cas9 (анализ 2, см. ниже), протокол для скрининга эффективных молекул гРНК для молекул Cas9, например молекул дикого типа или мутантных молекул Cas9 (анализ 3, см. ниже), и протокол для изучения образования RNP в присутствии ДНК-мишени (анализ 4). В некоторых вариантах осуществления анализ проводится с использованием двух разных протоколов, один для проверки наилучшего стехиометрического соотношения гРНК: белок Cas9, а другой для определения наилучших условий раствора для образования RNP.

[0832] Чтобы определить наилучший раствор для формирования комплексов RNP, готовят раствор 2 мкМ Cas9 в воде+10x SYPRO Orange® (Life Technologies cat # S-6650) и распределяют в 384-луночный планшет. Затем добавляют эквимолярное количество гРНК, разведенное в растворах с различным рН и солью. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут и кратковременного центрифугирования для удаления любых пузырьков используется термоциклер Bio-Rad CFX₃84™ Real-Time System C1000 Touch ™ с программным обеспечением Bio-Rad CFX Manager для запуска градиента от 20°C до 90°C с повышением температуры на 1°С каждые 10 секунд.

[0833] Второй анализ включает смешивание различных концентраций гРНК с 2 мкМ Cas9 в оптимальном буфере из анализа 1 выше и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут в 384-луночном планшете. Добавляют равный объем оптимального буфера+10x SYPRO Orange® (Life Technologies cat # S-6650) и планшет герметизируют клеем Microseal® B (MSB-1001). После непродолжительного центрифугирования для удаления пузырьков, термоциклер Bio-Rad CFX₃84™ Real-Time System C1000 Touch™ с программным обеспечением Bio-Rad CFX Manager используется для запуска градиента от 20°C до 90°C с увеличением на 1°С при температуре каждые 10 секунд.

[0834] В третьем анализе очищают представляющую интерес молекулу Cas9 (например, белок Cas9, например, вариантный белок Cas9). Библиотека вариантов молекул гРНК синтезируется и ресуспендируется до концентрации 20 мкМ. Молекула Cas9 инкубируется с молекулой гРНК в конечной концентрации 1 мкМ каждые в заранее определенном буфере в присутствии 5x SYPRO Orange® (Life Technologies cat # S-6650). После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 2 минут для удаления пузырьков для запуска градиента используется термоциклер Bio-Rad CFX₃84™ Real-Time System C1000 Touch ™ с программным обеспечением Bio-Rad CFX Manager для запуска градиента от 20°C до 90°C с повышением температуры на 1°C каждые 10 секунд.

[0835] В четвертом анализе DSF-эксперимент проводят со следующими образцами: только белок Cas9, белок Cas9 с гРНК, белок Cas9 с гРНК и ДНК-мишенью и белок Cas9 с ДНК-мишенью. Порядок смешивания компонентов: реакционный раствор, белок Cas9, гРНК, ДНК и SYPRO Orange. Реакционный раствор содержит 10 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ NaCl, в отсутствие или в присутствии MgCl2. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 2 минут для удаления любых пузырьков используется термоциклер Bio-Rad CFX₃84™ Real-Time System C1000 Touch™ с программным обеспечением Bio-Rad CFX Manager для запуска градиента от 20°C до 90°C с повышением температуры на 1°С каждые 10 секунд.

b) Доставка агентов для генного редактирования

[0836] В некоторых вариантах осуществления уменьшение, делеция, устранение, нокаут или нарушение эндогенных генов, кодирующих TCR, таких как TRAC и TRBC1 или TRBC2, осуществляется путем доставки или введения одного или более агентов, способных к введению расщепления, например компонентов Cas9 и/или гРНК в клетку с использованием любого из ряда известных способов доставки или носителя для введения или переноса в клетки, например, с использованием лентивирусных векторов доставки, или любых известных способов или носителей для доставки молекул Cas9 и гРНК. Иллюстративные способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505, WO 2015/161276; US 2015/0056705, US 2016/0272999, US 2017/0211075; или US 2017/0016027. В некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие один или более компонентов одного или более агентов, способных вводить расщепление, например разрыв ДНК, вводят в клетки, например, любыми способами для введения нуклеиновых кислот в клетку, описанную в настоящем документе или известную В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий компоненты одного или более агентов, способных вводить расщепление, такие как гид-РНК CRISPR и/или фермент Cas9, могут быть доставлены в клетку.

[0837] Молекулы Cas9 и молекулы гРНК, например комплекс молекула Cas9/молекула гРНК, могут быть использованы для манипуляций с клеткой, например, для редактирования нуклеиновой кислоты-мишени в широком спектре клеток.

[0838] В одном варианте осуществления клетка подвергается манипуляции путем редактирования (например, индуцирования мутации) одного или более генов-мишеней, например, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления модулируется экспрессия одного или более генов-мишеней (например, гена TRAC, TRBC1 и/или TRBC2). В другом варианте осуществления изобретения клетка подвергается манипуляции ex vivo путем редактирования (например, индукции мутации) одного или более генов-мишеней и/или модуляции экспрессии одного или более генов-мишеней, например гена TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, и вводится пациенту. Источники клеток-мишеней для манипуляций ex vivo могут включать, например, кровь пациента, пуповинную кровь пациента или костный мозг пациента. Источники клеток-мишеней для манипуляций ex vivo могут также включать, например, гетерологичную донорскую кровь, пуповинную кровь или костный мозг.

[0839] Молекулы Cas9 и гРНК, описанные в настоящем документе, могут быть доставлены в клетку-мишень. В одном варианте осуществления клеткой-мишенью является Т-клетка, например, CD8+ Т-клетка (например, наивная CD8+ Т-клетка, Т-клетка центральной памяти или Т-клетка эффекторной памяти), CD4+ Т-клетка, Т-клетка-натуральный киллер (NKT-клетки), регуляторные T-клетки (Treg), T-клетки памяти стволовых клеток, лимфоидные клетки-предшественники, гемопоэтические стволовые клетки, клетки-натуральные киллеры (NK-клетки) или дендритные клетки. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку или клетку, полученную из iPS-клетки, например, iPS-клетку, сгенерированную у пациента, которую подвергают манипуляциям, чтобы изменить (например, вызвать мутацию) или манипулировать экспрессией одного или более генов-мишеней, например гена TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, и она дифференцируется, например, в Т-клетку, например, в CD8+ Т-клетку (например, в наивную CD8+ Т-клетку, Т-клетку центральной памяти или эффекторную T-клетку памяти), CD4+ T-клетку, T-клетку памяти стволовых клеток, лимфоидную клетку-предшественник или гемопоэтическую стволовую клетку.

[0840] В одном варианте осуществления клетка-мишень была изменена так, чтобы она содержала гены специфических Т-клеточных рецепторов (TCR) (например, гены TRAC и TRBC). В другом варианте осуществления TCR обладает специфичностью связывания для опухолеассоциированного антигена, например, карциноэмбрионального антигена (CEA), GP100, антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками 1 (MART1), антигена меланомы A3 (MAGEA3), NYESO1 или p53.

[0841] В одном варианте осуществления клетка-мишень была изменена, чтобы она содержала специфический химерный антигенный рецептор (CAR). В одном варианте осуществления CAR обладает специфичностью связывания для опухолеассоциированного антигена, например, CD19, CD20, карбоангидразы IX (CAIX), CD171, CEA, ERBB2, GD2, альфа-фолатного рецептора, антигена Льюиса Y, простат-специфического мембранного антигена (PSMA) или опухолеассоциированного гликопротеин 72 (TAG72).

[0842] В другом варианте осуществления клетка-мишень была изменена для связывания одного или более из следующих опухолевых антигенов, например, с помощью TCR или CAR. Опухолевые антигены могут включать, но не ограничиваются ими, AD034, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, Фибулин-1, HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Галектин9, HOM-MEEL-40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB1, KM -HN-3, KM-KN-1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a, MPP11, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK11, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY -REN-9, NY-SAR-35, OGFr, PLU-1, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, SCP1, SCP-1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B или тирозиназу.

(1) Методы Ex Vivo-доставки компонентов в клетки-мишени

[0843] Компоненты, например молекула Cas9 и молекула гРНК, могут быть введены в клетки-мишени в различных формах с использованием различных способов доставки и составов, см., например, Таблицы 19 и 20. Когда компонент Cas9 или гРНК кодируется в качестве ДНК для доставки, ДНК может обычно, но не обязательно, включать контрольную область, например, содержащую промотор, для осуществления экспрессии. Подходящие промоторы для последовательностей молекул Cas9 включают, например, промоторы CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK или CAG. Подходящие промоторы для гРНК включают, например, промоторы H1, EF-1a, тРНК или U6. Промоторы с аналогичной или различающейся эффективностью могут быть выбраны для регуляции экспрессии компонентов. Последовательности, кодирующие молекулу Cas9, могут содержать сигнал ядерной локализации (NLS), например, NLS SV40. В одном варианте осуществления промотор для молекулы Cas9 или молекулы гРНК может быть независимо индуцируемым, тканеспецифичным или клеточно-специфичным. В некоторых вариантах осуществления агент, способный индуцировать генетическое нарушение, вводит комплексы RNP. Комплексы RNP включают последовательность рибонуклеотидов, таких как молекула РНК или гРНК, и белок, такой как белок Cas9 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления белок Cas9 доставляется в виде рибонуклеопротеинового комплекса (RNP), который включает белок Cas9, представленный в настоящем описании, и молекулу гРНК, представленную в настоящем документе, например, гРНК, нацеленную на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления RNP, который включает одну или более молекул гРНК, нацеленных на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, таких как любой, как описано, и фермент Cas9 или его вариант, непосредственно вводятся в клетку посредством физической доставки (например, электропорацией, генной пушки, трансфекция фосфатом кальция, сжатия или сдавливания клеток) липосом или наночастиц. В конкретных вариантах осуществления RNP включает одну или более молекул гРНК, нацеленных на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, и фермент Cas9 или его вариант вводят посредством электропорации.

[0844] В Таблице 19 приведены примеры формы, в которой компоненты могут быть доставлены в клетку-мишень.

Таблица 19 Иллюстративные способы доставки

Элементы Комментарии Cas9 Молекула(молекулы) гРНК Молекула(молекулы) ДНК ДНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 и гРНК транскрибируются из ДНК. В этом варианте осуществления они кодируются на отдельных молекулах. ДНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 и гРНК транскрибируются из ДНК, здесь из одной молекулы. ДНК РНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 транскрибируется с ДНК, и гРНК предоставляется в виде транскрибированной или синтезированной РНК in vitro. мРНК РНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 транслируется с транскрибированной мРНК in vitro, а гРНК предоставляется в виде транскрибированной или синтезированной РНК in vitro. мРНК ДНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 транслируется с транскрибированной мРНК in vitro, а гРНК транскрибируется с ДНК. Белок ДНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 представлена в виде белка, а гРНК транскрибируется с ДНК. Белок РНК В этом варианте осуществления молекула Cas9 предоставляется в виде белка, а гРНК предоставляется в виде транскрибированной или синтезированной РНК.

[0845] В Таблице 20 суммированы различные способы доставки для компонентов системы Cas, например, компонента молекулы Cas9 и компонента молекулы гРНК, как описано в настоящем документе.

Таблица 20 Сравнение иллюстративных способов доставки

Вектор/способ доставки Доставка в неделящиеся клетки Продолжительность экспрессии Геномная интеграция Тип доставляемой молекулы Физическая (например, электропорация, генная пушка, кальций фосфатная трансфекция, сжатие или сдавливание клеток) ДА Транзиторная НЕТ Нуклеиновые кислоты и белки Вирусный Ретровирус НЕТ Стабильная ДА РНК Лентивирус ДА Стабильная ДА/НЕТ с модификациями РНК Аденовирус ДА Транзиторная НЕТ ДНК Аденоассоциированный вирус (AAV) ДА Стабильная НЕТ ДНК Вирус осповакцины ДА кратко транзиторная НЕТ ДНК Вирус простого герпеса ДА Стабильная НЕТ ДНК Невирусный Катионные липосомы ДА Транзиторная Зависит от того, что доставляется Нуклеиновые кислоты и белки Полимерные наночастицы ДА Транзиторная Зависит от того, что доставляется Нуклеиновые кислоты и белки Биологические невирусные носители доставки Ослабленные бактерии ДА Транзиторная НЕТ Нуклеиновые кислоты Сконструированные бактериофаги ДА Транзиторная НЕТ Нуклеиновые кислоты Вирусоподобные частицы млекопитающих ДА Транзиторная НЕТ Нуклеиновые кислоты Биологические липосомы: Тени эритроцитов и экзосомы ДА Транзиторная НЕТ Нуклеиновые кислоты

(a) ДНК-доставка молекулы Cas9 и/или молекулы гРНК

[0846] ДНК, кодирующая молекулы Cas9 (например, молекулы eaCas9) и/или молекулы гРНК, может быть доставлена в клетки известными в данной области способами или как описано в настоящем документе. Например, ДНК, кодирующая Cas9 и/или кодирующую gRNA, может быть доставлена, например, векторами (например, вирусными или невирусными векторами), не векторными методами (например, с использованием голой ДНК или комплексов ДНК) или их комбинацией.

[0847] В некоторых вариантах осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется вектором (например, вирусным вектором/вирусом или плазмидой).

[0848] Вектор может содержать последовательность, которая кодирует молекулу Cas9 и/или молекулу гРНК. Вектор также может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид (например, для ядерной локализации, нуклеолярной локализации, митохондриальной локализации), слитый, например, с последовательностью молекулы Cas9. Например, вектор может содержать последовательность ядерной локализации (например, из SV40), слитую с последовательностью, кодирующей молекулу Cas9.

[0849] Один или более регуляторных/контрольных элементов, например, промотор, энхансер, интрон, сигнал полиаденилирования, консенсусная последовательность Козака, сайты внутренней посадки рибосомы (IRES), последовательность 2А и акцептор или донор сплайсинга могут быть включены в векторы. В одном варианте осуществления промотор распознается РНК-полимеразой II (например, промотор CMV). В другом варианте осуществления промотор распознается РНК-полимеразой III (например, промотор U6). В другом варианте осуществления промотор представляет собой регулируемый промотор (например, индуцируемый промотор). В другом варианте осуществления промотор является конститутивным промотором. В другом варианте осуществления промотор представляет собой тканеспецифичный промотор. В другом варианте осуществления промотор представляет собой вирусный промотор. В другом варианте осуществления промотор представляет собой невирусный промотор.

[0850] В одном варианте осуществления вектор или носитель доставки представляет собой вирусный вектор (например, для генерации рекомбинантных вирусов). В одном варианте осуществления вирус представляет собой ДНК-вирус (например, вирус dsДНК или ssДНК). В одном варианте осуществления вирус представляет собой РНК-вирус (например, вирус ssРНК). Иллюстративные вирусные векторы/вирусы включают, например, ретровирусы, лентивирусы, аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV), вирусы коровьей оспы, поксвирусы и вирусы простого герпеса.

[0851] В одном варианте осуществления вирус инфицирует делящиеся клетки. В другом варианте осуществления вирус инфицирует неделящиеся клетки. В другом варианте осуществления вирус инфицирует как делящиеся, так и неделящиеся клетки. В другом варианте осуществления вирус может интегрироваться в геном хозяина. В другом варианте осуществления вирус сконструирован так, чтобы иметь пониженный иммунитет, например, у человека. В другом варианте осуществления вирус способен к репликации. В другом варианте осуществления вирус является дефектным по репликации, например, имея делецию или замену на другие гены одной или более кодирующих областей для генов, необходимых для дополнительных циклов репликации и/или упаковки вириона. В другом варианте осуществления вирус вызывает транзиторную экспрессию молекулы Cas9 и/или молекулы гРНК. В другом варианте осуществления вирус вызывает продолжительную экспрессию молекулы Cas9, например, по меньшей мере, 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 год, 2 года или постоянную экспрессию молекулы Cas9 и/или молекулы гРНК. Способность упаковки вирусов может варьироваться, например, от, по меньшей мере, примерно 4 т.п.н. до, по меньшей мере, приблизительно 30 т.п.н., например, по меньшей мере, примерно 5 т.п.н., 10 т.п.н., 15 т.п.н., 15 т.п.н., 20 т.п.н., 25 т.п.н., 30 т.п.н., 35 т.п.н., 40 т.п.н., 45 т.п.н. или 50 т.п.н..

[0852] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется рекомбинантным ретровирусом. В другом варианте осуществления ретровирус (например, вирус мышиного лейкоза Молони) содержит обратную транскриптазу, например, которая позволяет интегрироваться в геном хозяина. В одном варианте осуществления ретровирус является компетентным для репликации. В другом варианте осуществления ретровирус является дефектным по репликации, например, имея делецию или замену на другие гены одной или более кодирующих областей для генов, необходимых для дополнительных циклов репликации и упаковки вириона.

[0853] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется рекомбинантным лентивирусом. Например, лентивирус является дефектным по репликации, например, не содержит одного или более генов, необходимых для репликации вируса.

[0854] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется рекомбинантным аденовирусом. В другом варианте осуществления аденовирус сконструирован так, чтобы иметь пониженный иммунитет у человека.

[0855] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется рекомбинантным AAV. В варианте осуществления AAV может включать свой геном в геном клетки-хозяина, например клетки-мишени, как описано в настоящем документе. В другом варианте осуществления AAV представляет собой самокомплементарный аденоассоциированный вирус (scAAV), например scAAV, который упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе с образованием двухцепочечной ДНК. Серотипы AAV, которые можно использовать в раскрытых способах, включают AAV1, AAV2, модифицированный AAV2 (например, модификации в Y444F, Y500F, Y730F и/или S662V), AAV3, модифицированный AAV3 (например, модификации в Y705F, Y731F и/или T492V).), AAV4, AAV5, AAV6, модифицированный AAV6 (например, модификации в S663V и/или T492V), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh l0 и псевдотипированный AAV, такой как AAV2/8, AAV2/5 и AAV2/6, также могут быть использованы в раскрытых способах.

[0856] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется гибридным вирусом, например гибридом одного или более вирусов, описанных в настоящем документе.

[0857] Упаковочная клетка используется для образования вирусной частицы, способной инфицировать клетку-мишень. Такая клетка включает клетку 293, которая может упаковывать аденовирус, и клетку ψ2 или клетку PA317, которая может упаковывать ретровирус. Вирусный вектор, используемый в генной терапии, обычно генерируется линией клеток-продуцентов, которые упаковывают вектор нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Вектор обычно содержит минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в клетку-хозяин или клетку-мишень (если применимо), при этом другие вирусные последовательности заменяются экспрессирующей кассетой, кодирующей подлежащий экспрессии белок, например, Cas9. Например, вектор AAV, используемый в генной терапии, обычно содержит только последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) из генома AAV, которые необходимы для упаковки и экспрессии гена в клетке-хозяине или клетке-мишени. Отсутствующие вирусные функции обеспечиваются в транс-активной упаковочной клеточной линии. С этого момента вирусная ДНК упакована в клеточную линию, которая содержит плазмиду-помощник, кодирующую другие гены AAV, а именно rep и cap, но без последовательностей ITR. Клеточная линия также инфицируется аденовирусом в качестве помощника. Вирус-помощник способствует репликации вектора AAV и экспрессии генов AAV из плазмиды-помощника. Плазмида-помощник не упаковывается в значительных количествах из-за отсутствия последовательностей ITR. Загрязнение аденовирусом может быть уменьшено, например, тепловой обработкой, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV.

[0858] В одном варианте осуществления вирусный вектор обладает способностью распознавания типа клеток. Например, вирусный вектор может быть псевдотипирован с другим/альтернативным вирусным оболочечным гликопротеином; сконструирован со специфическим для типа клеток рецептором (например, генетическая модификация гликопротеинов вирусной оболочки для включения нацеливающих лигандов, таких как пептидный лиганд, одноцепочечное антитело, фактор роста); и/или сконструирован так, чтобы иметь молекулярный мостик с двойной специфичностью, при этом один конец распознает вирусный гликопротеин, а другой конец распознает фрагмент поверхности клетки-мишени (например, лиганд-рецептор, моноклональное антитело, авидин-биотин и химическую конъюгацию).

[0859] В одном варианте осуществления вирусный вектор достигает экспрессии, специфической для типа клеток. Например, тканеспецифичный промотор может быть сконструирован для ограничения экспрессии трансгена (Cas 9 и гРНК) только в конкретной клетке-мишени. Специфичность вектора также может быть опосредована микроРНК-зависимым контролем экспрессии трансгена. В одном варианте осуществления вирусный вектор обладает повышенной эффективностью слияния вирусного вектора и мембраны клетки-мишени. Например, слитый белок, такой как способный к слиянию гемагглютинин (HA), может быть включен для увеличения поглощения вируса клетками. В одном варианте осуществления вирусный вектор обладает способностью ядерной локализации. Например, вирус, который требует разрушения ядерной мембраны (во время клеточного деления) и, следовательно, не будет инфицировать неделящуюся клетку, может быть изменен для включения пептида ядерной локализации в матричный белок вируса, тем самым обеспечивая возможность трансдукции пролиферирующих клеток.

[0860] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется не векторным способом (например, с использованием голой ДНК или комплексов ДНК). Например, ДНК может быть доставлена, например, органически модифицированным кремнеземом или силикатом (Ormosil), электропорацией, транзиторным сжатием или сдавливанием клеток (например, как описано в Lee et al. [2012] Nano Lett 12: 6322-27), генной пушкой, сонопорацией, магнитофекцией, липид-опосредованная трансфекцией, дендримерами, неорганическими наночастицами, фосфатом кальция или их комбинацией.

