РЕЦЕПТОР ДЛЯ VISTA Российский патент 2024 года по МПК G01N33/574 A61K39/00 C07K16/28 A61K38/17 A61P35/00 

ВВЕДЕНИЕ

Иммунотерапия в корне изменила ситуацию в области терапии рака. Развитие терапии на основе иммунных контрольных точек прогрессирует с головокружительной скоростью. Тем не менее, только часть пациентов восприимчива к методам иммунотерапевтического лечения. Особой проблемой в иммунотерапии рака оказалась идентификация связанных с этим механизмом биомаркеров, которые можно было бы использовать для идентификации кандидатов для такого лечения и принятия решений по лечению заболевания (Topalian et al., N. Engl. J. Med., 366(26): 2443-54 (2012)). Таким образом, отбор пациентов является важным вопросом, поскольку его решение позволит избежать токсичности и затрат, связанных с лечением, для пациентов, которым вряд ли удастся помочь.

Чтобы гарантировать отсутствие постоянной активации иммунного воспалительного ответа после того, как опухолевые антигены стимулировали ответ, существует или активируется несколько контролей или "контрольных точек". Эти контрольные точки в основном представлены Т-клеточным рецептором, связывающимся с лигандами на клетках в окружающей опухоль микросреде с образованием иммунологических синапсов, которые затем регулируют функционирование Т-клетки.

VISTA (V-доменный иммуноглобулиновый супрессор активации Т-клеток) представляет собой отрицательный белок-регулятор контрольных точек, который регулирует Т-клеточную активацию и иммунные ответы. Он является трансмембранным белком I типа, который содержит один IgV-подобный домен, имеющий гомологию с аналогичными доменами как В7, так и CD28 семейства, и внутриклеточный домен. Цитоплазматический хвостовой домен VISTA содержит два потенциальных сайта связывания с протеинкиназой С, а также остатки пролина, которые могут функционировать в качестве докинг-сайтов, что позволяет предположить возможность функционирования VISTA в качестве как рецептора, так и лиганда.

VISTA гомологичен лиганду 1 белка программируемой клеточной смерти (PDL-1), но демонстрирует уникальную картину экспрессии, которая ограничивается компартментом гемопоэтических клеток. VISTA экспрессируется в наибольшей степени на миелоидных и гранулоцитарных клетках, экспрессируется с более низкими уровнями на Т-клетках, но не присутствует на В-клетках (Wang et al., JEM, 208(3): 577-592 (2011); Flies et al., J. Immunology, 187(4): 1537-1541 (2011)). VISTA индуцируется на популяциях Т-клеток и миелоидных клеток после активации или иммунизации, что позволяет предположить участие воспаления в его экспрессии (Wang и др., выше). С другой стороны, в опухолевых клетках никакой экспрессии VISTA не обнаруживается (Le Mercier et al., Cancer Res; 74: 1933-44 (2014)), хотя имеется опубликованное сообщение относительно экспрессии VISTA с низкой частотой раковыми клетками желудка человека (Böger et al., OncoImmunology, 6: 4, е1293215 (2017)). Если экспрессия VISTA имеет место, то она, по-видимому, ограничивается CD11b⁺ клетками, инфильтрующими микроокружение опухоли в случае рака толстой кишки или легкого. Однако было отмечено, что необходимы дальнейшие исследования для определения характеристик опухоли, которые могут быть связаны с экспрессией VISTA в микроокружении опухоли (Lines et al., Cancer Immunol. Res., 2(6): 510-7 (2014)).

По-видимому, VISTA действует как в качестве отрицательного рецептора на Т-клетках, так и в качестве лиганда, экспрессируемого на антигенпредставляющих клетках (АРС), взаимодействующего с неизвестным рецептором на Т-клетках.

Некоторые данные свидетельствуют о том, что VISTA отрицательно регулирует Т-клеточные ответы, действуя в качестве лиганда, взаимодействующего с неизвестным рецептором на Т-клетках. Так же, как и PD-L1, VISTA представляет собой лиганд, который существенно подавляет иммунитет (Lines et al., Cancer Res., 74: 1924-32 (2014)), и так же, как и в случае с PD-L1, блокирование VISTA способствует развитию иммунитета в процессе терапевтического лечения рака в доклинических онкологических моделях (см. Le Mercier и др., выше). В то время, как блокирование VISTA усиливает иммунитет, особенно опосредуемый CD8⁺ и CD4⁺ Т-клетками иммунитет, обработка растворимым слитым белком на основе Ig и внеклеточного домена VISTA (VISTA-Ig) приводит к ингибированию пролиферации Т-клеток и продуцирования цитокинов in vitro, а сверхэкспрессия VISTA на клетках опухоли МСА105 нарушает защитный противоопухолевый иммунитет у мышей (Wang и др., выше). Кроме того, введение VISTA-специфичного моноклонального антитела способствовало усилению CD4⁺ Т-клеточного ответа in vivo и развитию аутоиммунной реакции у мышей (Wang и др., выше). С другой стороны, по всей видимости, VISTA обладает функциональными активностями, которые не дублируются другими представителями Ig суперсемейства, и может играть роль в развитии аутоиммунной реакции и иммунного надзора при раке. В частности, хотя в исследованиях с использованием слитых белков на основе Fc (кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина) четко показано, что VISTA действует в качестве лиганда (Wang и др., выше, Lines и др., выше), также описано его действие в передаче сигнала, подобной таковой с участием рецепторов (Flies et al., J. Clin, Invest., 124: 1966-75 (2014)). Действительно, непосредственная отрицательная роль VISTA как рецептора на Т-клетках подтверждается рядом исследований.

Хорошо известно, что состав инфильтратов иммунных клеток варьирует не только между различными опухолевыми образованиями, но также и в пределах опухолей одного и того же анатомического места расположения. Авторы предположили, что ответ на различные иммунотерапевтические комбинации вероятно будет зависеть от иммунного окружения клеток пациента (Farkona et al., ВМС Medicine, 14: 73 (2016)). В связи с этим, как известно, чтобы избежать иммунной атаки, необходимо индуцировать экспрессию PDL-1 (Sharma et al., Cell, 168: 707-23 (2017)). Показано, что внутри опухоли и вне опухоли экспрессия PDL-1 происходит по-разному (Mino-Kenudson, Cancer Biol. Med., 13(2): 157-70 (2016)), но ассоциирована с объективным ответом на антитело к белку 1 программируемой клеточной смерти (PD-1) (Topalian и др., выше). С другой стороны, связывающиеся с VISTA партнеры, которые опосредуют эффекты данного белка, все еще не идентифицированы (Le Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6: 418 (2015)). Хотя начаты два клинических испытания фазы I с анти-VISTA молекулой, биомаркера, способного предсказать ответ пациента на эти методы лечения, не существует. Таким образом, существует потребность в выявлении связывающегося с VISTA партнера, поскольку это облегчило бы разработку терапевтических средств и позволило бы отбирать пациентов, восприимчивых к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом.

Все способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данной заявке, можно использовать при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, вместе с подходящими способами и материалами, описываемыми в данной заявке. При практическом применении данного изобретения используются, если не указано иное, традиционные методы химии белка, молекулярной вирусологии, микробиологии, технологии рекомбинантной ДНК и фармакологии, находящиеся в пределах компетентности специалиста в данной области техники. Такие методы полностью разъяснены в литературе (см., например, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001). Номенклатуры, использованные в сочетании с и лабораторными методиками, и методами молекулярной и клеточной биологии, биохимия белка, энзимологии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данной заявке, являются номенклатурами, хорошо известными и обычно используемыми в данной области техники. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном описании, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Кроме того, указанные материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения, если не указано иное.

Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны исходя из следующего далее подробного описания и из формулы изобретения.

ПОДПИСИ К ФИГУРАМ

На ФИГ. 1 показана блок-схема методики скрининга CAPTIREC™ с использованием трифункциональных реагентов для химических и протеомных исследований (TRICEPS™). В качестве исследуемого лиганда использовали слитый белок VISTA-Fc. В качестве контрольного лиганда использовали антитело к CD28.

На ФИГ. 2 представлено изображение для PSGL-1 (гликопротеиновый лиганд 1 Р-селектина) с использованием приложения Protter. Сайты N-гликозилирования указаны остатками, заключенными в квадраты, а экспериментально обнаруженные пептиды указаны закрашенными кружками.

На ФИГ. 3 показаны результаты типичных анализов связывания для VISTA-Fc с внеклеточным доменом PSGL-1 конструкции А.

На ФИГ. 4 показаны результаты типичных анализов связывания для VISTA-Fc с внеклеточным доменом PSGL-1 конструкции В.

На ФИГ. 5 показана типичная гистограмма результатов детектирования PSGL-1 в клетках HL-60 методом проточной цитометрии. Изотипический контроль и фон представлены серым заштрихованным пиком, а клетки, экспрессирующие PSGL-1, представлены белым заштрихованным пиком.

На ФИГ. 6 показан типичный вестерн-блот, демонстрирующий взаимодействие между VISTA и PSGL-1. PSGL-1 указан стрелками; известно, что неполное восстановление PSGL-1 приводит к образованию более чем одной зоны.

На ФИГ. 7 показана гистограмма, отражающая ослабление взаимодействия между VISTA и PSGL-1 в присутствии антитела к VISTA. Высота каждого столбика отражает интенсивность зон, соответствующих белку PSGL-1. Символ "-" указывает на отсутствие добавленного антитела к VISTA. Символ "+" указывает на преинкубацию с антителом к VISTA.

На ФИГ. 8 показана типичная гистограмма результатов детектирования PSGL-1 в РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) методом проточной цитометрии. Изотипический контроль и фон представлены серым заштрихованным пиком, а клетки, экспрессирующие PSGL-1, представлены белым заштрихованным пиком.

На ФИГ. 9 показан типичный вестерн-блот, демонстрирующий совместную иммунопреципитацию PSGL-1 с использованием антител к VISTA и к PSGL-1. PSGL-1 указан стрелкой.

На ФИГ. 10 показаны результаты экспрессии PSGL-1 в типичных анализах методом проточной цитометрии в подгруппах наивных и покоящихся, эффекторных и истощенных эффекторных Т-клеток.

На ФИГ. 11 показаны результаты экспрессии PSGL-1 в типичных анализах методом проточной цитометрии в подгруппах циркулирующих центральных Т-клеток памяти и циркулирующих эффекторных Т-клеток памяти.

На ФИГ. 12 показан пример множественного окрашивания матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) для PSGL-1, VISTA и PDL-1 в случае опухоли плоскоклеточного рака легкого.

На ФИГ. 13 показана гистограмма, демонстрирующая ингибирование VISTA-зависимого высвобождения интерлейкина-2 (IL-2) из CD4⁺ Т-клеток в присутствии PSGL-1.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае, когда существует множество определений для применяемого в данном описании термина, преимущественную силу имеют те, которые приведены в этом разделе, если не указано иное.

Термин "примерно" или "приблизительно" относится к обычному диапазону значений ошибки для данной величины или диапазона, известному специалистам в данной области техники. Обычно он означает нахождение в пределах 20%, например, в пределах 10% или в пределах 5% (либо 1% или меньше) от данной величины или диапазона.

Использованный в данном описании термин "вводить" или "введение" относится к акту инъекции или иной физической доставки вещества, которое находится вне организма (например, предложенного в данном изобретении антитела к PSGL-1 и/или антитела к VISTA), пациенту, такой как мукозальная, интрадермальная, внутривенная, внутримышечная доставка, и/или любому другому методу физической доставки, изложенному в данном описании или известному в данной области техники. Когда заболевание или его симптом подвергают лечению, введение вещества обычно осуществляют после начала заболевания или начала проявления его симптомов. В случае предупреждения заболевания или его симптомов введение вещества обычно осуществляют перед началом заболевания или началом проявления его симптомов.

Использованный в данном описании термин "антагонист" или "ингибитор" относится к молекуле, которая способна ингибировать или иным образом уменьшать одну или несколько биологических активностей целевого белка, такого как PSGL-1, VISTA или другая коингибирующая молекула, описанная в данной заявке. В некоторых воплощениях антагонист PSGL-1 (например, антагонистическое антитело, предложенное в данной заявке) может действовать, например, ингибируя или иным образом ослабляя активацию и/или клеточные сигнальные пути в клетке, экспрессирующей PSGL-1 (например, в Т-клетке), и/или в клетке, экспрессирующей VISTA (например, в VISTA-несущей опухолевой клетке, регуляторной Т-клетке, миелоидной супрессорной клетке или обладающей супрессивным действием дендритной клетке), тем самым ингибируя биологическую активность клетки по сравнению с биологической активностью в отсутствие антагониста. В некоторых воплощениях антителами, предложенными в данной заявке, являются антагонистические антитела к PSGL-1. В некоторых воплощениях антагонист коингибирующей молекулы (например, антагонистическое антитело к VISTA, CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4), PD1 (белок 1 программируемой (клеточной) смерти), LAG3 (продукт гена активации лимфоцитов), BTNL2 (бутирофилин-подобный белок 2), В7-Н3, В7-Н4, к бутирофилину, CD48, CD244, TIM-3 (молекула 3, содержащая Т-клеточный иммуноглобулиновый и муциновый домены), CD200R (рецептор CD200), CD200, CD160, BTLA (В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор), HVEM (медиатор проникновения вируса герпеса), LAIR1 (лейкоцитарный иммуноглобулиноподобный рецептор 1), TIM1, к галектину 9, TIM3, CD48, 2В4, CD155, CD112, CD113 или TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с Ig и ITIM доменами; ITIM означает иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив)) может действовать, например, ингибируя или иным образом ослабляя активацию и/или клеточные сигнальные пути в клетке, экспрессирующей коингибирующую молекулу (например, в Т-клетке или антигенпредставляющей клетке), тем самым ингибируя биологическую активность клетки по сравнению с биологической активностью в отсутствие антагониста. В одном из воплощений молекула-антагонист представляет собой антагонистическое антитело, т.е. антитело, которое ингибирует или снижает одну или несколько биологических активностей антигена, такого как PSGL-1, VISTA или другая коингибирующая молекула, описанная в данной заявке. Определенные антагонистические антитела в значительной степени или полностью ингибируют одну или несколько биологических активностей указанного антигена.

Использованный в данном описании термин "агонист" или "активатор" относится к молекуле, которая способна активировать или иным образом повышать одну или несколько биологических активностей целевого белка, такого как костимулирующая молекула. В некоторых воплощениях агонист костимулирующей молекулы (например, агонистическое антитело к CD154, TNFRSF25 (суперсемейство (SF) рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR), 25-ый член), GITR (индуцированный глюкокортикоидами TNFR), 4-1ВВ, ОХ40, CD27, TMIGD2 (белок 2, содержащий трансмембранный и иммуноглобулиновый домены), ICOS (индуцируемый Т-клеточный костимулятор), CD28, CD40, TL1A (TNF-подобный лиганд 1А), GITRL (лиганд GITR), 4-1BBL (лиганд 4-1ВВ), OX40L (лиганд ОХ40), CD70, HHLA2 (ассоциированный с длинными концевыми повторами белок 2 эндогенного ретровируса-Н человека), ICOSL (лиганд ICOS), цитокину, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L (лиганд CD30), В7-Н2, CD80, CD86, CD40L (лиганд CD40), TIM4, TIM1, SLAM (сигнальная лимфоцит-активирующая молекула), CD48, CD58, CD155, CD112, DR3 (рецептор смерти 3), GITR, CD2 и CD226) может действовать, например, активируя или иным образом усиливая активацию и/или клеточные сигнальные пути клетки, экспрессирующей данную костимулирующую молекулу (например, Т-клетки или антигенпредставляющей клетки), тем самым усиливая биологическую активность данной клетки по сравнению с биологической активностью в отсутствие агониста. В одном из воплощений молекула-агонист представляет собой агонистическое антитело, т.е. антитело, которое активирует или повышает одну или несколько биологических активностей антигена, такого как PSGL-1, VISTA или другая коингибирующая молекула, описанная в данной заявке. Определенные агонистические антитела в значительной степени или полностью активируют одну или несколько биологических активностей указанного антигена.

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" или "Ig" в данном описании используются взаимозаменяемо. Эти термины используются в данном описании в самом широком смысле и конкретно охватывают моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела) любого изотипа, такие как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела, химерные антитела и фрагменты антител, при условии, что указанные фрагменты сохраняют желаемую биологическую функцию. Антитело, обладающее реакционной способностью по отношению к специфическому антигену, может быть создано рекомбинантными методами, такими как отбор библиотек рекомбинантных антител в фаговых или подобных векторах, или путем иммунизации животного этим антигеном или нуклеиновой кислотой, кодирующей данный антиген. Подразумевается, что эти термины включают в себя полипептидный продукт В-клеток, принадлежащий к полипептидам класса иммуноглобулинов, который способен связываться со специфическим молекулярным антигеном и состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну тяжелую цепь (примерно 50-70 килодальтон (кДа)) и одну легкую цепь (примерно 25 кДа), и каждая амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область, содержащую от примерно 100 до примерно 130 или более аминокислот, а каждая карбокси-концевая часть каждой цепи включает константную область (см. Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York). В некоторых воплощениях специфический молекулярный антиген, который может связываться с антителом, предложенным в данной заявке, включает целевой полипептид, фрагмент или эпитоп PSGL-1.

Антитела также включают, но не ограничиваются этим, синтетические антитела, моноклональные антитела, полученные рекомбинантным путем антитела, мультиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела, химерные антитела, интраантитела, антиидиотипические (anti-Id) антитела и функциональные фрагменты любого из перечисленного выше, которые относятся к части полипептида тяжелой или легкой цепи антитела, сохраняющей некоторую долю связывающей активности или всю связывающую активность антитела, из которого данный фрагмент был получен. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов включают одноцепочечные Fv (scFv) (в том числе, например, моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, F(ab)₂ фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, соединенные дисульфидными связями Fv (sdFv), Fd фрагменты, Fv фрагменты, диатело, триотело, тетратело и миниантитело. В частности, антитела, предложенные в данной заявке, включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, антигенсвязывающие домены, или молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт, который связывается с антигеном VISTA (например, содержащие один или более определяющих комплементарность участков (CDR) антитела к VISTA). Описание таких фрагментов антител можно найти, например, в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); and Skerra, Meth. Enzymol, 178: 497-515 (1989) и в Day E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Антитела, предложенные в данной заявке, могут представлять собой молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b). Антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA, предложенные в данной заявке, могут представлять собой агонистические антитела или антагонистические антитела.

