Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), которые представляют собой рекомбинантные химерные белки, обладающие способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на выбранные мембранные антигены, более конкретно, в которых внеклеточный лигандсвязывающий домен представляет собой scFV, полученный из моноклонального антитела к CD123, что обусловливает специфический иммунитет против CD123-позитивных клеток. Установлено, что на опухолевых клетках при лейкозе, прежде всего при остром миелоидном лейкозе (AML), часто имеет место сверхэкспрессия альфа-цепи рецептора интерлейкина-3 (CD123) по сравнению со здоровыми гематопоэтическими стволовыми клетками. Сконструированные иммунные клетки, наделенные CAR, предлагаемые в изобретении, отличаются более высокой эффективностью при лечении лимфом и лейкозов.

Предпосылки создания изобретения

Адаптивная иммунотерапия, в которой применяют перенос аутологичных антигенспецифических Т-клеток, созданных ex vivo, представляет собой перспективную стратегию для лечения вирусных инфекций и рака. Т-клетки, применяемые для адаптивной иммунотерапии, можно создавать либо путем размножения антигенспецифических Т-клеток, либо посредством перенаправления Т-клеток с помощью методов генетической инженерии (Park, Rosenberg и др., 2011). Перенос Т-клеток, специфических в отношении вирусных антигенов, является хорошо зарекомендовавшей себя процедурой, которую применяют для лечения ассоциированных с трансплантацией вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных заболеваний. Продемонстрировано также, что выделение и перенос специфических в отношении опухоли Т-клеток приводит к успеху при лечении меланомы.

В Т-клетках были успешно созданы новые специфичности посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena, Dotti и др., 2010). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из «нацеливающего» фрагмента, ассоциированного с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. В целом, связывающий фрагмент CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), который содержит фрагменты моноклонального антитела, представляющие собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, соединенные гибким линкером. Успешно применяли также связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR получали из цитоплазматической области дзета-цепей CD3 или гамма-цепей Fc- рецептора. Было продемонстрировано, что первое поколение CAR позволяло успешно перенаправлять Т-клеточную цитотоксичность, однако для них не удалось обеспечить пролонгированное размножение и противоопухолевую активность in vivo. Для повышения выживаемости и усиления пролиферации модифицированных с помощью CAR Т-клеток осуществляли добавление сигнальных доменов из костимулирующих молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD134) и 4-1BB (CD137), по отдельности (второе поколение) или в комбинации (третье поколение). CAR позволяли успешно перенаправлять Т-клетки на антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток при различных злокачественных заболеваниях, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti и др., 2010)

Следует отметить, что индукционные терапии острого миелоидного лейкоза (AML) в основном не изменялись в течение практически 50 лет, и AML остается заболеванием с плохим прогнозом. Острый миелоидный лейкоз (AML) представляет собой заболевание, характеризующееся быстрой пролиферацией незрелых миелоидных клеток в костном мозге, что приводит к нарушению гематопоэза. Хотя стандартная индукционная химиотерапия может приводить к полным ремиссиям, у многих пациентов, в конце концов, наступает рецидив и смерть в результате заболевания, что требует разработки новых терапевтических средств для лечения AML.

Современные успехи, достигнутые в отношении иммунофенотипировая клеток AML, позволили установить несколько ассоциированных с AML антигенов клеточной поверхности, которые могут являться мишенями при разработке терапий в будущем. Альфа-цепь рецептора интерлейкина-3 (IL-3Rα; CD123 - регистрационный номер NCBI: NP_001254642) идентифицирована в качестве потенциальной иммунотерапевтической мишени, поскольку для нее характерна сверхэкспрессия на опухолевых клетках AML по сравнению со здоровыми гематопоэтическими стволовыми клетками. Кроме того, завершена фаза I испытаний двух CD123-специфических терапевтических средств, в которых продемонстрированы хорошие профили безопасности обоих лекарственных средств (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 и NCT00397579). К сожалению, указанные имеющие в качестве мишени CD123 лекарственные средства обладали ограниченной эффективностью, что свидетельствует о потребности в альтернативных и более эффективных и специфических нацеленных на CD123 терапевтических средствах с выраженной противолейкозной активностью.

Вероятно, более эффективной альтернативной терапией для лечения лейкоза может являться применение Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR), которые перенаправляют Т-клеточную специфичность на антигены, ассоциированные с поверхностью опухолевых клеток (ТАА) независимым от ГКГС образом. Разработано несколько групп CAR, мишенью которых являются различные антигены, для лечения В-клеточных злокачественных заболеваний. Однако несущие сконструированный CAR Т-клетки, предназначенные для лечения AML, остаются редкими.

В частности, все еще существует необходимость в улучшении конструкции CAR, которые лучше совместимы с пролиферацией Т-клеток, для того, чтобы обеспечивать выраженное клиническое преимущество клеток, экспрессирующих указанные CAR.

Кроме того, существует потребность в усовершенствовании CD123-CAR, которые обладают способностью к пролиферации и избирательному нацеливанию на экспрессирующие CD123 клетки.

Кроме того, применение указанной экспрессирующей CAR иммунной Т-клетки, мишенью которой является CD123, в комбинации с цитотоксическими химиотерапевтическими агентами, которые обычно применяют в качестве противораковых терапий, остается проблематичным.

Ряд цитотоксических агентов, таких как антиметаболиты, алкилирующие агенты, антрациклины, ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, соединения платины и веретенные яды (токсины, блокирующие митотическое веретено), разработаны для уничтожения раковых клеток, прежде всего экспрессирующих CD123 раковых клеток.

Эти химиотерапевтические агенты могут оказаться вредными при разработке сильных противоопухолевых иммунокомпетентных клеток из-за их неспецифической токсичности. Основанные на применении малых молекул терапии, мишенью которых являются пути клеточной пролиферации, тоже могут мешать созданию противоопухолевого иммунитета.

Таким образом, существует также необходимость в разработке Т-клеток, мишенью которых является CD123, которые являлись бы специфическими и совместимыми с применением лекарственных средств, прежде всего противораковых химиотерапии, в том числе влияющих на клеточную пролиферацию.