[0861] В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации включает смешивание клеток с ДНК, кодирующей Cas9 и/или гРНК, в картридже, камере или кювете и подачу одного или более электрических импульсов определенной длительности и амплитуды. В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации осуществляется с использованием системы, в которой клетки смешиваются с ДНК, кодирующей Cas9 и/или gRNA, в сосуде, соединенном с устройством (например, насосом), который подает смесь в картридж, камеру или кювету, в которой подается один или более электрических импульсов определенной длительности и амплитуды, после чего клетки доставляются во второй сосуд.

[0862] В одном варианте осуществления ДНК, кодирующая Cas9 и/или гРНК, доставляется комбинацией векторного и не векторного метода. Например, виросома содержит липосому, объединенную с инактивированным вирусом (например, вирусом HIV или вирусом гриппа), который может привести к более эффективному переносу гена, чем только вирусный или липосомный метод.

[0863] В одном варианте осуществления носитель доставки представляет собой невирусный вектор. В одном варианте осуществления невирусный вектор представляет собой неорганическую наночастицу. Иллюстративные неорганические наночастицы включают, например, магнитные наночастицы (например, Fe3MnO2) и диоксид кремния. Наружная поверхность наночастицы может быть конъюгирована с положительно заряженным полимером (например, полиэтиленимином, полилизином, полисерином), который позволяет прикреплять (например, конъюгировать или захватывать) полезную нагрузку. В одном варианте осуществления невирусный вектор представляет собой органическую наночастицу. Иллюстративные органические наночастицы включают, например, липосомы SNALP, которые содержат катионные липиды вместе с нейтральными липидами-помощниками, которые покрыты полиэтиленгликолем (ПЭГ), и комплексы протамин-нуклеиновая кислота, покрытые липидом.

[0864] Иллюстративные липиды для переноса генов представлены ниже в Таблице 21.

Таблица 21 Липиды, используемые для переноса генов

Липид Сокращение Признак 1,2-Диолеил-sn-глицеро-3-фосфатидил DOPC Помощник 1,2-Диолеил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин DOPE Помощник Холестерин Помощник N-[1-(2,3-Диолеилокси)пропил]N, N,N-триметиламмоний хлорид DOTMA Катионный 1,2-Диолеилoxy-3- триметиламмоний-пропан DOTAP Катионный Диоктадециламидоглицилспермин DOGS Катионный N-(3-аминопропил)-N, N-диметил-2,3-bis(додецилокси)-1-пропанаминий бромид GAP-DLRIE Катионный Цетилтриметиламмоний бромид CTAB Катионный 6-Лауроксигексил орнитинат LHON Катионный 1-(2,3-Диолеилоксипропил)-2,4,6-триметилпиридиний 2Oc Катионный 2,3-Диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо-этил]-N, N-диметил-1-пропанаминий трифторацетат DOSPA Катионный 1,2-диолеил-3-триметиламмоний-пропан DOPA Катионный N-(2-Гидроксиэтил)-N, N-диметил-2,3-bis(тетрадецилокси)-1-пропанаминий бромид MDRIE Катионный Димиристооксипрпил диметил гидроксиэтил аммоний бромид DMRI Катионный 3β-[N-(N',N'-Диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерин DC-Chol Катионный Бис-гуанидиний-трен-холестерин BGTC Катионный 1,3-Диодезокси-2-(6-карбокси-спермил)-пропиламид DOSPER Катионный Диметилоктадециламмоний бромид DDAB Катионный Диоктадециламидоглицилспермидин DSL Катионный rac-[(2,3-Диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]-диметиламмоний хлорид CLIP-1 Катионный rac-[2(2,3-Дигексадецилоксипропил-оксиметилокси)этил]триметиламмоний бромид CLIP-6 Катионный Этилдимиристоилфосфатидил EDMPC Катионный 1,2-Дистеарилокси-N, N-диметил-3-аминопропан DSDMA Катионный 1,2-Димиристоил-триметиламмоний пропан DMTAP Катионный O, O'-Димиристил-N-лизил аспартат DMKE Катионный 1,2-Дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин DSEPC Катионный N-пальмитоил D-эритро-сффингозил карбамоил-спермин CCS Катионный N-t-бутил-N0-тетрадецил-3-тетрадециламинопопионамидин diC14-амидин Катионный Октадеценоилокси[этил-2-гептадеценил-3 гидроксиэтил] имидазолиний хлорид DOTIM Катионный N1-Холестерилоксикарбонил-3,7-диазанонан-1,9-диамин CDAN Катионный 2-(3-[Бис(3-аминопропил)-амино]пропиламино)-N-дитетрадецилкарбамоил-этил-ацетамид RPR209120 Катионный 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропан DLinDMA Катионный 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан DLin-KC2-DMA Катионный дилинолеил-метил-4-диметиламинобутират DLin-MC3-DMA Катионный

[0865] Иллюстративные полимеры для переноса генов прдставлены ниже в Таблице 22.

Таблица 22 Полимеры, используемые для переноса генов

Полимер Сокращение Поли(этилен)гликоль PEG Полиэтиленимин PEI Дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP Диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат DTBP Поли(этиленимин) бискарбамат PEIC Поли(L-лизин) PLL Гистидин модифицированный PLL Поли(N-винилпирролидон) PVP Поли(пропиленимин) PPI Поли(амидоамин) PAMAM Поли(амидоэтиленимин) SS-PAEI Триэтилентетрамин TETA Поли(β-аминоэфир) Поли(4-гидрокси-L-пролиновый эфир) PHP Поли(аллиламин) Поли(α-[4-аминобутил]-L-гликолевая кислота) PAGA Поли(D, L-молочная-ко-гликолевая кислота) PLGA Поли(N-этил-4-винилпиридиний бромид) Поли(фосфазены) PPZ Поли(фосфоэфиры) PPE Поли(фосфорамидаты) PPA Поли(N-2-гидроксипропилметакриламид) pHPMA Поли(2-(диметиламино)этил метакрилат) pDMAEMA Поли(2-аминоэтилпрпилен фосфат) PPE-EA Хитозан Галактозилированный хитозан N-Додацилированный хитозан Гистон Коллаген Декстран-спермин D-SPM

[0866] В одном варианте осуществления носитель имеет нацеливающие модификации для увеличения поглощения клеток-мишеней наночастиц и липосом, например, клеточно-специфических антигенов, моноклональных антител, одноцепочечных антител, аптамеров, полимеров, сахаров и пептидов, проникающих в клетки. В одном варианте осуществления носитель использует фузогенные и дестабилизирующие эндосомы пептиды/полимеры. В варианте осуществления носитель претерпевает вызванные кислотой конформационные изменения (например, чтобы ускорить эндосомное освобождение карго). В одном варианте осуществления расщепляемый стимулом полимер используется, например, для высвобождения в клеточном компартменте. Например, могут быть использованы катионные полимеры на основе дисульфида, которые расщепляются в восстановливающих условиях клеточной среды.

[0867] В варианте осуществления носитель для доставки представляет собой биологический невирусный носитель для доставки. В одном варианте осуществления носитель представляет собой аттенуированную бактерию (например, природную или искусственно сконструированную, чтобы быть инвазивной, но аттенуированной для предотвращения патогенеза и экспрессии трансгена (например, Listeria monocytogenes, некоторые штаммы Salmonella, Bifidobacterium longum и модифицированная Escherichia coli), бактерии, имеющие питательный и тканеспецифичный тропизм к определенным клеткам (бактерии, имеющие модифицированные поверхностные белки для изменения специфичности клеток-мишеней). В одном варианте осуществления носитель представляет собой генетически модифицированный бактериофаг (например, сконструированные фаги, обладающие большой упаковочной способностью, меньшей иммуногенностью, содержащие последовательности поддержания плазмиды млекопитающих и включающие нацеливающие лиганды). В одном варианте осуществления носитель представляет собой вирусоподобную частицу млекопитающего. Например, могут быть получены модифицированные вирусные частицы (например, путем очистки «пустых» частиц с последующей сборкой вируса ex vivo с желаемым карго). Носитель также может быть сконструирован так, чтобы включать нацеливающие лиганды для изменения специфичности ткани мишени. В одном варианте осуществления носитель представляет собой биологическую липосому. Например, биологическая липосома представляет собой частицу на основе фосфолипида, полученную из клеток человека (например, фиктивных эритроцитов, которые представляют собой эритроциты, расщепленные на сферические структуры, полученные от пациента (например, нацеливание на ткань может быть достигнуто путем прикрепления различных ткане- или клеточно-специфических лигандов), или секреторные экзосомы - связанные с мембраной нановезикулы (30-100 нм) эндоцитозного происхождения (например, могут быть получены из клеток различных типов и поэтому могут поглощаться клетками без необходимости нацеливания на лиганды).

[0868] В одном варианте осуществления доставляются одна или более молекул нуклеиновой кислоты (например, молекулы ДНК), отличных от компонентов системы Cas, например компонента молекулы Cas9 и/или компонента молекулы гРНК, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты доставляется одновременно с одним или более компонентами системы Cas. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты доставляется до или после (например, с интервалом менее чем примерно 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 6 часов, 9 часов, 12 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 1 неделю, 2 недели или 4 недели) одного или более компонентов системы Cas. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты доставляется способом, отличным от способа доставки одного или более компонентов системы Cas, например компонента молекулы Cas9 и/или компонента молекулы гРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть доставлена любым из способов доставки, описанных в настоящем документе. Например, молекула нуклеиновой кислоты может доставляться вирусным вектором, например ретровирусом или лентивирусом, а компонент молекулы Cas9 и/или компонент молекулы гРНК может доставляться электропорацией. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует ген TRAC, ген TRBC или ген CAR.

(b) Доставка РНК, кодирующей молекулу Cas9

[0869] РНК, кодирующая молекулы Cas9 (например, молекулы eaCas9, молекулы eiCas9 или слитые белки eiCas9) и/или молекулы гРНК, могут быть доставлены в клетки, например клетки-мишени, описанные в настоящем документе, известными в данной области способами или как описано в настоящем документе. Например, Cas9-кодирующая и/или гРНК-кодирующая РНК может быть доставлена, например, путем микроинъекции, электропорации, транзиторного сжатия или сдавливания клеток (например, как описано в Lee et al. [2012] Nano Lett 12: 6322-27) липид-опосредованной трансфекции, пептид-опосредованной доставки или их комбинации.

[0870] В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации включает смешивание клеток с РНК, кодирующей молекулы Cas9 (например, молекулы eaCas9, молекулы eiCas9 или слитые белки eiCas9) и/или молекулы гРНК, в картридже, камере или кювете и подачу одного или более электрических импульсов определенной продолжительности и амплитуды. В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации осуществляется с использованием системы, в которой клетки смешиваются с РНК, кодирующей молекулы Cas9 (например, молекулы eaCas9, молекулы eiCas9 или слитые белки eiCas9) и/или молекулы гРНК в сосуде, подключенном к устройству (например, насосу), который подает смесь в картридж, камеру или кювету, в которую подается один или более электрических импульсов определенной длительности и амплитуды, после чего клетки доставляются во второй сосуд.

(c) Доставка белка Cas9 и рибонуклеопротеина (RNP)

[0871] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов, способных вводить расщепление, например система Cas9/гРНК, вводятся в клетку в виде рибонуклеопротеинового комплекса (RNP). Комплексы RNP включают последовательность рибонуклеотидов, таких как молекула РНК или гРНК, и белок, такой как белок Cas9 или его вариант. Например, белок Cas9 доставляется в виде комплекса RNP, который включает белок Cas9 и молекулу гРНК, нацеленную на последовательность-мишень, например, с помощью электропорации или другого метода физической доставки. В некоторых вариантах осуществления RNP доставляется в клетку посредством электропорации или другими физическими средствами, например, с помощью генной пушки, трансфекции фосфатом кальция, сжатия или сдавливания клетки. В некоторых вариантах осуществления RNP может пересекать плазматическую мембрану клетки без необходимости в дополнительных агентах доставки (например, низкомолекулярных агентах, липидах и т. д.).

[0872] В некоторых вариантах осуществления доставка одного или более агентов, способных индуцировать генетическое нарушение, например CRISPR/Cas9, в качестве RNP дает преимущество в том, что направленное нарушение происходит транзиторно, например, в клетках, в которые введен RNP, без размножения агента в потомстве клеток. Например, доставка с помощью RNP сводит к минимуму наследование агента потомством клеток, тем самым уменьшая вероятность ошибочного генетического нарушения в потомстве.

[0873] В некоторых вариантах осуществления более чем один агент(ы) или его компоненты доставляются в клетку. Например, в некоторых вариантах осуществления агент(ы), способный вызывать генетическое нарушение двух или более участков в геноме, например, локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, доставляется в клетку. В некоторых вариантах осуществления агент(ы) и их компоненты доставляются с использованием одного способа. Например, в некоторых вариантах осуществления агент(ы) для индукции генетического нарушения локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2 доставляются в виде полинуклеотидов, кодирующих компоненты для генетического нарушения. В некоторых вариантах осуществления один полинуклеотид может кодировать агенты, которые нацелены на локусы TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления два или более разных полинуклеотида могут кодировать агенты, которые нацелены на локусы TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления агенты, способные индуцировать генетическое нарушение, могут доставляться в виде комплексов рибонуклеопротеинов (RNP), и два или более различных комплексов RNP могут доставляться вместе в виде смеси или по отдельности.

[0874] Молекулы Cas9 (например, молекулы eaCas9, молекулы eiCas9 или слитые белки eiCas9) могут быть доставлены в клетки известными в данной области способами или как описано в настоящем документе. Например, белковые молекулы Cas9 могут быть доставлены, например, путем микроинъекции, электропорации, транзиторного сжатия или сдавливания клеток (например, как описано в Lee et al. [2012] Nano Lett 12: 6322-27), липид-опосредованной трансфекции, пептид-опосредованной доставки или их комбинации. Доставка может сопровождаться ДНК, кодирующей гРНК или с помощью гРНК. В некоторых вариантах осуществления белок Cas9 доставляется в виде рибонуклеопротеинового комплекса (RNP), который включает белок Cas9, представленный в настоящем описании, и молекулу гРНК, представленную в настоящем документе, например, гРНК, нацеленную на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления комплекс RNP включает последовательность рибонуклеотидов, такую как молекула РНК или гРНК, и белок, такой как белок Cas9 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления RNP, который включает одну или более молекул гРНК, нацеленных на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, таких как любой описанный, и фермент Cas9 или его вариант, непосредственно вводится в клетку посредством физической доставки (например, электропорации, генной пушки, трансфекции фосфатом кальция, сжатия или сдавливания клеток) липосом или наночастиц. В конкретных вариантах осуществления RNP включает одну или более молекул гРНК, нацеленных на TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, таких как любые описанные, и фермент Cas9 или его вариант вводят посредством электропорации.

[0875] В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации включает смешивание клеток с молекулами Cas9 (например, молекулами eaCas9, молекулами eiCas9 или слитыми белками eiCas9) с или без молекул гРНК в картридже, камере или кювете и подачу одного или более электрических импульсов определенной длительности и амплитуды. В одном варианте осуществления доставка посредством электропорации осуществляется с использованием системы, в которой клетки смешаны с молекулами Cas9 (например, молекулами eaCas9, молекулами eiCas9 или белками слияния eiCas9) с молекулами гРНК или без них в сосуде, подключенном к устройству (например, насосу), который подает смесь в картридж, камеру или кювету, в которую подается один или более электрических импульсов определенной длительности и амплитуды, после чего клетки доставляются во второй сосуд.

B. Направленная интеграция с помощью направляемой гомологией репарации (HDR)

[0876] В некоторых вариантах осуществления, предложенных в настоящем описании, направляемая гомологией репарация (HDR) может использоваться для направленной интеграции конкретной части матричного полинуклеотида, содержащего трансген, например последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из представленных рекомбинантных рецепторов, например рекомбинантный T клеточный рецептор (TCR), в определенный участок в геноме, например, локус TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, например трансген, кодирующий рекомбинантный Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент или цепь, вводится в клетку, например иммунную клетку, имеющую генетическое нарушение сайта-мишени в гене константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или в гене константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC). В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты или трансген, кодирующий рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или его цепь, направляются для интеграции в сайт-мишень или рядом с ним посредством направляемой гомологией репарации (HDR). В конкретных вариантах осуществления интеграция в сайт-мишень или рядом с ним происходит в пределах части кодирующей последовательности гена TRAC и/или TRBC, такой как, например, часть кодирующей последовательности ниже или в 3'-области от сайта-мишени.

[0877] В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень находится в гене константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC). В некоторых вариантах осуществления сайт(сайты)-мишень находится в гене константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2). В некоторых вариантах осуществления один или более сайтов-мишеней находятся в гене TRAC и один или оба из гена TRBC1 и TRBC2. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты и/или трансген, кодирующий рекомбинантный рецептор, такой как любой из представленных TCR или его часть, вводится в иммунную клетку, имеющую генетическое нарушение одного или более сайтов-мишеней в пределах TRAC, TRBC1 и/или TRBC2, направленное на один сайт-мишень из, по меньшей мере, одного сайта-мишени посредством HDR, или рядом с ним.

[0878] В некоторых вариантах осуществления направленное генетическое нарушение и направленная интеграция нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантный рецептор, посредством HDR происходит в одном или более сайтах-мишенях (также известных как «положение-мишень», «последовательность ДНК-мишени» или «локализация-мишень») эндогенных генов, которые кодируют один или более доменов, областей и/или цепей эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления варианты осуществления, представленные в настоящем описании, включают одно или более направленных генетических нарушений, например разрыв ДНК, в одном или более локусах эндогенного гена TCR (как например, эндогенные гены, кодирующие константные домены TCRα и/или TCRβ) методами редактирования генов в комбинации с направленным нокином нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантный рецептор (как например, рекомбинантный TCR или CAR), путем направляемой гомологией репарации (HDR). В некоторых вариантах осуществления разрыв ДНК происходит в результате стадии редактирования генов, например разрывов ДНК, генерируемых направленными нуклеазами, используемыми для введения направленного генетического нарушения, такого как любые описанные здесь. Примеры способов редактирования генов эндогенных локусов TCR известны и включают, но не ограничиваются ими, описанные в настоящем документе или в другом месте, например, в публикациях США № US 2011/0158957, US 2014/0301990, US 2015/0098954, US2016/0208243, US2016/272999 и US2015/056705; Международных публикациях PCT №. WO2014/191128, WO2015/136001, WO2015/161276, WO2016/069283, WO2016/016341, WO2017/193107 и WO2017/093969; и в Osborn et al. (2016) Mol. Ther. 24 (3): 570-581.

[0879] Изменение последовательностей нуклеиновых кислот в сайте-мишени может происходить с помощью HDR с экзогенно предоставленным матричным полинуклеотидом (также называемым донорным полинуклеотидом или матричной последовательностью). Например, матричный полинуклеотид обеспечивает изменение последовательности-мишени, такое как вставка трансгена, содержащегося в матричном полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления плазмиду или вектор можно использовать в качестве матрицы для гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления линейный фрагмент ДНК можно использовать в качестве матрицы для гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечный матричный полинуклеотид можно использовать в качестве матрицы для изменения последовательности-мишени альтернативными методами направляемой гомологией репарации (например, отжиг одной цепи) между последовательностью-мишенью и матричным полинуклеотидом. Модифицированное полинуклеотидом изменение последовательности-мишени зависит от расщепления нуклеазой, например направленной нуклеазой, такой как CRISPR/Cas9. Расщепление нуклеазой может включать двухцепочечный разрыв или два одноцепочечных разрыва.

[0880] В некоторых вариантах осуществления способы для HDR включают введение в иммунную клетку, например, Т-клетку, одного или более агентов, где каждый из одного или более агентов независимо способен индуцировать генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC). В некоторых вариантах осуществления один или более агентов могут включать нуклеазу цинкового пальца (ZFN), TAL-эффекторную нуклеазу (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, которая специфически связывается, распознает или гибридизуется с сайтом-мишенью в локусе TRAC или TRBC, например, с использованием методов, описанных выше в разделе V.A. В некоторых вариантах осуществления один или более агентов вводят, используя комбинацию CRISPR-Cas9, в которой каждый из одного или более агентов содержит гид-РНК (гРНК), содержащую нацеливающий домен, который комплементарен по меньшей мере одному сайту-мишени. Любые последовательности нацеливающих доменов гРНК, которые нацелены на локус TRAC или TRBC, можно использовать для осуществления генетического нарушения, включая любые, описанные выше. В некоторых вариантах осуществления локус TRAC для нацеливания на локус TRAC представляет собой GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO: 1048). В некоторых вариантах осуществления последовательность нацеливающего домена гРНК для нацеливания на локус TRBC представляет собой GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO: 1053).

[0881] В некоторых вариантах осуществления HDR включает введение в иммунную клетку, например T-клетку, одной или более нацеливающих последовательностей гРНК, способных индуцировать генетическое нарушение гена константной области T-клеточного рецептора альфа (TRAC).

[0882] В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение осуществляют путем введения в клетку последовательности нацеливающего домена гРНК вместе с Cas9, например, с использованием способов, описанных выше. Cas9 может быть введен в виде нуклеиновой кислоты или в виде кодируемого белка. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение осуществляют путем введения в клетку, например посредством электропорации, комплекса рибонуклеопротеина (RNP), содержащего гРНК и белок Cas9, например, с использованием способов, описанных выше.

В некоторых вариантах осуществления способы HDR дополнительно включают введение в клетку полинуклеотида, такого как матричный полинуклеотид, который содержит (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из предложенных TCR или его антигенсвязывающих частей, и (b) одно или более плечей гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC). В некоторых вариантах осуществления одно или более плеч гомологии облегчают передачу генетической информации из матричного полинуклеотида в локус-мишень, например, сайт-мишень локуса TRAC.