Термины "антитела к PSGL-1", "антитела, которые связываются с PSGL-1", "антитела, которые связываются с эпитопом PSGL-1" и аналогичные термины используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к антителам, которые связываются с полипептидом PSGL-1, таким как антиген или эпитоп PSGL-1. Такие антитела включают гуманизированные антитела. Антитело, которое связывается с антигеном PSGL-1, может перекрестно взаимодействовать с родственными антигенами. В некоторых воплощениях антитело, которое связывается с PSGL-1, не взаимодействует перекрестно с другими антигенами. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, не блокирует или не ингибирует связывание PSGL-1 с Р-селектином, L-селектином или Е-селектином. Антитело, которое связывается с PSGL-1, может быть идентифицировано, например, с применением иммуноанализов, BIAcore или других методов, известных специалистам в данной области техники. Антитело связывается с PSGL-1 в том случае, когда оно связывается с PSGL-1 с более высокой аффинностью, чем с любым перекрестно взаимодействующим антигеном, что определено с использованием экспериментальных методов, таких как радиоиммуноанализы (RIA) и иммуноферментные твердофазные анализы (ELISA), например, антитело, которое специфически связывается с PSGL-1. Обычно, сигнал при специфическом или избирательном взаимодействии будет по меньшей мере в два раза превышать фоновый сигнал или шум, и может превышать фон более чем в 10 раз. См., например, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, Second Edition, Raven Press, New York, на страницах 332-336 в качестве обсуждения, касающегося специфичности антител. В некоторых воплощениях антителом, "которое связывается с" представляющим интерес антигеном, является антитело, которое связывается с антигеном с аффинностью, достаточной для того, чтобы данное антитело было полезным в качестве диагностического и/или терапевтического агента для направленного воздействия на клетку или ткань, экспрессирующую данный антиген, и не взаимодействовало перекрестно в значительной степени с другими белками. В таких воплощениях степень связывания антитела с "не являющимся мишенью" белком будет составлять менее чем примерно 10% от связывания данного антитела со своим особым белком-мишенью, как определено в анализе с применением сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или радиоиммунопреципитации (RIA). Что касается связывания антитела с молекулой-мишенью, то термин "специфическое связывание", или "специфически связывается с" конкретным полипептидом или эпитопом либо является "специфичным к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое при измерении отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, посредством определения связывания молекулы в сравнении со связыванием контрольной молекулы, которая, как правило, представляет собой молекулу аналогичной структуры, не обладающую связывающей активностью. Например, специфическое связывание может быть определено с использованием конкуренции с контрольной молекулой, которая аналогична мишени, например, в присутствии избытка немеченой мишени. В этом случае указанием на специфическое связывание служит тот факт, что связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Термин "специфическое связывание" или "специфически связывается с" конкретным полипептидом или эпитопом либо является "специфичным к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени, использованный в данном описании, может быть применен, например, к молекуле, имеющей Kd в отношении мишени, составляющую по меньшей мере примерно 10^-4 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-5 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-6 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-7 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-8 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-9 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-10 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-11 М, альтернативно, по меньшей мере примерно 10^-12 М или меньше. В некоторых воплощениях термин "специфическое связывание" относится к связыванию, когда молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом конкретного полипептида по существу без связывания с каким-либо другим полипептидом или эпитопом полипептида. В некоторых воплощениях антитело, которое связывается с PSGL-1 или VISTA, имеет константу диссоциации (Kd), составляющую не более 1 мкМ, не более 100 нМ, не более 10 нМ, не более 1 нМ или не более 0,1 нМ. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA связывается с эпитопом PSGL-1 или VISTA, который является консервативным среди PSGL-1 или VISTA из разных видов.

Термин "антиген" относится к заданному антигену, с которым может избирательно связываться антитело. Антигеном-мишенью может быть полипептид, углевод, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. В некоторых воплощениях антигеном-мишенью является полипептид, в том числе, например, полипептид PSGL-1.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающий домен", "антигенсвязывающий участок" и аналогичные термины относятся к той части антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие связывающемуся агенту свойственную ему специфичность и аффинность к данному антигену (например, к определяющим комплементарность участкам (CDR)).

Термин "антигенпредставляющая клетка" или "АРС" относится к гетерогенной группе иммунных клеток, которые опосредуют клеточный иммунный ответ путем процессинга и представления антигенов для распознавания определенными лимфоцитами, такими как Т-клетки. АРС включают, но не ограничиваются этим, дендритные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса и В-клетки.

Термины "связывается" или "связывание", использованные в данном описании, относятся к взаимодействию между молекулами с образованием комплекса. Взаимодействиями могут быть, например, нековалентные взаимодействия, включая водородные связи, ионные связи, гидрофобные взаимодействия и/или ван-дер-Ваальсовы взаимодействия. Комплекс также может образовываться в результате связывания двух или более молекул, удерживаемых вместе ковалентными или нековалентными связями, взаимодействиями или силами. Прочность всех нековалентных взаимодействий между одним антигенсвязывающим сайтом на антителе и одним эпитопом на молекуле-мишени, такой как PSGL-1, представляет собой аффинность антитела или функционального фрагмента к этому эпитопу. Отношение константы скорости ассоциации (k₁) к константе скорости диссоциации (k_-1) антитела с одновалентным антигеном (k₁/k_-1) представляет собой константу ассоциации K, которая является мерой аффинности. Значение K варьирует для разных комплексов антитела и антигена и зависит от обеих констант k₁ и k_-1. Константу ассоциации K для антитела, предложенного в данной заявке, можно определить, используя любой метод, приведенный в данном описании, или любой другой метод, хорошо известный специалистам в данной области техники. Аффинность по одному сайту связывания не всегда отражает истинную силу взаимодействия между антителом и антигеном. Когда сложные антигены, содержащие множественные, повторяющиеся антигенные детерминанты, как например, поливалентный PSGL-1, приходят в контакт с антителами, содержащими множественные сайты связывания, взаимодействие антитела с антигеном в одном сайте будет увеличивать вероятность взаимодействия во втором сайте. Сила таких множественных взаимодействий между мультивалентным антителом и антигеном называется авидностью. Авидность антитела может представлять собой более подходящую меру его связывающей способности, чем аффинность его отдельных сайтов связывания. Например, высокая авидность может компенсировать низкую аффинность, как это иногда наблюдается для пентамерных антител IgM, которые могут иметь более низкую аффинность, чем IgG, но более высокая авидность IgM, являющаяся результатом их мультивалентности, позволяет им эффективно связываться с антигеном.

Термин "биологический образец" относится к образу, который получен из биологического источника, такого как пациент или субъект. В некоторых воплощениях биологический образец включает, но не ограничивается этим, цельную кровь, частично очищенную кровь, РВМС, тканевые биоптаты и тому подобное. Предпочтительно, биологический образец представляет собой образец опухоли. В некоторых предпочтительных воплощениях биологический образец получают посредством биопсии ткани (например, получают биоптат опухоли, который может включать в себя иммунные инфильтраты).

Термин "блокировать" или его грамматический эквивалент, при использовании в контексте антитела, относится к антителу, которое предотвращает или аннулирует биологическое действие антигена, с которым связывается данное антитело. Блокирующее антитело включает антитело, которое объединяется с антигеном, не вызывая реакции, но которое блокирует другой белок в случае последующего объединения или образования комплекса с указанным антигеном. Блокирующее действие антитела может быть действием, приводящим к изменению биологической активности антигена, которое может быть измерено. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, блокирует способность VISTA связываться с PSGL-1, что может приводить к ингибированию или блокированию подавляющих сигналов от VISTA. Определенные антитела к PSGL-1, описанные в данной заявке, ингибируют или блокируют подавляющие сигналы от VISTA на VISTA-экспрессирующих клетках, в том числе на величину от примерно 98% до примерно 100% по сравнению с соответствующим контролем (например, контролем являются клетки, не прошедшие обработку тестируемым антителом). В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, блокирует связывание PSGL-1 с внеклеточным доменом VISTA и/или блокирует связывание VISTA-экспрессирующей клетки с PSGL-1-экспрессирующей клеткой. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, не блокирует связывание PSGL-1 с белком, отличающимся от VISTA, таким как Р-селектин, L-селектин и/или Е-селектин.

Термин "VISTA" или "полипептид VISTA" и аналогичные термины относятся к полипептиду ("полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо), кодируемому геном из открытой рамки считывания 54 на хромосоме 10 человека (VISTA), который также известен в данной области техники как В7-Н5, тромбоцитарный рецептор Gi24, GI24, стресс-индуцируемый секретируемый белок 1, SISP1, и РР2135, содержащий аминокислотную последовательность:

и родственным полипептидам, включая их SNP(однонуклеотидный полиморфизм)-варианты. Показано или предполагается, что полипептид VISTA содержит несколько различных областей в пределах аминокислотной последовательности, включая: сигнальную последовательность (остатки 1-32; см. Zhang et al., Protein Sci, 13: 2819-2824 (2004)); иммуноглобулиновый домен - IgV-подобный (остатки 33-162); и трансмембранный участок (остатки 195-215). Зрелый белок VISTA включает аминокислотные остатки 33-311 в SEQ ID NO: 1. Внеклеточный домен белка VISTA включает аминокислотные остатки 33-194 в SEQ ID NO: 1. Родственные полипептиды включают аллельные варианты (например, SNP-варианты); сплайс-варианты; фрагменты; производные; варианты с заменами, делециями и вставками; слитые полипептиды; и межвидовые гомологи, предпочтительно те, которые сохраняют активность VISTA и/или являются достаточными для генерации иммунного ответа на VISTA. VISTA может находиться в нативной или денатурированной форме. Полипептиды VISTA, описанные в данной заявке, могут быть выделены из различных источников, например, из человеческих тканей разных типов или из другого источника, либо получены рекомбинантными методами или методами синтеза. "Полипептид VISTA с нативной последовательностью" представляет собой полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид VISTA природного происхождения. Такие полипептиды VISTA с нативной последовательностью могут быть выделены из природных источников или могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. Термин "полипептид VISTA с нативной последовательностью", в частности, охватывает природные укороченные или секретируемые формы конкретного полипептида VISTA (например, последовательность внеклеточного домена), формы природных вариантов (например, формы, образовавшиеся в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты данного полипептида.

Нуклеиновокислотная последовательность кДНК, кодирующей полипептид VISTA, например, содержит:

Как описано в данной заявке, VISTA представляет собой иммуномодулятор, который является отрицательным регулятором контрольных точек иммунных ответов (например, ингибирует или подавляет иммунные ответы). Кроме того, как описано в данной заявке, PSGL-1 представляет собой рецептор VISTA. Кроме того, как описано в данной заявке, способы модулирования (например, предупреждения, ингибирования, блокирования) взаимодействия PSGL-1 и VISTA с агентами (например, антителами), которые связываются с PSGL-1 и/или VISTA, полезны, в том числе, например, для ингибирования или блокирования подавляющих сигналов от VISTA. Модулирование взаимодействия VISTA и PSGL-1 может вызывать усиление иммунного ответа, включая усиление активации иммунной системы (например, активации Т-клеток, такой как пролиферация Т-клеток). Антитела, которые связываются с VISTA, используемые в способах, описанных в данной заявке, включают таковые, раскрытые в WO 2014/197849 (PCT/US 2014/041388).

Ортологи полипептида VISTA также хорошо известны в данной области техники. Например, мышиный ортолог полипептида VISTA представляет собой супрессор активации Т-клеток, содержащий V-область иммуноглобулинов (VISTA) (также известный как PD-L3, PD-1H, PD-XL, Pro 1412 и UNQ730), последовательность которого приблизительно на 70% идентична последовательности данного полипептида у человека. Ортологи VISTA также можно найти среди других организмов, включая шимпанзе, корову, крысу и данио.

Выражение "VISTA-экспрессирующая клетка", "клетка, обладающая экспрессией VISTA" или его грамматический эквивалент относится к клетке, которая экспрессирует эндогенный или трансфицированный VISTA на клеточной поверхности. VISTA-экспрессирующие клетки включают VISTA-несущие опухолевые клетки, регуляторные опухолевые клетки (например, CD4⁺ Foxp3⁺ регуляторные Т-клетки), миелоидные супрессорные клетки (например, CD11b⁺ или CD11b^high миелоидные супрессорные клетки) и/или обладающие супрессивным действием дендритные клетки (например, CD11b⁺ или CD11b^high дендритные клетки). Клетка, экспрессирующая VISTA, продуцирует на своей поверхности VISTA со значительными уровнями, благодаря чему антитело к VISTA может связываться с ним и/или PSGL-1, или клетка, экспрессирующая PSGL-1, может связываться с ним. Согласно некоторым аспектам ингибирование или блокирование такого связывания может оказывать терапевтический эффект. Клетка, которая "сверхэкспрессирует" VISTA, представляет собой клетку, имеющую значительно более высокие уровни VISTA на своей клеточной поверхности по сравнению с клеткой ткани того же типа, которая, как известно, экспрессирует VISTA. Такая сверхэкспрессия может быть обусловлена амплификацией гена или усиленной транскрипцией или трансляцией. Сверхэкспрессию VISTA можно определить в диагностическом или прогностическом анализе, оценивая повышенные уровни белка VISTA, присутствующего на поверхности клетки (например, с использованием иммуногистохимического анализа; FACS анализа). Альтернативно или помимо этого, можно измерить уровни кодирующей VISTA нуклеиновой кислоты или мРНК в клетке, например, с использованием методов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH; см. заявку W098/45479, опубликованную в октябре 1998 года), саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР), такой как количественная ПЦР в режиме реального времени (РВ-ПЦР). Помимо описанных выше анализов квалифицированным практикам доступны различные анализы in vivo. Например, на клетки организма пациента можно воздействовать антителом, которое может быть помечено детектируемым агентом, и связывание данного антитела с клетками пациента можно оценить, например, путем внешнего сканирования по радиоактивности или путем анализа биоптата, взятого у пациента, предварительно подвергнутого воздействию антитела. VISTA-экспрессирующая опухолевая клетка включает, но не ограничивается этим, опухолевые клетки острого миелоидного лейкоза (AML).

Термины "VISTA-опосредуемое заболевание", "VISTA-опосредуемое расстройство" и "VISTA-опосредуемое состояние" используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, расстройству или состоянию, которое полностью или частично вызывается или которое является результатом присутствия VISTA. Такие заболевания, расстройства или состояния включают таковые, которые вызваны или иным образом ассоциированы с VISTA, в том числе вызваны VISTA-экспрессирующими клетками или ассоциированы с ними (например, опухолевыми клетками, миелоидными супрессорными клетками (MDSC), обладающими супрессивным действием дендритными клетками (обладающими супрессивным действием DC) и/или регуляторными Т-клетками (T_reg)). В некоторых воплощениях VISTA аберрантно (например, в высокой степени) экспрессирован на поверхности клетки. В некоторых воплощениях VISTA может быть аберрантно активирован на клетках конкретного типа. В других воплощениях нормальная, аберрантная или избыточная передача сигнала в клетках обусловлена связыванием VISTA с рецептором VISTA (например, PSGL-1), который может связываться или иным образом взаимодействовать с VISTA.

Термины "нарушение клеточной пролиферации" и "пролиферативное расстройство" относятся к расстройствам, которые ассоциированы с некоторым уровнем аномальной пролиферации клеток. В некоторых воплощениях нарушением клеточной пролиферации является опухоль или рак. Термин "опухоль", использованный в данном описании, относится к любому росту и размножению опухолевых клеток, как злокачественному, так и доброкачественному, и любым предраковым и раковым клеткам и тканям. Термины "рак", "раковый", "нарушение клеточной пролиферации", "пролиферативное расстройство" и "опухоль" не являются взаимоисключающими, что указано в данном описании. Термины "рак" и "раковый" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфолейкозы. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак (например, плоскоклеточный рак эпителиального происхождения), рак легкого, в том числе мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскокпеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоклеточный рак, гастрический рак или рак желудка, в том числе рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак полости рта, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, кол о ректальный рак, рак эндометрия или рак матки, рак слюнных желез, рак почки или почечно-клеточный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, печеночную карциному, анальный рак, рак пениса, меланому, множественную миелому и В-клеточную лимфому, рак головного мозга, рак кожи, рак пищевода, а также рак головы и шеи и связанные с этими видами рака метастазы. В некоторых воплощениях рак представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, относящуюся к раку, который возникает в кроветворной ткани, такой как костный мозг, или в клетках иммунной системы. Примерами гематологической злокачественной опухоли являются лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или острый моноцитарный лейкоз (AMoL)), лимфома (лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома) и миелома (множественная миелома, плазмацитома, локализованная миелома или экстрамедуллярная миелома).

"Коингибирующая молекула" (также известная как "отрицательный регулятор контрольных точек" или "NCR") относится к молекуле, которая подавляет иммунные ответы (например, активацию Т-клеток) посредством передачи отрицательного сигнала к Т-клеткам после их встречи с лигандами или контррецепторами. Типичные функции коингибирующей молекулы заключаются в предотвращении непропорциональной иммунной активации, сведению к минимуму побочных негативных последствий и/или в поддержании периферической аутотолерантности. В некоторых воплощениях коингибирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый антигенпредставляющей клеткой. В некоторых воплощениях коингибирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый Т-клеткой. В некоторых воплощениях коингибирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый как антигенпредставляющей клеткой, так и Т-клеткой.

"Костимулирующая молекула" относится к молекуле, которая активирует иммунные ответы (например, вызывает активацию Т-клеток) посредством передачи положительного сигнала к Т-клеткам после их встречи с лигандами или контррецепторами. Т-клетке, чтобы стать полностью активированной, необходимы два сигнала: 1) антиген-специфичный сигнал, который обеспечивается через Т-клеточный рецептор, взаимодействующий с молекулами пептид-МНС (главный комплекс гистосовместимости) на антигенпредставляющей клетке; и 2) костимулирующий сигнал, который является антиген-неспецифичным и обеспечивается посредством взаимодействия между костимулирующими молекулами, экспрессируемыми на мембране антигенпредставляющей клетки и Т-клетки. Костимуляция Т-клеток обеспечивает пролиферацию, дифференцировку и выживаемость Т-клеток. В некоторых воплощениях костимуллирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый антигенпредставляющей клеткой. В некоторых воплощениях костимуллирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый Т-клеткой. В некоторых воплощениях костимуллирующей молекулой является лиганд или рецептор, экспрессируемый как антигенпредставляющей клеткой, так и Т-клеткой.