Таким образом, с целью применения «имеющихся в наличии» аллогенных терапевтических клеток в сочетании с химиотерапией при создании изобретения был разработан способ конструирования аллогенных Т-клеток, менее аллогенных и устойчивых к химиотерапевтическим средствам. Связанная с этой стратегий терапевтическая польза состоит в повышенной эффективности в результате синергетического действия между химиотерапией и иммунотерапией. Кроме того, устойчивость к лекарственным средствам может также являться благоприятной из-за способности к избирательному размножению сконструированной Т-клетки, что позволяет избегать проблем, связанных с неэффективным генным переносом в указанные клетки

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения были разработаны CD123-специфические CAR, обладающие различной структурой и содержащие различные scFV, полученные из различных специфических в отношении CD123 антител. Указанные CD123-специфические CAR взаимозаменяемо обозначают как CD123-специфический CAR или анти-CD123 CAR, или 123 CAR, или «CAR, предлагаемый в изобретении».

В частности, при создании изобретения разработан CD123-специфический CAR, содержащий scFV, полученный из Klon43, с различными архитектурами, и идентифицированы высоко специфические и обладающие очень высокой избирательностью конструкции CAR, которые связываются с экспрессирующими CD123 клетками и избирательно разрушают экспрессирующие CD123 раковые клетки.

После неспецифической активации in vitro (например, с использованием покрытых CD3/CD28 гранул и рекомбинантного IL2), Т-клетки из доноров трансформировали полинуклеотидами, экспрессирующими указанные CAR, используя вирусную трансдукцию. В некоторых случаях Т-клетки подвергали дополнительному конструированию для создания неаллореактивных Т-клеток, более конкретно путем разрушения компонента TCR (αβ-цепи Т-клеточных рецепторов) для предупреждения реакции «трансплантат-против-хозяина».

Т-клетки конструировали также для создания Т-клеток, устойчивых к противораковым лекарственным средствам, для их применения в комбинации с указанными классическими противораковыми лекарственными средствами.

Полученные сконструированные Т-клетки обладали разной степенью реактивностью in vitro в отношении CD123-позитивных клеток, что свидетельствует о том, что CAR, предлагаемые в настоящем изобретении, принимали участие в антигензависимой активации, а также пролиферации Т-клеток, что делает возможным их применение для иммунотерапии.

Полученные сконструированные Т-клетки обладали реактивностью in vivo в отношении CD123-позитивных клеток и значительно снижали количество раковых клеток in vivo.

Сконструированные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, которые созданы для проявления реактивности in vivo в отношении CD123-позитивных клеток, хорошо переносятся при их применении в сочетании с противораковыми лекарственными средствами. В конкретном варианте осуществления сконструированные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, сохраняют эффективность даже после несколько введений, что делает их ценными для иммунотерапии в качестве первой обработки (индукции), в качестве консолидированного лечения, в качестве лечения в комбинации с классической противораковой химиотерапией.

В настоящей заявке подробно описаны полипептидные и полинуклеотидные последовательности, которые кодируют CAR, предлагаемые в настоящем изобретении.

Сконструированные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для таких терапевтических применений, как лечение В-клеточной лимфомы или лейкоза.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическое изображение сконструированной иммунной клетки, предлагаемой в изобретении. Сконструированная иммунная клетка, представленная на этом чертеже, представляет собой Т-клетку, трансдуцированную ретровирусом, кодирующим полипептид CAR. Указанную Т-клетку конструировали также с целью обеспечения улучшенного и более безопасного приживления трансплантата пациенту, что необязательно подпадает под объем настоящего изобретения. Ген X может представлять собой, например, ген, экспрессирующий компонент TCR (TCRaльфa или TCRбета), ген Y может представлять собой ген, с которым связана чувствительность Т-клетки к иммуносупрессорным лекарственным средствам типа средств, мишенью которых является CD52 (таких как Campath (Кэмпас) или HPRT (таких как 6-тиогуанин);

на фиг. 2 - схематическое изображение различной архитектуры CAR (V1-V6), предлагаемого в изобретении (123 CAR);

на фиг. 3 - различные структуры CAR, предлагаемого в изобретении, каждый из которых различается применяемой шарнирной областью;

на фиг. 4 - данные о дегранулирующей активности в процентах (%) дегрануляции 6 различных scFv с одной конкретной архитектурой (v3: шарнир CD8 /трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR⁺-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD123 клетками (RPMI8226) или с клетками, которые не экспрессируют CD123 (K562). Белые прямоугольники соответствуют сигналам, свидетельствующим о дегрануляции, которые обнаружены в Т-клетках, которые культивировали индивидуально, черные прямоугольники соответствуют сигналам, которые обнаружены, когда Т-клетки совместно культивировали с клетками RPMI8226, а серые прямоугольники соответствуют сигналам, свидетельствующим о дегрануляции, которые обнаружены, когда Т-клетки совместно культивировали с клетками K562;

на фиг. 5 - данные о дегранулирующей активности (CD8/CD107a⁺-клетки), выраженные в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI), CAR Т-клеток после совместного культивирования в течение 6 ч с CD123neg-клетками (K562) или клетками, экспрессирующими высокие или низкие уровни CD123 (RPMI8226 и KG1a соответственно);

на фиг. 6 - проценты (%) дегрануляции, обусловленной различными анти-CD123 CAR Т-клетками, при совместном культивировании в течение 6 ч с клетками, экспрессирующими различные уровни CD123 (KG1a или RPMI8226), или с клетками, которые не экспрессируют CD123 (K562);

на фиг. 7 - данные о количестве IFN гамма (IFNγ), высвободившегося различными экспрессирующими анти-CD123 CAR Т-клетками при совместном культивировании в течение 24 ч с клетками, экспрессирующими различные уровни CD123 (KG1a или RPMI8226), или с клетками, которые не экспрессируют CD123 (K562);

на фиг. 8 - данные об удельной цитолитической активности различных экспрессирующих анти-CD123 CAR⁺-Т-клеток. Анализы осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК CAR. Т-клетки совместно культивировали с клетками K562 + KG1a или K562 + RPMI8226. Определяли жизнеспособность клеток для каждой клеточной линии в конце периода совместного культивирования и рассчитывали процент удельного клеточного лизиса;

на фиг. 9 - общая конструкция, применяемая для трансдукции Т-клеток и проценты (%) Т-клеток, экспрессирующих CAR или BFP (синий флуоресцентный белок), в день 8 или 10 после трансдукции, в образцах из двух различных доноров при анализе с помощью проточной цитометрии. CAR соответствовали конструкции CAR Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR;