[0883] В некоторых вариантах осуществления «рекомбинация» относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления «гомологичная рекомбинация (HR)» относится к специализированной форме такого обмена, который имеет место, например, во время репарации двухцепочечных разрывов в клетках с помощью механизмов репарации, направляемой гомологией. Этот процесс требует гомологии нуклеотидной последовательности, использует матричный полинуклеотид для матричной репарации ДНК-мишени (то есть той, которая подверглась двухцепочечному разрыву, например, сайт-мишень в эндогенном гене) и по-разному известен как «не-кроссоверная генная конверсия» или«генная конверсия короткого тракта», потому что это приводит к переносу генетической информации от матричного полинуклеотида к мишени. В некоторых вариантах осуществления такой перенос может включать коррекцию ошибочного спаривания гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной мишенью, например, из-за генетического нарушения, и матричным полинуклеотидом, и/или «отжиг цепи в зависимости от синтеза», в котором матричный полинуклеотид используется для повторного синтеза генетической информации, которая станет частью мишени, и/или связанных процессов. Такая специализированная HR часто приводит к изменению последовательности молекулы-мишени, так что часть или вся последовательность матричного полинуклеотида включается в полинуклеотид-мишень.

[0884] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид, например полинуклеотид, содержащий трансген, интегрируется в геном клетки с помощью механизмов, независимых от гомологии. Способы включают создание двухцепочечного разрыва (DSB) в геноме клетки и расщепление матричной полинуклеотидной молекулы с использованием нуклеазы, так что матричный полинуклеотид интегрируется в сайт DSB. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид интегрируется не зависящими от гомологии способами (например, NHEJ). После in vivo-расщепления матричные полинуклеотиды могут быть целенаправленно интегрированы в геном клетки в место расположения DSB. Матричный полинуклеотид может включать один или более одинаковых сайтов-мишеней для одной или более нуклеаз, используемых для создания DSB. Таким образом, матричный полинуклеотид может быть расщеплен одной или болееи одинаковыми нуклеазами, используемыми для расщепления эндогенного гена, в котором желательна интеграция. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид включает сайты-мишени нуклеаз, отличные от нуклеаз, используемых для индукции DSB. Как описано в настоящем документе, генетическое нарушение сайта-мишени или положения-мишени может быть создано любыми механизмами, такими как ZFN, TALEN, система CRISPR/Cas9 или нуклеазы TtAgo.

[0885] В некоторых вариантах осуществления, предложенных в настоящем описании, направляемая гомологией репарация (HDR) может использоваться для направленной интеграции конкретной части матричного полинуклеотида, содержащего трансген, например последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из представленных рекомбинантных рецепторов, например рекомбинантные TCR, в определенный участок в геноме, например, локус TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления наличие генетического нарушения (например, разрыва ДНК) и полинуклеотида, например, матричного полинуклеотида, содержащего одно или более плеч гомологии (например, последовательности нуклеиновой кислоты, гомологичные последовательностям, окружающим генетическое нарушение), используются для индукции или прямой HDR с гомологичными последовательностями, действующими в качестве матрицы для репарации ДНК.

[0886] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид, имеющий гомологию с последовательностями в одном или более сайтах-мишенях в эндогенной ДНК или рядом с ними, можно использовать для изменения структуры ДНК-мишени, например, направленной вставки трансгена. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит последовательности гомологии (например, плечи гомологии), фланкирующие трансген, например последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие рекомбинантный рецептор, для направленной вставки. В некоторых вариантах осуществления гомологичные последовательности нацелены на трансген в одном или более из локусов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид включает дополнительные последовательности (кодирующие или некодирующие последовательности) между плечами гомологии, такие как регуляторные последовательности, такие как промоторы и/или энхансеры, донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга, сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), последовательности, кодирующие элементы пропуска рибосомы (например, 2A-пептиды), маркеры и/или сайты SA, и/или один или более дополнительных трансгенов.

[0887] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид включает или содержит трансген, часть трансгена и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный рецептор, такой как рекомбинантный TCR или его цепь, которые содержат один или более вариабельных доменов и один или более константных доменов. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный TCR или его цепь содержат один или более константных доменов, которые имеют полную, например, 100% или примерно 100% идентичности со всем или с частью и/или фрагментом константного домена эндогенного TCR. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует весь или часть константного домена, например часть или фрагмент константного домена, который полностью или частично идентичен константному домену эндогенного TCR. В некоторых вариантах осуществления трансген содержит нуклеотиды последовательности, имеющей или имеющей по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 99,9% идентичности со всей или с частью последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 348, 349 или 1047.

[0888] В некоторых вариантах осуществления трансген содержит последовательность, кодирующую цепь TCRα и/или TCRβ или их часть, которая была оптимизирована по кодонам. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует часть цепи TCRα и/или TCRβ с менее чем 100% идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующей частью нативной или эндогенной цепи TCRα и/или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления кодируемая цепь TCRα и/или TCRβ содержит аминокислотную последовательность, которая имеет, имеет примерно или имеет по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или более чем 99% идентичности, но менее 100% идентичности с соответствующей нативной или эндогенной цепью TCRα и/или TCRβ. В конкретных вариантах осуществления трансген кодирует константный домен TCRα и/или TCRβ или его часть с менее чем 100% идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующим нативным или эндогенным константным доменом TCRα и/или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления константный домен TCRα и/или TCRβ содержит аминокислотную последовательность, которая имеет, имеет примерно или имеет по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или более чем 99% идентичности, но менее 100% идентичности с соответствующей нативной или эндогенной цепью TCRα и/или TCRβ. В конкретных вариантах осуществления трансген кодирует константные домены цепей TCRα и/или TCRβ и/или константные домены TCRα и/или TCRβ, содержащие одну или более модификаций для введения одной или более дисульфидных связей. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует цепь TCRα и/или TCRβ и/или TCRα и/или TCRβ с одной или болееи модификациями для удаления или предотвращения нативной дисульфидной связи, например, между TCRα, кодируемой трансгеном, и эндогенной цепью TCRβ, или между TCR β, кодируемой трансгеном, и эндогенной цепью TCR α. В некоторых вариантах осуществления один или более нативных цистеинов, которые образуют и/или способны образовывать нативную межцепочечную дисульфидную связь, замещены другим остатком, например серином или аланином. В некоторых вариантах осуществления цепи TCRα и/или TCRβ и/или константные домены цепи TCRα и/или TCRβ модифицированы для замены одного или более нецистеиновых остатков на цистеин. В некоторых вариантах осуществления один или более ненативных остатков цистеина способны образовывать ненативные дисульфидные связи, например, между рекомбинантной цепью TCRα и цепью TCRβ, кодируемой трансгеном. В некоторых вариантах осуществления цистеин вводится в один или более из остатков Thr48, Thr45, Tyr10, Thr45 и Ser15 на основании нумерации константного домена TCRα, представленного в SEQ ID NO: 1352. В некоторых вариантах осуществления цистеины могут быть введены в остаток Ser57, Ser77, Ser17, Asp59 Glu15 цепи TCR β на основани нумерации цепи TCRβ, представленной в SEQ ID NO: 1353. Иллюстративные ненативные дисульфидные связи TCR описаны в опубликованных Международных РСТ № WO 2006/000830, WO 2006/037960 и Kuball et al. (2007) Blood, 109: 2331-2338.

[0889] В некоторых вариантах осуществления трансген содержит одну или более модификаций для введения одного или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между цепью TCRα и цепью TCRβ. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует цепь TCRα или ее часть или фрагмент, содержащий константный домен TCRα, содержащий цистеин в положении, соответствующем положению 48 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 1355. В некоторых вариантах осуществления константный домен TCRα имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1352 или 1355, или последовательность аминокислот, которая имеет, имеет примерно или имеет, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности с ними и содержит один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с цепью TCRβ. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует цепь TCRβ или ее часть, содержащую константный домен TCRβ, содержащий цистеин в положении, соответствующем положению 57 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 1353. В некоторых вариантах осуществления константный домен TCRα имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1353, 1354 или 1356, или последовательность аминокислот, которая имеет, имеет примерно или имеет, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности с ними и содержит один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с цепью TCRβ.

[0890] Матричный полинуклеотид может представлять собой ДНК, одноцепочечную и/или двухцепочечную и может быть введен в клетку в линейной или циклической форме. Смотри также, Патентные публикации США № 20100047805 и 20110207221. Матричный полинуклеотид также может быть введен в форме ДНК, которая может быть введена в клетку в циклической или линейной форме. При введении в линейной форме концы матричного полинуклеотида могут быть защищены (например, от экзонуклеолитической деградации) известными способами. Например, один или более дидезоксинуклеотидных остатков добавляются к 3'-концу линейной молекулы, и/или самокомплементарные олигонуклеотиды лигируются с одним или обоими концами. Смотри, например, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272: 886-889. Дополнительные способы защиты экзогенных полинуклеотидов от деградации включают, но не ограничиваются ими, добавление концевой аминогруппы (аминогрупп) и использование модифицированных межнуклеотидных связей, таких как, например, фосфоротиоаты, фосфорамидаты и остатки O-метил рибозы или дезоксирибозы. При введении в двухцепочечной форме матричный полинуклеотид может включать в себя один или более нуклеазных сайтов-мишеней, например, нуклеазные сайты-мишени, фланкирующие трансген для интеграции в геном клетки. Смотри, например, Патентную публикацию № 20130326645.

[0891] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит трансгенные, например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие рекомбинантный рецептор, фланкированные гомологичными последовательностями (также называемыми «плечами гомологии») на 5'- и 3'-концах, чтобы обеспечить механизм репарации ДНК, например, механизм гомологичной рекомбинации, чтобы использовать матричный полинуклеотид в качестве матрицы для репарации, эффективно вставляя трансген в сайт-мишень интеграции в геноме. Плечо гомологии должно простираться, по меньшей мере, до области, в которой может произойти резекция конца, например, чтобы позволить разрезанному одноцепочечному выступу найти комплементарную область в матричном полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления плечо гомологии не прстирается на повторяющиеся элементы, например ALU-повторы или LINE-повторы. На основе гомологии между последовательностью эндогенного гена, окружающей генетическое нарушение, и 5'- и/или 3'-плечами гомологии, включенными в полинуклеотид, например матричный полинуклеотид, механизм репарации клеточной ДНК может использовать матричный полинуклеотид для репарации разрыва ДНК и повторного синтеза генетической информации в сайте генетического нарушения, тем самым эффективно вставляя или интегрируя трансгенные последовательности в матричном полинуклеотиде в сайте генетического нарушения или рядом с ним.

[0892] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит следующие компоненты: [5′-плечо гомологии] - [трансген] - [3'-плечо гомологии]. Плечи гомологии обеспечивают рекомбинацию в хромосоме, таким образом вставляя трансген в ДНК в сайт расщепления, например, сайт-мишени (сайты-мишени) или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления плечи гомологии фланкируют наиболее дистальный сайт-мишень (сайты-мишени).

[0893] В некоторых аспектах трансген (например, последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты) в матричном полинуклеотиде можно использовать для определения локализации сайтов-мишеней и/или плеч гомологии. В некоторых аспектах сайт-мишень генетического нарушения может использоваться в качестве гида для конструирования матричных полинуклеотидов и/или плеч гомологии, используемых для HDR. В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение может являться мишенью вблизи желаемого сайта направленной интеграции трансгенных последовательностей (например, кодирующих рекомбинантный TCR или его часть). В некоторых аспектах сайт-мишень находится в пределах экзона открытой рамки считывания локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В некоторых аспектах сайт находится в интроне открытой рамки считывания локуса TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

[0894] Иллюстративные длины плеч гомологии включают по меньшей мере или по меньшей мере примерно, или составляют, или составляют примерно 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 или 5000 нуклеотидов. Иллюстративные длины плеч гомологии включают менее чем или менее чем примерно или составляют или составляют примерно 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 или 5000 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления длина плеча гомологии составляет 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000 или 4000-5000 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит, по меньшей мере, или менее или примерно 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар оснований гомологии 5'-сайта-мишени, 3'-сайта-мишени, или обоих, 5'- и 3'-сайта-мишени, например, в пределах гена, локуса или открытой рамки считывания TRAC, TRBC1 и/или TRBC2. В конкретных вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, например, плечи гомологии, имеющие гомологию 5'-сайта-мишени, 3'-сайта-мишени или обоих, 5'- и 3'-сайта-мишени, например, в гене, локусе или открытой рамке считывания TRAC. В некоторых вариантах осуществления пиллюстративные 5'- и 3'-плечи гомологии для направленной интеграции в локус TRAC представлены в SEQ ID NO: 1343 и 1344, соответственно.

[0895] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид может представлять собой линейную одноцепочечную ДНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид представляет собой (i) линейную одноцепочечную ДНК, которая может отжигаться на цепи ДНК-мишени, содержащей одноцепочечный разрыв (ii) линейную одноцепочечную ДНК, которая может отжигаться на интактной цепи ДНК-мишени, (iii) линейную одноцепочечную ДНК, которая может отжигаться на транскрибируемой цепи ДНК-мишени, (iv) линейную одноцепочечную ДНК, которая может отжигаться на нетранскрибированной цепи ДНК-мишени, или более одной из предшествующих.

[0896] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит плечи гомологии для нацеливания на эндогенный локус TRAC (пример нуклеотидной последовательности локуса гена TRAC человека представлен в SEQ ID NO: 348; Эталонной последовательности NCBI: NG_001332.3, TRAC или описан в Таблице 13 в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение локуса TRAC вводится в раннюю кодирующую область гена, включая последовательность, следующую непосредственно за стартовым сайтом транскрипции, в пределах первого экзона кодирующей последовательности или в пределах 500 п.н. от стартового сайта транскрипции (например, в пределах менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.) или в пределах 500 п.н. от старт-кодона (например, в пределах менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение вводят с использованием любой из направленных нуклеаз и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит примерно от 500 до 1000, например, от 600 до 900 или от 700 до 800 пар оснований гомологии по обе стороны от генетического нарушения, вызванного направленными нуклеазами и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит примерно 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар оснований 5'-последовательностей плеч гомологии, которые гомологичны 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 парам оснований последовательностей 5'-области генетического нарушения (например, в локусе TRAC), трансген и примерно 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар оснований последовательностей 3'-области плеч гомологии, которые гомологичны 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 парам оснований последовательностей 3'-области генетического нарушения (например, в локусе TRAC). В некоторых вариантах осуществления примеры 5'- и 3'-плечей гомологии для направленной интеграции в локус TRAC представлены в SEQ ID NO: 1343 и 1344.

[0897] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит плечи гомологии для нацеливания на эндогенный локус TRBC1 или TRBC2 (пример нуклеотидной последовательности локуса гена TRBC1 человека представлен в SEQ ID NO: 349; Эталонной последовательности NCBI: NG_001333.2, TRBC1, описанной в Таблице 14 настоящего документа; пример нуклеотидной последовательности локуса гена TRBC2 человека, представленной в SEQ ID NO: 1047; Эталонной последовательности NCBI: NG_001333.2, TRBC2, описанной в Таблице 15 настоящего документа). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение локуса TRBC1 или TRBC2 вводится в раннюю кодирующую область гена, включая последовательность, непосредственно следующую за стартовым сайтом транскрипции, в пределах первого экзона кодирующей последовательности или в пределах 500 п.н. от стартового сайта транскрипции (например, в пределах менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.) или в пределах 500 п.н. от старт-кодона (например, в пределах менее чем 500, 450, 400, 350, 300, 250 п. 200, 150, 100 или 50 п.н.). В некоторых вариантах осуществления генетическое нарушение вводят с использованием любой из направленных нуклеаз и/или гРНК, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит примерно от 500 до 1000, например, от 600 до 900 или от 700 до 800 пар оснований гомологии по обе стороны от генетического нарушения, вызванного направленными нуклеазами и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид содержит примерно 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар оснований 5'-последовательностей плеч гомологии, которые гомологичны 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 парам оснований последовательностей 5'-области генетического нарушения (например, в локусе TRBC1 или TRBC2), трансген и примерно 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар оснований последовательностей 3'-области плеч гомологии, которые гомологичны 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 парам оснований последовательностей 3'-области генетического нарушения (например, в локусе TRBC1 или TRBC2).

[0898] В некоторых случаях матричный полинуклеотид содержит промотор, например промотор, который является экзогенным и/или не присутствует в локусе-мишени или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления промотор управляет экспрессией только в конкретном типе клеток (например, промотор, специфичный для Т-клеток или В-клеток или NK-клеток). В некоторых вариантах осуществления, в которых последовательности, кодирующие функциональный полипептид, не содержат промотора, экспрессия интегрированного трансгена затем обеспечивается транскрипцией, управляемой эндогенным промотором или другим контрольным элементом в интересующей области.

[0899] Трансген, включая трансген, кодирующий рекомбинантный рецептор или его антигенсвязывающую часть, или его цепь и/или еще дополнительный трансген, может быть вставлен так, что его экспрессия управляется эндогенным промотором в сайте интеграции, а именно промотором, который управляет экспрессия эндогенного гена TCR, в который он встроен (например, TRAC, TRBC1 и/или TRBC2). Например, в некоторых вариантах осуществления кодирующие последовательности в трансгене могут быть вставлены без промотора, но в рамке с кодирующей последовательностью эндогенного гена-мишени, так что экспрессия интегрированного трансгена контролируется транскрипцией эндогенного промотора в сайте интеграции. В некоторых вариантах осуществления трансген, кодирующий рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или его цепь и/или один или более второй трансген независимо функционально связан с эндогенным промотором гена в сайте-мишени. В некоторых вариантах осуществления элемент пропуска рибосомы/элемент саморасщепления, такой как элемент 2А, расположен выше последовательности, кодирующей трансген, так что элемент пропуска рибосомы/элемент саморасщепления расположен в рамке с эндогенным геном. В некоторых вариантах осуществления трансген, кодирующий рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или его часть, функционально связан с эндогенным промотором гена в сайте-мишени (например, TRAC, TRBC1 и/или TRBC2).

[0900] В некоторых вариантах осуществления трансген может содержать промотор и/или энхансер, например конститутивный промотор или индуцируемый или тканеспецифичный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой или содержит конститутивный промотор. Иллюстративные конститутивные промоторы включают, например, ранний промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор убиквитина С человека (UBC), промотор фактора элонгации 1α человека (EF1α), промотор фосфоглицераткиназы 1 мыши (PGK) и куриный промотор β-актина в сочетании с ранним энхансером CMV (CAGG). В некоторых вариантах осуществления конститутивный промотор представляет собой синтетический или модифицированный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой или содержит MND-промотор, синтетический промотор, который содержит область U3 модифицированного MoMuLV LTR с энхансером вируса миелопролиферативной саркомы (последовательность представлена в SEQ ID NO: 1361 или 1347); см. Challita et al. (1995) J. Virol. 69 (2): 748-755). В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой тканеспецифичный промотор. В другом варианте осуществления промотор представляет собой вирусный промотор. В другом варианте осуществления промотор представляет собой невирусный промотор. В некоторых случаях промотор выбирают из промотора (EF1α) фактора элонгации человека 1 альфа (последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1359 или 1360) или его модифицированной формы (промотор EF1α с энхансером HTLV1; последовательность, представленная в SEQ ID). NO: 1345) или промотор MND (последовательность представлена в SEQ ID NO: 1361 или 1347. В некоторых вариантах осуществления трансген не включает регуляторный элемент, например промотор.

[0901] Трансген может быть вставлен в эндогенный ген таким образом, что весь эндогенный ген полностью или частично не экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления трансген (например, вместе или без пептид-кодирующих последовательностей) интегрируется в любой эндогенный локус. В некоторых вариантах осуществления трансген интегрируется в локусы генов TRAC, TRBC1 и/или TRBC2.

[0902] Кроме того, могут быть включены акцепторные последовательности сплайсинга. Иллюстративные известные последовательности акцепторного сайта сплайсинга включают, например, CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG (SEQ ID NO: 1357) (из гена HBB человека) и TTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO: 1358) (из гена иммуноглобулина-гамма человека).

[0903] В иллюстративном варианте осуществления матричный полинуклеотид включает в себя плечи гомологии для нацеливания на локус TRAC, регуляторные последовательности, например, промотор, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный рецептор, например, TCR. В иллюстративном варианте осуществления используется дополнительный матричный полинуклеотид, который включает в себя плечи гомологии для нацеливания на локусы TRBC1 и/или TRBC2, регуляторные последовательности, например промотор, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие другой фактор.

[0904] В некоторых вариантах осуществления иллюстративные матричные полинуклеотиды содержат трансген, кодирующий рекомбинантный Т-клеточный рецептор, под функциональным контролем промотора фактора элонгации 1 альфа (EF1α) с энхансером HTLV1 (последовательность представлена в SEQ ID NO: 1345) или промотора MND (последовательность представлена в SEQ ID NO: 1361 или 1347) или связаны с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими элемент пропуска рибосомы P2A (последовательность представлена в SEQ ID NO: 204), для управления экспрессией рекомбинантного TCR из локуса эндогенного гена-мишени (например, TRAC), 5'-область последовательности плеча гомологии приблизительно 600 п.н. (например, представленная в SEQ ID NO: 1343), 3'-область последовательности плеча гомологии приблизительно 600 п.о. (например, представленная в SEQ ID NO: 1344), которые гомологичны последовательностям, окружающим сайт-мишень интеграции в экзоне 1 гена константной области человеческого TCR α (TRAC). В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид дополнительно содержит другие последовательности нуклеиновой кислоты, например последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие маркер, например, поверхностный маркер или маркер селекции. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид дополнительно содержит последовательности вирусного вектора, например, последовательности вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[0905] В некоторых вариантах осуществления трансген дополнительно кодирует один или более маркеров. В некоторых вариантах осуществления один или более маркеров представляют собой маркер трансдукции, суррогатный маркер и/или маркер селекции, включая, но не ограничиваясь этим, любой суррогатный и/или маркер селекции, описанные в настоящем документе.