"Химиотерапевтический агент" представляет собой химический или биологический агент (например, агент, включающий низкомолекулярное лекарственное средство, или биологический агент, такой как антитело или клетка), применимый для лечения рака, независимо от механизма действия. Химиотерапевтические агенты включают соединения, используемые в терапии направленного действия и традиционной химиотерапии. Примеры химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетил камптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин-гамма II и калихеамицин-омега II (см., например, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN®, доксорубицин (в том числе морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин, и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора препарат паклитаксела в форме связанных с альбумином наночастиц ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL.) и доцетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (GEMZAR®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN®); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN®); оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA®); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений, а также комбинации двух или более указанных выше соединений, такие как CHOP, сокращенное название для комбинированной терапии с применением циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона, и FOLFOX, сокращенное название для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN™) в комбинации с 5-FU и лейковорином. Дополнительные химиотерапевтические агенты включают цитотоксические агенты, полезные в составе конъюгатов антитело лекарственное средство, такие как майтанзиноиды (DM1 и DM4, например) и ауристатины (ММАЕ и MMAF, например).

В определение химиотерапевтического агента также включены: (1) антигормональные агенты, действие которых заключается в регулировании или ингибировании эффектов гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогенов (SERM), в том числе, например, тамоксифен (включая NOLVADEX®; тамоксифена цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и FARESTON® (торемифена цитрат); (2) ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующую выработку эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE® (мегестрола ацетат), AROMASIN® (экземестан; Pfizer), форместан, фадрозол, RIVISOR® (ворозол), FEMARA® (летрозол; Novartis) и ARIMIDEX® (анастрозол; AstraZeneca); (3) антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); (4) ингибиторы протеинкиназ, такие как ингибиторы МЕК (WO 2007/044515); (5) ингибиторы липидной киназы; (6) антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, которые подавляют экспрессию генов в сигнальных путях, вовлеченных в аберрантную пролиферацию клеток, например, генов РКС-альфа (протеинкиназа С), киназ Raf и H-Ras, такие как облимерсен (GENASENSE®, Genta Inc.); (7) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, ANGIOZYME®) и ингибиторы экспрессии HER2 (человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2 типа); (8) вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® и VAXID®; рекомбинантный интерлейкин-2 (rIL-2) PROLEUKIN®; ингибиторы топоизомеразы 1, такие как LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; (9) антиангиогенные агенты, такие как бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech); (10) иммуномодулирующие агенты, такие как биспецифичные (BITE) антитела-рекрутеры Т-клеток и Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений.

"CDR" относится к одному из трех гипервариабельных участков тяжелой цепи (Н1, Н2 или Н3) в пределах некаркасной области структуры β-листа вариабельного домена тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина (Ig или антитела) или к одному из трех гипервариабельных участков легкой цепи (L1, L2 или L3) в пределах некаркасной области структуры β-листа вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела. Соответственно, CDR представляют собой последовательности вариабельных участков, чередующиеся внутри последовательностей каркасной области. Участки CDR хорошо известны специалистам в данной области техники и определены, например, Kabat, как участки наибольшей гипервариабельности в пределах вариабельных (V) доменов антитела (Kabat et al., J. Biol, Chem., 252: 6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot Chem., 32: 1-75 (1978)). Кроме того, последовательности участков CDR были структурно определены Chothia как такие остатки, которые не являются частью консервативной структуры β-листа и вследствие этого способны принимать разные конформации (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). Обе номенклатуры являются общепризнанными номенклатурами в данной области техники. Последовательности участков CDR также были определены согласно базам данных AbM, методу "контакта" и IMGT. Положения CDR в пределах канонического вариабельного домена антитела были определены путем сравнения многочисленных структур (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); Morea et al., Methods, 20: 267-279 (2000)). Поскольку количество остатков в гипервариабельном участке в разных антителах разное, то дополнительные остатки по сравнению с остатками в канонических положениях традиционно нумеруют буквами а, b, с и так далее вслед за номером остатков в канонической схеме нумерации вариабельного домена (Al-Lazikani и др., выше (1997)). Такая номенклатура также хорошо известна специалистам в данной области техники.

Термин "гипервариабельный участок", "HVR" или "HV", при использовании в данном описании относится к участкам вариабельного домена антитела, которые имеют гипервариабельность в последовательности и/или образуют петли с определенной структурой. Как правило, антитела содержат шесть гипервариабельных участков: три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Применяется ряд методов определений границ гипервариабельных участков, и они включены в данное описание. Определение CDR по Kabat основано на вариабельности последовательностей и используется чаще всего (Kabat et. al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, альтернативно, ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987)). Окончание петли CDR-H1 no Chothia, при определении номера с использованием правила нумерации по Kabat, варьирует между положениями Н32 и Н34 в зависимости от длины петли (это происходит потому, что схема нумерации по Kabat допускает наличие вставок в положениях Н35А и Н35В; если ни в положении 35А, ни в положении 35В вставки нет, то петля заканчивается в положении 32; если вставка присутствует только в положении 35А, то петля заканчивается в положении 33; если присутствуют вставки в обоих положениях 35А и 35В, то петля заканчивается в положении 34). Гипервариабельные участки по AbM представляют собой компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и они используются программным обеспечением AbM от Oxford Molecular для моделирования структуры антител. Расположение гипервариабельных участков методом "контакта" основано на анализе доступных кристаллических структур комплексов. Остатки каждого из этих гипервариабельных участков указаны ниже.

Недавно была разработана и широко внедрена в практику универсальная система нумерации ImMunoGeneTics (IMGT) Information System^® (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol., 27(1): 55-77 (2003)). IMGT является объединенной информационной системой, специализирующейся на иммуноглобулинах (Ig), Т-клеточных рецепторах (TR) и главном комплексе гистосовместимости (МНС) человека и других позвоночных. Здесь, CDR указываются как в терминах аминокислотной последовательности, так и расположения в легкой или тяжелой цепи. Поскольку в разных видах "расположение" CDR в структуре вариабельного домена иммуноглобулина сохраняется и присутствует в структурах, называемых петлями, то используя системы нумерации, в которых производится выравнивание последовательностей вариабельных доменов в соответствии со структурными признаками, легко идентифицировать остатки CDR и каркаса. Эту информацию можно использовать в случае привития и замены остатков CDR из иммуноглобулинов одного вида в акцепторный каркас, обычно, из человеческого антитела. Соответствие между нумерацией по Kabat и единой системой нумерации IMGT также хорошо известно специалисту в данной области техники (например, Lefranc и др., выше). Типичная система, показанная в данном описании, объединяет системы Kabat и Chothia.

Гипервариабельные участки могут содержать "протяженные гипервариабельные участки", приведенные ниже: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 или 26-35А (Н1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) в VH. Число таких остатков вариабельного домена составляет 25 согласно Kabat и др., выше, для каждого из этих определений. Применяемые в данном описании термины "HVR" и "CDR" используются взаимозаменяемо.

Термин "константная область" или "константный домен" относится к карбокси-концевой части легкой и тяжелой цепи, которая непосредственно не вовлечена в связывание антитела с антигеном, но демонстрирует различные эффекторные функции, например, взаимодействие с Fc-рецептором. Эти термины относятся к той части молекулы иммуноглобулина, которая имеет более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельным доменом, который содержит антигенсвязывающий сайт. Константный домен содержит константные СН1-, СН2- и СН3-домены тяжелой цепи и константный CL-домен легкой цепи.

В контексте полипептида термин "производное", использованный в данном описании, относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность полипептида PSGL-1, фрагмента полипептида PSGL-1 или антитела, связывающегося с полипептидом PSGL-1, которая была изменена путем замен, делеций или вставок аминокислотных остатков. Термин "производное", использованный в данном описании, также относится к полипептиду PSGL-1, фрагменту полипептида PSGL-1 или антителу, связывающемуся с полипептидом PSGL-1, которые были химически модифицированы, например, в результате ковалентного присоединения молекулы любого типа к данному полипептиду. Например, но не в порядке ограничения, полипептид PSGL-1, фрагмент полипептида PSGL-1 или антитело к PSGL-1 могут быть химически модифицированы, например, в результате гликозилирования, ацетилирования, ПЭГилирования, фосфорилирования, амидирования, путем получения производных с использованием известных защитных/блокирующих групп, в результате протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и так далее. Данные производные модифицированы таким образом, что они отличаются от природного или исходного пептида или полипептидов либо типом, либо расположением присоединенных молекул. Производные также включают делецию одной или более химических групп, которые в естественных условиях присутствуют в этом пептиде или полипептиде. Производное полипептида PSGL-1, фрагмент полипептида PSGL-1 или антитело к PSGL-1 могут быть химически модифицированы путем химической модификации с использованием методов, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, режим обработки, использование метаболического синтеза туникамицина и так далее. Кроме того, производное полипептида PSGL-1, фрагмент полипептида PSGL-1 или антитело к PSGL-1 могут содержать одну или более неклассических аминокислот. Полипептидное производное обладает функцией, аналогичной или идентичной функции полипептида PSGL-1, фрагмента полипептида PSGL-1 или антитела к PSGL-1, описанных в данной заявке.

Термин "детектируемый зонд", использованный в данном описании, относится к соединению, которое обеспечивает получение детектируемого сигнала. Данный термин включает в себя, без ограничения, любой флуорофор, хромофор, радиоактивную метку, фермент, антитело или фрагмент антитела и тому подобное, которые обеспечивают получение детектируемого сигнала благодаря своей активности.

Термин "диагностический агент" относится к веществу, вводимому субъекту, которое помогает в диагностике заболевания. Такие вещества можно использовать для выявления, точного определения и/или установления локализации вызывающего заболевание процесса. В некоторых воплощениях диагностический агент включает вещество, конъюгированное с антителом, предложенным в данной заявке, которое при введении субъекту или при контакте с образцом, полученным от субъекта, помогает в диагностике рака, опухолеобразования или любого другого VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Термин "детектируемый агент" относится к веществу, которое можно использовать для установления наличия или присутствия желаемой молекулы, такой как антитело, предложенное в данной заявке, в образце или организме субъекта. Детектируемым агентом может быть вещество, которое можно визуализировать, или вещество, содержание которого можно определить и/или измерить иным образом (например, путем количественного определения).

Термин "детектирование", использованный в данном описании, охватывает количественное или качественное детектирование.

Термин "кодировать" или его грамматические эквиваленты при использовании в применении к молекуле нуклеиновой кислоты, относится к молекуле нуклеиновой кислоты в ее нативном состоянии или в случае манипулирования с ней методами, хорошо известными специалистам в данной области техники, которая может быть транскрибирована с получением мРНК и которая затем транслируется в полипептид и/или его фрагмент. Антисмысловая цепь комплементарна такой молекуле нуклеиновой кислоты и на основании нее может быть получена кодирующая последовательность.

Термин "эпитоп", использованный в данном описании, относится к участку антигена, такого как полипептид PSGL-1 или фрагмент полипептида PSGL-1, с которым связывается антитело. Предпочтительно, термин "эпитоп", использованный в данном описании, относится к локализованному участку на поверхности антигена, такого как полипептид PSGL-1 или фрагмент полипептида PSGL-1, который способен связываться с одним или несколькими антигенсвязывающими участками антитела и который у животного, такого как млекопитающее (например, человек) обладает антигенной или иммуногенной активностью, то есть способен вызывать иммунный ответ. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида, который вызывает антительный ответ у животного. Эпитоп, обладающий антигенной активностью, представляет собой часть полипептида, с которым антитело связывается, что определено любым способом, хорошо известным в данной области техники, например, с использованием иммуноанализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными. Обычно эпитопы состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть образован смежными остатками или несмежными остатками, сближенными в результате сворачивания антигена-белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные несмежными аминокислотами, обычно утрачиваются при указанном воздействии. В некоторых воплощениях эпитоп PSGL-1 представляет собой пространственный компонент поверхности полипептида PSGL-1. В других воплощениях эпитоп PSGL-1 представляет собой линейный компонент полипептида PSGL-1. Как правило, антиген имеет несколько или много разных эпитопов и взаимодействует со многими разными антителами.

Термин "эксципиент", использованный в данном описании, относится к инертному веществу, которое обычно используется в качестве разбавителя, наполнителя, консерванта, связующего вещества или стабилизирующего агента, и включает, но не ограничивается этим, белки (например, сывороточный альбумин и т.д.), аминокислоты (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, глицин, гистидин и т.д.), жирные кислоты и фосфолипиды (например, алкилсульфонаты, каприлат и т.д.), поверхностно-активные вещества (например, SDS (додецилсульфат натрия), полисорбат, неионное поверхностно-активное вещество и т.д.), сахариды (например, сахарозу, мальтозу, трегалозу и т.д.) и полиолы (например, маннит, сорбит и т.д.). Также см. книгу Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, которая тем самым включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Если речь идет о пептиде или полипептиде, то термин "фрагмент", использованный в данном описании, относится к пептиду или полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность меньше полноразмерной. Такой фрагмент может возникать, например, в результате укорочения на амино-концевой части, укорочения на карбокси-концевой части и/или делеции остатка(ов) внутри аминокислотной последовательности. Например, фрагменты могут быть результатом альтернативного сплайсинга рибонуклеиновой кислоты (РНК) или протеазной активности in vivo. В некоторых воплощениях фрагменты PSGL-1 или VISTA включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере из 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности полипептида PSGL-1 или VISTA либо антитела, которое связывается с полипептидом PSGL-1 или VISTA. В некоторых воплощениях фрагмент полипептида PSGL-1 или VISTA либо антитело, которое связывается с антигеном PSGL-1 или VISTA, сохраняет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 функции данного полипептида или антитела.

Термин остатки "каркасной области" или "FR" относится к таким остаткам вариабельных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельных участков, определенных в данном описании. FR остатками являются такие остатки вариабельных доменов, которые фланкируют CDR. FR остатки присутствуют, например, в химерных, гуманизированных, человеческих, однодоменных антителах, диателах, линейных антителах и биспецифичных антителах.

"Функциональный фрагмент" антитела будет проявлять по меньшей мере одну биологическую функцию, если не несколько или все из биологических функций, присущих интактному антителу, причем эта функция представляет собой по меньшей мере специфическое связывание с антигеном-мишенью.

Термин "слитый белок", использованный в данном описании, относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность антитела и аминокислотную последовательность гетерологичного полипептида или белка (например, полипептида или белка, в норме не составляющего часть антитела (например, антитела, не являющегося антителом к PSGL-1 или не являющегося антителом к VISTA)). Термин "слияние", при использовании применительно к PSGL-1, VISTA, антителу к PSGL-1 или антителу к VISTA, относится к присоединению пептида или полипептида либо его фрагмента, варианта и/или производного к гетерологичному пептиду или полипептиду. В некоторых воплощениях такой слитый белок сохраняет биологическую активность PSGL-1, VISTA, антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA. В некоторых воплощениях слитый белок содержит VH-домен, VL-домен, VH CDR (один, два или три VH CDR) и/или VL CDR (один, два или три VL CDR) антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA, при этом слитый белок связывается с эпитопом PSGL-1 или VISTA.

Термин "тяжелая цепь", при использовании применительно к антителу, относится к полипептидной цепи размером примерно 50-70 кДа, амино-концевая часть которой включает вариабельную область, состоящую из примерно 120-130 или более аминокислот, а карбокси-концевая часть которой включает константную область. Константная область может принадлежать к одному из пяти различных типов, называемых альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основании аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Эти различные тяжелые цепи отличаются по размеру: α, δ и γ содержат приблизительно 450 аминокислот, в то время как μ и ε содержат приблизительно 550 аминокислот. В сочетании с легкой цепью эти различные типы тяжелых цепей дают начало пяти хорошо известным классам антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелая цепь может представлять собой тяжелую цепь иммуноглобулина человека.

Термин "шарнирная область" относится в данном описании к гибкому участку из аминокислот, расположенному в центральной части тяжелых цепей иммуноглобулинов классов IgG и IgA, который связывает эти 2 цепи дисульфидными связями. Как правило, шарнирную область определяют как область, простирающуюся от Glu216 до Pro230 в молекуле человеческого IgG1 (Burton, Mol. Immunol., 22: 161-206, 1985). Шарнирные области IgG других изотипов могут быть выравнены относительно последовательности IgG1 путем помещения первого и последнего остатков цистеина, образующих S-S связи, между тяжелыми цепями в те же положения. "Домен СН2" в Fc части человеческого IgG (также называемый доменом "Сγ2") обычно простирается от примерно 231-й аминокислоты до примерно 340-й аминокислоты. Уникальность домена СН2 заключается в том, что он не спарен тесно с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между этими двумя СН2-доменами интактной нативной молекулы IgG. Было высказано предположение, что присутствие углеводной части может обеспечить замену спариванию по типу домен-домен и помочь стабилизировать домен СН2 (Burton, Mol. Immunol., 22: 161-206, 1985). "Домен СН3" содержит участок из остатков, располагающихся в С-концевой части по отношению к домену СН2 в Fc части (т.е. от примерно 341-ого аминокислотного остатка до примерно 447-ого аминокислотного остатка в IgG).

Термин "хозяин", использованный в данном описании, относится к животному, такому как млекопитающее (например, человек).

Термин "клетка-хозяин", использованный в данном описании, относится к конкретной подвергаемой воздействию клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или возможному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может быть не идентично родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, вследствие мутаций или влияния окружающей среды, что может проявляться в последующих поколениях, или вследствие встраивания молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки хозяина.

"Гуманизированными" формами нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерные антитела, включающие иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых нативные остатки CDR заменены на остатки из соответствующего CDR видов, не являющихся человеком (донорного антитела), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющих желаемую специфичность, аффинность и функциональную активность. В некоторых случаях, один или более остатков FR области иммуноглобулина человека заменяют на соответствующие остатки иммуноглобулина из вида, не являющегося человеком. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации делают для дальнейшего улучшения эффективности антител. Тяжелая или легкая цепь гуманизированного антитела может содержать по существу все из по меньшей мере одного или более вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR соответствуют таковым иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, и все или по существу все FR представляют собой FR из последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, константной области иммуноглобулина человека. Для дальнейших подробностей см. Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); и патенты США №№6800738 (опубликован 5 октября 2004 г.), 6719971 (опубликован 27 сентября 2005 г.), 6639055 (опубликован 28 октября 2003 г.), 6407213 (опубликован 18 июня 2002 г.) и 6054297 (опубликован 25 апреля 2000 г.).

"Эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для получения полезных или желаемых результатов. Эффективное количество может быть введено за одну или более чем одну процедуру введения, нанесения или дозирования. Такая доставка зависит от ряда изменяемых параметров, включая период времени, в течение которого следует использовать отдельную стандартную дозировку, биодоступность агента, путь введения и так далее. В некоторых воплощениях эффективное количество также относится к количеству антитела, предложенного в данной заявке, необходимому для достижения конкретного результата (например, ингибирования ассоциированной с PSGL-1 или VISTA биологической активности клетки, такой как модулирование активации Т-клеток). В некоторых воплощениях этот термин относится к терапевтической дозировке (например, антитела, предложенного в данной заявке), которой достаточно для снижения и/или ослабления тяжести и/или продолжительности определенного заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ними симптома. Этот термин также охватывает количество, необходимое для снижения или ослабления развития или прогрессирования определенного заболевания, расстройства или состояния, снижения или уменьшения вероятности рецидива, развития или начала определенного заболевания, расстройства или состояния и/или для улучшения или усиления профилактического(их) или терапевтического(их) эффекта(ов) другой терапии (например, терапии, отличающейся от применения антитела к PSGL-1, предложенного в данной заявке). В некоторых воплощениях эффективное количество антитела составляет от примерно 0,1 мг/кг (мг антитела на один кг массы тела субъекта) до примерно 100 мг/кг. В некоторых воплощениях эффективное количество антитела, предложенного в данной заявке, составляет примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 90 мг/кг или примерно 100 мг/кг (или находится в этом диапазоне).

Термин "ингибировать" или его грамматический эквивалент, при использовании в контексте антитела, относится к антителу, которое подавляет, аннулирует или снижает биологическую активность антигена, с которым связывается данное антитело. Ингибирующее действие антитела может быть действием, приводящим к изменению биологической активности антигена, которое может быть измерено. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, ингибирует способность VISTA связываться с PSGL-1, что может приводить к подавлению коингибирующей активности VISTA. Определенные антитела к PSGL-1, описанные в данной заявке, ингибируют или блокируют подавляющие сигналы от VISTA на VISTA-экспрессирующих клетках, на величину более чем 5%, как например, от приблизительно 5% до приблизительно 50%, или на величину более чем 50% (например, от приблизительно 50% до приблизительно 98%) по сравнению с соответствующим контролем (например, контролем являются клетки, не прошедшие обработку тестируемым антителом). В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, ингибирует связывание PSGL-1 с внеклеточным доменом VISTA и/или ингибирует связывание VISTA-экспрессирующей клетки с PSGL-1-экспрессирующей клеткой. Кроме того, в некоторых воплощениях антитело к PSGL-1, описанное в данной заявке, не ингибирует связывание PSGL-1 с белком, отличающимся от VISTA, таким как Р-селектин, L-селектин и/или Е-селектин.

Термин "иммунный инфильтрат" или "иммунные клетки опухоли" относится к клеткам, которые инфильтруют микроокружение опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, лимфоциты (например, Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки), дендритные клетки, тучные клетки и макрофаги.

Использованный в данном описании термин "в комбинации" в контексте введения других терапевтических средств относится к применению более чем одной терапии (например, применению антитела к PSGL-1 и антитела к VISTA). Использование термина "в комбинации" не ограничивает порядок, в котором терапевтические средства вводят субъекту, или время их введения (например, одну терапию применяют до, одновременно с или после другой терапии). Первое терапевтическое средство можно вводить до введения (например, за 1 минуту, 45 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно с введением или после введения (например, через 1 минуту, 45 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) второго терапевтического средства субъекту, который имел, имеет VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние либо восприимчив к нему. Любое дополнительное терапевтическое средство можно вводить с другими дополнительными терапевтическими средствами (например, антителом к PSGL-1 и антителом к VISTA) в любом порядке или в любой момент времени. В некоторых воплощениях антитела можно вводить в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим средством (например, с терапевтическими средствами, не являющимися антителами, которые в настоящее время вводят для предупреждения, лечения, сдерживания развития и/или ослабления VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния). Неограничивающие примеры терапевтических средств, которые можно вводить в комбинации с антителом, включают следующее: антагонист коингибирующей молекулы, агонист костимулирующей молекулы, химиотерапевтический агент, облучение, аналгезирующие агенты, анестетики, антибиотики или иммуномодулирующие агенты либо любой другой агент, приведенный в Фармакопее США и/или Настольном справочнике врача.

"Выделенное" антитело по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеточного или тканевого источника и/или других загрязняющих компонентов, из которых антитело получено, или по существу не содержит химических предшественников или других химических реагентов, использованных в ходе химического синтеза. Выражение "по существу не содержит клеточного материала" включает в себя препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов тех клеток, из которых его выделяют или получают рекомбинантным методом. Таким образом, антитело, которое по существу не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее чем примерно 30%, 20%, 10% или 5% (по массе сухого вещества) гетерологичного белка (также обозначаемого в данном описании как "загрязняющий белок"). В некоторых воплощениях, когда антитело получают рекомбинантным методом, оно по существу не содержит культуральной среды, например, культуральная среда составляет менее чем примерно 20%, 10% или 5% от объема белкового препарата. В некоторых воплощениях, когда антитело получают путем химического синтеза, оно по существу не содержит химических предшественников или других химических реагентов, например, оно отделено от химических предшественников или других химических реагентов, вовлеченных в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее чем примерно 30%, 20%, 10%, 5% (по массе сухого вещества) химических предшественников или соединений, отличающихся от представляющего интерес антитела. Загрязняющие компоненты также могут включать, но не ограничиваются этим, материалы, которые будут мешать терапевтическим применениям антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. В некоторых воплощениях антитело будет очищено (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено методом Лоури (Lowry et al., J. Bio. Chem., 193: 265-275, 1951), например, до 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков на N-конце или внутри аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенного состояния по данным SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело, находящееся in situ внутри рекомбинантных клеток после того, как по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, при получении выделенного антитела будет использована по меньшей мере одна стадия очистки. В конкретном воплощении, антитела, предложенные в данной заявке, являются выделенными.

Молекула "выделенной" нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, отделенную от молекул других нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике молекул нуклеиновой кислоты. Кроме того, молекула "выделенной" нуклеиновой кислоты, как например, молекула кДНК, по существу может не содержать другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными методами, либо может по существу не содержать химических предшественников или других химических реагентов в случае химического синтеза. В некоторых воплощениях молекула(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующая(ие) антитело, предложенное в данной заявке, являет(ют)ся выделенной(ыми) или очищенной(ыми).

Термин "легкая цепь", при использовании применительно к антителу, относится к полипептидной цепи размером примерно 25 кДа, где амино-концевая часть включает вариабельную область, состоящую из от примерно 100 до примерно 110 или более аминокислот, а карбокси-концевая часть включает константную область. Приблизительная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. На основании аминокислотной последовательности константных доменов существуют два различных типа цепей, называемых каппа (к) или лямбда (А). Аминокислотные последовательности легких цепей хорошо известны в данной области техники. Легкая цепь может представлять собой легкую цепь иммуноглобулина человека.

Использованные в данном описании термины "сдерживать развитие", "осуществление сдерживания развития" и "сдерживание развития" относятся к благоприятным эффектам, получаемым субъектом от терапии (например, в результате применения профилактического или терапевтического агента), которая не приводит к излечиванию заболевания. В некоторых воплощениях субъекту назначают одну или более чем одну терапию (например, вводят профилактические или терапевтические агенты, такие как антитело, предложенное в данной заявке) для "сдерживания развития" VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе одного или более чем одного его симптома, с тем, чтобы предотвратить прогрессирование или обострение данного заболевания, расстройства или состояния.

Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции гомогенных или по существу гомогенных антител, т.е. антитела, образующие эту популяцию, в значительно степени идентичны друг другу, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Другими словами, моноклональное антитело представляет собой гомогенное антитело, которое возникает в результате роста клона одной клетки (например, гибридомы, эукариотической клетки хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей данное гомогенное антитело, прокариотической клетки хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей данное гомогенное антитело и т.д.) и обычно характеризуется наличием тяжелых цепей одного и только одного класса и подкласса и легких цепей только одного типа. Такие антитела обладают высокой специфичностью и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. В некоторых воплощениях термин "моноклональное антитело", использованный в данном описании, означает антитело, продуцируемое одной гибридомой или другой клеткой, при этом антитело связывается только с эпитопом VISTA, как определено, например, с использованием ELISA или другого анализа связывания с антигеном или конкурентного связывания, известного в данной области техники. Термин "моноклональное" не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела, предложенные в данной заявке, могут быть получены гибридомным методом, как описано в Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены с использованием методов выделения из фаговых библиотек. Другие методы получения клональных клеточных линий и экспрессируемых ими моноклональных антител хорошо известны в данной области техники (см., например, главу 11 в Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York). Другие типичные способы получения других моноклональных антител приведены в данном описании в разделе Примеры.

Термин "природный", когда он используется применительно к таким биологическим материалам, как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, клетки хозяина и тому подобное, относится к тем, которые встречаются в природе, а не получены в результате деятельности людей.

Термин "фармацевтически приемлемый", использованный в данном описании, означает "одобренный к применению регулирующим агентством федерального или государственного управления" или перечисленный в Фармакопее США, Европейской Фармакопее или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных и, более конкретно, на людях.

Термин "поликлональные антитела", использованный в данном описании, относится к популяции антител, образованных в результате иммунного ответа на белок, имеющий много эпитопов, и поэтому включающий в себя множество разных антител, направленных на одинаковые и на разные эпитопы данного белка. Методы получения поликлональных антител известны в данной области техники (см., например, главу 11 в Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York).

Использованный в данном описании термин "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты" и другие подобные термины применяются взаимозаменяемо и включают в себя ДНК, РНК, мРНК и тому подобное.

Использованные в данном описании термины "предупреждают", "предупреждающий" и "предупреждение" относятся к полному или частичному ингибированию развития, рецидива, начала или распространения VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома в результате введения терапевтического средства или комбинации терапевтических средств, предложенных в данной заявке (например, комбинации профилактических или терапевтических агентов, таких как антитело, предложенное в данной заявке).

Использованный в данном описании термин "профилактический агент" относится к любому агенту, который может полностью или частично ингибировать развитие, рецидив, начало или распространение VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома у субъекта. В некоторых воплощениях термин "профилактический агент" относится к антителу к PSGL-1, предложенному в данной заявке. В некоторых других воплощениях термин "профилактический агент" относится к агенту, отличающемуся от антитела к PSGL-1, предложенного в данной заявке. В некоторых воплощениях профилактическим агентом является агент, который, как известно, полезен или использовался либо используется в настоящее время для предупреждения VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома или препятствует началу, развитию, прогрессированию и/или способствует ослаблению тяжести VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома. В некоторых воплощениях профилактическим агентом является гуманизированное антитело к PSGL-1, как например, гуманизированное моноклональное антитело к PSGL-1.

Термин "гликопротеиновый лиганд 1 Р-селектина" (также известный как PSGL-1, PSGL1, лиганд селектина Р, SELPLG, CLA и CD162) относится к полипептиду ("полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо), кодируемому геном SELPLG, например, содержащему аминокислотную последовательность:

и родственным полипептидам, включая их SNP-варианты. PSLG-1 представляет собой муциноподобный гликопротеиновый лиганд человека, который, как известно, связывается с тремя селектинами (Р-селектином, Е-селектином и L-селектином), но с Р-селектином он связывается с самой высокой аффинностью (McEver ef al., J. Clin. Invest, 100(3): 485-492 (1997) и Carlow et al., Immunological Reviews, 230: 75-96 (2009)). PSGL-1 представляет собой соединенный дисульфидными связями гомодимер из двух субъединиц по 120 кДа, который экспрессируется на поверхности моноцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и в некоторых CD34⁺ стволовых клетках. Известно, что как таковой, этот белок играет роль в переносе лейкоцитов во время воспаления путем прикрепления лейкоцитов к активированным тромбоцитам или клеткам эндотелия, экспрессирующим селектины. Обычно PSGL-1 имеет две посттрансляционные модификации: сульфатирование тирозина и присоединение тетрасахарида сиалил-Льюис X (sLex) к его О-связанным гликанам, чтобы связывание с ним протекало с высокой аффинностью. Аберрантная экспрессия гена SELPLG и полиморфизмы в этом гене ассоциированы с нарушениями врожденных и адаптивных иммунных ответов.

Как будет очевидно специалистам в данной области техники, антитело к PSGL-1, предложенное в данной заявке, может связываться с полипептидом, фрагментом полипептида, антигеном и/или эпитопом PSGL-1, поскольку эпитоп представляет собой часть более длинного антигена, например, представляющего собой часть более длинного фрагмента полипептида, который, в свою очередь, например, представляет собой часть более длинного полипептида. PSGL-1 может находиться в нативной или денатурированной форме. Полипептиды PSGL-1, описанные в данной заявке, могут быть выделены из различных источников, например, из человеческих тканей разных типов или из другого источника, либо получены рекомбинантными методами или методами синтеза. "Полипептид PSGL-1 с нативной последовательностью" представляет собой полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид PSGL-1 природного происхождения. Такие полипептиды PSGL-1 с нативной последовательностью могут быть выделены из природных источников или могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. Термин "полипептид PSGL-1 с нативной последовательностью", в частности, охватывает природные укороченные или секретируемые формы конкретного полипептида PSGL-1 (например, последовательность внеклеточного домена), формы природных вариантов (например, формы, образовавшиеся в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты данного полипептида.

Нуклеиновокислотная последовательность кДНК, кодирующей полипептид PSGL-1, например, содержит:

Ортологи полипептида PSGL-1 человека также хорошо известны в данной области техники. Например, ортологи PSGL-1 можно найти среди таких организмов, как мышь (Mus musculus), крыса (Rattus norvegicus), собака (Canis lupus familiaris), корова (Bos taurus), данио (Danio rerio), лошадь (Equus caballus), шимпанзе (Pan troglodytes) и так далее.

Термины "PSGL-1-опосредуемое заболевание", "PSGL-1-опосредуемое расстройство" и "PSGL-1-опосредуемое состояние" используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, расстройству или состоянию, которое полностью или частично вызывается или которое является результатом присутствия PSGL-1. Такие заболевания, расстройства или состояния включают таковые, которые вызваны или иным образом ассоциированы PSGL-1, в том числе вызваны PSGL-1-экспрессирующими клетками или ассоциированы с ними (например, опухолевыми клетками, миелоидными супрессорными клетками (MDSC), обладающими супрессивным действием дендритными клетками (обладающими супрессивным действием DC) и/или регуляторными Т-клетками (T_reg)). В некоторых воплощениях PSGL-1 аберрантно (например, в высокой степени) экспрессирован на поверхности клетки. В некоторых воплощениях PSGL-1 может быть аберрантно активирован на клетках конкретного типа. В других воплощениях нормальная, аберрантная или избыточная передача сигнала в клетках обусловлена связыванием PSGL-1 с лигандом PSGL-1 (например, VISTA), который может связываться или иным образом взаимодействовать с PSGL-1. В предпочтительном воплощении PSGL-1-опосредуемое заболевание вызвано связыванием PSGL-1 с конкретным лигандом PSGL-1 (например, VISTA), но не с другими лигандами (например, селектинами).

Термин "облучение", при использовании в терапевтическом контексте, относится к типу лечения, при котором используют луч интенсивной энергии для уничтожения клеток-мишеней (например, раковых клеток). Лучевая терапия заключается в использовании рентгеновских лучей, протонов или других форм энергии, передачу которых осуществляют посредством внешнего пучка. Лучевая терапия также включает лучевую терапию, при которой источник излучения помещен в тело пациента (например, брахитерапию), при этом небольшой контейнер с радиоактивным материалом имплантируют непосредственно внутрь или вблизи опухоли.

Термин "относительный уровень экспрессии" относится к количественному определению уровня экспрессии белка в заданном образце относительно другого референсного белка в том же образце и/или относительно другого образца сравнения. В контексте описанных в данной заявке способов уровень экспрессии PSGL-1 может быть выражен в абсолютных числах, например, с учетом стандартной кривой, или может быть выражен в относительных уровнях экспрессии по сравнению с одним или несколькими другими белками, которые подлежат анализу в данном образце (например, VISTA, CD11b, CD33, CD4 или CD8).

Термин "рекомбинантное антитело", относится к антителу, которое получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных методов. Рекомбинантными антителами могут быть антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, которым трансфицирована клетка хозяина, антитела, выделенные из комбинаторных библиотек рекомбинантных антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным для генов иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с использованием любого другого метода, который включает сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела могут иметь вариабельную и константную области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека (см. Kabat Е. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication, №91-3242). Однако, в некоторых воплощениях такие рекомбинантные антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, в случае использования животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи происходящими из последовательностей и родственными последовательностям VH и VL из антител зародышевой линии человека, не могут естественным образом существовать в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Использованный в данном описании термин "побочные эффекты" охватывает нежелательные и неблагоприятные эффекты терапии (например, профилактического или терапевтического агента). Нежелательные эффекты необязательно являются неблагоприятными. Неблагоприятный эффект терапии (например, профилактического или терапевтического агента) может быть вредным или вызывающим неприятные ощущения либо может быть связан с риском. Примеры побочных эффектов включают, диарею, кашель, гастроэнтерит, стерторозное дыхание, тошноту, рвоту, анорексию, спазмы в животе, лихорадку, боль, снижение массы тела, гипогидратацию, алопецию, одышку, бессонницу, головокружение, воспаление слизистой оболочки, нервные и мышечные эффекты, усталость, сухость полости рта и снижение аппетита, высыпания или отеки в месте введения, симптомы гриппа, такие как лихорадочное состояние, озноб и утомляемость, проблемы с пищеварительным трактом и аллергические реакции. Дополнительные нежелательные эффекты, испытываемые пациентами, многочисленны и известны в данной области техники. Многие из них описаны в Настольном справочнике врача (67-ое изд., 2013).