на фиг. 10 - данные о дегранулирующей активности Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR, в отношении различных клеточных линий (клетки Дауди и K562, которые не экспрессируют CD123, KG1a, MOLM13 и RPMI8226, которые экспрессируют повышенные уровни CD123 (KG1a<MOLM13<RPMI8226). На верхней панели представлены % CD107a⁺-клеток (в популяции CD8⁺-клеток) для трех независимых доноров, а на нижней панели представлены данные об интенсивности окрашивания CD107a для репрезентативного донора. NTD обозначает нетрансдуцированные клетки;

на фиг. 11 - данные о количестве IFN гамма, высвободившегося после совместного культивирования в течение 24 ч Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR, с различными клеточными линиями;

на фиг. 12 - данные об удельной цитолитической активности Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR. Рассчитывали процент удельного клеточного лизиса. Результаты представляют собой данные, полученные по меньшей мере для двух независимых доноров;

на фиг. 13 - данные о дегранулирующей активности (в процентах (%) дегрануляции) Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR;

на фиг. 14 - данные о дегранулирующей активности (в MFI) Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR и 32716-V3 CAR;

на фиг. 15 - данные об активности in vivo Т-клеток, экспрессирующих Klon43-v3 CAR, в организме мышей с иммунодефицитом NOG. Мышам инъецировали клетки MOLM13, содержащие люциферазу, либо за 2, либо за 7 дней до инъекции нетрансдуцированных человеческих Т-клеток и взятые в различных дозах анти-CD123 CAR⁺-Т-клетки. Результаты выражены в виде биолюминесцентного сигнала, обнаруженного в различные моменты времени после инъекции Т-клеток (среднее значение для 4 мышей в каждой группе за исключением группы G12, в которой 1 из 4 мышей умерла между днями 21 и 28).

-

Подробное описание изобретения

Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, использованные в настоящем описании, имеют значение, которое является общепринятым для специалистов в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.

Для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно применять все методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые указаны в настоящем описании, при этом в настоящей заявке описаны приемлемые методы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В случае разночтения следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только для иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения, если не указано иное.

При осуществлении на практике настоящего изобретения следует применять, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалисту в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, изд-во Wiley and son Inc, Library of Congress, USA, 2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд. (Sambrook и др., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001); Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Mullis и др., US №4683195; Nucleic Acid Hybridization (под ред. В.D. Harries и S.J. Higgins, 1984); Transcription And Translation (под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, изд-во Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (изд-во IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; серия: Methods In ENZYMOLOGY (под. ред. J. Abelson и M. Simon, изд-во Academic Press, Inc., New York), прежде всего том 154 и том 155 (под ред. Wu и др.) и том 185, «Gene Expression Technology)) (под ред. D. Goeddel); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (под ред. Mayer и Walker, изд-во Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, тома I-IV (под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell, 1986); и Manipulating the Mouse Embryo, (изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор («123 CAR» или «CAR»), который имеет одну из полипептидных структур, выбранных из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD123, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% любой из SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 48.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет одну из полипептидных структур, выбранных из V1, V3 и V5, которые проиллюстрированы на фиг. 2, указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD123, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен СD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% любой из SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет одну из полипептидных структур, выбранных из V1, V3 и V5, которые проиллюстрированы на фиг. 2, указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD123, шарнир, трансмембранный домен, цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен СD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% любой из SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 42.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 44.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 46.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 75.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 76.

В настоящем изобретении предложен специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где последовательность указанного 123 CAR идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 77.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), который имеет полипептидную структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2 и описана выше, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD123, содержащие следующие последовательности CDR:

GFTFTDYY (SEQ ID NO: 67),

RSKADGYTT (SEQ ID NO: 68),

ARDAAYYSYYSPEGAMDY (SEQ ID NO: 69) и

QNVDSA (SEQ ID NO: 70),

SAS (SEQ ID NO: 71),

QQYYSTPWT (SEQ ID NO: 72),

- и где указная структура содержит:

шарнир, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), описанный выше, в котором внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL, является гуманизированным.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), описанный выше, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен является гуманизированным.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), описанный выше, где указанный CD123-специфический химерный антигенный рецептор является гуманизированным.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (123 CAR), описанный выше, в котором внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD123, содержит следующую последовательность

и

, в которой X обозначает аминокислоту,

аминокислота может представлять собой любую из аминокислот, например, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин, валин.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), описанный выше, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD123 соответственно, содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

(вариант VH1: SEQ ID NO: 60):

(вариант VH2: SEQ ID NO: 61):

(вариант VH3: SEQ ID NO: 62):

(вариант VH4: SEQ ID NO: 63):

(вариант VH5: SEQ ID NO: 64):

(вариант VH6: SEQ ID NO: 65):

(вариант VH7: SEQ ID NO: 66):

(вариант VL1: SEQ ID NO: 54):

(вариант VL2: SEQ ID NO: 55):

(вариант VL3: SEQ ID NO: 56):

(вариант VL4: SEQ ID NO: 57):

(вариант VL5: SEQ ID NO: 58):

и

(вариант VL6: SEQ ID NO: 59):

или их комбинацию.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), описанный выше, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD123 соответственно, содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

и

или их комбинацию.

Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD123-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), описанный выше, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD123 соответственно, содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

и по меньшей мере одну из следующих последовательностей:

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором указанная структура V3 содержит шарнир СD8альфа и трансмембранный домен СD8альфа.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором указанная структура V3 содержит шарнир СD8альфа, цитоплазматический домен 4-1ВВ и трансмембранный домен СD8альфа.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором указанная структура V3 содержит шарнир СD8альфа и трансмембранный домен 4-1ВВ.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором указанные VH и VL идентичны по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором указанные VH и VL идентичны по меньшей мере на 80% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 19 и/или SEQ ID NO: 20.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, дополнительно содержащий другой внеклеточный лигандсвязывающий домен, который не является специфическим для CD123.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, дополнительно содержащий сигнальный пептид, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В настоящем изобретении предложен CD123-специфический CAR, описанный выше, в котором линкер, имеющий SEQ ID NO: 10, встроен между VH и VL.