[0906] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например матричный полинуклеотид, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фракцию и/или часть рекомбинантного рецептора или его цепи, например рекомбинантного TCR или его цепь, и подвергается направленному воздействию в сайте-мишени (сайтах-мишенях), который находится внутри генного локуса, который кодирует эндогенный рецептор, например, эндогенный ген, кодирующий цепь или домен TCR. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты является мишенью для интеграции в рамке внутри локуса эндогенного гена. В конкретных вариантах осуществления интеграция в рамке приводит к получению кодирующей последовательности для рекомбинантного рецептора, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть и/или фрагмент рекомбинантного рецептора в рамке с частью и/или фрагментом генного локуса, который кодирует оставшаяся часть и/или фрагмент рецептора, например, для интеграции экзогенной и эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, чтобы получить кодирующую последовательность, кодирующую полный, цельный и/или полноразмерный рекомбинантный рецептор. В определенных вариантах осуществления интеграция генетически нарушает экспрессию эндогенного рецептора, кодируемого геном, в сайте-мишени. В конкретных вариантах осуществления трансген, кодирующий часть рекомбинантного рецептора, направляется в локус гена посредством HDR.

[0907] В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует часть рекомбинантного TCR и интегрируется в рамке в эндогенную открытую рамку считывания и/или в локус гена, кодирующего цепь или домен TCR. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует часть рекомбинантного TCR и встраивается в рамке внутрь эндогенной открытой рамки считывания, кодирующей константный домен TCR. В некоторых вариантах осуществления интеграция трансгена в локус модифицирует и/или приводит к получению модифицированного локуса, который кодирует полный рекомбинантный TCR. В конкретных вариантах осуществления часть кодируемого рекомбинантного TCR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, присутствующей в трансгене, а остальная часть рекомбинантного TCR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, присутствующей в открытой рамке считывания эндогенного гена, кодирующего константные домены TCRα или TCRβ (например, описанные в Таблицах 13-15 настоящего документа). В конкретных вариантах осуществления транскрипция модифицированного локуса приводит к получению мРНК, которая кодирует рекомбинантный TCR. В конкретных вариантах осуществления часть мРНК транскрибируется из последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в трансгене, а оставшаяся или дополнительная часть мРНК транскрибируется из последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в открытой рамке считывания эндогенного гена. В некоторых вариантах осуществления трансген интегрируется в сайт-мишень непосредственно перед и в рамке с областью или частью открытой рамки считывания, которая кодирует оставшуюся часть рекомбинантного TCR.

[0908] В конкретных вариантах осуществления модифицированный локус TRAC или TRBC включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный TCR. В некоторых аспектах модифицированный локус TRAC или TRBC в генетически сконструированной клетке содержит трансгенную последовательность (также называемую в настоящем описании как экзогенная или гетерологичная последовательности нуклеиновой кислоты), кодирующую часть рекомбинантного TCR, интегрированного в эндогенный локус TRAC или TRBC, который обычно кодирует константный домен TCRα или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя индукцию направленного генетического нарушения и зависимой от гомологии репарации (HDR) с использованием матричных полинуклеотидов, содержащих трансген, кодирующий часть рекомбинантного TCR, и, таким образом, направляя интеграцию трансгена в локус TRAC или TRBC.

[0909] В некоторых вариантах осуществления трансгенная последовательность, кодирующая часть рекомбинантного TCR, содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую цепь TCRβ и часть цепи TCRα. В некоторых вариантах осуществления часть цепи TCRα, кодируемой трансгенными последовательностями, составляет менее чем полноразмерная цепь TCRα. В конкретных вариантах осуществления часть цепи TCRα содержит вариабельный домен TCRα и часть константного домена TCRα, который менее чем полноразмерный константный домен TCRα, например полноразмерный нативный константный домен TCRα, или не содержит последовательности, кодирующей константный домен TCRα. В некоторых аспектах после интеграции трансгенной последовательности в эндогенный локус TRAC полученный модифицированный локус TRAC кодирует рекомбинантный рецептор TCR, кодируемый слиянием трансгена, подвергнутого направленному воздействию с помощью HDR, и открытую рамку считывания или ее частичную последовательность эндогенного локуса TRAC. В некоторых вариантах осуществления кодируемый рекомбинантный TCR содержит цепь TCRα, например, функциональную цепь TCRα, которая способна связываться с цепью TCRβ.

[0910] В конкретных вариантах осуществления трансгенная последовательность, кодирующая часть рекомбинантного TCR, содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую цепь TCRα и часть цепи TCRβ. В некоторых вариантах осуществления часть цепи TCRβ, кодируемая трансгенными последовательностями, составляет или включает менее чем полноразмерная цепь TCRβ. В конкретных вариантах осуществления часть цепи TCRβ содержит вариабельный домен TCRβ и часть константного домена TCRβ, который менее чем полноразмерный константный домен TCRβ, например полноразмерный константный домен TCRβ, или не содержит последовательности, кодирующей константный домен TCRβ. В некоторых аспектах после интеграции трансгенной последовательности в эндогенный локус TRBC, например, локус TRBC1 и/или TRBC2, полученный модифицированный локус TRBC кодирует рекомбинантный рецептор TCR, кодируемый слиянием трансгена, нацеленного с помощью HDR, и открытую рамку считывания или ее частичную последовательность эндогенного локуса TRBC. В некоторых вариантах кодированный рекомбинантный TCR содержит цепь TCRβ, например функциональную цепь TCRβ, которая способна связываться с цепью TCRα.

[0911] В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой рекомбинантный TCR или его цепь, которая содержит один или более вариабельных доменов и один или более константных доменов. В конкретных вариантах осуществления трансген кодирует часть и/или фрагмент рекомбинантного TCR, который не включает константный домен TCR, и трансген интегрируется в рамке с последовательностью, например последовательностью геномной ДНК, кодирующей константный домен эндогенного TCR. В некоторых вариантах осуществления интеграция приводит к получению кодирующей последовательности, которая кодирует полный, цельный и/или полноразмерный рекомбинантный TCR или его цепь. В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность содержит трансгенную последовательность, кодирующую часть или фрагмент TCR или его цепь, и эндогенную последовательность, кодирующую константный домен эндогенного TCR.

[0912] В некоторых вариантах осуществления часть рекомбинантного TCR содержит полноразмерную цепь TCRβ (включая вариабельный домен TCRβ и константный домен TCRβ), вариабельный домен TCRα и часть константного домена TCRα. В некоторых вариантах осуществления трансген вставлен или интегрирован в локус TRAC, например, в открытую рамку считывания TRAC, в сайте-мишени, приводя к вставке в рамке трансгена с областью или частью открытой рамки считывания, кодирующей оставшуюся эндогенную часть константного домена TCRα. В некоторых вариантах осуществления вставка приводит к получению модифицированного локуса TRAC, кодирующего полный рекомбинантный TCR. В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус TRAC кодирует рекомбинантный TCR, часть которого кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты трансгена, такая как часть, которая включает полноразмерную цепь TCRβ (включая вариабельный домен TCRβ и константный домен TCRβ), вариабельный домен TCRα и часть константного домена TCRα и оставшаяся или дополнительная часть, такая как оставшаяся или дополнительная часть константного домена TCRα, кодируется эндогенной и/или нативной последовательностью TRAC. В некоторых вариантах осуществления эндогенная и/или нативная последовательность TRAC кодирует оставшуюся часть рекомбинантного TCR. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид дополнительно содержит другие последовательности нуклеиновой кислоты, например последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие маркер, например, поверхностный маркер или маркер селекции. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид дополнительно содержит последовательности вирусного вектора, например, последовательности вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[0913] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например полинуклеотид, такой как матричный полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный Т-клеточный рецептор, вводят в клетки в нуклеотидной форме, например, в виде полинуклеотида или вектора. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид вводят в клетку для конструирования, в дополнение к агенту (агентам), способному индуцировать направленное генетическое нарушение, как например нуклеаза и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) можно доставлять до, одновременно или после того, как агент (агенты), способный вызывать направленное генетическое нарушение, вводится в клетку. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) доставляется одновременно с агентами. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды доставляются перед агентами, например, за секунды и до часов и до дней перед матричными полинуклеотидами, включая, но не ограничиваясь этим, от 1 до 60 минут (или любое время между ними) до агентов, от 1 до 24 часов (или в любое другое время) перед агентами или более чем за 24 часа до агентов. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды доставляются после агентов, от секунд до часов или до дней после матричных полинуклеотидов, включая момент непосредственно после доставки агента, например, от 1 минуты до 4 часов, например, примерно 10 минут, 20 минут, 30 минут. минуты, 40 минут, 50 минут, 60 минут, 90 минут, 2 часа, 3 часа или 4 часа после доставки агентов и/или предпочтительно в течение 4 часов после доставки агентов. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид доставляется более чем через 4 часа после доставки агентов.

[0914] В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды могут быть доставлены с использованием тех же систем доставки, что и агент (агенты), способный индуцировать направленное генетическое нарушение, например нуклеаза и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды могут быть доставлены с использованием систем доставки, отличных от систем доставки агента (агенты), способный индуцировать целевое генетическое нарушение, например нуклеазы и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид доставляется одновременно с агентом (агентами). В других вариантах осуществления матричный полинуклеотид доставляется в другое время, до или после доставки агента(ов). В некоторых вариантах осуществления любой подходящий способ, известный для введения полинуклеотида в клетку, может быть использован для доставки агентов и/или матричной ДНК, включая описанные в настоящем документе.

[0915] В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, например матричный полинуклеотид, вводится в клетки в нуклеотидной форме, например, в невирусном векторе или внутри него. В некоторых вариантах осуществления невирусный вектор представляет собой или включает полинуклеотид, например полинуклеотид ДНК или РНК, который подходит для трансдукции и/или трансфекции любым подходящим и/или известным невирусным способом доставки генов, таким как, но не ограничиваясь этим, микроинъекция, электропорация, транзиторное сжатие или сдавливание клеток (например, как описано в Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27), липид-опосредованная трансфекция, пептид-опосредованная доставка, например, проникающие в клетку пептиды или их комбинации.

[0916] В некоторых вариантах осуществления матричная полинуклеотидная последовательность может содержаться в векторной молекуле, содержащей последовательности, которые не гомологичны области, представляющей интерес в геномной ДНК. В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой ДНК-вирус (например, вирус dsДНК или ssДНК). В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой РНК-вирус (например, вирус ssРНК). Иллюстративные вирусные векторы/вирусы включают, например, ретровирусы, лентивирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы коровьей оспы, вирусы оспы и вирусы простого герпеса или любые вирусы, описанные где-либо в настоящем документе.

[0917] В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид может быть перенесен в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид переносится в Т-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 или лентивирусные векторы на основе HIV-1.

[0918] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинного концевого повтора (LTR), например ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), мышиного вируса стволовых клеток (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV). Большинство ретровирусных векторов происходят из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые получены из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотропными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая человека. В одном варианте осуществления ген, подлежащий экспрессии, заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Был описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, Патенты США No. 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109).

[0919] В других аспектах матричный полинуклеотид доставляется вирусными и/или невирусными методами переноса генов. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид доставляется в клетку через аденоассоциированный вирус (AAV). Может использоваться любой вектор AAV, включая, но не ограничиваясь ими, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и их комбинации. В некоторых случаях AAV содержит LTR, которые имеют гетерологичный серотип по сравнению с серотипом капсида (например, ITR AAV2 с капсидами AAV5, AAV6 или AAV8). Матричный полинуклеотид может быть доставлен с использованием той же системы переноса генов, которая используется для доставки нуклеазы (включая тот же вектор), или может быть доставлен с использованием системы доставки, отличной от той, которая используется для нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид доставляют с использованием вирусного вектора (например, AAV), а нуклеазу (нуклеазы) доставляют в форме мРНК. Клетка также может быть обработана одной или более молекулами, которые ингибируют связывание вирусного вектора с рецептором клеточной поверхности, как описано в настоящем документе, до, одновременно и/или после доставки вирусного вектора (например, несущего нуклеазы (нуклеаз) и/или матричный полинуклеотид).

[0920] В некоторых вариантах осуществления один или более агентов и матричный полинуклеотид доставляются в одном и том же формате или способе. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более агентов и матричный полинуклеотид, оба содержатся в векторе, например в вирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид кодируется в одном и том же векторном остове, например геном AAV, плазмидная ДНК, а также Cas9 и гРНК. В некоторых аспектах один или более агентов и матричный полинуклеотид находятся в разных форматах, например, комплекс рибонуклеиновая кислота-белок (RNP) для агента Cas9-гРНК и линейная ДНК для матричного полинуклеотида, но они доставляются одним и тем же методом. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды и нуклеазы могут находиться в одном и том же векторе, например в векторе AAV (например, AAV6). В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды доставляются с использованием вектора AAV, и агент (агенты), способный индуцировать направленное генетическое нарушение, например, нуклеаза и/или гРНК, доставляются в другой форме, например, в виде мРНК, кодирующих нуклеазы и/или или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды и нуклеазы доставляются с использованием метода того же типа, например, вирусного вектора, но на отдельных векторах. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды доставляются в другой системе доставки в качестве агентов, способных индуцировать генетическое нарушение, таких как нуклеазы и/или гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид вырезается из остова вектора in vivo, например, он фланкирован последовательностями распознавания гРНК. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид находится на отдельной полинуклеотидной молекуле, отличной от Cas9 и гРНК. В некоторых вариантах осуществления Cas9 и гРНК вводятся в форме комплекса рибонуклеопротеина (RNP), а матричный полинуклеотид вводится в виде молекулы полинуклеотида, например, в виде вектора или линейной молекулы нуклеиновой кислоты, например, линейной ДНК. Типы или нуклеиновые кислоты и векторы для доставки включают любые из описанных в настоящем документе.

VI. КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ

[0921] Также предложены композиции, включающие связывающие молекулы, например, TCR и сконструированные клетки, включая фармацевтические композиции и составы, и способы применения и применения молекул и композиций, как например при лечении заболеваний, состояний и расстройств, при которых экспрессируется E6 HPV16 или E7 HPV16, и/или детектирование, диагностические и прогностические методы.

A. Фармацевтические композиции и составы

[0922] Предложены фармацевтические составы, включающие связывающие молекулы, например TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие связывающие молекулы. Фармацевтические композиции и составы обычно включают один или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. В некоторых вариантах композиция включает, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент.

[0923] Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для пациента, которому композиция будет вводиться.

[0924] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для пациента. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

[0925] В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой или связывающей молекулой и/или способом введения. Соответственно, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используется смесь двух или более консервантов. Консервант или его смеси обычно присутствуют в количестве от примерно 0,0001% до примерно 2% от общей массы композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[0926] Буферные агенты в некоторых аспектах включены в композиции. Подходящие буферные агенты включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используется смесь двух или более буферных агентов. Буферный агент или их смеси обычно присутствуют в количестве от примерно 0,001% до примерно 4% от общей массы композиции. Способы приготовления вводимых фармацевтических композиций известны. Примеры способов описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

[0927] Составы связывающих молекул могут включать лиофилизированные составы и водные растворы. Состав или композиция могут также содержать более чем один активный ингредиент, полезный для конкретного показания, заболевания или состояния, которое лечат связывающими молекулами или клетками, предпочтительно такими, которые обладают активностями, комплементарными связывающей молекуле или клетке, где соответствующие активности не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для назначенной цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает другие фармацевтически активные агенты или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические агенты, например, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т. д. В некоторых вариантах осуществления клетки или связывающие молекулы вводят в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты включают соли, полученные из минеральных кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, и органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислоты, например п-толуолсульфоновая кислота.

[0928] Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция приготовлена ​​в виде комплекса включения, такого как комплекс включения циклодекстрина, или в виде липосомы. Липосомы могут служить для нацеливания клеток-хозяев (например, Т-клеток или NK-клеток) на конкретную ткань. Для получения липосом доступно много способов, таких как описанные, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) и в Патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.

[0929] Фармацевтическая композиция в некоторых аспектах может использовать системы доставки с медленным высвобождением, с отсроченным высвобождением и с замедленным высвобождением, так что доставка композиции происходит до того как и с достаточным временем, чтобы вызвать сенсибилизацию участка, подлежащего лечению. Многие типы систем доставки с высвобождением доступны и известны. Такие системы могут избежать повторного введения композиции, тем самым увеличивая удобство для пациента и врача.

[0930] Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления содержит связывающие молекулы и/или клетки в количествах, эффективных для лечения или предотвращения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. Терапевтическая или профилактическая эффективность в некоторых вариантах осуществления контролируется путем периодической оценки подвергнутых лечению пациентов. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Тем не менее, другие схемы дозировки могут быть полезны и могут быть определены. Желаемая доза может быть введена однократным болюсным введением композиции, многократным болюсным введением композиции или непрерывным инфузионным введением композиции.

[0931] В некоторых вариантах осуществления, в контексте сконструированных клеток, содержащих связывающие молекулы, пациенту вводят клетки в диапазоне от примерно одного миллиона до примерно 100 миллиардов клеток, например, от 1 миллиона до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 5 миллионов клеток, примерно 25 миллионов клеток, примерно 500 миллионов клеток, примерно 1 миллиарда клеток, примерно 5 миллиардов клеток, примерно 20 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 40 миллиардов клеток или в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений), как например от примерно 10 миллионов до примерно 100 миллиардов клеток (например, примерно 20 миллионов клеток, примерно 30 миллионов клеток, примерно 40 миллионов клеток, примерно 60 миллионов клеток, примерно 70 миллионов клеток, примерно 80 миллионов клеток, примерно 90 миллионов клеток, примерно 10 миллиардов клеток, примерно 25 миллиардов клеток, примерно 50 миллиардов клеток, примерно 75 миллиардов клеток, примерно 90 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из вышеуказанных значений), а в некоторых случаях от примерно 100 миллионов клеток до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 120 миллионов клеток 250 миллионов клеток, примерно 350 миллионов клеток, примерно 450 миллионов клеток, примерно 650 миллионов клеток, примерно 800 миллионов клеток, примерно 900 миллионов клеток, примерно 3 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 45 миллиардов клеток) или любое значение между этими диапазонами и/или такое количество клеток на килограмм массы тела пациента.

[0932] Клетки или связывающие молекулы могут быть введены с использованием стандартных методов введения, составов и/или устройств. Предложены составы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Введение клеток может быть аутологичным или гетерологичным. Например, иммунореактивные клетки или предшественники могут быть получены от одного пациента и введены одному и тому же пациенту или другому совместимому пациенту. Иммунореактивные клетки периферической крови или их потомство (например, in vivo, ex vivo или in vitro полученные) можно вводить посредством локализованной инъекции, включая введение катетера, системную инъекцию, локализованную инъекцию, внутривенную инъекцию или парентеральное введение. Когда вводят терапевтическую композицию (например, фармацевтическую композицию, содержащую генетически модифицированную иммунореактивную клетку), она, как правило, будет приготовлена в единогй лекарственной форме инъекции (раствор, суспензия, эмульсия).

[0933] Составы включают препараты для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального или суппозиторного введения. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции вводят парентерально. Используемый в настоящем описании термин «парентеральный» включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное, внутричерепное, внутригрудное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции вводят пациенту с использованием периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

[0934] Композиции в некоторых вариантах осуществления представлены в виде стерильных жидких препаратов, например изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть забуферены до выбранного рН. Жидкие препараты обычно легче приготовить, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько удобнее вводить, особенно инъекцией. Вязкие композиции, с другой стороны, могут быть приготовлены в пределах соответствующего диапазона вязкости, чтобы обеспечить более длительные периоды контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, физиологический раствор, солевой раствор с фосфатным буфером, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.

[0935] Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения связывающей молекулы в растворитель, как например путем смешивания с подходящим носителем, разбавителем или наполнителем, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или тому подобное. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие агенты (например, метилцеллюлозу), рН-буферные агенты, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и тому подобное, в зависимости от желаемого пути введения и препарата. В некоторых аспектах можно консультироваться со стандартными текстами, чтобы приготовить подходящие препараты.

[0936] Могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, включая антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и тому подобным. Пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть достигнута путем использования агентов, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

[0937] Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем эти матрицы имеют форму профильных изделий, например, пленки или микрокапсулы.

[0938] Составы, используемые для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны.

B. Терапевтические и профилактические методы и применения

[0939] Также предложены способы введения и применения, такие как терапевтическое и профилактическое применение связывающих молекул, включая TCR и их антигенсвязывающие фрагменты и антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, и/или сконструированных клеток, экспрессирующих связывающие молекулы. Такие способы и применения включают терапевтические способы и применения, например, включающие введение молекул, клеток или композиций, содержащих их, пациенту, имеющему заболевание, состояние или расстройство, экспрессирующее или ассоциированное с HPV, например, HPV16, и/или в которых клетки или ткани экспрессируют, например, специфически экспрессируют, HPV16, например, E6 HPV16 или E7 HPV16. В некоторых вариантах осуществления молекулу, клетку и/или композицию вводят в эффективном количестве для эффективного лечения заболевания или расстройства. Применения включают применения связывающих молекул и клеток в таких способах и лечениях, а также в приготовлении лекарственного средства для осуществления таких терапевтических способов. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляются путем введения связывающих молекул или клеток или композиций, содержащих их, пациенту, имеющему, имевшему или у которого подозрение на наличие заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления способы, таким образом, подвергают лечению заболевание или состояние или расстройство у пациента.