Используемые в данном описании термины "субъект" и "пациент" применяются взаимозаменяемо. Как использовано в данном описании в некоторых воплощениях, субъект представляет собой млекопитающее, такое как не являющееся приматом млекопитающее (например, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.) или примат (например, обезьяна и человек). В некоторых воплощениях субъектом является человек. В некоторых воплощениях субъектом является млекопитающее (например, человек), имеющее VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние и/или связанный с ним симптом. В другом воплощении субъектом является млекопитающее (например, человек) с риском развития VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома.

Использованное в данном описании выражение "по существу все" означает по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99% или примерно 100%.

Использованный в данном описании термин "терапевтический агент" относится к любому агенту, который можно использовать для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, расстройства или состояния, в том числе для лечения, предупреждения или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома. В некоторых воплощениях термин "терапевтический агент" относится к антителу к PSGL-1, предложенному в данной заявке. В некоторых воплощениях термин "терапевтический агент" относится к агенту, отличающемуся от антитела к PSGL-1, предложенного в данной заявке. В некоторых воплощениях терапевтическим агентом является агент, который, как известно, полезен или использовался либо используется в настоящее время для лечения, предупреждения или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства, состояния или связанного с ним симптома.

Эффект от комбинации терапевтических средств (например, применения терапевтических агентов) может быть большим, чем аддитивные эффекты любых двух или большего числа монотерапий. Например, синергический эффект комбинации терапевтических агентов позволяет применять более низкие дозировки одного или более агентов и/или использовать менее частое введение данных агентов субъекту с VISTA-опосредуемым заболеванием, расстройством или состоянием и/или связанным с ним симптомом. Возможность использования более низких дозировок при лечении терапевтическими средствами и/или менее частого введения терапевтических средств снижает токсичность, связанную с введением терапевтических средств субъекту без уменьшения эффективности данных терапий в отношении предупреждения, лечения или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома. Помимо этого, синергический эффект может приводить к улучшению эффективности терапий в отношении предупреждения, лечения или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома. И наконец, синергический эффект комбинации терапевтических средств (например, терапевтических агентов) может предотвращать или уменьшать неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, связанные с применение любой монотерапии.

Термин "терапевтически эффективное количество", использованный в данном описании, относится к количеству терапевтического агента (например, антитела к PSGL или любого другого терапевтического агента, в том числе описанного в данной заявке, включая, например, антитело к VISTA), которого достаточно для снижения и/или ослабления тяжести и/или продолжительности определенного заболевания, расстройства или состояния и/или связанного с ним симптома. Терапевтически эффективное количество терапевтического агента может представлять собой количество, необходимое для снижения или ослабления развития или прогрессирования определенного заболевания, расстройства или состояния, снижения или уменьшения вероятности рецидива, развития начала определенного заболевания, расстройства или состояния и/или улучшения или усиления профилактического или терапевтического эффекта другой терапии (например, терапии, отличающейся от применения антитела к PSGL, в том числе описанного в данной заявке).

Использованный в данном описании термин "терапия" относится к любому протоколу, способу и/или агенту, который можно использовать для предупреждения, сдерживания развития, лечения и/или ослабления VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния. В некоторых воплощениях термины "терапии" и "терапия" относятся к терапии биологическими средствами, поддерживающей терапии и/или другим терапиям, полезным для лечения, предупреждения и/или ослабления VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, известного специалисту в данной области техники, такому как представитель медицинского персонала.

Использованные в данном описании термины "лечить", "лечение" и "подвергание лечению" относятся к снижению и/или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния в результате применения одной или более чем одной терапии (включая, но не ограничиваясь этим, введение одного или более терапевтических агентов, таких как антитело к PSGL-1, в том числе описанное в данной заявке). В некоторых воплощениях такие термины относятся к ослаблению или ингибированию рака (например, гематологической злокачественной опухоли). В некоторых воплощениях такие термины относятся к снижению и/или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности заболевания, расстройства или состояния, которое восприимчиво к иммунному модулированию, такому как модулирование, возникающее в результате усиления активации Т-клеток.

Термин "микроокружение опухоли" относится к клеточной среде, в которой находится опухоль. Микроокружение опухоли может включать в себя окружающие кровеносные сосуды, иммунные клетки, фибробласты, происходящие из костного мозга воспалительные клетки, лимфоциты, сигнальные молекулы и внеклеточный матрикс.

Термин "вариабельный домен" или "вариабельная область" относится к части легкой или тяжелой цепей антитела, которая обычно локализована в амино-концевой части легкой или тяжелой цепи, имеет длину примерно 120-130 аминокислот в тяжелой цепи и примерно 100-110 аминокислот в легкой цепи, используется для связывания каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном и определяет специфичность каждого конкретного антитела к его конкретному антигену. Вариабельные домены сильно различаются по последовательности среди разных антител. Вариабельность в последовательности сконцентрирована в CDR, в то время как менее вариабельные части в вариабельном домене называются каркасными областями (FR). Каждая вариабельная область содержит три CDR, которые соединены с четырьмя FR. CDR легкой и тяжелой цепей в первую очередь отвечают за взаимодействие антитела с антигеном. Хотя FR непосредственно не участвует в связывании с антигеном, она определяет укладку молекул и, таким образом, количество CDR, которые представлены на поверхности вариабельной области для взаимодействия с антигеном. В некоторых воплощениях вариабельная область представляет собой вариабельную область иммуноглобулина человека.

Термин "нумерация остатков в вариабельном домене по Kabat" или "нумерация аминокислотных положений по Kabat" и его варианты относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при обобщении данных по антителам в работе Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или содержать дополнительные аминокислоты в соответствии с укорачиванием FR или CDR вариабельного домена либо вставкой в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52а по Kabat) после остатка 52 в Н2 и встроенные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. по Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела посредством выравнивания участков гомологии последовательности антитела со "стандартной" последовательностью, пронумерованной по Kabat. Систему нумерации по Kabat, как правило, используют при ссылке на остаток в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al. Sequences of Immunological Interest. 5th Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Систему нумерации EU" или "EU-индекс", как правило, используют при ссылке на остаток в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, EU-индекс, приведенный в работе Kabat и др., выше). Термин "EU-индекс по Kabat" относится к нумерации остатков антитела EU, представляющего собой lgG1 человека. Если в данном описании не указано иное, то ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков согласно системе нумерации по Kabat. Описаны и другие системы нумерации, в том числе, например, согласно базе данных AbM, Chothia, методу "контакта" и IMGT.

Термин "вариант", когда он используется в отношении PSGL-1, VISTA или антитела к PSGL-1 либо антитела к VISTA, относится к пептиду или полипептиду, содержащему одну или более (например, от примерно 1 до примерно 25, от примерно 1 до примерно 20, от примерно 1 до примерно 15, от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 1 до примерно 5) замен, делеций и/или вставок в аминокислотной последовательности по сравнению с нативной или немодифицированной последовательностью. Например, вариант PSGL-1 или VISTA может получаться в результате одного или более (например, от примерно 1 до примерно 25, от примерно 1 до примерно 20, от примерно 1 до примерно 15, от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 1 до примерно 5) изменений в аминокислотной последовательности нативного PSGL-1 или VISTA, соответственно. Также в качестве примера, вариант антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA может получаться в результате одного или более (например, от примерно 1 до примерно 25, от примерно 1 до примерно 20, от примерно 1 до примерно 15, от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 1 до примерно 5) изменений в аминокислотной последовательности нативного или ранее не модифицированного антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA. Варианты могут иметь природное происхождение, как например аллельные или сплайс-варианты, или могут быть сконструированы искусственно. Полипептидные варианты могут быть получены на основе соответствующих молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих данные варианты. В некоторых воплощениях вариант PSGL-1, вариант VISTA или вариант антитела к PSGL-1 либо антитела к VISTA по меньшей мере сохраняет функциональную активность PSGL-1, VISTA, антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA, соответственно. В некоторых воплощениях вариант антитела к PSGL-1 связывается с PSGL-1 и/или проявляет антагонистическую активность в отношении PSGL-1. В некоторых воплощениях вариант антитела к VISTA связывается с VISTA и/или проявляет антагонистическую активность в отношении VISTA. В некоторых воплощениях данный вариант кодируется вариантом молекулы нуклеиновой кислоты с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP), которая кодирует PSGL-1, VISTA, VH-или VL-области либо подобласти антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA.

Термин "вектор" относится к веществу, которое используют для введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Пригодные для использования векторы включают, например, экспрессирующие векторы, плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы, эписомы и искусственные хромосомы, которые могут включать в себя последовательности для отбора или селективные маркеры, пригодные для стабильной интеграции в хромосому клетки хозяина. Кроме того, такие векторы могут включать в себя один или более генов селектируемого маркера и соответствующие контролирующие экспрессию последовательности. Гены селектируемых маркеров, которые могут быть введены, обеспечивают, например, устойчивость к антибиотикам или токсинам, ауксотрофный дефицит комплемента или снабжение важнейшими питательными веществами, отсутствующими в культуральных средах. Контролирующие экспрессию последовательности могут включать конститутивный и индуцибельный промоторы, энхансеры транскрипции, терминаторы транскрипции и тому подобное, которые хорошо известны в данной области техники. Когда две или более молекул нуклеиновой кислоты должны экспрессироваться совместно (например, для обеих тяжелой и легкой цепей антитела), обе молекулы нуклеиновой кислоты могут быть встроены, например, в один экспрессирующий вектор или в отдельные экспрессирующие векторы. В случае одного экспрессирующего вектора, кодирующие нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с одной общей контролирующей экспрессию последовательностью или могут быть связаны с разными контролирующими экспрессию последовательностями, такими как один индуцибельный промотор и один конститутивный промотор. Введение молекул нуклеиновой кислоты в клетку хозяина может быть подтверждено с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Такие методы включают, например, анализ нуклеиновых кислот, такой как нозерн-блоттинг, или амплификация мРНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), или иммуноблоттинг для анализа экспрессии генных продуктов, или другие подходящие аналитические методы тестирования экспрессии введенной нуклеиновокислотной последовательности или соответствующего ей генного продукта. Специалистам в данной области техники понятно, что молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется в количестве, достаточном для получения желаемого продукта (например, антитела к PSGL-1, предложенного в данной заявке), и также понятно, что уровни экспрессии можно оптимизировать для получения достаточной экспрессии, используя методы, хорошо известные в данной области техники.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

При практическом применении данного изобретения используются, если не указано иное, традиционные методы молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, синтеза и модификации олигонуклеотидов, гибридизации нуклеиновых кислот и методы смежных областей, находящиеся в пределах компетентности специалиста в данной области техники. Эти методы описаны в ссылках, цитированных в данном описании, и полностью раскрыты в литературе. См, например, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные откорректированные издания); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные откорректированные издания); Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

PSGL-1 ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ РЕЦЕПТОР ДЛЯ VISTA

В процессе канцерогенеза опухолевые клетки взаимодействуют со сложным микроокружением, в составе которого находятся внеклеточный матрикс и клетки хозяина неопухолевой природы, в том числе мезенхимальные клетки, эндотелиальные клетки сосудов и воспалительные или иммунные клетки. Микроокружение играет важнейшую роль в подавлении опухолеспецифических Т-клеточных ответов. Чтобы гарантировать отсутствие постоянной активации иммунного воспалительного ответа после того, как опухолевые антигены стимулировали ответ, существует или активируется множество контрольных точек. Эти контрольные точки представлены в основном Т-клеточным рецептором, связывающимся с лигандами на клетках в окружающей опухоль микросреде с образованием иммунологических синапсов, которые затем регулируют функционирование Т-клетки.

VISTA представляет собой одну из таких иммунных контрольных точек. Экспрессия этого белка ограничена гемопоэтическими клетками, и во многих моделях рака он был обнаружен только на лейкоцитах, инфильтрирующих опухоль, но не на опухолевых клетках. VISTA отрицательно регулирует Т-клеточный иммунитет посредством прямого воздействия на Т-клетки, вовлекая различные рецепторы/лиганды, поскольку, являясь уникальным среди белков - иммунных контрольных точек, он действует и как лиганд, и как рецептор (Le Mercier, выше).

Теперь авторы настоящего изобретения идентифицировали, что PSGL-1 является связывающим партнером (например, лигандом или рецептором) белка VISTA. PSGL-1 представляет собой гомодимерный трансмембранный гликопротеин массой 120 кДа, несущий О- и N-присоединенные гликаны, наиболее известная роль которых заключается в переносе иммунных клеток посредством связывания с селектинами. PSGL-1 экспрессируется в клетках лимфоидной, миелоидной и дендритной линий (Laszik et al., Blood, 88(8): 3010-21 (1996)). Наивные Т-клетки экспрессируют не связывающуюся с селектинами форму PSGL-1, которая может взаимодействовать с потенциально другими неизвестными в настоящее время связывающими партнерами (Veerman et al, Nat. Immunol., 8(5), 532-539 (2007)). Также наблюдали экспрессию в опухолевых клетках. Недавно продемонстрировано, что PSGL-1 стимулирует истощение Т-клеток, способствуя тем самым росту меланомной опухоли посредством индукции неизвестного партнера (Tinoco et al., Immunity, 44: 1190-03 (2016)).

Авторы изобретения продемонстрировали прямое связывание между этими двумя белками и показали, что PSGL-1 и VISTA действуют совместно в предотвращении активации Т-клеток. Действительно, физическое взаимодействие между VISTA и PSGL-1 лежит в основе функционального взаимодействия, поскольку оба гена совместно экспрессируются в ряде опухолей. Ни один из других предполагаемых рецепторов VISTA не обнаруживает такой совместной локализации, что подчеркивает специфичность такой взаимосвязи. Кроме того, VISTA и PSGL-1 экспрессируются в микроокружении опухолевых клеток. Более конкретно, гибридизация in situ выявила, что оба гена экспрессируются в соседних клетках в микроокружении опухоли. В иммунных инфильтратах каждая PSGL-1-экспрессирующая клетка располагается вблизи VISTA-экспрессирующей клетки, и это указывает на то, что PSGL-1 является надежным заменителем активированного VISTA.

ДИАГНОСТИКА VISTA-ОПОСРЕДУЕМЫХ РАССТРОЙСТВ

Приведенные выше данные указывают на то, что PSGL-1 представляет собой достоверный биомаркер для диагностирования VISTA-опосредуемого расстройства, такого как VISTA-опосредуемый рак. Таким образом, для диагностических задач с целью обнаружения, диагностирования или мониторирования VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния могут быть использованы такие реагенты, как меченые нуклеиновокислотные зонды или антитела, предложенные в данной заявке, которые связываются с PSGL-1 нуклеиновой кислотой или белком PSGL-1.

Таким образом, согласно первому аспекту изобретение относится к способу обнаружения in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта, причем указанный способ включает стадии:

а) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным связываться с белком PSGL-1 или PSGL-1 нуклеиновой кислотой; и

b) обнаружение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом.

Согласно способу по настоящему изобретению факт связывания с PSGL-1 показывает наличие VISTA-опосредуемого рака. Предпочтительно, факт связывания с PSGL-1 в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли показывает наличие VISTA-опосредуемого рака.

Реагентом, способным связываться с белком или нуклеиновой кислотой PSGL-1, может быть любой реагент или любое соединение, известный(ое) специалистам в данной области техники, который(ое) обладает способностью специфично связываться с PSGL-1. Например, специалисту сразу будет понятно, что ДНК- или РНК-зонд, который специфично гибридизуется с PSGL-1, специфично связывается с PSGL-1. Аналогичным образом, специалисту сразу будет понятно, что антитело к PSGL-1, как например, антитело, описанное в данной заявке, специфично связывается с PSGL-1.

Изобретение также относится к способу обнаружения in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта, причем указанный способ включает стадии:

a) приведения в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным связываться с белком PSGL-1 или нуклеиновой кислотой PSGL-1; и

b) количественного определения связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом.

Согласно способу по настоящему изобретению факт связывания с PSGL-1 показывает наличие VISTA-опосредуемого рака. Предпочтительно, факт связывания с PSGL-1 в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли показывает наличие VISTA-опосредуемого рака.

Как будет очевидно специалисту в данной области, уровень реагента, связывающегося с PSGL-1, можно определить количественно любым известным специалистам в данной области техники способом, что подробно описано далее. Предпочтительные способы включают применение иммуноферментных анализов, таких как ELISA или метод иммуноферментных пятен (ELISPOT), иммунофлуоресценции, иммуногистохимии (IHC), радиоиммуноанализа (RIA) или FACS.

Результат количественного определения на стадии b) способа по настоящему изобретению представляет собой прямое отражение уровня экспрессии PSGL-1 в образце, в первую очередь в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли. Таким образом, способ по настоящему изобретению предоставляет возможность идентификации VISTA-опосредуемого рака путем определения уровня экспрессии PSGL-1, как описано выше. В предпочтительном воплощении уровень экспрессии PSGL-1 в указанном образце, в первую очередь в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли, сравнивают с референсным уровнем.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу обнаружения in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта, причем указанный способ включает стадии:

a) определения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта; и

b) сравнения уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем;

при этом повышение анализируемого уровня PSGL-1 на стадии а) по сравнению с референсным уровнем показывает наличие VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Изобретение также относится к способу диагностики in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта, причем указанный способ включает стадии:

a) определения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта; и

b) сравнения уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем;

при этом повышение анализируемого уровня PSGL-1 на стадии (b) по сравнению с референсным уровнем показывает наличие VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Уровень экспрессии PSGL-1 предпочтительно сравнивают или измеряют относительно уровней в контрольной клетке или контрольном образце, также называемых как "референсный уровень" или "референсный уровень экспрессии". Термины "референсный уровень", "референсный уровень экспрессии", "контрольный уровень" и "контроль" используются в данном описании взаимозаменяемо. "Контрольный уровень" означает отдельный исходный уровень, измеренный в сопоставимой контрольной клетке, которая, как правило, не поражена болезнью или раком. Указанная контрольная клетка может быть получена от одного и того же индивида, поскольку, даже у ракового пациента ткань, которая является местом развития опухоли, все еще содержит не пораженную опухолью здоровую ткань. Она также может происходить от другого индивида, состояние которого находится в норме или который не имеет того же заболевания, что и заболевание у индивида, от которого получали пораженный болезнью или исследуемый образец. В контексте настоящего изобретения термин "референсный уровень" относится к "контрольному уровню" экспрессии PSGL-1, используемому для оценки тестируемого уровня экспрессии PSGL-1 в содержащем раковые клетки образце от пациента. Например, если уровень PSGL-1 в биологическом образце от пациента выше референсного уровня PSGL-1, то такие клетки будут считаться имеющими высокий уровень экспрессии или демонстрирующими сверхэкспрессию PSGL-1. Референсный уровень может быть определен множеством методов. Поэтому уровни экспрессии могут определяться клетками, несущими PSGL-1, или, альтернативно, уровень экспрессии PSGL-1 не зависит от количества клеток, экспрессирующих PSGL-1. Таким образом, референсный уровень для каждого пациента может быть предписан референсным соотношением для PSGL-1, при этом такое референсное соотношение может быть определено любым из методов определения референсных уровней, изложенных в данном описании.