В настоящем изобретении предложен полинуклеотид, который кодирует CD123-специфический химерный антигенный рецептор, соответствующий любому из описанных выше CD123-специфических CAR, указанный полинуклеотид дополнительно содержит сигнальный пептид, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В настоящем изобретении предложен экспрессионный вектор, содержащий описанный выше полинуклеотид.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на поверхности клеточной мембраны CD123-специфический химерный антигенный рецептор, описанный выше, предпочтительно сконструированная иммунная клетка может экспрессировать на поверхности клеточной мембраны CD123-специфический химерный антигенный рецептор, описанный выше.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, полученная из Т-лимфоцитов, необязательно устойчивая к противораковому лекарственному средству и несущая делецию в гене, который кодирует TCR альфа или TCR бета.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, в которой экспрессия TCR подавлена.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, где экспрессия по меньшей мере одного белка ГКГС, предпочтительно β2m или HLA, подавлена в указанной сконструированной иммунной клетке. β2m обозначает бета-2-микроглобулин, a HLA обозначает человеческий лейкоцитарный антиген. Белок ГКГС представляет собой белок ГКГС класса I или класса II.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, где сконструированная иммунная клетка подвергнута мутации для придания устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессорному лекарственному средству, химиотерапевтическому лекарственному средству или противораковому лекарственному средству.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, предназначенная для применения в терапии.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где пациент представляет собой человека.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся наличием экспрессирующих CD123 клеток.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, отличающееся избыточным количеством экспрессирующих CD123 клеток.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, связанное с гематологическим раком.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние, связанное с гематологическим раком, представляет собой лейкоз или злокачественные лимфопролиферативные нарушения.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз выбран из группы, состоящей из острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, мелодиспластического синдрома, острого лимфоидного лейкоза, хронического лимфоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз представляет собой острый миелогенный лейкоз (AML).

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный гематологический рак представляет собой злокачественное лимфопролиферативное нарушение.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанное лимфопролиферативное нарушение представляет собой лимфому.

В настоящем изобретении предложена сконструированная иммунная клетка, описанная выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанная лимфома выбрана из группы, состоящей из множественной миеломы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта и фолликулярной лимфомы (мелкоклеточной и крупноклеточной).

В настоящем изобретении предложен способ разрушения клетки гематологического рака, заключающийся в том, что приводят в контакт указанную клетку гематологического рака со сконструированной клеткой по одному из п.п. 13-17 формулы изобретения, в количестве, эффективном для разрушения указанной раковой клетки.

В настоящем изобретении предложен способ создания иммунной клетки, заключающийся в том, что:

(а) получают иммунную клетку,

(б) осуществляют экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CD123-специфического химерного антигенного рецептора по одному из п.п. 1-10 формулы изобретения.

В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, заключающийся в том, что:

(а) получают иммунную клетку,

(б) интродуцируют в указанную клетку по меньшей мере один полинуклеотид, который кодирует указанный CD123-специфический химерный антигенный рецептор,

(в) осуществляют экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.

В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, заключающийся в том, что:

(а) получают иммунную клетку,

(б) интродуцируют в указанную клетку по меньшей мере один полинуклеотид, который кодирует указанный CD123-специфический химерный антигенный рецептор,

(в) интродуцируют по меньшей мере один другой химерный антигенный рецептор, который не является специфическим для CD123.

В настоящем изобретении предложен также способ лечения индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что:

(а) получают иммунную клетку, экспрессирующую на поверхности CD123- специфический химерный антигенный рецептор по одному из п.п. 1-10 формулы изобретения,

(б) вводят указанные иммунные клетки указанному пациенту.

В настоящем изобретении предложен способ лечения указанного выше индивидуума, нуждающегося в этом, заключающийся в том, что указанную иммунную клетку получают из донора.

В настоящем изобретении предложен способ лечения указанного выше индивидуума, нуждающегося в этом, заключающийся в том, что указанную иммунную клетку получают из организма самого пациента.

CD123-специфические химерные антигенные рецепторы

Настоящее изобретение относится к новым конструкциям анти-CD123 химерного антигенного рецептора (CAR), которые содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен трансдукции сигнала.

Понятие «внеклеточный лигандсвязывающий домен» в контексте настоящего описания обозначает олиго- или полипептид, обладающий способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен, позволяющий распознавать лиганд, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой (V_L) и тяжелой (V_H) цепи специфического в отношении антигена-мишени моноклонального антитела к CD123, соединенные гибким линкером. Указанные V_L и V_H предпочтительно выбирают из антител, обозначенных в научной литературе как 7G3, Old4, 26292, 32716, Klon43 и 12F1, которые описаны в таблице 1-8, более предпочтительно Old4, Klon43 и 12F1 и еще более предпочтительно Klon43. Они предпочтительно сцеплены друг с другом гибким линкером, который содержит последовательность SEQ ID NO: 10. Другими словами, указанные CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 22 (см. таблицу 2).

Более предпочтительно указанные CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 14, 19, 20, 21, 22, и еще более предпочтительно указанные CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотным последовательностям, имеющим SEQ ID NO: 19 и/или 20.

Еще более предпочтительно указанные CAR содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 22, и еще более предпочтительно указанные CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотным последовательностям, имеющим SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 20.

В контексте настоящего описания понятие «рекомбинантное антитело» означает антитело или фрагмент антитела, созданное/созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, такое, например, как антитело или фрагмент антитела, экспрессируемое/экспрессируемый бактериофагом, системой экспрессии дрожжей или системой экспрессии клеток млекопитающих. Подразумевается также, что понятие относится к антителу или фрагменту антитела, созданному с помощью синтеза молекулы ДНК, которая кодирует антитело или фрагмент антитела, и эта молекула ДНК экспрессирует белок антитела или фрагмента антитела или аминокислотную последовательность, специфическую для антитела или фрагмента антитела, при этом ДНК или аминокислотную последовательность получали с использованием технологии получения рекомбинантной или синтетической ДНК, которая доступна и хорошо известна в данной области.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «консервативные модификации последовательности» или «гуманизация» относится к модификациям аминокислот, которые существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания CAR и/или которые не оказывают существенного влияния на активность CAR, содержащего модифицированную аминокислотную последовательность, и снижают или аннулируют ответ в виде человеческого антимышиного антитела (HAMA). Указанные консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции в указанном фрагменте антитела в указанном CAR и/или в любых других частях указанной молекулы CAR. Модификации можно интродуцировать в антитело, во фрагмент антитела или в любую из других частей молекулы CAR, предлагаемой в изобретении, с помощью стандартных технологий, известных в данной области, таких как сайтнаправленный мутагенез, опосредуемый ПЦР мутагенез, или путем применения оптимизированных последовательностей зародышевых линий.

Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фениланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR, предлагаемом в изобретении, можно заменять на другие аминокислотные остатки из того же семейства боковых цепей и измененный CAR можно тестировать в отношении способности связывать CD123, используя функциональные анализы, представленные в настоящем описании.

Домен трансдукции сигнала или внутриклеточный сигнальный домен CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, ответствен за внутриклеточную передачу сигнала после связывания внеклеточного лигандсвязывающего домена с мишенью, приводя к активации иммунной клетки и иммунному ответу. Другими словами, домен трансдукции сигнала ответствен за активацию по меньшей мере одной из обычных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется CAR. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, понятие «домен трансдукции сигнала» относится к участку белка, который трансдуцирует сигнал эффекторной сигнальной функции и побуждает клетку осуществлять специализированную функцию.

Предпочтительными примерами домена трансдукции сигнала, которые можно применять в CAR, могут являться цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора и корецепторов, совместное действие которых состоит в инициации трансдукции сигнала после контакта с рецептором антигена, а также любое производное или любой вариант указанных последовательностей и любой синтетической последовательности, которая имеет такую же функциональную способность. Домен трансдукции сигнала содержит два различных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей, те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, известные как мотивы активации иммунных рецепторов на основе тирозина, ITAM. ITAM представляют собой хорошо известные сигнальные мотивы, присутствующие во внутрицитоплазматическом «хвосте» различных рецепторов, которые служат в качестве сайтов связывания для класса syk/zap70 тирозинкиназ. Примерами ITAM, применяемых согласно изобретению, могут служить (но, не ограничиваясь только ими) ITAM, происходящие из ТСRдзета, FcR-гамма, FcR-бета, FcRэпсилон, СD3гамма, CD3дельта, СD3эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR может содержать происходящий из СD3дзета сигнальный домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%-99% или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.

В конкретном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит костимуляторную сигнальную молекулу. Костимуляторная молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа. Понятие «костимуляторный лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на Т-клетке, создавая тем самым сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, создаваемому, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая (но, не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторный лиганд может включать (но, не ограничиваясь только ими) CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, М1СВ, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3. Под понятие «костимуляторный лиганд» подпадает, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на Т-клетке, такой как (но, не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-Н3, лиганд, специфически связывающийся с CD83. Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру, присутствующему на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но, не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но, не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора. Примерами костимуляторных молекул являются CD27, CD28, CD8, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, специфически связывающийся с CD83, и т.п.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит часть костимуляторной сигнальной молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 4-1ВВ (GenBank: ААА53133.) и CD28 (NP_006130.1). В частности, домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8.

CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, экспрессируется на поверхности клеточной мембраны. Таким образом, CAR содержит также трансмембранный домен. Отличительными особенностями соответствующих трансмембранных доменов являются способность экспрессироваться на поверхности клетки, согласно настоящему изобретению предпочтительно на поверхности иммунной клетки, прежде всего лимфоцитов или естественных клеток-киллеров (NK), и взаимодействовать друг с другом, направляя клеточный ответ иммунной клетки на заранее определенную клетку-мишень. Трансмембранный домен можно получать как из встречающегося в естественных условиях, так и синтетического источника. Трансмембранный домен можно получать из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Примерами трансмембранных полипептидов могут служить (но, не ограничиваясь только ими) субъединица Т-клеточного рецептора, такая как α-, β-, γ- или δ-субъединица, полипептид, образующий комплекс с CD3, р55 (α-цепь), р75 (β-цепь) или γ-цепь рецептора IL2, цепь субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или CD-белки. Альтернативно этому, трансмембранный домен может быть синтетическим, и он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен получают из альфа-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). Трансмембранный домен может содержать также шарнирную область между указанным внеклеточным лигандсвязывающим доменом и указанным трансмембранным доменом. В контексте настоящего описания понятие «шарнирная область», как правило, обозначает любой олиго- или полипептид, функция которого заключается в сцеплении трансмембранного домена с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, шарнирную область используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лигандсвязывающего домена. Шарнирная область может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот, и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Шарнирную область можно получать из полных встречающихся в естественных условиях молекул, или их частей, таких как полная внеклеточная область CD8, CD4 или CD28, или ее часть, или полная константная область антитела или ее часть. Альтернативно этому, шарнирная область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в естественных условиях шарнирной последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная шарнирная область представляет собой часть альфа-цепи человеческого CD8, FcγRIIIα-рецептора или IgG1 соответственно, которые обозначены в настоящем описании как SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или шарнирные полипептиды, последовательности которых идентичны предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% последовательностям указанных полипептидов.

CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, дополнительно содержит трансмембранный домен (ТМ), более конкретно выбранный из CD8α и 4-1ВВ, который идентичен полипептидам, имеющим SEQ ID NO: 6 или 7.

CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, дополнительно содержит трансмембранный домен (ТМ) из CD8α и 4-1ВВ, и еще более предпочтительно идентичный полипептидам, имеющим SEQ ID NO: 6 или 7.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, дополнительно содержит ТМ-домен из CD8α, имеющий SEQ ID NO: 6, или идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности SEQ ID NO: 6.

В раковых клетках часто имеет место понижающая регуляция или мутация антигенов-мишеней, что приводит к появлению так называемых вариантов «потерянных антигенов» (антигенов, ускользающих от иммунологического надзора). Таким образом, для того, чтобы противостоять ускользанию опухоли от иммунологического надзора и придавать иммунной клетке большую специфичность в отношении мишени, CD123-специфический CAR, предлагаемый в изобретении, может содержать другие внеклеточные лигандсвязывающие домены, предназначенные для одновременного связывания с другими элементами на мишени и усиления тем самым активации и функции иммунной клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать тандемно на одном и том же трансмембранном полипептиде и их необязательно можно отделять друг от друга с помощью линкера. В другом варианте осуществления изобретения указанные другие внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать на различных трансмембранных полипептидах, из которых состоит CAR. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к популяции CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, настоящее изобретение относится к способу создания иммунных клеток, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и экспрессируют на поверхности указанной клетки популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания иммунной клетки, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и интродуцируют в указанную клетку полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, из которых состоит популяция CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Под популяцией CAR подразумевают по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или большее количество CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Согласно настоящему изобретению различные внеклеточные лигандсвязывающие домены, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно могут связываться одновременно с различными элементами на мишени, усиливая тем самым активацию и функцию иммунной клетки. Настоящее изобретение относится также к выделенной иммунной клетке, которая содержит популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 19, и/или полипептид, имеющий SEQ ID NO: 20, более предпочтительно CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%, предпочтительно идентичный на 80%-99% SEQ ID NO: 19, и/или полипептид, идентичный на 80%-99% SEQ ID NO: 20. Еще более предпочтительно CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, идентичный на 85-99% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 19 и/или SEQ ID NO: 20.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий следующие последовательности:

и

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере полипептид, имеющий следующую последовательность:

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий следующую последовательность:

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере один полипептид, выбранный из следующих последовательностей:

и

и по меньшей мере одну последовательность, выбранную из следующих последовательностей

и

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит один полипептид, выбранный из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит один полипептид, выбранный из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, и пептид выбранный из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66.