[0940] Используемый в настоящем описании термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечащий») относится к полному или частичному ослаблению или уменьшению заболевания или состояния или расстройства, или симптома, неблагоприятного эффекта или исхода, или связанного с этим фенотипа. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются ими, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. Термины не подразумевают полное излечение заболевания или полное устранение какого-либо симптома или воздействия на все симптомы или исходы.

[0941] Используемый в настоящем описании термин «задержка развития заболевания» означает задержать, препятствовать, замедлять, затормозить, стабилизировать, подавить и/или отсрочить развитие заболевания (такого как онкологическое заболевание). Эта задержка может быть различной продолжительности, в зависимости от истории болезни и/или индивидуума, которого подвергают лечению. Как очевидно для специалиста в данной области, достаточная или значительная задержка может, по сути, охватывать предотвращение, поскольку у индивидуума не развивается заболевание. Например, поздняя стадия онкологического заболевания, такая как развитие метастазирования, может быть отсрочена.

[0942] «Предотвращение» при использовании в настоящем описании, включает обеспечение профилактики в отношении возникновения или рецидива заболевания у пациента, который может быть предрасположен к заболеванию, но еще не был диагностирован как имеющий заболевание. В некоторых вариантах осуществления предложенные молекулы и композиции используются для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

[0943] При использовании в настоящем описании, «подавлять» функцию или активность означает уменьшать функцию или активность по сравнению с другими такими же условиями, за исключением состояния или параметра, представляющего интерес, или, альтернативно, по сравнению с другим условием. Например, связывающая молекула или композиция или клетка, которая подавляет рост опухоли, снижает скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствие связывающей молекулы, композиции или клетки.

[0944] «Эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, связывающей молекулы или клеток или композиции, в контексте введения относится к количеству, эффективному в дозировках/количествах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.

[0945] «Терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, связывающей молекулы или клеток, относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата, как например для лечения заболевания, состояния или расстройства, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса пациента и популяции вводимых клеток. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают введение связывающих молекул, клеток и/или композиций в эффективных количествах, например терапевтически эффективных количествах.

[0946] «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическая доза используется у пациентов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

[0947] Используемый в настоящем описании термин «пациент» представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое животное, и обычно представляет собой человека.

[0948] К числу заболеваний, подлежащих лечению, относятся онкологические заболевания, обычно онкологические заболевания, ассоциированные с HPV, и любые ассоциированные с HPV, например, HPV 16-ассоциированные заболевания или состояния, или заболевания или состояния, при которых экспрессируется онкопротеин HPV, например, E6 или E7, такой как онкопротеин HPV 16, например, E6 HPV 16 или E7 HPV 16. При определенных заболеваниях и состояниях вирусный белок, такой как онкопротеин, такой как HPV 16, E6 или E7, экспрессируется в злокачественных клетках или злокачественных новообразованиях или эксрпессируется ими, и/или их пептидный эпитоп экспрессируется на таких злокачественных опухолях или тканях, как например при MHC презентировании. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой злокачественное новообразование, экспрессирующее HPV16. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой карциному, меланому или другое предраковое или раковое состояние, вызванное или иным образом ассоциированное с HPV, таким как HPV-16. В некоторых вариантах осуществления карцинома может быть плоскоклеточной или аденокарциномой. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние могут характеризоваться аномалией эпителиальных клеток, связанной с онкогенной инфекцией HPV, такой как килоцитоз; гиперкератоз; предраковые состояния, включающие интраэпителиальные неоплазии или интраэпителиальные поражения; выраженные дисплазии; и инвазивные или злокачественные опухоли. К числу заболеваний или состояний, ассоциированных с HPV 16, которые можно подвергать лечению, относятся, но не ограничиваются ими, рак шейки матки, рак матки, рак анального канала, рак прямой кишки, рак влагалища, рак вульвы, рак полового члена, рак ротоглотки, рак миндалин, фарингеальный рак (рак глотки), рак гортани, рак ротовой полости, рак кожи, рак пищевода, рак головы и шеи, такой как плоскоклеточная карцинома (SCC) или мелкоклеточный рак легких. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак шейки матки.

[0949] В некоторых вариантах осуществления способы могут включать в себя стадии или признаки для идентификации пациента, у которого есть подозрение на наличие или риск развития заболевания или расстройства, ассоциированных с HPV 16 (см., например, Патенты США № 6355424 и 8968995), и/или пациент, подлежащий лечению, может быть пациентом, который идентифицирован как имеющий или подверженный такому риску наличия или развития такого HPV-ассоциированного заболевания или состояния или злокачественного новообразования. Следовательно, в некоторых аспектах предложены способы идентификации пациентов с заболеваниями или расстройствами, связанными с экспрессией E6 или E7 HPV 16, и отбора их для лечения и/или лечение таких пациентов, например селективное лечение таких пациентов с помощью предложенной молекулы, связывающей HPV 16, в том числе в некоторых аспектах с клетками, сконструированными для экспрессии таких связывающих молекул, включая в некоторых аспектах любые из TCR E6 или E7 HPV 16 или их антигенсвязывающие фрагменты или антитела против E6 или E7 HPV 16, например фрагменты антител и белки, содержащие их, такие как химерные рецепторы, например TCR-подобные CAR, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие TCR или CAR.

[0950] Например, пациент может быть обследован на наличие заболевания или расстройства, ассоциированного с экспрессией E6 или E7 HPV 16, таких как злокачественное новообразование, экспрессирующие E6 или E7 HPV 16. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя скрининг или детектирование присутствия заболевания, ассоциированного с E6 или E7 HPV 16, например, опухоль Таким образом, в некоторых аспектах образец может быть получен от пациента, у которого есть подозрение на заболевание или расстройство, ассоциированное с экспрессией E6 или E7 HPV 16, и проанализирован на уровень экспрессии E6 или E7 HPV 16. В некоторых аспектах пациент, который дает положительный результат на заболевание или расстройство, ассоциированное с E6 или E7 HPV 16, может быть выбран для лечения настоящими способами, и ему может быть введено терапевтически эффективное количество связывающей молекулы, описанной в настоящем документе, CAR, экспрессирующий такую связывающую молекулу, клетки, содержащие связывающую молекулу, или их фармацевтическая композиция, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способы могут быть использованы для контроля размера или плотности ткани, экспрессирующей E6 или E7 HPV 16, например, опухоли, со временем, например, до, во время или после лечения способами. В некоторых аспектах пациентов, которых лечат способами, представленными в настоящем документе, выбирают или тестируют как положительных на экспрессию HPV согласно таким способам, например, до начала или во время лечения.

[0951] В некоторых вариантах осуществления введение представленной молекулы, связывающей HPV 16, включая любой из TCR, E6 или E7 HPV 16, или их антигенсвязывающих фрагментов, или антител против E6 или E7 HPV 16, например фрагментов антител и белков, содержащих их, таких как химерные рецепторы, например TCR-подобные CAR, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие TCR или CAR, можно комбинировать с другим терапевтическим средством для лечения заболевания HPV. Например, дополнительное терапевтическое лечение может включать лечение другим противоопухолевым средством для лечения рака шейки матки. Подходящие дозировки для такого совместно вводимого агента могут быть снижены благодаря комбинированному действию (синергии) агента и молекулы, связывающей HPV 16.

[0952] В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется постоянное или рецидивирующее заболевание, например, после лечения другой молекулой, специфичной для HPV 16, и/или клетками, экспрессирующими нацеленную на HPV 16 связывающую молекулу, и/или другой терапией, включая химиотерапию, облучение и/или трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), например, аллогенная HSCT. В некоторых вариантах осуществления введение эффективно лечит пациента, несмотря на то, что пациент становится резистентным к другой HPV 16-направленной терапии. В некоторых вариантах осуществления у пациента не было рецидива, но определено, что он подвержен риску рецидива, например, высокому риску рецидива, и, таким образом, соединение или композицию вводят профилактически, например, для уменьшения вероятности или предотвращения рецидива.

[0953] В некоторых вариантах осуществления лечение не вызывает у пациента иммунного ответа на терапию и/или не вызывает такого ответа в степени, которая препятствует эффективному лечению заболевания или состояния. В некоторых аспектах степень иммуногенности и/или реакции трансплантат против хозяина меньше, чем при другой, но сопоставимой терапии. Например, в случае адоптивной клеточной терапии с использованием клеток, экспрессирующих TCR или CAR, включая предложенные связывающие молекулы, степень иммуногенности в некоторых вариантах осуществления снижается по сравнению с TCR или CAR, включающими другую связывающую молекулу.

[0954] В некоторых вариантах осуществления способы включают адоптивную клеточную терапию, посредством которой сконструированные клетки, экспрессирующие предложенные связывающие молекулы, вводят пациентам. Такое введение может стимулировать HPV 16-направленную активацию клеток (например, активацию Т-клеток), так что клетки заболевания или расстройства подвергаются направленному воздействию для разрушения.

[0955] Таким образом, предложенные способы и применения включают способы и применения для адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение клеток или композиции, содержащей клетки, в клетки или ткани пациента, такого как подверженный риску или подозреваемый на наличие заболевания, состояния или расстройства. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят пациенту, имеющему конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, например, посредством адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная Т-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции вводят пациенту, такому как пациент, имеющий или подверженный риску заболевания или состояния. В некоторых аспектах с помощью способов, таким образом, лечат, например, ослабляют один или более симптомов заболевания или состояния, как например уменьшают опухолевую нагрузку при злокачественном новообразовании, экспрессирующем E6 или E7 HPV 16.

[0956] Способы введения клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут использоваться в связи с предложенными способами и композициями. Например, способы адоптивной Т-клеточной терапии описаны, например, в публикации заявки на патент США № 2003/0170238, выданный Gruenberg et al.; Патент США № 4690915, выданный Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). Смотри, например, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLOS ONE 8 (4): e61338.

[0957] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия, например адоптивная клеточная терапия, например адоптивная Т-клеточная терапия, осуществляется путем аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от пациента, который должен получить клеточную терапию, или из образца, полученного от такого пациента. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают от пациента, например пациента, нуждающегося в лечении, и клетки после выделения и обработки вводят тому же пациенту.

[0958] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия, например адоптивная клеточная терапия, например адоптивная Т-клеточная терапия, осуществляется путем аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от пациента, отличного от пациента, который должен получить или кто в конечном итоге получает клеточную терапию, например, первый пациент. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому пациенту, например второму пациенту того же вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй пациенты являются генетически идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй пациенты генетически сходны. В некоторых вариантах осуществления второй пациент экспрессирует HLA того же класса или супертипа, что и первый пациент.

[0959] В некоторых вариантах осуществления пациент, которому вводят клетки, клеточные популяции или композиции, является приматом, таким как человек. В некоторых вариантах осуществления примат представляет собой обезьяну или человекообразную обезьяну. Пациентом может быть мужчина или женщина и может быть любого подходящего возраста, включая младенцев, юношей, подростков, взрослых и пожилых людей. В некоторых вариантах осуществления пациентом является млекопитающее, не являющимся приматом, такое как грызун. В некоторых примерах пациент или субъект представляет собой одобренную животную модель для заболевания, адоптивной клеточной терапии и/или для оценки токсических результатов, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS).

[0960] Предложенные связывающие молекулы, такие как TCR и их антигенсвязывающие фрагменты, а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и клетки, экспрессирующие их, можно вводить любым подходящим способом, например, инъекцией, например, внутривенной или подкожной инъекцией, внутриглазной инъекцией, периокулярной инъекцией, субретинальной инъекцией, интравитреальной инъекцией, транс-септальной инъекцией, субсклеральной инъекцией, внутрихориоидальной инъекцией, внутрикамеральной инъекцией, субконъюнктивальной инъекцией, субтеноновой инъекцией, ретробульбарной инъекцией, перибульбарной инъекцией или задней околосклеральной доставкой. В некоторых вариантах осуществления их вводят парентеральным, внутрилегочным и интраназальным, и, если желательно, для местного лечения, введением внутрь пораженного участка. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутригрудное или подкожное введение. Дозирование и введение могут частично зависеть от того, является ли введение кратким или хроническим. Различные схемы дозирования включают, но не ограничиваются, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и инмпульсную инфузию.

[0961] Для предотвращения или лечения заболевания подходящая дозировка связывающей молекулы или клетки может зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа связывающей молекулы, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли связывающая молекула для профилактики или для терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на связывающую молекулу, и призводится по усмотрение лечащего врача. Композиции, молекулы и клетки в некоторых вариантах осуществления соответственно вводят пациенту за один раз или в течение серии процедур.

[0962] В некоторых вариантах осуществления, в контексте сконструированных клеток, содержащих связывающие молекулы, пациенту вводят клетки в диапазоне от примерно одного миллиона до примерно 100 миллиардов клеток, например, от 1 миллиона до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 5 миллионов клеток, примерно 25 миллионов клеток, примерно 500 миллионов клеток, примерно 1 миллиарда клеток, примерно 5 миллиардов клеток, примерно 20 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 40 миллиардов клеток или в диапазоне, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений), как например от примерно 10 миллионов до примерно 100 миллиардов клеток (например, примерно 20 миллионов клеток, примерно 30 миллионов клеток, примерно 40 миллионов клеток, примерно 60 миллионов клеток, примерно 70 миллионов клеток, примерно 80 миллионов клеток, примерно 90 миллионов клеток, примерно 10 миллиардов клеток, примерно 25 миллиардов клеток, примерно 50 миллиардов клеток, примерно 75 миллиардов клеток, примерно 90 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из вышеуказанных значений), а в некоторых случаях от примерно 100 миллионов клеток до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 120 миллионов клеток 250 миллионов клеток, примерно 350 миллионов клеток, примерно 450 миллионов клеток, примерно 650 миллионов клеток, примерно 800 миллионов клеток, примерно 900 миллионов клеток, примерно 3 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 45 миллиардов клеток) или любое значение между этими диапазонами и/или такое количество клеток на килограмм массы тела пациента. Опять же, дозы могут варьироваться в зависимости от особенностей, специфичных для заболевания или расстройства и/или пациента, и/или других способов лечения.

[0963] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы или клетки вводят как часть комбинированного лечения, как например, одновременно или последовательно, в любом порядке, с другим терапевтическим вмешательством, таким как другой TCR, антитело или сконструированная клетка или рецептор или агент, такой как цитотоксический или терапевтический агент.

[0964] Клетки или антитела в некоторых вариантах осуществления вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами или в связи с другим терапевтическим вмешательством, либо одновременно, либо последовательно в любом порядке. В некоторых контекстах клетки вводят совместно с другой терапией, достаточно близкой по времени, так что клеточные популяции усиливают действие одного или более дополнительных терапевтических агентов или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят до введения одного или более дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят после введения одного или более дополнительных терапевтических агентов.

[0965] После введения клеток млекопитающему (например, человеку), биологическую активность популяций сконструированных клеток и/или связывающих молекул в некоторых аспектах измеряют любым из ряда известных способов. Параметры для оценки включают специфическое связывание сконструированной или природной Т-клетки или другой иммунной клетки с антигеном in vivo, например, с помощью визуализации или ex vivo, например, с помощью ИФА или проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления способность сконструированных клеток разрушать клетки-мишени можно измерить, используя любой подходящий метод, известный в данной области, такой как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) и Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25-40 (2004). В некоторых вариантах осуществления биологическая активность клеток также может быть измерена путем анализа экспрессии и/или секреции некоторых цитокинов, таких как CD 107a, IFNγ, IL-2 и TNF. В некоторых аспектах биологическая активность измеряется путем оценки клинического исхода, такого как уменьшение опухолевой массы или нагрузки.

[0966] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки модифицируют любым количеством способов, так что их терапевтическая или профилактическая эффективность увеличивается. Например, сконструированные TCR или экспрессирующие антитела CAR, экспрессируемые сконструированными клетками в некоторых вариантах осуществления, конъюгированы либо прямо, либо косвенно через линкер с нацеливающим фрагментом. Практика конъюгации соединений, например TCR или CAR, с нацеливающими фрагментами известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 11 (1995) и Патент США № 5087616.

C. Методы диагностики и детектирования

[0967] Также предложены способы, включающие использование предложенных связывающих молекул, например TCR или их антигенсвязывающих фрагментов, и антител и их антигенсвязывающих фрагментов, для обнаружения HPV 16, например, E6 HPV 16 или E7 HPV 16, например, в диагностических и/или в прогностических методах в сочетании с HPV 16-экспрессирующим заболеванием или состоянием. Способы в некоторых вариантах осуществления включают инкубацию биологического образца со связывающей молекулой и/или введение связывающей молекулы пациенту. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает клетку или ткань, такую как опухолевая ткань или ткань злокчественного новообразования. В некоторой связывающей молекуле с областью или пептидным эпитопом HPV 16, например E6 или E7 HPV 16, и детектирование того, образуется ли комплекс между связывающей молекулой и пептидным эпитопом. Такой способ может быть методом in vitro или in vivo. В одном варианте осуществления молекула, анти-HPV 16-связывающая молекула используется для отбора пациентов, имеющих право на терапию анти-HPV 16-связывающими молекулами или сконструированными клетками, содержащими такие молекулы, например, где HPV 16, например E6 или E7 HPV 16, представляет собой биомаркер для отбора пациентов.

[0968] В некоторых вариантах осуществления образец, такой как клетка, образец ткани, лизат, композиция или другой полученный из нее образец, контактирует со связывающей молекулой и связывается или образуется комплекс между связывающей молекулой и образцом (например, областью или эпитопом HPV 16 в образце) определяется или детектируется. Когда связывание в тестируемом образце демонстрируется или детектируется по сравнению с контрольной клеткой того же типа ткани, это может указывать на наличие ассоциированного заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления образец взят из тканей человека.

[0969] Можно использовать различные способы, известные в данной области, для определения специфического связывания молекулы с антигеном. Иллюстративные иммуноанализы включают иммуноанализ с флуоресцентной поляризацией (FPIA), иммуноанализ с флуоресценцией (FIA), иммуноферментный анализ (EIA), иммуноферментный анализ с нефелометрическим ингибированием (NIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Индикаторная группа или группа меток может быть присоединена к связывающим молекулам пациента, и может быть выбрана так, чтобы удовлетворить потребности различных применений метода, которые часто продиктованы наличием оборудования для анализа и совместимых процедур иммуноанализа. Иллюстративные метки включают радионуклиды (например, 125I, 131I, 35S, 3H или 32P), ферменты (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, люцифераза или β-глактозидаза), флуоресцентные фрагменты или белки (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, GFP или BFP) или люминесцентные фрагменты (например, наночастицы QdotTM, поставляемые компанией Quantum Dot Corporation, Пало-Альто, Калифорния). Общие методики, которые должны использоваться при выполнении различных иммуноанализов, отмеченных выше, известны специалистам в данной области.

[0970] В целях диагностики связывающие молекулы могут быть помечены детектируемым фрагментом, включая, но не ограничиваясь этим, радиоизотопы, флуоресцентные метки и различные фермент-субстратные метки, известные в данной области. Способы конъюгации меток со связывающими молекулами, например TCR или антителами, известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы не должны быть помечены, и их присутствие может быть детектировано с использованием меченого антитела, которое связывается со связывающими молекулами.

[0971] Предложенные связывающие молекулы в некоторых вариантах осуществления можно использовать в любом известном методе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Связывающие молекулы также можно использовать для диагностических анализов in vivo, таких как визуализация in vivo. Как правило, связывающая молекула помечена радионуклидом (таким как ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I или ³H), так что интересующие клетки или ткани могут быть локализованы in vivo после введения пациенту. Связывающая молекула также может быть использована в качестве окрашивающего реагента при патологии, например, с использованием известных методик.

VII. ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИЗДЕЛИЯ

[0972] Также предложены промышленные изделия, содержащие предложенные связывающие молекулы, например, TCR, антитела и CAR и/или сконструированные клетки и/или композиции. Промышленные изделия могут включать контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку или связанны с ней. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенного введения и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер в некоторых вариантах осуществления содержит композицию, которая представлена сама по себе или объединена с другой композицией, эффективной для лечения, предотвращения и/или диагностики состояния. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет стерильный порт доступа. Иллюстративные контейнеры включают в себя пакеты для внутривенного раствора, флаконы, в том числе с пробками, прокалываемыми иглой для инъекции. Этикетка или вкладыш в упаковку могут указывать, что композиция используется для лечения заболевания или состояния, ассоциированных с Е6 или Е7 HPV 16. Промышленное изделие может включать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция включает антитело или сконструированный антигенный рецептор; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция включает дополнительный агент, такой как цитотоксический или иной терапевтический агент. Промышленное изделие может дополнительно включать вкладыш в упаковку, указывающий, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, промышленное изделие может дополнительно включать другой или такой же контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер. Кроме того, он может включать другие материалы, такие как другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и/или шприцы.

VIII. Определения

[0973] Если не указано иное, то подразумевается, что все термины в области техники, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, которые обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится заявленный объект. В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены в настоящем документе для ясности и/или для удобства ссылки, и включение таких определений в настоящее описание не обязательно должно истолковываться как представляющее существенную разницу по сравнению с тем, что обычно понимается в данной области техники.

[0974] Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной. Полипептиды, включая предложенные антитела и цепи антител и другие пептиды, например линкеры, могут включать аминокислотные остатки, включая природные и/или неприродные аминокислотные остатки. Термины также включают модификации полипептида после экспрессии, например, гликозилирование, сиалилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. В некоторых аспектах полипептиды могут содержать модификации в отношении нативной или природной последовательности при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, в результате мутаций хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок вследствие амплификации ПЦР.

[0975] «Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественной среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном местоположении, которое отличается от его естественного хромосомного расположения.

[0976] «Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая TCR или антитело» относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим альфа- или бета-цепи TCR (или их фрагменты) или тяжелые и легкие цепи (или их фрагменты) антитела, включая такие молекулы нуклеиновой кислоты в одном векторе или отдельных векторах, и такие молекулы нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или более местах в клетке-хозяине.