Например, контроль может представлять собой заранее определенное значение, которое может принимать различные формы. Это может быть единичное значение отсечения, такое как медиана или среднее значение. "Референсный уровень" может быть выражен одним числом, равно применимым к каждому пациенту индивидуально, или референсный уровень может варьировать в зависимости от конкретных субпопуляций пациентов. Таким образом, например, у пожилых мужчин может быть другой референсный уровень, чем у более молодых мужчин, для одного и того же рака, а у женщин может быть другой референсный уровень по сравнению с мужчинами для того же рака. Альтернативно, "референсный уровень" может быть определен путем измерения уровня экспрессии PSGL-1 в неонкогенных раковых клетках из той же ткани, что и ткань злокачественных опухолевых клеток, подлежащих тестированию. В такой же мере, "референсный уровень" может представлять собой определенное соотношение между уровнями PSGL-1 в злокачественных опухолевых клетках пациента и PSGL-1 в неопухолевых клетках от того же пациента. Кроме того, "референсным уровнем" может быть уровень PSGL-1 в клетках, культивируемых in vitro, которым можно манипулировать для имитации опухолевых клеток или можно манипулировать любым другим способом, который дает уровни экспрессии, точно определяющие референсный уровень. С другой стороны, "референсный уровень" может быть установлен с учетом используемых для сравнения групп, таких как группы, не имеющие повышенных уровней PSGL-1, и группы, имеющие повышенные уровни PSGL-1. Другим примером используемых для сравнения групп будут группы, имеющие конкретное заболевание, состояние или симптомы, и группы без такого заболевания. Заранее заданное значение может быть классифицировано, например, таким образом: тестируемую популяцию делят поровну (или неравномерно) на такие группы, как группа с низким риском, группа со средним риском и группа с высоким риском.

Референсный уровень также можно определить путем сравнения уровня PSGL-1 в популяциях пациентов, имеющих один и тот же тип рака. Это может быть осуществлено, например, путем анализа гистограммы, на которой вся когорта пациентов представлена графически, при этом первая ось представляет собой уровень PSGL-1, а вторая ось представляет собой количество пациентов в когорте, опухолевые клетки которых экспрессируют PSGL-1 с заданным уровнем. Путем идентификации подмножеств популяций этой когорты, которые имеют одинаковые или схожие уровни PSGL-1, можно выявить две или более отдельных групп пациентов. Затем определение референсного уровня может быть проведено с учетом уровня, наилучшим образом показывающего различие для этих отдельных групп. Референсный уровень также может представлять уровни двух или более маркеров, одним из которых является PSGL-1. Два или более маркеров могут быть представлены, например, соотношением значений для уровней каждого маркера.

Аналогичным образом, очевидно, что здоровая популяция будет иметь другой "нормальный" диапазон по сравнению с диапазоном популяции, которая, как известно, имеет состояние, ассоциированное с экспрессией PSGL-1. Соответственно, в выбранном заранее заданном значении может быть учтена категория, в которую попадает индивидуум. Для выбора соответствующих диапазонов и категорий специалистам средней квалификации в данной области техники может быть достаточно обычного экспериментирования. Под "повышенным" или "более высоким" подразумевается "высокий относительно выбранного контроля". Обычно контрольный уровень будет определен для практически здоровых нормальных индивидов соответствующей возрастной категории.

Также будет понятно, что контроли согласно изобретению могут представлять собой, в дополнение к заранее заданным значениям, образцы материалов, тестируемых параллельно с экспериментальными материалами. Примеры включают ткань или клетки, полученные в одно и то же время от одного и того же субъекта, например, части одного биоптата или части одного образца клеток от этого субъекта.

Предпочтительно, референсный уровень PSGL-1 представляет собой уровень экспрессии PSGL-1 в образцах нормальной ткани (например, от пациента, не имеющего VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, либо от того же пациента до начала заболевания).

В некоторых воплощениях экспрессия заданного белка указывает на присутствие в образце клетки определенного типа. Например, экспрессия PSGL-1, CD4 и/или CD8 клетками в образце может указывать на присутствие Т-клеток в данном образце. Аналогичным образом, экспрессия VISTA, по отдельности или в комбинации с CD11b или CD33 клетками в образце, может указывать на присутствие VISTA-несущих опухолевых клеток, регуляторных Т-клеток (например, CD4⁺Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток), миелоидных супрессорных клеток (например, CD11b⁺ или CD11 b^high и/или CD33⁺ миелоидных супрессорных клеток) и/или обладающих супрессивным действием дендритных клеток (например, CD11b⁺ или CD11 b^high дендритных клеток). Предпочтительно, экспрессия VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8, в первую очередь в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли, показывает наличие VISTA-опосредуемого рака у субъекта.

Согласно этим конкретным воплощениям способ обнаружения in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта включает стадии:

a) определения уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 в биологическом образце от указанного субъекта; и

b) сравнения уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 на стадии а) с референсным уровнем;

при этом повышение анализируемого уровня PSGL-1 на стадии (b) по сравнению с референсным уровнем показывает наличие VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Изобретение также относится к способу диагностики in vitro VISTA-опосредуемого рака у субъекта, причем указанный способ включает стадии:

a) определения уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 в биологическом образце от указанного субъекта; и

b) сравнения уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 на стадии а) с референсным уровнем;

при этом повышение анализируемого уровня PSGL-1 на стадии (b) по сравнению с референсным уровнем показывает наличие VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Более точный диагноз VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния может позволить медицинским работникам раньше применить превентивные меры или агрессивное лечение, тем самым предотвращая развитие или дальнейшее прогрессирование VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАЦИЕНТОВ, ВОСПРИИМЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ АНТИ-VISTA ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

Приведенные выше данные указывают на то, что PSGL-1 является достоверным биомаркером для диагностики VISTA-опосредуемого расстройства, такого как VISTA-опосредуемый рак. Выявленные таким образом пациенты восприимчивы к действию анти-VISTA терапевтических агентов.

Согласно другому аспекту изобретение относится к способу идентификации in vitro имеющих опухоль пациентов, которые будут восприимчивы к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом. Предпочтительно, указанные пациенты экспрессируют PSGL-1, в первую очередь в иммунных инфильтратах, и экспрессия PSGL-1 указывает на то, что указанные пациенты будут восприимчивы к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом.

В первом воплощении настоящее изобретение относится к способу in vitro диагностики у пациента рака, который восприимчив к лечению VISTA-блокирующим агентом, причем указанный способ включает стадии:

a) определения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного пациента; и

b) сравнения уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем; и

с) диагностирования, что рак является восприимчивым к лечению VISTA-блокирующим агентом, на основании указанного сравнения.

В другом воплощении указанный референсный уровень представляет собой уровень экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце от второго пациента, имеющего тот же VISTA-опосредуемый рак, что и первый пациент, при этом второй пациент восприимчив к данному лечению. В предпочтительном воплощении аналогичный уровень экспрессии PSGL-1 в первом биологическом образце по сравнению с уровнем экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце указывает на то, что первый пациент будет восприимчив к лечению.

В другом воплощении стадия а) включает определение уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 в указанном биологическом образце, предпочтительно, с использованием иммунных инфильтратов. Предпочтительно, уровень экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительные уровни их экспрессии в первом биологическом образце сравнивают с уровнем экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительными уровнями их экспрессии во втором биологическом образце от второго пациента, имеющего тот же VISTA-опосредуемый рак, что и первый пациент, при этом второй пациент восприимчив к данному лечению. В предпочтительном воплощении аналогичный уровень экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительные уровни их экспрессии в первом биологическом образце по сравнению с уровнем экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11, CD33, CD4 и CD8 или относительными уровнями их экспрессии во втором биологическом образце указывает на то, что первый пациент будет восприимчив к лечению.

ИЗМЕРЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ PSGL-1

Экспрессию PSGL-1 можно измерить любыми способами, доступными специалистам в данной области техники. Так, экспрессию PSGL-1 можно оценить путем измерения уровня нуклеиновой кислоты PSGL-1 (например, мРНК или соответствующей кДНК для PSGL-1) или путем измерения уровня белка PSGL-1.

В этом случае способ по изобретению может включать одну или множество промежуточных стадий между отбором биологического образца и измерением уровня экспрессии PSGL-1, при этом указанные стадии соответствуют выделению образца мРНК (или соответствующей кДНК) или образца белка из указанного биологического образца. Получение или выделение мРНК (и ее обратная транскрипция в кДНК) или белков из клеточного образца являются просто рутинными методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники.

После получения образца мРНК (или соответствующей кДНК) или белка можно измерить уровень экспрессии PSGL-1, либо по мРНК (т.е. относительно общего содержания мРНК или кДНК, присутствующей в образце), либо по белку (т.е. относительно общего содержания белка, присутствующего в образце). В таком случае метод, используемый для этой цели, зависит от типа преобразования (мРНК, кДНК или белка) и типа доступного образца.

Когда экспрессию маркера измеряют по мРНК (или соответствующей кДНК), может быть применен любой метод, обычно используемый специалистами в данной области техники. Эти технологии для анализа уровня генной экспрессии, такие как, например, анализ транскриптомов, включают применение хорошо известных методов, таких как ПЦР (полимеразная цепная реакция, если используется ДНК), ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией, если используется РНК) или количественная ОТ-ПЦР, или массивов нуклеиновых кислот (включая массивы ДНК и массивы олигонуклеотидов) для большей производительности.

Термин "массивы нуклеиновых кислот", использованный в данном описании, относится к множеству разных нуклеиновокислотных зондов, прикрепленных к подложке, который может представлять собой микрочип, стеклянную пластинку или гранулу, имеющую размер микросферы. Микрочип может быть изготовлен из полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или материала на основе диоксида кремния, углеродного материала, металлов, неорганического стекла или нитроцеллюлозы.

Зондами могут быть нуклеиновые кислоты, такие как кДНК ("массив кДНК"), мРНК ("массив мРНК") или олигонуклеотиды ("массив олигонуклеотидов"), при этом указанные олигонуклеотиды обычно имеют подходящую длину приблизительно 25-60 нуклеотидов.

Чтобы определить профиль экспрессии конкретного гена, в нуклеиновую кислоту, соответствующую всему указанному гену или его части, вводят метку, затем помещают для контакта с массивом в условиях гибридизации, что приводит к образованию комплексов между указанной меченой нуклеиновой кислотой-мишенью и прикрепленными к поверхности чипа зондами, которые комплементарны этой нуклеиновой кислоте. Затем выполняют детектирование наличия меченых гибридизированных комплексов.

Эти технологии подходят для мониторинга уровня экспрессии одного гена, в частности, или множества генов, либо даже всех генов генома (полного генома или полного транскриптома) в биологическом образце (клетках, тканях и т.д.).

В предпочтительном воплощении профиль экспрессии определяют, используя количественную ПЦР. Метод количественной ПЦР или ПЦР в режиме реального времени является хорошо известной и легко доступной технологией для специалистов в данной области техники и не нуждается в подробном описании.

В конкретном воплощении, которое не следует рассматривать как ограничивающее объем данного изобретения, определение профиля экспрессии с использованием количественной ПЦР может быть выполнено так, как приведено ниже. Кратко, реакции ПЦР в режиме реального времени проводят, используя универсальный мастер-микс для ПЦР TaqMan® (Applied Biosystems). Добавляют 6 мкл кДНК к 9 мкл смеси для ПЦР, содержащей 7,5 мкл универсального мастер-микса для ПЦР TaqMan®, 0,75 мкл 20х смеси зонда и праймеров и 0,75 мкл воды. Данная реакция состоит из одной начальной стадии, имеющей продолжительность 2 мин при 50°С, затем 10 мин при 95°С, и 40 циклов амплификации, включающих по 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Эту реакцию и сбор данных можно выполнить, используя систему детектирования последовательностей ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems). Количество транскрибируемых с матрицы молекул в образце определяют, регистрируя цикл амплификации в экспоненциальной фазе (значение порогового цикла или С_т) в тот момент времени, когда можно обнаружить сигнал флуоресценции выше фоновой флуоресценции. Таким образом, начальное количество транскрибируемых с матрицы молекул обратно пропорционально С_т.

В другом предпочтительном воплощении профиль экспрессии определяют, применяя нуклеиновокислотный микрочип.

Настоящее изобретение также относится к микрочипу, предназначенному для реализации способов по изобретению, содержащему не больше 500, предпочтительно не больше 300, не больше 200, более предпочтительно не больше 150, не больше 100, еще более предпочтительно не больше 75, не больше 50, не больше 40, не больше 30, не больше 20, не больше 10 различных зондов, по меньшей мере 1 из которых специфично связывается с мРНК (или соответствующей кДНК) для PSGL-1 или белком PSGL-1. В предпочтительном воплощении указанным микрочипом является нуклеиновокислотный микрочип, содержащий не больше 500, предпочтительно не больше 300, не больше 200, более предпочтительно не больше 150, не больше 100, еще более предпочтительно не больше 75, не больше 50, не больше 40, не больше 30, не больше 20, не больше 10 различных зондов (таким образом, исключаются, например, пангеномные микрочипы), по меньшей мере 1 из которых специфично связывается с мРНК (или соответствующей кДНК) для PSGL-1. Указанный микрочип также может содержать по меньшей мере один зонд, который специфично гибридизуется с геном "домашнего хозяйства" помимо зонда, специфично гидридизующегося с PSGL-1. Например, геном "домашнего хозяйства" является ген бета-2-микроглобулина.

В качестве альтернативы можно использовать любую существующую или будущую технологию, подходящую для определения генной экспрессии на основе количества мРНК в образце. Например, специалисты в данной области техники могут измерить экспрессию гена путем гибридизации с меченым нуклеиновокислотным зондом, например, с помощью нозерн-блоттинга (в случае мРНК) или саузерн-блоттинга (в случае кДНК), но также с использованием таких методов как метод серийного анализа экспрессии генов (SAGE) и его варианты, такие как longSAGE, superSAGE, deepSAGE и так далее.

Кроме того, в качестве исходного материала можно использовать тканевые микрочипы (также известные как ТМА). ТМА состоят из парафиновых блоков, в которых собраны в виде массива до 1000 отдельных тканевых "цилиндров" (tissue cores), что позволяет проводить мультиплексный гистологический анализ. В методе тканевых микрочипов для извлечения тканевых "цилиндров" из представляющих интерес участков в залитых парафином тканях, таких как клинические биоптаты или образцы опухоли, используют полую иглу диаметром всего 0,6 мм. Затем эти тканевые "цилиндры" встраивают в парафиновый блок-реципиент со строго упорядоченной схемой расстановки. Из этого блока готовят срезы, используя микротом, их устанавливают на предметное стекло микроскопа и затем анализируют любым методом стандартного гистологического анализа. Из каждого блока микрочипа можно приготовить 100-500 срезов, которые можно подвергнуть независимым испытаниям. Тесты, обычно применяемые для тканевых микрочипов, включают иммуногистохимию и флуоресцентную гибридизацию in situ. В случае анализа на уровне мРНК технологию тканевых микрочипов можно сочетать с флуоресцентной гибридизацией in situ. Пример гибридизации in situ с применением RNAscope 2.5 (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA) показан в разделе Примеры.

И наконец, для определения количества мРНК в образце можно использовать массивно-параллельное секвенирование (применяя секвенирование РНК (RNA-Seq) или "секвенирование целого транскриптома методом выстрела из дробового ружья"). Для этой цели доступно множество методов массивно-параллельного секвенирования. Такие способы описаны например, в US 4882127; US 4849077; US 7556922; US 6723513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45 (2008); Pihlak et al. War. Biotechnol., 26(6): 676-684 (2008); Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023 (2009); Mardis, Genome Med., 1(4): 40 (2009); Metzker, Nature Rev. Genet, 11(1): 31-46 (2010).

Если экспрессию маркера оценивают применительно к белку, то возможно применение антител, специфичных к PSGL-1. Связывание с антителом к PSGL-1 можно обнаружить, и/или количественно определить, и/или оценить с применением различных анализов, доступных специалисту в данной области, таких как, например, иммунопреципитация, иммуногистохимия (IHC), вестерн-блоттинг, дот-блоттинг, ELISA, ELISPOT, использование белковых чипов, антительных чипов или тканевых чипов в сочетании с иммуногистохимией. Другие методы, которые могут быть использованы, включают методы сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET), методы микроскопии или гистохимии, особенно включая методы конфокальной микроскопии и электронной микроскопии, методы, основанные на использовании одной или нескольких длин волн возбуждения и подходящего оптического метода, а также электрохимический метод (методы вольтаметрии и амперометрии), методы атомно-силовой микроскопии и радиочастотные методы, как например, многополюсную резонансную спектроскопию, конфокальную и неконфокальную, определение сигнала флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, поглощения, отражения, пропускания и двойного лучепреломления или показателя преломления (например, методом поверхностного плазмонного резонанса, эллипсометрией, методом резонансного зеркала и т.д.), проточную цитометрию, радиоизотопную или магнитно-резонансную томографию, анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE); посредством сочетания высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и масс-спектрофотометрии, посредством жидкостной хроматографии/масс-спектрофотометрии/масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области техники, и нет необходимости в их подробном изложении в данном описании.