В одном из вариантов осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, выбранный из перечня, состоящего из SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 46, предпочтительно CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 42, CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 44, и CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 46.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, идентичный на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 42.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 42, еще более предпочтительно CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 42, в частности CAR идентичен на 85%-99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 42.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, идентичный на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 44.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 44, еще более предпочтительно CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 44, в частности CAR идентичен на 85%-99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 44.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, идентичный на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 46.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 46, еще более предпочтительно CAR идентичен на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 46, в частности CAR идентичен на 85%-99% SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 46.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, состоит из полипептида, имеющего SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 42, еще более предпочтительно CAR состоит из полипептида, идентичного на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 42.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, состоит из полипептида, имеющего SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 44, еще более предпочтительно CAR состоит из полипептида, идентичного на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 44.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, состоит из полипептида, имеющего SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 46, еще более предпочтительно CAR состоит из полипептида, идентичного на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 46.

Согласно изобретению иммунные клетки, экспрессирующие анти-CD123, предлагаемый в изобретении, запускают противораковый иммунный ответ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунные клетки, экспрессирующие CAR, предлагаемый в изобретении, наделенные анти-CD123 CAR, предлагаемым в изобретении, запускают иммунный ответ, который не включает ответ в виде человеческого антимышиного антитела (HAMA).

Согласно изобретению сконструированную иммунную клетку можно вводить в эффективном количестве пациенту, который нуждается в этом, по меньшей мере один, два или большее количество раз, индивидуально или в сочетании с другой обработкой.

В настоящем изобретении описан CD123-специфический химерный антигенный химерный рецептор (CAR), который имеет одну из полипептидных структур, выбранных из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD123, шарнир, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.

Полинуклеотиды, векторы:

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, векторам, кодирующим описанный выше CAR, предлагаемый в изобретении.

Полинуклеотид может содержаться в кассете экспрессии или экспрессионном векторе (например, в плазмиде, предназначенной для интродукции в бактериальную клетку-хозяина, или вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, предназначенный для трансфекции клетки насекомого- хозяина, или плазмидном или вирусном векторе, таком как лентивирус, предназначенном для трансфекции клетки млекопитающего-хозяина).

В конкретном варианте осуществления изобретения можно включать различные нуклеотидные последовательности в один полинуклеотид или вектор, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомальную skip-последовательность, такую как последовательность, кодирующую пептид 2А. Пептиды 2А, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусов группы пикорнавирусов, приводят к рибосомальному «перескоку» (skip) от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. Donnelly и Elliott, 2001; Atkins, Wills и др., 2007; Doronina, Wu и др., 2008). Под «кодоном» понимают три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, можно синтезировать два полипептида из одной непрерывной рамки считывания в мРНК, если полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, присутствующей в рамке считывания. Такие рибосомальные skip-механизмы хорошо известны в данной области и известно их применение в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.

Для направления трансмембранного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина, в последовательность полинуклеотида или в последовательность вектора помещают секреторную сигнальную последовательность (известную также как лидерная последовательность, пре- про-последовательность или пре-последовательность). Секреторную сигнальную последовательность функционально связывают с трансмембранной нуклеотидной последовательностью, т.е. две последовательности соединяют в правильной рамке считывания и размещают так, чтобы направлять новый синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности, как правило, размещают в 5'-направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности можно размещать и в другом месте представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, Welch и др., US №5037743; Holland и др., US №5143830). В предпочтительном варианте осуществления изобретения сигнальный пептид содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 или идентичные по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% SEQ ID NO: 1 и/или 2.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что с учетом вырожденности генетического кода могут иметь место значительные вариации последовательности указанных полинуклеотидных молекул. Предпочтительно нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют оптимизированные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно для экспрессии в человеческих клетках. Оптимизация кодонов относится к замене в представляющей интерес последовательности кодонов, встречающихся относительно редко в генах с высоким уровнем экспрессии, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в генах с высоким уровнем экспрессии в указанных видах, такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и подлежащие замене кодоны. Клетки

Клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой клетку, происходящую из гематопоэтической клетки, функционально участвующую в инициации и/или реализации врожденного или адаптивного иммунного ответа. Клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой Т-клетку, полученную из донора. Указанную Т-клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно получать из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой зрелые стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, более предпочтительно нечеловеческие стволовые клетки, стволовые клетки из пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, тотипотентные стволовые клетки или гематопоэтические стволовые клетки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки представляют собой человеческие клетки, прежде всего человеческие стволовые клетки.

Репрезентативными человеческими клетками являются CD34⁺-клетки. Указанная выделенная клетка может представлять собой также дендритную клетку, дендритную киллерную клетку, тучную клетку, NK-клетку, В-клетку или Т-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка может иметь происхождение из группы, состоящей из CD4⁺-Т-лимфоцитов и CD8⁺-Т-лимфоцитов. Перед осуществлением размножения и генетической модификации клеток, предлагаемых в изобретении, из организма индивидуума можно получать источник клеток с помощью различных методов, не ограничивающих объем изобретения. Клетки можно получать из многочисленных источников, включая (но, не ограничиваясь только ими) мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из инфицированной области, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять любое количество Т-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области. В другом варианте осуществления изобретения указанную клетку предпочтительно получают из организма здорового донора. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка представляет собой часть смешанной популяции клеток, обладающих различными фенотипическими характеристиками.

Предпочтительно для выделения и получения стволовых клеток не требуется разрушение по меньшей мере одного человеческого эмбриона. Иммунные клетки могут иметь происхождение из организма пациента, если предполагается осуществление аутологичных обработок, или из организма доноров, если требуется получение аллогенных клеток, которые можно применять для аллогенных обработок.