[0977] Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку и ее потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты родительской клетке, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, что и клетки, скринированные или отобранные для первоначальной трансформации, включено в настоящее описание.

[0978] Используемый в настоящем описании термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» и «процент идентичности» при использовании в отношении аминокислотной последовательности (эталонной полипептидной последовательности) определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате (например, рассматриваемое антитело или фрагмент), которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности полипептида сравнения, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

[0979] Замена аминокислоты может включать замену одной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой. Аминокислотные замены могут быть введены в связывающую молекулу, например, TCR или антитело, представляющее интерес, и продукты, подвергнутые скринингу на требуемую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, пониженную иммуногенность или улучшенную цитолитическую активность.

[0980] Аминокислоты обычно могут быть сгруппированы в соответствии со следующими общими свойствами боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[0981] В некоторых вариантах осуществления консервативные замены могут включать замену члена одного из этих классов на другого члена того же класса. В некоторых вариантах осуществления неконсервативные аминокислотные замены могут включать замену члена одного из этих классов на члена другого класса.

[0982] Используемый в настоящем описании термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в настоящем описании как «экспрессирующие векторы».

[0983] Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.

[0984] При использовании в настоящем описании, формы в единственном числе включают ссылку на множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Например, «один» означает «по меньшей мере, один» или «один или более». Понятно, что аспекты и варианты, описанные в настоящем документе, включают «состоящий» и/или «состоящий по существу из» аспектов и вариантов.

[0985] На всем протяжении настоящего раскрытия различные аспекты заявленного объекта представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона дано просто для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема заявленного объекта изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, если предложен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в заявленный предмет. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны и также охватываются заявленным объектом с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба из этих пределов, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включаются в заявленный предмет. Это применяется независимо от широты диапазона.

[0986] Используемый в настоящем описании термин «примерно» относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известного специалисту в данной области техники. Ссылка на «примерное» значение или параметр в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к этому значению или параметру как таковым. Например, описание, относящееся к «примерно X», включает в себя описание «X».

[0987] Используемый в настоящем описании термин «композиция» относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста, водная, неводная или любая их комбинация.

[0988] При использовании в настоящем описании, утверждение о том, что клетка или популяция клеток является «положительной» по конкретному маркеру, относится к детектируемому присутствию на или в клетке определенного маркера, обычно поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин относится к наличию поверхностной экспрессии, детектируемой с помощью проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и путем детектирования указанного антитела, где окрашивание выявляется с помощью проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем детектированное окрашивание, проводя ту же процедуру с соответствующим контролем изотипа в других идентичных условиях, и/или на уровне, по существу аналогичном уровню для клетки, о которой известно, что она является положительной для маркера, и/или на уровне, существенно более высоком, чем для клетки, о которой известной как об отрицательной для маркера.

[0989] При использовании в настоящем описании, утверждение о том, что клетка или популяция клеток является «отрицательной» для конкретного маркера, относится к отсутствию существенного детектируемого присутствия на или в клетке конкретного маркера, обычно поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, детектируемой с помощью проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и путем детектирования указанного антитела, где окрашивание не детектируют с помощью проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем выявленное окрашивание, выполняя ту же самую процедуру с соответствующим контролем изотипа в других идентичных условиях, и/или на уровне, существенно более низком, чем уровень для клетки, о которой известно, что она является положительной для маркера, и/или на уровне, существенно сходным с уровнем в клетке, которая, как известно, является отрицательной для маркера.

[0990] Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, упомянутые в настоящей заявке, включены в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была отдельно включена в качестве ссылки. Если представленное в настоящем описании определение противоречит или иным образом не согласуется с определением, изложенным в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, определение, изложенное здесь, имеет преимущественную силу над определением, которое включено здесь ссылкой,

[0991] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие предмет описания.

Иллюстративные варианты осуществления

[0992] Среди предложенных вариантов осуществления присутствуют:

1. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987, 999 или 1390, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или

область Vβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.

2. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, отличающиеся тем, что

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1185), где X₂ представляет собой A, G, V, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, N, A, Y, R или P; X₄ представляет собой E, S, A, G, F, N, D, V, P, L, I, M или R; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, A, S, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A или N; X₁₁ представляет собой Y, F, Q, R или N; X₁₂ представляет собой K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, M, F или V; X₁₄ представляет собой I, T, S, R, Y или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀KX₁₂I (SEQ ID NO: 1186), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой А, V или Е; X₃ представляет собой S, N, T, R или P; X₄ представляет собой E, A, G, F, V, P, I, D или S; X₅ представляет собой R, H, T, A P, S, G или F; X₆ представляет собой G, H, L, T, S или A, отсутствует; X₇ представляет собой S, T или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, T или отсутствует; Х₁₀ представляет собой F, Y или N; X₁₂ представляет собой Y, T или L;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YKYI (SEQ ID NO: 1187), где X₂ представляет собой A, V или E; X₃ представляет собой S, N или R; X₄ представляет собой E, G, V, P, I или D; X₅ представляет собой R, T, P, S, G или F; X₆ представляет собой G, T, S или отсутствует; X₇ представляет собой S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; Х₉ представляет собой Т или отсутствует;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1188), где X₂ представляет собой G, V, Q или M; X₃ представляет собой G, A, Y, S, N или R; X₄ представляет собой S, G, L, I, M или R; Х₅ представляет собой N, D, G, S, L, Q или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, D, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; X₁₄ представляет собой S, T или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃T (SEQ ID NO: 1189), где X₂ представляет собой G, V или Q; X₃ представляет собой G, Y, S или N; Х₄ представляет собой S, L или М; Х₅ представляет собой N, G, L или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇YKLS (SEQ ID NO: 1190), где X₂ представляет собой G или V; Х₃ представляет собой А или Y; X₄ представляет собой G, S или R; Х₅ представляет собой D или S; X₆ представляет собой N или отсутствует; X₇ представляет собой D или отсутствует.

3. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1 или 2, отличающиеся тем, что

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1200), где X₂ представляет собой S, V или I; X₃ представляет собой S, N или A; X₄ представляет собой R, V, S, L, P, G, I или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, R, T или S; X₆ представляет собой L, G, A, D, R, V или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, V, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е, G или К; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; X₁₄ представляет собой Y, F, T или I;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1201), где X₄ представляет собой R, V, S, L, G или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, T или S; X₆ представляет собой A, L, R, D, G или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е или G; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; X₁₄ представляет собой Y, F или T;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀TQY (SEQ ID NO: 1202), где X₄ представляет собой R, L или G; X₅ представляет собой F, V, T или Y; X₆ представляет собой L или A, отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой S, G или отсутствует; X₉ представляет собой T, G, P или S; X₁₀ представляет собой D или E.

4. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1185), где X₂ представляет собой A, G, V, Q, M или E; X₃ представляет собой S, G, N, A, Y, R или P; X₄ представляет собой E, S, A, G, F, N, D, V, P, L, I, M или R; X₅ представляет собой R, N, H, T, D, G, S, P, L, Q или F; X₆ представляет собой G, H, A, S, T или отсутствует; X₇ представляет собой T, S, G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, G, S, D, F, Y, A или N; X₁₁ представляет собой Y, F, Q, R или N; X₁₂ представляет собой K, Q или D; X₁₃ представляет собой Y, L, T, M, F или V; X₁₄ представляет собой I, T, S, R, Y или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀KX₁₂I (SEQ ID NO: 1186), где X₁ представляет собой A или V; Х₂ представляет собой А, V или Е; X₃ представляет собой S, N, T, R или P; X₄ представляет собой E, A, G, F, V, P, I, D или S; X₅ представляет собой R, H, T, A P, S, G или F; X₆ представляет собой G, H, L, T, S или A, отсутствует; X₇ представляет собой S, T или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, T или отсутствует; Х₁₀ представляет собой F, Y или N; X₁₂ представляет собой Y, T или L;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YKYI (SEQ ID NO: 1187), где X₂ представляет собой A, V или E; X₃ представляет собой S, N или R; X₄ представляет собой E, G, V, P, I или D; X₅ представляет собой R, T, P, S, G или F; X₆ представляет собой G, T, S или отсутствует; X₇ представляет собой S или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; Х₉ представляет собой Т или отсутствует;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1188), где X₂ представляет собой G, V, Q или M; X₃ представляет собой G, A, Y, S, N или R; X₄ представляет собой S, G, L, I, M или R; Х₅ представляет собой N, D, G, S, L, Q или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, N, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, D, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V; X₁₄ представляет собой S, T или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃T (SEQ ID NO: 1189), где X₂ представляет собой G, V или Q; X₃ представляет собой G, Y, S или N; Х₄ представляет собой S, L или М; Х₅ представляет собой N, G, L или R; X₆ представляет собой A, S, G или отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой G или отсутствует; X₉ представляет собой G, S или отсутствует; X₁₀ представляет собой S, Y, A, N или отсутствует; X₁₁ представляет собой Y, Q или R; Х₁₂ представляет собой К или Q; Х₁₃ представляет собой L или V;

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇YKLS (SEQ ID NO: 1190), где X₂ представляет собой G или V; Х₃ представляет собой А или Y; X₄ представляет собой G, S или R; Х₅ представляет собой D или S; X₆ представляет собой N или отсутствует; X₇ представляет собой D или отсутствует.

5. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1200), где X₂ представляет собой S, V или I; X₃ представляет собой S, N или A; X₄ представляет собой R, V, S, L, P, G, I или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, R, T или S; X₆ представляет собой L, G, A, D, R, V или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, R, S, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, V, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е, G или К; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; X₁₄ представляет собой Y, F, T или I;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (SEQ ID NO: 1201), где X₄ представляет собой R, V, S, L, G или A; X₅ представляет собой F, G, Y, L, V, T или S; X₆ представляет собой A, L, R, D, G или отсутствует; X₇ представляет собой G, D, T или отсутствует; X₈ представляет собой S или отсутствует; X₉ представляет собой S, H, G, T, D, L или отсутствует; X₁₀ представляет собой T, S, A, G, P, N или Y; X₁₁ представляет собой D, Y, E, G или N; Х₁₂ представляет собой Т, Е или G; X₁₃ представляет собой Q, Y или L; X₁₄ представляет собой Y, F или T;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀TQY (SEQ ID NO: 1202), где X₄ представляет собой R, L или G; X₅ представляет собой F, V, T или Y; X₆ представляет собой L или A, отсутствует; X₇ представляет собой G или отсутствует; X₈ представляет собой S, G или отсутствует; X₉ представляет собой T, G, P или S; X₁₀ представляет собой D или E.

6. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988, 1002 или последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994 или 1010 или последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности.

7. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-6, где область Vα содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1191), где X₁ представляет собой N, S, D, T или V; X₂ представляет собой S, V, R, T или I; Х₃ представляет собой М, F, G, S, N, А, L, V или Р; X₄ представляет собой F, S, N, A или отсутствует; X₅ представляет собой D, S, Q, Y, N, V, T или P; и X₆ представляет собой Y, S, R, N, G или T; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1192), где X₁ представляет собой I, V, L, G, N, T, Y или M; X₂ представляет собой S, V, Y, L, P, F, I или T; X₃ представляет собой S, Y, K, L, T или F; X₄ представляет собой I, G, N, A, S или отсутствует; X₅ представляет собой S, D или отсутствует; X₆ представляет собой K, G, N, S, D, T или E; X₇ представляет собой D, E, G, A, K, L или N; и X₈ представляет собой K, V, D, P, N, T, L или M.

8. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-7, где область Vβ содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность SX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1203), где X₂ представляет собой G или N; Х₃ представляет собой Н или D; Х₄ представляет собой Т, L, N или V; и X₅ представляет собой A, S, Y или T; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1204), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Q, Y или N; X₃ представляет собой G, N, R или Y; X₄ представляет собой N, G, E или T; X₅ представляет собой S, E, A или G; и X₆ представляет собой A, E, I или Q.

9. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-8, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связываются или распознают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E7 в контексте молекулы МНС, причем пептидный эпитоп представляет собой или содержит Е7 (11-19) YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236).

10. TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-9, отличающиеся тем, что:

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 694, 712, 729, 744, 762, 776, 788, 802, 818, 832, 846, 858, 870, 882, 896, 911, 926, 940, 952, 964, 976, 988 или 1002, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963, 975, 987 или 999; и/или

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 703, 721, 736, 753, 769, 782, 794, 809, 825, 840, 852, 864, 876, 888, 902, 919, 932, 946, 958, 970, 982, 994, 1010 или 1381, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969, 981, 993, 1008 или 1380.

11. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-10, где область Vα дополнительно содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 171, 692, 710, 727, 742, 760, 171, 800, 816, 570, 909, 938, 151, или 1000; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 172, 693, 711, 728, 743, 761, 172, 801, 817, 831, 571, 910, 939, 152 или 1001.

12. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-11, где область Vβ содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 701, 719, 154, 751 или 139; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 702, 720, 155, 752, 140 или 918.

13. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-12, отличающиеся тем, что

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 692, 693 и 694, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 703, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 712, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 721, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 729, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 736, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 744, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 753, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 760, 761 и 762, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 769, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 776, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 782, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 742, 743 и 788, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 794, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 800, 801 и 802, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 751, 752 и 809, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 818, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 825, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831 и 832, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 840, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 846, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 852, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 831 и 858, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 864, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 870, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 876, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 882, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 888, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 816, 817 и 896, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 902, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 909, 910 и 911, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 701, 702 и 919, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 926, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 932, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 938, 939 и 940, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 946, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 952, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 958, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 964, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR -3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 720 и 970, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 727, 728 и 976, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 982, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 710, 711 и 988, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 719, 729 и 994, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1000, 1001 и 1002, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 1009 и 1010, соответственно; или

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 1391, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 1381, соответственно.

14. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-13, отличающиеся тем, что

область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 691, 709, 726, 741, 759, 775, 787, 799, 815, 830, 845, 857, 869, 881, 895, 908, 925, 937, 951, 963 975, 987, 999 или 1390; и/или

область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 700, 718, 735, 750, 768, 781, 793, 808, 824, 839, 851, 863, 875, 887, 901, 917, 931, 945, 957, 969 981, 993, 1008 или 1380.

15. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-14, отличающиеся тем, что

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 691 и 700, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 709 и 718, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 726 и 735, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 741 и 750, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 759 и 768, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 775 и 781, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 787 и 793, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 799 и 808, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 815 и 824, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 830 и 839, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 845 и 851, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 857 и 863, соответственно, режим Vα и Vβ он включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 869 и 875, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 881 и 887, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 895 и 901, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 908 и 917, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 925 и 931, соответственно области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 937 и 945, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 951 и 957, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 963 и 969, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 975 и 981, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 987 и 993, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 999 и 1008, соответственно; или области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1390 и 1380, соответственно.

16. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-15, где альфа-цепь дополнительно содержит константную область альфа (Cα), и/или бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ).

17. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16, где области Cα и Cβ представляют собой константные области мыши.

18. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16 или 17, отличающиеся тем, что

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 262, 833, 1012, 1014, 1015, 1017, 1018, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 263, 1013 или 1016, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

19. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16, где области Cα и Cβ представляют собой константные области человека.

20. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16 или 19, отличающиеся тем, что

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

21. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-20, отличающиеся тем, что

а) альфа-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 687, 705, 722, 737, 755, 771, 783, 795, 811, 826, 841, 853, 865, 877, 891, 904, 921, 933, 947 959, 971, 983, 995, 1386, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1049, 1051, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1073, 1075, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

b) бета-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 696, 714, 731, 746, 764, 777, 789, 804, 820, 835, 847, 859, 871, 883, 897, 913, 913, 927, 941, 953, 965, 977, 989, 1004 или 1376, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1050, 1052, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090 или 1092, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

22. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-20, отличающиеся тем, что

альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 687 и 696, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 705 и 714, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 722 и 731, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 737 и 746, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 755 и 764, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 771 и 777, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 783 и 789, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 795 и 804, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 811 и 820, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 826 и 835, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 841 и 847, соответственно, альфа и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 853 и 859, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 865 и 871, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 877 и 883, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 891 и 897, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 904 и 913, соответственно, альфа- и бета-цепи включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 921 и 927, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 933 и 941, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 947 и 953, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 959 и 965, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 971 и 977, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 983 и 989, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 995 и 1004, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1386 и 1376, соответственно.

23. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-19, где TCR или антигенсвязывающий фрагмент содержат одну или более модификаций в α-цепи и/или β-цепи, так что когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются в клетке, то снижается частота ошибочных спариваний между α-цепью и β-цепью TCR и α-цепью и β-цепью эндогенного TCR, экспрессия α-цепи и β-цепи TCR увеличивается и/или стабильность α цепи и β-цепи TCR увеличивается, каждая по сравнению с экспрессией в клетке TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, не содержащих одну или более модификаций.

24. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23, где одна или более модификаций представляют собой замену, делецию или вставку одной или более аминокислот в области Cα; и/или области Cα.

25. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23 или 24, где одна или более модификаций содержат замену(замены) для введения одного или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

26. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-16, 19 и 23-25, содержащие область Cα, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 48, с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 или 524, или в положении, соответствующем положению 49 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 215 или 220; и/или область Cβ, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 57 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 214 или 216, или в положении, соответствующем положению 58 с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 631 или 889.

27. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 16, 19 и 23-26, отличающиеся тем, что:

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 200, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, содержащие один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с бета-цепью; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 197, 199, 632 или 890, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, которые содержат один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с альфа-цепью.

28. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-27, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируются нуклеотидной последовательностью, которая была оптимизирована по кодонам.

29. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-19 и 23-28, отличающиеся тем, что

а) альфа-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 688, 706, 723, 738, 756, 772, 784, 796, 812, 827, 842, 854, 866, 878, 892, 905, 922, 934, 948, 960, 972, 984, 996 или 1387, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1129, 1131, 1133, 1135, 1137, 1139, 1141, 1143, 1145, 1147, 1149, 1151, 1153, 1155, 1157, 1159, 1161, 1163, 1165, 1167, 1169, 1171, 1173 или 1385, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

b) бета-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 697, 715, 732, 747, 765, 778, 790, 805, 821, 836, 848, 860, 872, 884, 898, 914, 928, 942, 954, 966, 978, 990, 1005 или 1377, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174 или 1375, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

30. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-19 и 23-29, отличающиеся тем, что:

альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 688 и 697, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 706 и 715, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 723 и 732, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат амино кислотные последовательности SEQ ID NO: 738 и 747, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 756 и 765, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 772 и 778, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 784 и 790, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 796 и 805, соответственно, альфа и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 812 и 821, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 827 и 836, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 842 и 848, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 854 и 860, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 866 и 872, соответственно, альфа- и бета-цепи включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 878 и 884, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 892 и 898, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 905 и 914, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 922 и 928, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 934 и 942, соответственно, альфа- и бета цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 948 и 954, соответственно, альфа- и бета цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 960 и 966, соответственно, альфа- и бета цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 972 и 978, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 984 и 990, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 996 и 1005, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1387 и 1377, соответственно.

31. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-30, где альфа- и/или бета-цепь дополнительно содержат сигнальный пептид.

32. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 31, отличающиеся тем, что:

альфа-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 181, 184, 187, 189, 190, 192, 193, 310, 311; и/или

бета-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 182, 185, 186, 188, 191 или 194.

33. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-32, которые выделены или очищены или являются рекомбинантными.

34. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-33, которые являются человеческими.

35. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-34, которые являются моноклональными.

36. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-35, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются одноцепочечными.

37. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-35, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат две цепи.

38. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-37, где антигенспецифичность является по меньшей мере частично CD8-независимой.

39. TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 9-38, где молекула МНС представляет собой молекулу HLA-A2.

40. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 или его альфа- или бета-цепь.

41. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 40, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, отличающаяся тем, что:

нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1049, 1051, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1073, 1075, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности;

нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1050, 1052, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090 или 1092, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

42. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 40, где нуклеотидная последовательность оптимизирована по кодонам.

43. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 40 или 42, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, отличающаяся тем, что:

нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1129, 1131, 1133, 1135, 1137, 1139, 1141, 1143, 1145, 1147, 1149, 1151, 1153, 1155, 1157, 1159, 1161, 1163, 1165, 1167, 1169, 1171, 1173 или 1385, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности;

нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174 или 1375, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

44. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-43, где нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы.

45. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 44, где пептид, который вызывает пропуск рибосомы, представляет собой пептид P2A или T2A и/или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 204 или 211.

46. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-45, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460. 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472 или 1382, или нуклеотидную последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

47. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или

область Vβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.

48. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 47, где область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂RX₄AX₆NNDMR, где X₂ представляет собой V или M; Х₄ представляет собой Р или D; и X₆ представляет собой N или R.

49. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 47 или 48, отличающиеся тем, что:

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄WGX₇SNQPX₁₂H, где X₄ представляет собой L, F или P; X₇ представляет собой R или Q; и X₁₂ представляет собой Q или L; или

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈SGNTIY, где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой W или Q; X₆ представляет собой G или P; Х₇ представляет собой R или S; и X₈ представляет собой S или отсутствует.

50. T-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность AX₂RX₄AX₆NNDMR, где X₂ представляет собой V или М; Х₄ представляет собой Р или D; и X₆ представляет собой N или R.

51. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄WGX₇SNQPX₁₂H, где X₄ представляет собой L, F или P; X₇ представляет собой R или Q; и X₁₂ представляет собой Q или L; или

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность ASSX₄X₅X₆X₇X₈SGNTIY, где X₄ представляет собой L или R; Х₅ представляет собой W или Q; X₆ представляет собой G или P; Х₇ представляет собой R или S; и X₈ представляет собой S или отсутствует.