Хотя для осуществления способов по настоящему изобретению подходит любой из приведенных выше методов, особо можно упомянуть FACS, ELISA, ELISPOT, вестерн-блоттинг и IHC. Предпочтительные методы включают ELISPOT, FACS и IHC.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ PSGL-1-СТАТУСА ОПУХОЛИ

Определение связывания реагента с PSGL-1 (как описано выше) позволяет определить PSGL-1-статус подлежащей лечению опухоли. PSGL-1-статус может быть определен любым способом или методом, известным или в настоящее время используемым специалистом в данной области техники, обычно основанном на определении уровня экспрессии PSGL-1. Затем, с учетом PSGL-1-статуса опухоли можно спрогнозировать, будет ли пациент восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту.

Не так давно стало очевидно, что иммунологические данные (тип, плотность и расположение иммунных клеток в образцах опухоли) являются более надежным прогностическим фактором выживаемости пациента, чем данные гистопатологических методов, используемые в настоящее время для определения стадии коло ректального рака.

Кроме того, все больше данных, полученных в результате клинических испытаний, подтверждают потенциал методов лечения с ориентацией на иммунную активность при определенных типах рака (Robert и др., Stagg и др.). Это привело к разработке более стандартизованных способов характеристики иммунного инфильтрата опухоли при раке, например, по значению "иммунного балла", с целью проведения количественной оценки иммунного инфильтрата in situ в дополнение к стандартизированным клиническим параметрам с целью оказания помощи в прогнозировании и отборе пациентов для иммунотерапии при различных типах рака (см, например, Galon et al., J, Pathol,, 232(2): 199-209 (2014); Galon et al, J. Transl. Med., 14: 273 (2016)).

Таким образом, способ детектирования или диагностики VISTA-опосредуемого рака, описанного в данной заявке, включает определение для данной опухоли оценки на предмет PSGL-1.

Согласно этому воплощению способ включает стадии:

a) приведения в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным связываться с белком PSGL-1 или нуклеиновой кислотой PSGL-1;

b) количественного определения связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом; и

c) оценки опухолевых клеток путем сравнения количественного значения уровня стадии а) с соответствующей шкалой, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток.

В предпочтительном воплощении стадия b) включает количественное определение связывания указанного реагента с PSGL-1 в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли в указанном биологическом образце.

Согласно этому предпочтительному воплощению способ включает стадии:

a) приведения в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным связываться с белком PSGL-1 или нуклеиновой кислотой PSGL-1;

b) количественного определения связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом; и

c) оценивания иммунных клеток опухоли путем сравнения количественного значения уровня на стадии а) с соответствующей шкалой, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток.

Иммунные клетки опухоли (или иммунные инфильтраты) содержат иммунные клетки, присутствующие в микроокружении опухоли, в первую очередь иммуносупрессорные клетки микроокружения опухоли, подобные некоторым макрофагам, моноцитам и так далее. В предпочтительном воплощении иммунные инфильтраты включают лимфоциты (например, Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки), дендритные клетки, тучные клетки и макрофаги. Соответственно, в этом воплощении стадия b) включает количественное определение связывания указанного реагента с PSGL-1 на лимфоцитах (например, Т-клетках, В-клетках, природных киллерных (NK) клетках), дендритных клетках, тучных клетках и макрофагах, присутствующих в микроокружении опухоли в указанном биологическом образце.

Для оценки прогностической ценности PSGL-1 можно использовать любой традиционный метод анализа опасностей. Репрезентативные методы анализа включают регрессионный анализ Кокса, который представляет собой полупараметрический метод моделирования данных о выживаемости или времени до наступления события при наличии цензурированных случаев (Hosmer и Lemeshow, 1999; Сох, 1972). В отличие от других анализов выживаемости, например, таблиц продолжительности жизни или процедуры Каплана-Мейера, анализ Кокса позволяет включать в такие модели прогностические переменные (ковариаты). Используя метод общепринятого анализа, например, анализ Кокса, можно проверить гипотезы касательно корреляции статуса экспрессии PSGL-1 в первичной опухоли либо с временем до начала рецидива заболевания (временем выживания без заболевания или временем до начала метастазирования заболевания), либо с временем до смерти от этого заболевания (общим временем выживания). Регрессионный анализ Кокса также известен как анализ пропорциональных рисков Кокса. Этот метод является стандартным методом исследования прогностической ценности опухолевого маркера в зависимости от времени выживания пациентов. При использовании в многофакторном режиме влияние нескольких ковариат исследуют параллельно, чтобы можно было идентифицировать отдельные ковариаты, которые имеют независимую прогностическую ценность, то есть наиболее полезные маркеры. Термин отрицательный или положительный "PSGL-1-статус" также можно обозначить как [PSGL-1(-)] или [PSGL-1(+)].

"Оценку" образца можно проводить в процессе диагностики или мониторинга рака. В самой простой форме оценивание может иметь категорию отрицательного или положительного, если судить по результатам визуального обследования образцов с использованием иммуногистохимии. Оценивание в более количественном выражении включает составление суждения относительно таких двух параметров, как интенсивность окрашивания и доля окрашенных ("положительных") клеток, которые находятся в образце.

В одном из воплощений, чтобы обеспечить стандартизацию, образцы можно оценивать на предмет уровней экспрессии PSGL-1 на разных шкалах, большая часть из которых основана на оценке интенсивности окрашивания продукта реакции и процентной доли положительных клеток (Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology, 2008, 52, 82-90).

В другом воплощении указанное оценивание включает использование соответствующей шкалы, основанной на интенсивности окрашивания и процентной доле положительных клеток.

В качестве первого примера, по аналогии с быстрым оцениванием по шкале Оллреда в случае IHC исследования рецептора эстрогена и рецептора прогестерона, образцы могут быть оценены на предмет уровней экспрессии PSGL-1 по глобальной шкале с объединением баллов от 0 до 8 для степени выраженности реактивности и для доли окрашенных клеток (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol., 1999; 17; 1474-1481). Более конкретно, первый критерий степени выраженности реактивности оценивают по шкале от 0 до 3, при этом 0 соответствует "отсутствию реактивности", а 3 соответствует "высокой реактивности". Второй критерий доли реактивности оценивают по шкале от 0 до 5, при этом 0 соответствует "отсутствию реактивности", а 5 соответствует "доле реактивности 67-100%". Затем для степени выраженности реактивности и оценку для доли реактивности суммируют, получая общую оценку от 0 до 8. Общая оценка 0-2 считается отрицательной, тогда как общая оценка 3-8 считается положительной.

Согласно этой шкале термины отрицательный или положительный "PSGL-1-статус" опухолей, использованные в описании настоящего изобретения, относятся к уровням экспрессии PSGL-1, которые соответствуют оценкам 0-2 или 3-8 по шкале Оллреда, соответственно.

В приведенной далее Таблице 2 проиллюстрированы методические рекомендации для интерпретации результатов IHC согласно методу Оллреда.

Согласно данному изобретению указанная соответствующая шкала может представлять собой шкалу от 0 до 8, по которой отсутствие реактивности оценивается баллом 0, а высокая реактивность, выраженная величиной доли реактивности 67-100%, оценивается баллом 8.

Другими словами, описан способ определения in vitro или ex vivo статуса опухоли от субъекта, при этом указанный способ включает стадии (а) оценивания опухоли от субъекта в соответствии со шкалой Оллреда; и (b) определения того, что статус опухоли соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда от 3 до 8; или (с) определения того, что статус опухоли соответствует [PSGL-1 (-)] с оценкой по шкале Оллреда от 0 до 2.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 3.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 4.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 5.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 6.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 7.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда 8.

Согласно другому конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой по шкале Оллреда от 3 до 8.

Другой описанный в данной заявке конкретный способ для определения in vitro или ex vivo PSGL-1-статуса опухолевых клеток у субъекта характеризуется тем, что он включает стадии:

(a) оценивания PSGL-1-несущих опухолевых клеток, как описано выше; и

(b) определения того, что PSGL-1-статус опухолевых клеток соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой от 3 до 8; или

(c) определения того, что PSGL-1 -статус опухолевых клеток соответствует [PSGL-1(-)] с оценкой от 0 до 2.

Другой описанный в данной заявке конкретный способ для определения in vitro или ex vivo PSGL-1-статуса иммунных клеток опухоли у субъекта характеризуется тем, что он включает стадии:

(a) оценивания PSGL-1-несущей опухолевой иммунной клетки, как описано выше; и

(b) определения того, что PSGL-1-статус иммунных клеток опухоли соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой от 3 до 8; или

(c) определения того, что PSGL-1-статус иммунных клеток опухоли соответствует [PSGL-1(-)] с оценкой от 0 до 2.

В предпочтительном воплощении иммунные клетки опухоли (т.е. иммунные инфильтраты) включают лимфоциты (например, Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки), дендритные клетки, тучные клетки и макрофаги. Соответственно, в этом воплощении стадия а) включает количественное определение связывания указанного реагента с PSGL-1 на лимфоцитах (например, Т-клетках, В-клетках, природных киллерных (NK) клетках), дендритных клетках, тучных клетках и макрофагах, присутствующих в микроокружении опухоли в указанном биологическом образце.

В качестве второго примера, по аналогии с традиционным оцениванием в случае IHC исследования рецептора HER-2, например, образцы могут быть оценены на предмет уровней экспрессии PSGL-1 на основе несколько более простого метода оценивания, объединяющего интенсивность окрашивания (предпочтительно, окрашивания мембран) и долю клеток, которые отображают окрашивание по объединенной шкале от 0 до 3+.

Согласно этой шкале, называемой упрощенной шкалой, 0 и 1+ относятся к отрицательному результату, в то время как 2+ и 3+ относятся к положительному результату окрашивания. Тем не менее, оценки в диапазоне от 1+ до 3+ могут считаться положительными, поскольку каждая положительная оценка может быть ассоциирована со значительно более высоким риском рецидива и смертельного исхода заболевания по сравнению с оценкой 0 (отрицательной), но увеличение интенсивности окрашивания среди образцов с положительными оценками может обеспечить дополнительное снижение риска.

Вообще говоря, термины отрицательный или положительный "PSGL-1-статус" опухолей, использованные в описании настоящего изобретения, относятся к уровням экспрессии PSGL-1, которые соответствуют оценкам от 0 до 1+ или от 2+ до 3+ на этой упрощенной шкале, соответственно. Следует учитывать только мембранную реактивность по всей периферии инвазивной опухоли, которая часто по внешнему виду напоминала "мелкоячеистую проволочную сетку". Согласно современным руководствам, в случае образцов, оцененных по PSGL-1 как пограничные (с оценкой 2+ или 3+), необходимо провести дополнительную оценку. Результаты IHC анализа следует отклонить и либо его повторить, либо выполнить тестирование с использованием FISH или любого другого метода, если, в качестве неограничивающего примера, контроли не соответствуют ожидаемым, артефакты затрагивают большую часть образца, и образец показывает высокий связанный с мембранами положительный результат для протоков молочной железы в норме (как внутренних контролей), что предполагает чрезмерное демаскирование антигена.

Для большей ясности в приведенной далее Таблице 3 суммированы эти параметры.

Соответствующей шкалой может быть шкала от 0 до 3⁺, где отсутствие мембранной реактивности опухолевых клеток или иммунных клеток опухоли оценивается баллом 0, а высокая полная реактивность более чем у 10% опухолевых клеток оценивается баллом 3⁺.

Более подробно, как описано выше, указанная соответствующая шкала представляет собой шкалу от 0 до 3, где отсутствие мембранной реактивности опухолевых клеток или иммунных клеток опухоли оценивается баллом 0, слабо заметная мембранная реактивность более чем у 10% опухолевых клеток или иммунных клеток опухоли оценивается баллом 1+; полная мембранная реактивность в степени от слабой до умеренной более чем у 10% опухолевых клеток или иммунных клеток опухоли оценивается баллом 2+; а высокая полная реактивность более чем у 10% опухолевых клеток или иммунных клеток опухоли оценивается баллом 3+.

Другими словами, описан способ определения in vitro или ex vivo статуса опухоли от субъекта, причем указанный способ включает стадии (а) оценивания опухоли от субъекта согласно упрощенной шкале, как описано выше; и (b) определения того, что статус опухоли соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой 2+ или 3 +; или (с) определения того, что статус опухоли соответствует [PSGL-1(-)] с оценкой 0 или 1+.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой 2+.

Согласно конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой 3+.

Согласно другому конкретному аспекту изобретения опухоль имеет статус [PSGL-1(+)] с оценкой 2+ или 3+.

В другом воплощении способ определения in vitro или ex vivo PSGL-1-статуса опухолевых клеток у субъекта может включать стадии:

(a) оценивания PSGL-1-несущих опухолевых клеток от указанного субъекта согласно способу, описанному выше; и

(b) определения того, что PSGL-1-статус опухолевых клеток соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой 2⁺ или 3⁺; или

(c) определения того, что PSGL-1-статус опухолевых клеток соответствует [PSGL-1(-)] с оценкой 0 или 1⁺.

В другом воплощении способ определения in vitro или ex vivo PSGL-1-статуса иммунных клеток опухоли у субъекта может включать стадии:

(a) оценивания PSGL-1-несущих иммунных клеток опухоли от указанного субъекта согласно способу, описанному выше; и

(b) определения того, что PSGL-1-статус иммунных клеток опухоли соответствует [PSGL-1(+)] с оценкой 2⁺ или 3⁺; или

(c) определения того, что PSGL-1-статус иммунных клеток опухоли соответствует [PSGL-1(-)] с оценкой 0 или 1⁺.

В предпочтительном воплощении иммунные клетки опухоли (т.е. иммунные инфильтраты) включают лимфоциты (например, Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки), дендритные клетки, тучные клетки и макрофаги. Соответственно, в этом воплощении стадия а) включает количественное определение связывания указанного реагента с PSGL-1 на лимфоцитах (например, Т-клетках, В-клетках, природных киллерных (NK) клетках), дендритных клетках, тучных клетках и макрофагах, присутствующих в микроокружении опухоли в указанном биологическом образце.

Как правило, результаты тестирования или анализа могут быть представлены в любом из множества форматов. Представление результатов может быть качественным. Например, в отчете о тестировании можно указать только, обнаружен ли конкретный полипептид или не обнаружен, возможно также с указанием пределов обнаружения. Отображение результатов может быть полуколичественным. Например, могут быть определены различные диапазоны, и этим диапазонам может быть присвоена оценка (например, от 0 до 3+ или от 0 до 8 в зависимости от использованной шкалы), которая в определенной степени предоставляет количественную информацию. Такая оценка может отражать различные факторы, например, количество клеток, в которых обнаружен PSGL-1, интенсивность сигнала (которая может показывать уровень экспрессии PSGL-1 или PSGL-1-несущих клеток) и так далее. Результаты могут быть отображены количественно, например, в виде процентной доли клеток, в которых обнаружен PSGL-1, в виде концентрации белка и так далее.

Специалисту средней квалификации в данной области техники будет очевидно, что тип результата, полученного после тестирования, будет варьировать в зависимости от технических ограничений данного тестирования и биологической значимости, связанной с обнаружением полипептида. Например, в случае определенных полипептидов чисто качественный результат (например, обнаруживается ли данный полипептид или не обнаруживается при определенном уровне обнаружения) предоставляет важную информацию. В других случаях необходим более количественный результат (например, отношение уровня экспрессии полипептида в тестируемом образце к уровню в норме).

АНТИТЕЛА К PSGL-1

Антителами для применения в способах по настоящему изобретению являются антитела, которые связываются с PSGL-1, включая полипептид PSGL-1, фрагмент полипептида PSGL-1 или эпитоп PSGL-1. Антитела к PSGL-1 включают гуманизированные антитела к PSGL-1. Также предложены антитела (например, гуманизированные антитела к PSGL-1), которые полностью блокируют связывание антитела к PSGL-1, предложенного в данной заявке, с полипептидом PSGL-1.

Согласно настоящему изобретению также предложены антитела, которые связываются с PSGL-1 и проявляют агонизирующий или антагонизирующий эффект в отношении взаимодействия между PSGL-1 и VISTA. Предпочтительно, антитело к PSGL-1 ингибирует или блокирует связывание PSGL-1 с VISTA, в первую очередь с внеклеточным доменом VISTA. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1 ингибирует или блокирует связывание VISTA-экспрессирующей клетки с PSGL-1-экспрессирующей Т-клеткой, такой как, например, миелоидная клетка, дендритная клетка, макрофаг или Т-клетка. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1 не блокирует или не ингибирует связывание PSGL-1 с Р-селектином, L-селектином или Е-селектином.

Антитела к PSGL-1 (например, гуманизированные антитела к PSGL-1), предложенные в данной заявке, также могут быть конъюгированы или слиты рекомбинантным методом с диагностическим агентом, детектируемым агентом или терапевтическим агентом (например, конъюгатом антитело-лекарственное средство). Например, детектируемым агентом может быть детектируемый зонд. Кроме того, предложены композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитело к PSGL-1 (например, гуманизированное антитело к PSGL-1).

Антитела, предложенные в данной заявке, которые связываются с антигеном, например, PSGL-1, могут быть получены любым методом, известным в области техники для синтеза антител, в частности, с использованием химического синтеза или методов рекомбинантной экспрессии. Например, некоторые антитела к PSGL-1 и способы получения таких антител описаны ранее (см., например, WO 2005/110475, WO 2003/013603; публикации заявок на патент США №№2009/0198044, 2005/0266003, 2009/0285812, 2013/0011391 и 2015/0183870; и патенты США №№7833530 и 8361472).

Поликлональное антитела, которые связываются с антигеном, могут быть получены с использованием различных методик, хорошо известных в данной области техники. Например, человеческий антиген можно вводить различным животным-хозяевам, включая, но не ограничиваясь этим, кроликов, мышей, крыс и т.д., чтобы индуцировать получение сывороток, содержащих поликлональные антитела, специфичные к человеческому антигену. Для усиления иммунного ответа, в зависимости от вида хозяина, можно использовать различные адъюванты, и они включают, но не ограничиваются этим, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гель гидроксида алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы типа плюроника, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области техники.