Более предпочтительно иммунная клетка, предлагаемая в изобретении, экспрессирует анти-CD123 CAR, который соответствует SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46, еще более предпочтительно иммунная клетка, предлагаемая в изобретении, экспрессирует гуманизированный анти-CD123 CAR, который соответствует гуманизированной SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46.

Методы конструирования иммунных клеток, наделенных CAR:

В настоящем изобретении предложен способ получения иммунных клеток для иммунотерапии, заключающийся в том, что интродуцируют ex vivo в указанные иммунные клетки полинуклеотиды или векторы, кодирующие CD123 CAR, ранее описанные в WO 2014/130635, WO 2013/176916, WO 2013/176915, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные полинуклеотиды включают в лентивирусные векторы, принимая во внимание, что они стабильно экспрессируются в клетках.

В других вариантах осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает стадию, на которой генетически модифицируют указанную клетку, делая ее более пригодной для аллогенной трансплантации.

Модификация Т-клетки путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR)

Согласно первому объекту изобретения иммунную клетку можно делать менее аллогенной, например, путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), согласно методу, описанному в WO 2013/176915, что можно объединять с инактивацией гена, кодирующего или регулирующего экспрессию белка HLA или β2m. Таким образом, существенно снижают риск возникновения реакции «трансплантат-против-хозяина» и отторжение трансплантата.

Таким образом, когда иммунные клетки представляют собой Т-клетки, то в настоящем изобретении предложены также способы создания менее аллогенных Т-клеток.

Методы получения менее аллогенных Т-клеток могут включать стадию инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR), в частности, генов TCRaльфa, TCRбета.

Описанные в WO 2013/176915 методы получения экспрессирующей CAR иммунной клетки, пригодной для аллогенной трансплантации, путем инактивации одного или нескольких компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), все включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к экспрессирующей анти-CD123 CAR иммунной клетке, в которой инактивируют по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом, в изобретении предложена экспрессирующая анти-CD123 CAR Т-клетка, в которой CAR имеет происхождение из Klon43, в частности идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 44, и в которой инактивируют по меньшей мере один ген, экспрессирующий один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR).

Согласно изобретению экспрессирующие анти-CD123 CAR иммунные клетки с инактивированным одним или несколькими компонентами Т-клеточного рецептора (TCR) предназначены для применения в качестве лекарственного средства.

Под инактивированным геном TCR подразумевается, что представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В конкретных вариантах осуществления изобретения способ генетической модификации основан на экспрессии в предназначенной для конструирования клетке редко расщепляющей эндонуклеазы, которая катализирует расщепление в требуемом гене, инактивируя тем самым указанный требуемый ген. Разрывы нуклеотидной цепи, вызываемые редко расщепляемой эндонуклеазой, как правило, репарируются с помощью различных механизмов гомологичной рекомбинации или соединения негомологичных концов (NHEJ). Однако NHEJ представляет собой несовершенный процесс репарации, который часто приводит к изменениям последовательности ДНК в сайте расщепления. Механизмы включают повторное соединение остатков двух концов ДНК посредством прямого повторного лигирования (Critchlow и Jackson, 1998) или посредством так называемого опосредуемого микрогомологией соединения концов (Betts, Brenchley и др., 2003; Ma, Kim и др., 2003). Репарация посредством соединения негомологичных концов (NHEJ) часто приводит к небольшим инсерциям или делециям и ее можно применять для создания специфических «выключений» генов. Указанная модификация может представлять собой замену, делецию или добавление по меньшей мере одного нуклеотида. Клетки, в которых произошел случай индуцированного расщеплением мутагенеза, т.е. случай мутагенеза, являющегося результатом NHEJ, можно идентифицировать и/или отбирать с помощью метода, хорошо известного в данной области. В конкретном варианте осуществления изобретения стадия инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR) в клетках каждого индивидуального образца, включает интродукцию в клетку редко расщепляющей эндонуклеазы, которая обладает способностью разрушать по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR). В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки каждого индивидуального образца трансформируют нуклеиновой кислотой, кодирующей редко расщепляющую эндонуклеазу, которая обладает способностью разрушать по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR), и указанную редко расщепляющую эндонуклеазу экспрессируют в указанных клетках.

Указанная редко расщепляющая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, нуклеазу с цинковыми пальцами, нуклеазу CRISPR/Cas9, нуклеазу Argonaute, TALE-нуклеазу или нуклеазу MBBBD (связывающие домены, обладающие сходными модульными свойствами связывания нуклеиновых кислот по типу «основание-с-основанием») (Modular Base-per-Base Binding domain (MBBBD)). В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная редко расщепляющая нуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу. Под TALE-нуклеазой понимают слитый белок, который состоит из связывающего ДНК домена, происходящего, из подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou и Bogdanove, 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Cermak, Doyle и др., 2011; Geissler, Scholze и др., 2011; Huang, Xiao и др., 2011; Li, Huang и др., 2011; Mahfouz, Li и др., 2011; Miller, Tan и др., 2011; Morbitzer, Romer и др., 2011; Mussolino, Morbitzer и др., 2011; Sander, Cade и др., 2011; Tesson, Usal и др., 2011; Weber, Gruetzner и др., 2011; Zhang, Cong и др., 2011; Deng, Yan и др., 2012; Li, Piatek и др., 2012; Mahfouz, Li и др., 2012; Мак, Bradley и др., 2012). При создании настоящего изобретения были получены новые TALE-нуклеазы для точного нацеливания на соответствующие гены, пригодные для стратегий адаптивной иммунотерапии.