52. Т-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие альфа-цепь, содержащую вариабельную область альфа (Vα), и бета-цепь, содержащую вариабельную область бета (Vβ), где:

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679, или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности;

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), представленную в любой из SEQ ID NO: 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686, или в последовательности, которая имеет с ними по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности.

53. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-52, где область Vα содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1191), где X₁ представляет собой N, S, D, T или V; X₂ представляет собой S, V, R, T или I; Х₃ представляет собой М, F, G, S, N, А, L, V или Р; X₄ представляет собой F, S, N, A или отсутствует; X₅ представляет собой D, S, Q, Y, N, V, T или P; и X₆ представляет собой Y, S, R, N, G или T; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 1192), где X₁ представляет собой I, V, L, G, N, T, Y или M; X₂ представляет собой S, V, Y, L, P, F, I или T; X₃ представляет собой S, Y, K, L, T или F; X₄ представляет собой I, G, N, A, S или отсутствует; X₅ представляет собой S, D или отсутствует; X₆ представляет собой K, G, N, S, D, T или E; X₇ представляет собой D, E, G, A, K, L или N; и X₈ представляет собой K, V, D, P, N, T, L или M.

54. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-53, где область Vβ содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность SX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO: 1203), где X₂ представляет собой G или N; Х₃ представляет собой Н или D; Х₄ представляет собой Т, L, N или V; и X₅ представляет собой A, S, Y или T; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 1204), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Q, Y или N; X₃ представляет собой G, N, R или Y; X₄ представляет собой N, G, E или T; X₅ представляет собой S, E, A или G; и X₆ представляет собой A, E, I или Q.

55. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-54, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связываются или распознают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E6 в контексте молекулы МНС, причем пептидный эпитоп представляет собой или содержит E6 (29-38) TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233).

56. TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-55, отличающиеся тем, что:

область Vα содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 478, 493, 505, 511, 523, 539, 555, 572, 588, 600, 612, 624, 638, 650, 662 или 679, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676; и/или

область Vβ содержит область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 486, 499, 517, 531, 548, 563, 581, 594, 606, 618, 630, 644, 656, 670 или 686, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655 667 или 685.

57. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-56, где область Vα дополнительно содержит:

область 1, определяющую комплементарность (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 161, 165, 537, 570, 142, 171 или 677; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 162, 166, 538, 571, 143, 172 или 678.

58. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-56, где область Vβ содержит:

область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 484, 148, 546, 561, 579, 168, 668 или 154; и/или

область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 485, 149, 547, 562, 580, 169, 669 или 155.

59. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-58, отличающиеся тем, что:

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 478, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 484, 485 и 486, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 493, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 505, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 499, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 511, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 517, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 523, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 531, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 537, 538 и 539, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 546, 547 и 548, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 555, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 563, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 570, 571 и 572, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 579, 580 и 581, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 594, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 600, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 606, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 612, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 618, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 624, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 630, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 638, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 561, 562 и 644, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 650, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 656, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 662, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 668, 669 и 670, соответственно; или

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 677, 678 и 679, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2, и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 686, соответственно.

60. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-59, отличающиеся тем, что:

область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 477, 492, 504, 510, 522, 536, 554, 569, 587, 599, 611, 623, 637, 649, 661 или 676; и/или

область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 483, 498, 516, 530, 545, 560, 578, 593, 605, 617, 629, 643, 655, 667 или 685.

61. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-60, отличающиеся тем, что: области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 477 и 483, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 492 и 498, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 504 и 498, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 510 и 516, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 522 и 530, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 536 и 545, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 554 и 560, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 569 и 578, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 587 и 593, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 599 и 605, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 611 и 617, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 623 и 629, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 637 и 643, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 649 и 655, соответственно; области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 661 и 667, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 676 и 685, соответственно.

62. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-61, где альфа-цепь дополнительно содержит константную область альфа (Cα), и/или бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ).

63. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 62, где области Cα и Cβ представляют собой константные области мыши.

64. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 62 или 63, отличающиеся тем, что:

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 262, 833, 1012, 1014, 1015, 1017, 1018, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 263, 1013 или 1016, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

65. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 62, где области Cα и Cβ представляют собой константные области человека.

66. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 62 или 65, отличающиеся тем, что:

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 212, 213, 215, 217, 218, 220 или 524, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 214, 216, 631 или 889, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

67. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-66, отличающиеся тем, что:

а) альфа-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 473, 488, 500, 506, 518, 532, 550, 565, 583, 595, 607, 619, 633, 645, 657 или 672, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 389, 430, 1019, 1021, 1023, 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043 или 1045, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

b) бета-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленная в любой из SEQ ID NO: 479, 494, 512, 526, 541, 556, 574, 589, 601, 613, 625, 639, 651, 663 или 681, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере, 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 390, 431, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044 или 1046, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

68. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-67, отличающиеся тем, что: альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 473 и 479, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 488 и 494, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 500 и 494, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 506 и 512, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 518 и 526, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 532 и 541, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 550 и 556, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 565 и 574, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 583 и 589, соответственно, альфа и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 595 и 601, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 607 и 613, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 619 и 625, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 633 и 639, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 645 и 651, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 657 и 663, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 672 и 681, соответственно.

69. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-68, где TCR или антигенсвязывающий фрагмент содержат одну или более модификаций в α-цепи и/или β-цепи, так что когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются в клетке, частота ошибочного спаривания между α-цепью и β-цепью TCR и эндогенными α-цепью и β-цепью TCR снижается, экспрессия α-цепи и β-цепи TCR увеличивается и/или стабильность α цепи и β-цепи TCR увеличивается, каждая по сравнению с экспрессией в клетке TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, не содержащих одну или более модификаций.

70. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 69, где одна или более модификаций представляют собой замену, делецию или вставку одной или более аминокислот в области Cα и/или области Cβ.

71. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 69 или 70, где одна или более модификаций содержат замену (замены) для введения одного или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

72. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-62, 65 и 69-71, содержащие область Cα, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 48, с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 212, 213, 217, 218 или 524 или в положении, соответствующем положению 49, с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 215 или 220; и/или область Cβ, содержащую цистеин в положении, соответствующем положению 57, с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 214 или 216, или в положении, соответствующем положению 58, с нумерацией, представленной в SEQ ID NO: 631 или 889.

73. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 62, 65 и 69-72, отличающиеся тем, что:

область Cα содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 196, 198, 200, 201, 203 или 525, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, содержащие один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с бета-цепью; и/или

область Cβ содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 197, 199, 632 или 890, или последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности, которые содержат один или более остатков цистеина, способных образовывать ненативную дисульфидную связь с альфа-цепью.

74. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-73, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент кодируются нуклеотидной последовательностью, которая была оптимизирована по кодонам.

75. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-62, 65 и 69-74, отличающиеся тем, что:

а) альфа-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 474, 489, 501, 507, 519, 533, 551, 566, 584, 596, 608, 620, 634, 646, 658 или 673, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1115, 1117, 1119, 1121, 1123, 1125 или 1127, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности; и/или

b) бета-цепь содержит:

аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 480, 495, 513, 527, 542, 557, 575, 590, 602, 614, 626, 640, 652, 664 или 682, последовательность аминокислот, которая имеет с ними по меньшей мере, 90% идентичности последовательности; или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126 или 1128, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

76. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-62, 65 и 69-75, где альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 474 и 482, соответственно; альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 489 и 497, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 501 и 497, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 507 и 515, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 519 и 529, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 533 и 544, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 551 и 559, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 566 и 577, соответственно, альфа и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 584 и 592, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 596 и 604, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 608 и 616, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 620 и 628, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 634 и 642, соответственно, альфа- и бета-цепи включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 646 и 654, соответственно, альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 658 и 666, соответственно; или альфа- и бета-цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 673 и 684, соответственно.

77. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-76, где альфа- и/или бета-цепь дополнительно содержит сигнальный пептид.

78. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 77, отличающиеся тем, что:

альфа-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 181, 184, 187, 189, 190, 192, 193, 310, 311; и/или

бета-цепь содержит сигнальный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 182, 185, 186, 188, 191 или 194.

79. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-78, которые выделены или очищены или являются рекомбинантными.

80. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-79, которые являются человеческими.

81. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-80, которые являются моноклональными.

82. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-81, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент являются одноцепочечными.

83. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-81, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат две цепи.

84. TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-83, где антигенспецифичность является по меньшей мере частично CD8-независимой.

85. TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-84, где молекула МНС представляет собой молекулу HLA-A2.

86. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 47-85 или его альфа- или бета-цепь.

87. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 86, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, отличающаяся тем, что:

нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 389, 430, 1019, 1021, 1023, 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043 или 1045, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности;

нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 390, 431, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044 или 1046, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

88. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 86, где нуклеотидная последовательность оптимизирована по кодонам.

89. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 86 или 88, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-цепь, отличающаяся тем, что:

нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1097, 1099, 1101, 1103, 1105, 1107, 1109, 1111, 1113, 1115, 1117, 1119, 1121, 1123, 1125 или 1127, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности;

нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126 или 1128, или нуклеотидную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

90. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 86-89, где нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-цепь, разделены пептидной последовательностью, которая вызывает пропуск рибосомы.

91. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 90, где пептид, который вызывает пропуск рибосомы, представляет собой пептид P2A или T2A и/или содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 204 или 211.

92. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 86-91, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444. 445, 446 или 447, или нуклеотидную последовательность, имеющую с ними по меньшей мере 90% идентичности последовательности.

93. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-92, где молекула нуклеиновой кислоты является синтетической.

94. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-93, где молекула нуклеиновой кислоты представляет собой кДНК.

95. Полинуклеотид, содержащий:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TCR или его антигенсвязывающую часть по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85, или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-94, и

(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

96. Полинуклеотид, содержащий:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть Т-клеточного рецептора (TCR), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47-61, 67-69 и 74-85, и константную область бета (Cβ); и (ii) часть альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47- 61, 67-69 и 74-85, где часть цепи TCRα меньше, чем полноразмерная цепь TCRα, и

(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

97. Полинуклеотид по варианту осуществления 96, где цепь TCRα содержит константную область альфа (Cα), где по меньшей мере часть указанной Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид.

98. Полинуклеотид по варианту осуществления 96 или 97, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) и одно из одного или более плеч гомологии вместе содержат последовательность нуклеотидов, кодирующую Сα, которая меньше, чем полная длина нативной Сα, где по меньшей мере часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид.

99. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 96-98, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь TCRβ, находится в 5'-области относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRα.

100. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 96-99, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) не содержит интрона.

101. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 96-100, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) представляет собой последовательность, которая является экзогенной или гетерологичной относительно открытой рамки считывания эндогенного геномного локуса TRAC Т-клетки, необязательно человеческой Т-клетки.

102. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 96-101, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке с одним или более экзонами или их частичной последовательностью, необязательно с экзоном 1 или его частичной последовательностью, открытой рамки считывания локуса TRAC, содержащейся в одном или более плечах гомологии.

103. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 97-102, где Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cα меньше чем полная длина нативной Cα.

104. Полинуклеотид по варианту осуществления 103, где дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 3155 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 348, или одним или более ее экзонами или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 3155 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 348, или с одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью.

105. Полинуклеотид по варианту осуществления 103 или 104, где дополнительная часть Cα кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1364, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1364 или ее частичной последовательностью.

106. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 103-105, где дополнительная часть области Cα и/или области Cβ, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или вставку одной или более аминокислот по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, необязательно указанные одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

107. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-106, где одно или более плеч гомологии содержат 5'-плечо гомологии и/или 3'-плечо гомологии.

108. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-107, где 5'-плечо гомологии содержит:

а) последовательность, содержащую, или по меньшей мере, содержащую или по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1343;

b) последовательность, содержащую, или по меньшей мере, содержащую или, по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1343; или

c) последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1343.

109. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-108, где 3'-плечо гомологии содержит:

а) последовательность, содержащую или по меньшей мере содержащую или по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, которая имеет, по меньшей мере, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1344;

b) последовательность, содержащую или по меньшей мере содержащую или по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1344; или

c) последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1344.

110. Полинуклеотид, содержащий:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TCR или его антигенсвязывающую часть по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-86, или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-92, и

(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

111. Полинуклеотид, содержащий:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть Т-клеточного рецептора (TCR), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47-61, 67-69 и 74-85 и константную область альфа (Cα); и (ii) часть бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47- 61, 67-69 и 74-85, где часть цепи TCRβ менее, чем полноразмерная цепь TCRβ, и

(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или более областям открытой рамки считывания локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

112. Полинуклеотид по варианту осуществления 111, где цепь TCRβ содержит константную область бета (Cβ), где по меньшей мере часть указанной Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются клеткой, в которую был введен полинуклеотид.

113. Полинуклеотид по варианту осуществления 111 или 112, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) и одно из одного или более плеч гомологии вместе содержат последовательность нуклеотидов, кодирующую Сβ, которая меньше чем полная длина нативной Сβ, где по меньшей мере, часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью, когда TCR или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируются клеткой, в которую был введен полинуклеотид.

114. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 111-113, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь TCRα, находится в 5'-области относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRβ.

115. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 111-114, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) не содержит интрона.

116. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 111-115, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) представляет собой последовательность, которая является экзогенной или гетерологичной по отношению к открытой рамке считывания эндогенного геномного локуса TRBC Т-клетки, необязательно Т-клетки человека.

117. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 111-116, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке с одним или более экзонами или их частичной последовательностью, необязательно экзоном 1 или его частичной последовательностью, открытой рамки считывания локуса TRBC, содержащейся в одном или более плечах гомологии.

118. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 111-117, где часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cβ меньше чем полная длина нативной Cβ.

119. Полинуклеотид по варианту осуществления 118, где дополнительная часть Cβ кодируется:

последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 349, или одним или более ее экзонами, или последовательностью, которая имеет, по меньшей мере, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 349, или одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью; или

последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1047, или одним или более ее экзонами, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1047, или одним или более ее экзонами, или их частичной последовательностью;

120. Полинуклеотид по варианту осуществления 118 или 119, где дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или вставку одной или более аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, причем необязательно указанные одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, которые способны образовывать одну или более ненативных дисульфидных связей между альфа-цепью и бета-цепью.

121. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 110-120, где одно или более плеч гомологии содержат 5'-плечо гомологии и/или 3'-плечо гомологии.

122. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-121, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более полицистронных элементов.

123. Полинуклеотид по варианту осуществления 122, где полистронный элемент(элементы) расположен между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или ее часть, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или ее часть.

124. Полинуклеотид по варианту осуществления 122 или 123, где один или более полицистронных элементов находятся в 5'-области относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR, или часть TCR, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR.

125. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 122-124, где один или более полицистронных элементов представляют собой или содержат последовательность пропуска рибосомы, необязательно, где последовательность пропуска рибосомы представляет собой элемент T2A, P2A, E2A или F2A.

126. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-125, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более гетерологичных или регуляторных контрольных элементов, функционально связанных с контролем экспрессии TCR, когда он экспрессируется клеткой, в которую был введен полинуклеотид.

127. Полинуклеотид по варианту осуществления 126, где один или более гетерологичных регуляторных или контрольных элементов содержат промотор, энхансер, интрон, сигнал полиаденилирования, консенсусную последовательность Козака, акцепторную последовательность сплайсинга и/или донорную последовательность сплайсинга.

128. Полинуклеотид по варианту осуществления 126 или 127, где гетерологичный регуляторный или контрольный элемент содержат гетерологичный промотор, необязательно промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1α) человека или промотор MND, или его вариант.

129. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-128, который представляет собой линейный полинуклеотид, необязательно двухцепочечный полинуклеотид или одноцепочечный полинуклеотид.

130. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-94 или полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-129.

131. Вектор по варианту осуществления 130, где вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

132. Вектор по варианту осуществления 130 или 131, где вектор представляет собой вирусный вектор.

133. Вектор по варианту осуществления 132, где вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.

134. Вектор по варианту осуществления 132 или 133, где вирусный вектор представляет сбой лентивирусный вектор.

135. Вектор по варианту осуществления 134, где лентивирусный вектор получен из HIV-1.

136. Вектор по варианту осуществления 132 или 133, где вирусный вектор представляет собой гаммаретровирусный вектор.

137. Вектор по варианту осуществления 132, где вирусный вектор представляет собой вектор AAV.

138 Вектор по варианту осуществления 137, где вектор AAV выбран из векторов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 или AAV8.

139. Сконструированная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-94, полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-129 или вектор по любому из вариантов осуществления 130-138.

140. Сконструированная клетка, содержащая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85, необязательно рекомбинантный TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85.

141. Сконструированная клетка по варианту осуществления 139 или 140, содержащая генетическое нарушение гена константной области эндогенного Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

142. Сконструированная клетка по варианту осуществления 141, где ген TRBC представляет собой один или оба из гена константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или гена константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2).

143. Сконструированная клетка по варианту осуществления 141 или 142, где сконструированная клетка не содержит непрерывного гена TRAC и/или TRBC; не содержит ген TRAC и/или TRBC; не содержит функционального гена TRAC и/или TRBC; и/или не экспрессирует, не экспрессирует на детектируемом уровне или экспрессирует на уровне менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от уровня генного продукта эндогенного TRAC или TRBC дикого типа.

144. Сконструированная клетка, содержащая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, где:

(1) клетка содержит генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC) и/или не экспрессирует, или не экспрессирует на детектируемом уровне или экспрессирует на уровне менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от уровня генного продукта эндогенного TRAC или TRBC дикого типа; и

(2) TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент включают TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85, необязательно рекомбинантный TCR или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85.

145. Сконструированная клетка, содержащая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, где:

(1) клетка содержит генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC) и/или не экспрессирует, или не экспрессирует на детектируемом уровне или экспрессирует на уровне менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от уровня генного продукта эндогенного TRAC или TRBC дикого типа; и

(2) TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(а) вариабельную область альфа (Vα), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности, и вариабельную область бета (Vβ), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности; и/или

(b) область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 153, 159 или 301, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295, и область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 156 или 160, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296.

146. Сконструированная клетка по варианту осуществления 145, отличающаяся тем, что:

область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 151 или 157; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 152 или 158; и/или

область Vβ дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 154; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 155.

147. Сконструированная клетка по варианту осуществления 145 или 146, где область Vα и область Vβ содержат:

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 153, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно;

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 157, 158 и 159, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 160, соответственно; или

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 301, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно.

148. Сконструированная клетка по варианту осуществления 145, отличающаяся тем, что:

область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295; и/или

область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296.

149. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 145-148:

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 117 и либо 118, либо 296, соответственно;

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 119 и 120, соответственно; или

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 295 и либо 118, либо 296, соответственно.

150. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 145-149, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связываются или распознают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E7 в контексте молекулы МНС, причем пептидный эпитоп представляет собой или содержит E7 (11-19) YMLDLQPET (SEQ ID NO: 236).

151. Сконструированная клетка, содержащая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, где:

(1) клетка содержит генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC), и/или не экспрессирует, или не экспрессирует на детектируемом уровне или экспрессирует на уровне менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от уровня генного продукта эндогенного TRAC или TRBC дикого типа; и

(2) TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или рекомбинантный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(a) вариабельную область альфа (Vα), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297 или 299, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними в по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или область Vβ, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298 или 300, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности; и/или

(b) область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 138, 144, 147, 163, 167, 173, 304 или 308, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297 или 299, и область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 141, 146, 150, 164, 170, 174, 305 или 309, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298 или 300.

152. Сконструированная клетка по варианту осуществления 151, отличающаяся тем, что:

область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 136, 142, 161, 165, 171, 302 или 306, или CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297 или 299; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 137, 143, 162, 166, 172, 303 или 307, или CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297 или 299; и/или

область Vβ дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 139, 145, 148, 168, или CDR-1, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленную в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298 или 300; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 140, 149 или 169, или CDR-2, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298 или 300.

153. Сконструированная клетка по варианту осуществления 151 или 152, отличающаяся тем, что

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 141, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 142, 143 и 144, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 145, 140 и 146, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 136, 137 и 147, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 150, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 161, 162 и 163, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 164, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 165, 166 и 167, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168, 169 и 170, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171, 172 и 173, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 174, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 302, 303 и 304, соответственно, а область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 139, 140 и 305, соответственно;

область Vα содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 306, 307 и 308, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 148, 149 и 309, соответственно.

154. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 151-153, отличающаяся тем, что:

область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 111, 113, 115, 121, 123, 125, 297 или 299; и/или

область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 112, 114, 116, 122, 124, 126, 298 или 300.

155. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 151-154: области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 111 и 112, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 113 и 114, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 115 и 116, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 121 и 122, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 123 и 124, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 125 и 126, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 297 и 298, соответственно, области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 299 и 300, соответственно.

156. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 151-155, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент связываются или распознают пептидный эпитоп вируса папилломы человека (HPV) 16 E6 в контексте молекулы МНС, причем пептидный эпитоп представляет собой или содержит E6 (29-38) TIHDIILECV (SEQ ID NO: 233).

157. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 145-156, где альфа-цепь дополнительно содержит константную область альфа (Cα), и/или бета-цепь дополнительно содержит константную область бета (Cβ).

158. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 143-157, где генный продукт представляет собой мРНК или белок, кодируемый геном TRAC или TRBC.

159. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-158, где генетическое нарушение включает мутацию или делецию в области гена TRAC или TRBC, которые находятся в кодирующей области, необязательно ранней кодирующей области гена, в пределах экзона 1 гена, в кодирующей области в пределах 500, 400, 300, 200, 100 или 50 пар оснований от старт-кодона гена, в последовательности сайта-мишени, которая комплементарна нацеливающему сайту нацеливающего домена гид-РНК (гРНК), имеющего последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1053 и 1259-1315, и/или с которой специфически гибридизуется нацеливающий домен, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1053 и 1259-1315,, и/или в последовательности сайта-мишени, которая комплементарна нацеливающему сайту нацеливающего домена гРНК, имеющего последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1048 и 1229-1258, и/или с которой специфически гибридизуется нацеливающий домен, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1048 и 1229-1258.

160. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-159, где на генетическое нарушение влияет один или более агентов, которые содержат (a) по меньшей мере одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC и/или гена TRBC или (b) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну гРНК.

161. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-160, где один или более агентов содержат, по меньшей мере, один комплекс молекулы Cas9 и, по меньшей мере, одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC и/или гена TRBC.

162. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 160 или 161, где по меньшей мере одна гРНК содержит нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC, причем указанный нацеливающий домен содержит последовательность, выбранную из UCUCUCAGCUGGUACACGGC (SEQ ID NO:1229), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (SEQ ID NO:1230), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (SEQ ID NO:1231), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO:1048), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (SEQ ID NO:1232), CUCAGCUGGUACACGGC (SEQ ID NO:1233), UGGUACACGGCAGGGUC (SEQ ID NO:1234), GCUAGACAUGAGGUCUA (SEQ ID NO:1235), GUCAGAUUUGUUGCUCC (SEQ ID NO:1236), UCAGCUGGUACACGGCA (SEQ ID NO:1237), GCAGACAGACUUGUCAC (SEQ ID NO:1238), GGUACACGGCAGGGUCA (SEQ ID NO:1239), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (SEQ ID NO:1240), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO:1241), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (SEQ ID NO:1242), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (SEQ ID NO:1243), AAACUGUGCUAGACAUG (SEQ ID NO:1244), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (SEQ ID NO:1245), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:1246), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:1247), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:1248), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (SEQ ID NO:1249), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:1250), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:1251), GACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:1252), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (SEQ ID NO:1253), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (SEQ ID NO:1254), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (SEQ ID NO:1255), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (SEQ ID NO:1256), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (SEQ ID NO:1257), и GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (SEQ ID NO:1258).

163. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 160-162, где гРНК содержит нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRBC, необязательно в одном или обоих генах TRBC1 и TRBC2, причем указанный нацеливающий домен-мишень содержит последовательность, выбранную из CACCCAGAUCGUCAGCGCCG (SEQ ID NO:1259), CAAACACAGCGACCUCGGGU (SEQ ID NO:1260), UGACGAGUGGACCCAGGAUA (SEQ ID NO:1261), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG (SEQ ID NO:1262), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO:1053), GAAAAACGUGUUCCCACCCG (SEQ ID NO:1263), AUGACGAGUGGACCCAGGAU (SEQ ID NO:1264), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU (SEQ ID NO:1265), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA (SEQ ID NO:1266), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG (SEQ ID NO:1267), UCAAACACAGCGACCUCGGG (SEQ ID NO:1268), CGUAGAACUGGACUUGACAG (SEQ ID NO:1269), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC (SEQ ID NO:1270), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG (SEQ ID NO:1271), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC (SEQ ID NO:1272), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC (SEQ ID NO:1273), CGGGUGGGAACACGUUUUUC (SEQ ID NO:1274), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU (SEQ ID NO:1275), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU (SEQ ID NO:1276), GGCUCAAACACAGCGACCUC (SEQ ID NO:1277), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC (SEQ ID NO:1278), AGGCUUCUACCCCGACCACG (SEQ ID NO:1279), CCGACCACGUGGAGCUGAGC (SEQ ID NO:1280), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC (SEQ ID NO:1281), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG (SEQ ID NO:1282), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC (SEQ ID NO:1283), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC (SEQ ID NO:1284), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG (SEQ ID NO:1285), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA (SEQ ID NO:1286), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG (SEQ ID NO:1287), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC (SEQ ID NO:1288), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG (SEQ ID NO:1289), UGGCUCAAACACAGCGACCU (SEQ ID NO:1290), ACUGGACUUGACAGCGGAAG (SEQ ID NO:1291), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG (SEQ ID NO:1292), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC (SEQ ID NO:1293), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG (SEQ ID NO:1294), CUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO:1295), CCUCGGCGCUGACGAUC (SEQ ID NO:1296), CCGAGAGCCCGUAGAAC (SEQ ID NO:1297), CCAGAUCGUCAGCGCCG (SEQ ID NO:1298), GAAUGACGAGUGGACCC (SEQ ID NO:1299), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:1300), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:1301), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:1302), GACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:1303), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU (SEQ ID NO:1304), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG (SEQ ID NO:1305), GUGGAGCUGAGCUGGUGG (SEQ ID NO:1306), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1307), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1308), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1309), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1310), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1311), GCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:1312), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:1313), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:1314), и GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:1315).

164. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-163, отличающаяся тем, что:

сконструированная клетка содержит генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC); и/или

один или более агентов содержат агент, содержащий, по меньшей мере, одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC, и агент, содержащий, по меньшей мере, одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRBC, необязательно одного или обоих, гена TRBC1 и гена TRBC2.

165. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 159-164, где нацеливающий домен содержит последовательность, комплементарную домену-мишени гена TRAC, и нацеливающий домен содержит последовательность GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO: 1048)

166. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 159-165, где нацеливающий домен содержит последовательность, комплементарную домену-мишени гена TRBC, и нацеливающий домен содержит последовательность GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO: 1053).

167. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 159-166, где гРНК дополнительно содержит первый домен комплементарности, второй домен комплементарности, который комплементарен первому домену комплементарности, проксимальный домен и, необязательно, хвостовой домен.

168. Сконструированная клетка по варианту осуществления 167, где первый домен комплементарности и второй домен комплементарности соединены связывающим доменом.

169. Сконструированная клетка по варианту осуществления 167 или 168, где гид-РНК содержит 3'-поли-А-хвост и 5'-Cap-аналог (Anti-Reverse Cap Analog) (ARCA).

170. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 161-169, где молекула Cas9 является ферментативно активной Cas9.

171. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 161-170, где молекула Cas9 представляет собой молекулу Cas9 S. aureus.

172. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 161-171, где молекула Cas9 представляет собой Cas9 S. pyogenes.

173. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-172, где сконструированная клетка содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

174. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-173, где эндогенный локус TRAC дополнительно модифицируется путем интеграции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, в локус TRAC, необязательно через HDR.

175. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-173, где эндогенный локус TRAC дополнительно модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, необязательно посредством направляемой гомологией репарации (HDR).

176. Сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRAC, кодирующий TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85.

177. Сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRAC, где эндогенный локус TRAC модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, причем указанная трансгенная последовательность кодирует (i) бета-цепь T-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47-61, 67-69 и 74-85, и константную область бета (Cβ); и (ii) часть альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47- 61, 67-69 и 74-85, где по меньшей мере часть константной области альфа (Cα) TCR кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или его частичной последовательностью.

178. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-176, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Cα, причем по меньшей мере, часть указанной Cα кодируется открытой рамкой считывания или ее частичной последовательностью эндогенного локуса TRAC.

179. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-178, где модифицированный локус TRAC содержит слияние в рамке (i) трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, и (ii) открытой рамки считывания или ее частичной последовательности эндогенного локуса TRAC.

180. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 175, 177 и 179, где трансгенная последовательность не содержит последовательности, кодирующей 3'-UTR или интрон.

181. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 177-180, где открытая рамка считывания или ее частичная последовательность содержит 3'-UTR эндогенного локуса TRAC.

182. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 176, 177 и 179-181, где трансгенная последовательность интегрирована в 3'-области относительно крайнего 5'-нуклеотида экзона 1 и в 5'-области относительно крайнего 3'-нуклеотида экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.

183. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 177-182, где по меньшей мере часть Cα кодируется по меньшей мере экзонами 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.

184. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 177-183, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, часть Cα кодируется, по меньшей мере, частью экзона 1 и экзонов 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.

185. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 175, 177 и 179-184, где трансгенная последовательность кодирует бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ) и/или вариабельную область TCR альфа (Vα).

186. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 173-185, дополнительно содержащая генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC), необязательно локуса TRBC1 или TRBC2.

187. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-173, где сконструированная клетка содержит генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

188. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-173, где эндогенный локус TRBC дополнительно модифицируется путем интеграции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, в локус TRBC, необязательно посредством HDR.

189. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 141-173, где эндогенный локус TRBC дополнительно модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR или его антигенсвязывающего фрагмента, необязательно посредством репарации, направляемой гомологией, (HDR).

190. Сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRBC, кодирующий TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85.

191. Сконструированная клетка, содержащая модифицированный локус TRBC, где эндогенный локус TRBC модифицируется путем интеграции трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, причем указанная трансгенная последовательность кодирует (i) альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельную область альфа (Vα) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47-61, 67-69 и 74-85, и константную область альфа (Cα); и (ii) часть бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельную область бета (Vβ) TCR или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-14, 21-23, 28-39, 47- 61, 67-69 и 74-85, где по меньшей мере часть константной области бета (Cβ) TCR кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или его частичной последовательностью.

192. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 188-190, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат Cβ, причем по меньшей мере, часть указанной Cβ кодируется открытой рамкой считывания или ее частичной последовательностью эндогенного локуса TRBC.

193. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 188-192, где модифицированный локус TRBC содержит слияние в рамке (i) трансгенной последовательности, кодирующей часть TCR, и (ii) открытой рамки считывания или ее частичной последовательности эндогенного локуса TRBC.

194. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 189, 191 и 193, где трансгенная последовательность не содержит последовательности, кодирующей 3'-UTR или интрон.

195. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 192-194, где открытая рамка считывания или ее частичная последовательность содержат 3'-UTR эндогенного локуса TRBC.

196. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 189, 191 и 193-195, где трансгенная последовательность интегрирована в 3'-области относительно крайнего 5'-нуклеотида экзона 1 и в 5'-области относительно крайнего 3'-нуклеотида экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.

197. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 191-196, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, часть Cβ кодируется, по меньшей мере, экзонами 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.

198. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 191-197, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, часть Cβ кодируется, по меньшей мере, частью экзона 1 и экзонов 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.

199. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 189, 191 и 193-198, где трансгенная последовательность кодирует альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα) и/или вариабельную область TCR бета (Vβ).

200. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 187-199, где локус TRBC представляет собой один или оба из локуса константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2).

201. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 188-200, дополнительно содержащая генетическое нарушение локуса константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC).

202. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-186 и 188-201, где трансгенная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит один или более полицистронных элементов.

203. Сконструированная клетка по варианту осуществления 202, где один или более полицистронных элементов находятся в 5'-области от трансгенной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент.

204. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-186 и 188-203, где полистронный элемент(элементы) расположен между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или его часть, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или его часть.

205. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-186 и 188-204, где один или более полицистронных элементов представляют собой или содержат последовательность пропуска рибосомы, необязательно где последовательность пропуска рибосомы представляет собой элемент T2A, P2A, E2A или F2A.

206. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 174-186 и 188-205, где трансгенная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит один или более гетерологичных или регуляторных контрольных элементов, функционально связанных с контролем экспрессии TCR, когда он экспрессируется сконструированной клеткой, в которую он был введен.

207. Сконструированная клетка по варианту осуществления 206, где один или более гетерологичных регуляторных или контрольных элементов содержат промотор, энхансер, интрон, сигнал полиаденилирования, консенсусную последовательность Козака, акцепторную последовательность сплайсинга и/или донорную последовательность сплайсинга.

208. Сконструированная клетка по варианту осуществления 206 или 207, где гетерологичный регуляторный или контрольный элемент содержит гетерологичный промотор, необязательно промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1α) человека или промотор MND или его вариант.

209. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 139-208, где TCR или его антигенсвязывающий фрагмент или его часть являются гетерологичными по отношению к клетке.

210. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 139-209, где сконструированная клетка представляет собой клеточную линию.

211. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 139-210, где сконструированная клетка представляет собой первичную клетку, полученную от пациента.

212. Сконструированная клетка по варианту осуществления 211, где пациентом является млекопитающее.

213. Сконструированная клетка по варианту осуществления 211 или 212, где пациентом является человек.

214. Сконструированная клетка по любому из вариантов осуществления 139-213, где сконструированная клетка представляет собой Т-клетку.

215. Сконструированная клетка по варианту осуществления 214, где Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку.

216. Сконструированная клетка по варианту осуществления 214, где Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку.

217. Способ получения клетки по любому из вариантов осуществления 139-216, включающий введение вектора по любому из вариантов осуществления 130-138 в клетку in vitro или ex vivo.

218. Способ получения клетки, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-94, полинуклеотида по любому из вариантов осуществления 95-129 или вектора по любому из вариантов осуществления 130-138 в клетку in vitro или ex vivo.

219. Способ по варианту осуществления 217 или 218, где вектор представляет собой вирусный вектор, а введение осуществляют трансдукцией.

220. Способ по любому из вариантов осуществления 217-219, дополнительно включающий введение в клетку одного или более агентов, где каждый из одного или более агентов независимо способен индуцировать генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

221. Способ получения сконструированной клетки, включающий:

(i) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-39 и 47-85, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 40-46 и 86-94, полинуклеотида по любому из вариантов осуществления 95-129 или вектора по любому из вариантов осуществления 130-138 в клетку; и

(ii) введение в клетку одного или более агентов, где каждый из одного или более агентов независимо способен индуцировать генетическое нарушение гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC).

222. Способ по варианту осуществления 221, где ген TRBC представляет собой один или оба из гена константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или гена константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2).

223. Способ по любому из вариантов осуществления 221-222, где один или более агентов, способных индуцировать генетическое нарушение, включают ДНК-связывающий белок или ДНК-связывающую нуклеиновую кислоту, которые специфически связываются с сайтом-мишенью или гибридизуются с ним.

224. Способ по варианту осуществления 223, где один или более агентов, способных индуцировать генетическое нарушение, включают (a) слитый белок, содержащий ДНК-нацеленный белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемую нуклеазу.

225. Способ по варианту осуществления 224, где ДНК-нацеленный белок или РНК-направляемая нуклеаза содержат белок цинкового пальца (ZFP), белок TAL или нуклеазу Cas, ассоциированную с нуклеиновой кислотой CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), специфичную для сайта-мишени в гене TRAC и/или TRBC.

226. Способ по варианту осуществления 225, где один или более агентов включают нуклеазу цинкового пальца (ZFN), эффекторную нуклеазу TAL (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, которая специфически связывается, распознает или гибридизуется с сайтом-мишенью.

227. Способ по варианту осуществления 225 или 226, где каждый из одного или более агентов содержит гид-РНК (гРНК), имеющую нацеливающий домен, который комплементарен по меньшей мере одному сайту-мишени.

228. Способ по вариантам осуществления 217-227, где ген TRBC представляет собой один или оба из гена константной области 1 Т-клеточного рецептора бета (TRBC1) или гена константной области 2 Т-клеточного рецептора бета (TRBC2).

229. Способ по любому из вариантов осуществления 221-228, где на генетическое нарушение воздействует один или более агентов, которые включают (а) по меньшей мере одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC и/или TRBC, или (b) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну гРНК.

230. Способ по варианту осуществления 229, где один или более агентов вводят в виде рибонуклеопротеинового комплекса (RNP), содержащего гРНК и белок Cas9.

231. Способ по варианту осуществления 230, где RNP вводят посредством электропорации, генной пушки, трансфекции фосфатом кальция, сжатия или сдавливания клеток.

232. Способ по варианту осуществления 230 или 231, где RNP вводят посредством электропорации.

233. Способ по любому из вариантов осуществления 227-232, где один или более агентов вводят в виде одного или более полинуклеотидов, кодирующих гРНК и/или белок Cas9.

234. Способ по любому из вариантов осуществления 220-233, где один или более агентов содержат по меньшей мере один комплекс молекулы Cas9 и по меньшей мере одну гРНК, имеющую нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени гена TRAC и/или гена TRBC.

235. Способ по любому из вариантов осуществления 220-234, где один или более агентов содержат, по меньшей мере, один комплекс из молекулы Cas9 и гРНК, имеющей нацеливающий домен, который представляет собой один или оба из (1) комплементарного домену-мишени гена TRAC, причем указанный нацеливающий домен содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1048 и 1229-1258; и (2) комплементарного домену-мишени гена TRBC, необязательно одного или обоих из генов TRBC1 и TRBC2, причем указанный домен-мишень содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1053 и 1259-1315.

236. Способ по любому из вариантов осуществления 229-235, где нацеливающий домен содержит последовательность, комплементарную домену-мишени гена TRAC, и нацеливающий домен содержит последовательность GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO: 1048).

237. Способ по любому из вариантов осуществления 229-236, где нацеливающий домен содержит последовательность, комплементарную домену-мишени гена TRBC, и нацеливающий домен содержит последовательность GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO: 1053).

238. Способ по любому из вариантов осуществления 229-237, где гид-РНК дополнительно содержит первый домен комплементарности, второй домен комплементарности, который комплементарен первому домену комплементарности, проксимальный домен и, необязательно, хвостовой домен.

239. Способ по варианту осуществления 238, где первый домен комплементарности и второй домен комплементарности соединены связывающим доменом.

240. Способ по любому из вариантов осуществления 239, где гид-РНК содержит 3'-поли-А-хвост и 5'-Cap-аналог (Anti-Reverse Cap Analog) (ARCA).

241. Способ по любому из вариантов осуществления 226-240, где молекула Cas9 представляет собой ферментативно активную Cas9.

242. Способ по любому из вариантов осуществления 226-241, где молекула Cas9 представляет собой молекулу Cas9 S. aureus.

243. Способ по любому из вариантов осуществления 226-241, где молекула Cas9 представляет собой Cas9 S. pyogenes.

244. Способ по любому из вариантов осуществления 220-243, отличающийся тем, что, по меньшей мере или более чем 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% или 95% клеток во множестве сконструированных клеток содержат генетическое нарушение в гене TRAC и/или гене TRBC.

245. Способ по любому из вариантов осуществления 220-244, где по меньшей мере или более чем 90%, 95%, 96%, 97% или 98% клеток во множестве сконструированных клеток содержат генетическое нарушение в гене TRAC и/или гене TRBC.

246. Способ по любому из вариантов осуществления 217-245, где по меньшей мере или более чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более клеток во множестве сконструированных клеток экспрессируют введенный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент и/или проявляют антигенное связывание с белком HPV, необязательно HPV E6 или HPV E7.

247. Способ по любому из вариантов осуществления 217-245, где по меньшей мере или более чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более клеток во множестве сконструированных клеток экспрессируют введенный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент и/или проявляют антигенное связывание с белком HPV, необязательно HPV E6 или HPV E7.

248. Способ по любому из вариантов осуществления 217-247, где по меньшей мере или более чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более клеток во множестве сконструированных клеток экспрессируют введенный TCR или его антигенсвязывающий фрагмент и/или проявляют антигенное связывание с белком HPV, необязательно HPV E6 или HPV E7.

249. Способ по любому из вариантов осуществления 220-248, где один или более агентов и молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или вектор вводят одновременно или последовательно в любом порядке.

250. Способ по любому из вариантов осуществления 220-251, где молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или вектор вводят после введения одного или более агентов.

251. Способ по варианту осуществления 250, где молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или вектор вводят сразу после или в течение примерно 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 6 минут, 6 минут, 8 минут, 9 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 40 минут, 50 минут, 60 минут, 90 минут, 2 часов, 3 часов или 4 часов после введения агента.

252. Композиция, содержащая сконструированные клетки по любому из вариантов осуществления 139-216.

253. Композиция, содержащая сконструированные клетки, полученные с применением способа по любому из вариантов осуществления 217-251.

254. Композиция по варианту осуществления 252 или 253, отличающаяся тем, что:

по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток в композиции содержат генетическое разрушение эндогенного гена константной области Т-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области Т-клеточного рецептора бета (TRBC); и/или

по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток в композиции не экспрессируют или не экспрессируют на детектируемом уровне генный продукт эндогенного гена TRAC или TRBC.

255. Композиция, содержащая множество сконструированных клеток, причем каждая содержит TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, где:

(1) по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток в композиция содержит генетическое нарушение эндогенного гена константной области T-клеточного рецептора альфа (TRAC) и/или гена константной области T-клеточного рецептора бета (TRBC), и/или где по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток в композиции не экспрессируют или не экспрессируют на детектируемом уровне генный продукт эндогенного гена TRAC или TRBC; и

(2) TCR или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(а) вариабельную область альфа (Vα), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности, и вариабельную область бета (Vβ), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296, или аминокислотную последовательность, которая имеет с ними по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности; и/или

(b) область Vα, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 153, 159 или 301, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295, и область Vβ, содержащую область 3, определяющую комплементарность, (CDR-3), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 156 или 160, или CDR3, содержащуюся в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296.

256. Композиция по варианту осуществления 255, отличающаяся тем, что:

область Vα дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 151 или 157; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 152 или 158; и/или

область Vβ дополнительно содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 154; и/или область 2, определяющую комплементарность, (CDR-2), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 155.

257. Композиция по варианту осуществления 255 или 256, где область Vα и область Vβ содержат:

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 153, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно;

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 157, 158 и 159, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 160, соответственно; или

CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 151, 152 и 301, соответственно, и область Vβ содержит CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно.

258. Композиция по любому из вариантов осуществления 255-257, отличающаяся тем, что:

область Vα содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vα, представленной в любой из SEQ ID NO: 117, 119 или 295; и/или

область Vβ содержит область 1, определяющую комплементарность, (CDR-1), CDR-2 и CDR-3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-1, CDR-2 и CDR-3, содержащиеся в аминокислотной последовательности области Vβ, представленной в любой из SEQ ID NO: 118, 120 или 296.

259. Композиция по любому из вариантов осуществления 255-258:

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 117 и либо 118, либо 296, соответственно;

области Vα и Vβ содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 119 и 120, соответственно; или