Предпочтительные TALE-нуклеазы, которые распознают и расщепляют последовательность-мишень, описаны в РСТ/ЕР2014/075317. В частности, можно также интродуцировать дополнительный каталитический домен в клетку с указанной редко расщепляющей эндонуклеазой для усиления мутагенеза с целью повышения способности к инактивации генов-мишеней. Более конкретно, указанный дополнительный каталитический домен представляет собой фермент, процессирующий конец ДНК. Примерами ферментов, процессирующих конец ДНК, являются (но, не ограничиваясь только ими) 5-3'-экзонуклеазы, 3-5'-экзонуклеазы, щелочные 5-3'-экзонуклеазы, 5'-флэп-эндонуклеазы, геликазы, фосфатаза, гидролазы и независимые от матриц ДНК-полимеразы. Примером указанного каталитического домена является (но, не ограничиваясь только ими) белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранного из группы, состоящей из hExoI (EXO1_HUMAN), Exol дрожжей (EXO1_YEAST), Exol E.coli, человеческой TREX2 (3'-репарационная экзонуклеаза), мышиной TREX1, человеческой TREX1, бычьей TREX1, крысиной TREX1, TdT (концевая дезоксинуклеотидил-трансфераза), человеческой ДНК2, ДНК2 дрожжей (DNA2_YEAST). В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный дополнительный каталитический домен обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный дополнительный каталитический домен представляет собой каталитический домен TREX, более предпочтительно каталитический домен TREX2 (WO 2012/058458). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный каталитический домен описывается одноцепочечным полипептидом TREX2. Указанный дополнительный каталитический домен можно сливать с содержащим нуклеазу слитым белком или химерным белком, предлагаемым в изобретении, необязательно с помощью пептидного линкера.

Известно, что эндонуклеолитические разрывы стимулируют скорость гомологичной рекомбинации. Таким образом, в другом варианте осуществления изобретения стадия генетической модификации способа дополнительно включает стадию интродукции в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере последовательность, гомологичную части нуклеотидной последовательности-мишени, в результате чего происходит гомологичная рекомбинация между последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и экзогенной нуклеиновой кислотой. В конкретных вариантах осуществления изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит первый и второй участки, которые гомологичны 5'- и 3'-областям последовательности нуклеиновой кислоты-мишени соответственно. В этих вариантах осуществления изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит третий участок, расположенный между первым и вторым участками, который не обладает никакой гомологией с 5'- и 3'-областями последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. После расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени стимулируется случай гомологичной рекомбинации между последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и экзогенной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно в указанном донорском матриксе применяют гомологичные последовательности, состоящие по меньшей мере из 50, предпочтительно более чем из 100 и более предпочтительно более чем из 200 пар оснований. В более конкретном варианте осуществления изобретения гомологичная последовательность может состоять из 200-6000, более предпочтительно 1000-2000 пар оснований. Фактически разделенные гомологи нуклеиновых кислот локализованы в областях, фланкирующих в направлении протии хода транскрипции и по ходу транскрипции сайт разрыва и подлежащую интродукции последовательность нуклеиновой кислоты следует располагать между двумя плечами. Иммунные «контрольные точки» (чекпойнты) В настоящем изобретении предложены аллогенные Т-клетки, экспрессирующие анти-CD123 CAR, в частности анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 44, в которых по меньшей мере один ген, который экспрессирует один или несколько компонентов Т-клеточного рецептора (TCR), инактивируют и/или один ген, выбранный из генов CTLA4, РРР2СА, РРР2СВ, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, С ASP 10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, инактивируют, что описано в WO 2014/184741.

Устойчивые к лекарственным средствам Т-клетки

Согласно другому объекту изобретения экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку, предлагаемую в изобретении, можно подвергать дополнительной генетической инженерии для повышения ее устойчивости к иммуносупрессорным лекарственным средствам или химиотерапевтическим обработкам, которые применяют в качества стандартной медицинской помощи в случае CD123-позитивных злокачественных клеток.

Для уничтожения раковых клеток разработан ряд цитотоксических агентов, таких как антиметаболиты, алкилирующие агенты, антрациклины, ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, соединения платины и веретенные яды. Однако применение этих агентов в сочетании с новыми терапиями, такими как иммунотерапии, является проблематичным. Например, химиотерапевтические агенты могут оказаться вредными при разработке сильных противоопухолевых иммунокомпетентных клеток из-за неспецифических профилей токсичности этих агентов. Основанные на применении малых молекул терапии, мишенью которых являются пути клеточной пролиферации, могут также мешать созданию противоопухолевого иммунитета. Если химиотерапевтические режимы, которые обладают кратковременной эффективностью, удается объединять с новыми терапиями на основе иммунокомпетентных клеток, то можно достигать значительного усиления антинеопластической терапии (см. обзор Dasgupta, McCarty м др., 2011).

Для усиления противораковой терапии и избирательного приживления аллогенных Т-клеток указанным аллогенным Т-клеткам придают устойчивость к лекарственным средствам для их защиты от токсических побочных действий химиотерапевтического агента. Устойчивость Т-клеток к лекарственным средствам также приводит к увеличению их количества in vivo или ex vivo, поскольку Т-клетки, которые экспрессируют ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, должны выживать и размножаться в отличие от чувствительных к лекарственному средству клеток.

Методы создания Т-клеток, устойчивых к химиотерапевтическим агентам, описаны в РСТ/ЕР2014/075317, документ полностью включен в настоящем описание в качестве ссылки.

В частности, настоящее изобретение относится к способу создания аллогенных клеток, пригодных для иммунотерапии, в которых по меньшей мере один ген, кодирующий компонент Т-клеточного рецептора (TCR), инактивируют, и один ген модифицируют с целью придания устойчивости к лекарственному средству, заключающемуся в том, что:

- получают экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку; в частности, Т-клетку, которая экспрессирует анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, предпочтительно гуманизированный 123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46;

- модифицируют указанную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR);

- модифицируют указанную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку для придания устойчивости к лекарственному средству указанной экспрессирующей анти-CD123 CAR Т-клетке;

- размножают указанную сконструированную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку в присутствии указанного лекарственного средства.

Альтернативно этому, настоящее изобретение относится к способу, заключающемуся в том, что:

- получают экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку; в частности, Т-клетку, которая экспрессирует анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, предпочтительно гуманизированный 123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46;

- модифицируют указанную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку для придания устойчивости к лекарственному средству указанной экспрессирующей анти-CD123 CAR Т-клетке;

- модифицируют указанную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент T-клеточного рецептора (TCR);

- размножают указанную сконструированную экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку в присутствии указанного лекарственного средства.

В частности, настоящее изобретение относится также к способу создания аллогенных клеток, пригодных для иммунотерапии, в которых по меньшей мере один ген, кодирующий компонент T-клеточного рецептора (TCR), инактивируют, и один ген модифицируют с целью придания устойчивости к лекарственному средству, заключающемуся в том, что:

- получают экспрессирующую анти-CD123 CAR Т-клетку; в частности, Т-клетку, которая экспрессирует анти-CD123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, предпочтительно гуманизированный 123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, более предпочтительно гуманизированный 123 CAR, имеющий SEQ ID NO: 75;