Моноклональные антитела могут быть получены с использованием широкого круга методов, известных в данной области техники, включая применение гибридомных и рекомбинантных технологий и методов фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных методов, включая методы, известные в данной области техники, информация о которых содержится, например, в работах Harlow et at,, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981); данные источники включены посредством ссылки во всей своей полноте. Термин "моноклональное антитело", использованный в данном описании, не ограничивается антителами, полученными с использованием гибридомной технологии. В данном описании в другом месте обсуждаются другие типичные методы получения моноклональных антител, такие как, например, применение технологии KM mouse™. Дополнительные типичные методы получения моноклональных антител приведены в данном описании в разделе Примеры. Альтернативно, также возможно применение антитела к PSGL-1, такого как, например, антитела, описанные в WO 2003/013603, WO 2005/110475, WO 2009/140623, Dimitroff et al., Cancer Res., 65(13): 5750-60 (2005), Veerman et al., Nature Immunol., 8(5): 532-9 (2007), Tinocco et al., Immunity, 44: 1190-1203 (2016).

Методы получения и скрининга специфических антител с использованием гибридомной технологии являются общепризнанными и хорошо известны в данной области техники. Кратко, мыши могут быть иммунизированы антигеном PSGL-1, и как только обнаружен иммунный ответ, например, в сыворотке крови мышей обнаружены антитела, специфичные к антигену PSGL-1, проводят забор селезенки мышей и осуществляют выделение спленоцитов. Затем выполняют слияние спленоцитов с использованием хорошо известных методов с любыми подходящими клетками миеломы, например клетками клеточной линии SP20, которую можно получить из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Гибридомы отбирают и клонируют методом предельного разведения.

Кроме того, для иммунизации животного можно использовать метод множественных сайтов повторных иммунизации (RIMMS) (статья Kilptrack et al., 1997, Hybridoma, 16: 381-9, включенная посредством ссылки во всей своей полноте). Затем клоны гибридом анализируют методами, известными в данной области техники в отношении клеток, которые секретируют антитела, обладающие способностью связываться с рассматриваемым полипептидом. В результате иммунизации мышей положительными клонами гибридом можно получить асцитную жидкость, которая, как правило, содержит высокие уровни антител.

Соответственно, согласно данному изобретению также предложены способы получения антител посредством культивирования гибридомной клетки, секретирующей модифицированное антитело, предложенное в данной заявке, при этом в некоторых воплощениях гибридому получают путем слияния спленоцитов, выделенных из мыши, иммунизированной PSGL-1, в том числе полипептидом PSGL-1, фрагментом полипептида PSGL-1 или эпитопом PSGL-1, с клетками миеломы и последующего скрининга гибридом, полученных в результате данного слияния, в отношении клонов гибридом, которые секретируют антитело, обладающее способностью связываться с PSGL-1.

Антитела к PSGL-1, обладающие способностью к модулированию (например, усилению или ингибированию) взаимодействия между PSGL-1 и VISTA, могут быть идентифицированы любым методом, известным специалистам в данной области техники. Примеры анализов для детектирования и измерения взаимодействия между PSGL-1 и VISTA описаны в экспериментальном разделе. Любой из этих анализов можно использовать для тестирования того, может ли антитело к PSGL-1 модулировать взаимодействие между PSGL-1 и VISTA.

Фрагменты антител, которые распознают (например, связываются с) PSGL-1, могут быть получены любым методом, известным специалистам в данной области техники. Например, Fab и F(ab')₂ фрагменты, предложенные в данной заявке, могут быть получены в результате протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов с использованием таких ферментов, как папаин (для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')₂ фрагментов). F(ab')₂ фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и СН1-домен тяжелой цепи. Помимо этого, антитела, предложенные в данной заявке, также могут быть получены с использованием различных методов фагового дисплея, известных в данной области техники.

Например, антитела также могут быть получены с использованием различных методов фагового дисплея. В методах фагового дисплея функциональные домены антител проявляются на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, последовательности ДНК, кодирующие VH- и VL-домены, амплифицируют из библиотек кДНК животного происхождения (например, из библиотек кДНК пораженных тканей человека или мыши). ДНК, кодирующую VH- и VL-домены, повторно объединяют вместе с scFv линкером с использованием ПЦР и клонируют в фагмидный вектор. Вектор вводят с использованием электропорации в Е. coli и Е. coli инфицируют хелперным фагом. Используемый в этих методах фаг обычно представляет собой нитевидный бактериофаг, включая fd и М13, и нуклеотидные последовательности VH- и VL-доменов обычно слиты рекомбинантным путем либо с фаговым геном III, или геном VIII. Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывается с конкретным антигеном, может быть отобран или идентифицирован с использованием антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой либо захваченного на твердой поверхности или грануле. Примеры методов фагового дисплея, которые могут быть использованы для получения антител, предложенных в данной заявке, включают методы, описанные в Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al, 1994, Eur. J. Immunol., 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; PCT/GB91/01134; WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO 97/13844; и патентах США №№5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108; все они включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Как описано в приведенных выше ссылках, после отбора, проведенного с использованием фага, кодирующие антитело участки ДНК фага, могут быть выделены и использованы для получения целых антител, включая человеческие антитела, или любого другого желаемого связывающегося с антигеном фрагмента, и экспрессированы в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжи и бактерии, например, как описано ниже. Также можно применять методы получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab')₂ рекомбинантным путем, используя способы, известные в данной области техники, такие, как описанные в публикации РСТ (Договор о патентной кооперации) № WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI, 34: 26-34; и Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043 (данные источники включены посредством ссылки во всей своей полноте).

Чтобы получить целые антитела, для амплификации VH- или VL-последовательностей в scFv клонах можно использовать ПЦР праймеры, содержащие нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующие последовательности для защиты сайта рестрикции. Используя методы клонирования, известные специалистам в данной области техники, ПЦР-амплифицированные VH-домены можно клонировать в векторы, экспрессирующие константную область VH, например, константную область иммуноглобулина гамма 4 человека, а ПЦР-амплифицированные VL-домены можно клонировать в векторы, экспрессирующие константную область VL, например, константные области каппа или лямбда иммуноглобулина человека. VH- и VL-домены также можно клонировать в один вектор, экспрессирующий необходимые константные области. Затем векторами, привносящими тяжелую цепь, и векторами, привносящими легкую цепь, совместно трансфицируют клеточные линии для получения стабильно или временно трансфицированных клеточных линий, которые экспрессируют полноразмерные антитела, например, IgG, используя методы, известные специалистам в данной области техники.

Для некоторых применений, включая применение антител in vivo на людях и в анализах обнаружения in vitro, можно использовать человеческие или химерные антитела. Для терапевтического лечения таких субъектов, как люди, особо желательны полностью человеческие антитела. Человеческие антитела могут быть получены разными способами, известными в данной области техники, включая описанные выше методы фагового дисплея с использованием библиотек антител, происходящих из последовательностей иммуноглобулинов человека. Также см. патенты США №№4444887 и 4716111 и заявки №№ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741; все они включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых воплощениях получают человеческие антитела. Человеческие антитела и/или полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функционально активные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулинов человека. Например, в мышиные эмбриональные стволовые клетки могут быть введены случайным образом или с использованием гомологической рекомбинации комплексы генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека. Альтернативно, помимо генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека в мышиные эмбриональные стволовые клетки могут быть введены нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область, константную область и D-сегмент (diversity region) иммуноглобулина человека. Гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина мыши могут быть переведены в нефункциональное состояние по отдельности или одновременно с введением локуса иммуноглобулина человека посредством гомологической рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция J_H-области предотвращает образование эндогенных антител. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки подращивают и с использованием микроинъекции вводят в бластоцисты для получения химерных мышей. Химерных мышей далее размножают для получения гомозиготного потомства, которое экспрессирует человеческие антитела. Трансгенных мышей иммунизируют обычным образом выбранным антигеном, например, целым полипептидом или его частью. Моноклональные антитела, направленные на данный антиген, могут быть получены из иммунизированных, трансгенных мышей с использованием традиционной гибридомой технологии. Полученные трансгенным путем иммуноглобулины человека, содержащиеся в трансгенных мышах, претерпевают реаранжировку в процессе дифференцировки В-клеток и впоследствии подвергаются переключению класса и соматическим мутациям. Таким образом, с использованием этого метода можно получать терапевтически полезные антитела IgG, IgA, IgM и IgE. Обзор по этой технологии получения человеческих антител см. в работе Lonberg и Huszar (1995, Int. Rev. Immunol., 13: 65-93). Подробное обсуждение этой технологии для получения человеческих антител и моноклональных человеческих антител и протоколы для получения таких антител см., например, в WO 98/24893, WO 96/34096 и WO 96/33735; и патентах США №№5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 и 5939598, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Другие способы подробно изложены в данном описании в разделе Примеры. Помимо этого, для получения человеческих антител, направленных на выбранный антиген, с использованием технологии, аналогичной описанной выше, можно контактировать с такими компаниями, как Abgenix, Inc. (Freemont, СА) и Genpharm (San Jose, CA).

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части антитела происходят из молекул разных иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison, 1985, Science, 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202 и патенты США №№5807715, 4816567, 4816397 и 6331415, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Гуманизированное антитело представляет собой антитело или его вариант либо их фрагмент, которое(ый) способно(ен) связываться с заранее заданным антигеном и которое(ый) содержит каркасную область, имеющую по существу аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и CDR, имеющий по существу аминокислотную последовательность иммуноглобулина вида, не являющегося человеком. Гуманизированное антитело содержит по существу все из вариабельных доменов, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена (Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv), в которых все или по существу все участки CDR соответствуют таковым иммуноглобулина вида, не являющегося человеком (например, донорного антитела), и все или по существу все каркасные области являются такими же, как консенсусная последовательность иммуноглобулина человека. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), в типичном случае, иммуноглобулина человека. Обычно антитело будет содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать в себя участок СН1, шарнирный участок, участки СН2, СН3 и СН4 тяжелой цепи. Гуманизированное антитело может быть выбрано из иммуноглобулинов любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Обычно, константный домен является константным доменом фиксации комплемента в том случае, если желательно, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность, и данный класс в типичном случае представляет собой IgG1. Когда такая цитотоксическая активность является нежелательной, константный домен может быть из класса IgG2. Примеры константных доменов VL и VH, которые можно использовать в некоторых воплощениях, включают, но не ограничиваются этим, С-каппа и С-гамма-1 (nG1m), описанные в Johnson et al. (1997), J. Infect. Dis., 176, 1215-1224, и таковые, описанные в патенте США №5824307. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации желаемых эффекторных функций находится в пределах компетенции специалиста средней квалификации в данной области техники. Каркасные и CDR участки гуманизированного антитела не обязательно точно соответствуют исходным последовательностям, например, донорный CDR или консенсусный каркас может быть подвергнут мутациям с заменой, вставкой или делецией по меньшей мере одного остатка, вследствие чего данный остаток CDR или каркаса в этом сайте не будет соответствовать ни консенсусному, ни вводимому антителу. Такие мутации, однако, не будут обширными. Обычно, по меньшей мере 75% остатков гуманизированного антитела будут соответствовать остаткам исходных последовательностей FR и CDR, чаще 90% или более 95%. Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, CDR-привитие (ЕР 239400; WO 91/09967; и патенты США №№5225539, 5530101 и 5585089), венирование или изменение поверхности (ЕР 592106 и ЕР 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814; и Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 969-973), перетасовку цепей (патент США №5565332) и методы, описанные, например, в патенте США №6407213, патенте США №5766886, заявке WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3): 267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10): 895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp): 5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene, 150(2): 409-10 (1994) и Pedersen et al, J. Mol. Biol., 235(3): 959-73 (1994). Также см. публикацию заявки на патент США № US 2005/0042664 А1, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Часто, каркасные остатки в каркасных областях будут заменены на соответствующий остаток из CDR донорного антитела с целью изменения (например, улучшения) связывания с антигеном. Такие замены в каркасе идентифицируют методами, хорошо известными в данной области техники, например, путем моделирования взаимодействия остатков CDR и каркаса для идентификации остатков каркаса, важных для связывания с антигеном, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркаса в определенных положениях. (См., например, Queen и др., патент США №5585089; и работу Reichmann et al., 1988, Nature, 332: 323, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте).

Однодоменные антитела, например, антитела, не содержащие легких цепей, могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники. См. работы Riechmann et al., 1999, J. Immunol., 231: 25-38; Nuttall et al, 2000, Сип.Pharm. BiotechnoL, 1(3): 253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol., 74(4): 277302; патент США №6005079; и заявки №№ WO 94/04678, WO 94/25591 и WO 01/44301, все они включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Кроме того, антитела, которые связываются с PSGL-1, в свою очередь, могут быть использованы для получения антиидиотипических антител, которые "имитируют" антиген, с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. (См., например, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J., 7(5): 437-444; и Nissinoff, 1991, J. Immunol., 147(8): 2429-2438).

Антитела, предложенные в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, синтетические антитела, моноклональные антитела, полученные рекомбинантным путем антитела, мультиспецифичные антитела (в том числе биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела, химерные антитела, интраантитела, антиидиотипические (anti-Id) антитела и функциональные фрагменты любого из перечисленного выше. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов включают одноцепочечные Fv (scFv) (в том числе, например, моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, F(ab)₂ фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, соединенные дисульфидными связями Fv (sdFv), Fd фрагменты, Fv фрагменты, диатело, триотело, тетратело и миниантитело.

В частности, антитела, предложенные в данной заявке, включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт, который связывается с PSGL-1 (например, полипептид PSGL-1, фрагмент полипептида PSGL-1, эпитоп PSGL-1). Молекулы иммуноглобулина, предложенные в данной заявке, могут представлять собой молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA1 и IgA2) или подкласса.

Варианты и производные антител включают функциональные фрагменты антител, которые сохраняют способность связываться с PSGL-1 (например, с полипептидом PSGL-1, фрагментом полипептида PSGL-1, эпитопом PSGL-1). Типичные функциональные фрагменты включают Fab фрагменты (фрагмент антитела, который содержит антигенсвязывающий домен и содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, соединенные как мостиком дисульфидной связью); Fab' (фрагмент антитела, содержащий один антигенсвязывающий домен, представляющий собой Fab, и дополнительную часть тяжелой цепи, соединенные через шарнирную область); F(ab')₂ (две Fab' молекулы, соединенные межцепочечными дисульфидными связями в шарнирных областях тяжелых цепей; Fab' молекулы могут быть направлены на один и тот же эпитоп или на разные эпитопы); биспецифичный Fab (Fab молекула, имеющая два антигенсвязывающих домена, каждый из которых может быть направлен на свой эпитоп); одноцепочечный Fab фрагмент, содержащий вариабельную область, также известный как sFv (вариабельная, определяющая связывание с антигеном область, состоящая из одной легкой и тяжелой цепи антитела, связанных вместе цепью из 10-25 аминокислот); соединенный дисульфидными связями Fv или dsFv (вариабельная, определяющая связывание с антигеном область, состоящая из одной легкой и тяжелой цепи антитела, связанных вместе дисульфидной связью); верблюжья VH (вариабельная, определяющая связывание с антигеном область одной тяжелой цепи антитела, в которой некоторые аминокислоты на поверхности VH являются такими же, как обнаруженные в тяжелой цепи природных верблюжьих антител); биспецифичный sFv (молекула sFv или dsFv, имеющая два антигенсвязывающих домена, каждый из которых может быть направлен на свой эпитоп); диатело (димеризованный sFv, образованный, когда VH-домен первого sFv соединяется с VL-доменом второго sFv, а VL-домен первого sFv соединяется с VH-доменом второго sFv; эти два антигенсвязывающих участка диатела могут быть направлены на один и тот же эпитоп или разные эпитопы); и триатело (тримеризованный sFv, образованный способом, аналогичным таковому для диатела, но в котором три антигенсвязывающих домена объединены в единый комплекс; эти три антигенсвязывающих домена могут быть направлены на один и тот же эпитоп или разные эпитопы). Производные антител также включают в себя одну или более CDR последовательностей антигенсвязывающего центра антитела (antibody combining site). Данные CDR последовательности могут быть соединены вместе с использованием остова, когда имеются две или несколько CDR последовательностей. В некоторых воплощениях антитело содержит одноцепочечный Fv ("scFv"). scFv представляют собой фрагменты антитела, содержащие VH- и VL-домены антитела, при этом такие домены присутствуют в виде единой полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор по scFv см. в Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Антитела, предложенные в данной заявке, могут быть моноспецифичными, биспецифичными, триспецифичными или иметь более высокую степень специфичности. Мультиспецифичные антитела могут обладать специфичностью к разным эпитопам полипептида PSGL-1 или могут обладать специфичностью как к полипептиду PSGL-1, так и к гетерологичному эпитопу, например, гетерологичному полипептиду или материалу твердой подложки. В некоторых воплощениях, антитела, предложенные в данной заявке, являются моноспецифичными в отношении определенного эпитопа полипептида PSGL-1 и не связываются с другими эпитопами.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены слитые белки, содержащие антитело, предложенное в данной заявке, которое связывается с PSGL-1, и гетерологичный полипептид. В некоторых воплощениях гетерологичный полипептид, с которым слито антитело, полезен для направленного воздействия антитела на клетки, имеющие экспрессированный на клеточной поверхности PSGL-1.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены панели антител, которые связываются с PSGL-1. В некоторых воплощениях панели антител характеризуются разными константами скорости ассоциации, разными константами скорости диссоциации, разными аффинностями к PSGL-1 и/или обладают разной специфичностью к PSGL-1. В некоторых воплощениях панели содержат или состоят из примерно 10, примерно 25, примерно 50, примерно 75, примерно 100, примерно 125, примерно 150, примерно 175, примерно 200, примерно 250, примерно 300, примерно 350, примерно 400, примерно 450, примерно 500, примерно 550, примерно 600, примерно 650, примерно 700, примерно 750, примерно 800, примерно 850, примерно 900, примерно 950 или примерно 1000 антител или больше. Панели антител можно использовать, например, в 96-луночных или 384-луночных планшетах, например, для таких анализов, как ELISA.

ПРИМЕНЕНИЕ СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С PSGL-1 РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

Антитела к PSGL-1, предложенные в данной заявке, можно использовать для анализа уровней PSGL-1 в биологическом образце с применением классических иммуногистологических методов, которые изложены в данном описании или известны специалистам в данной области техники (например, см. Jalkanen et al., 1985, J. Cell Biol., 101: 976-985; и Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol., 105: 3087-3096). Другие методы с использованием антител, полезные для детектирования экспрессии генов белков, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Подходящие метки для анализа антител известны в данной области техники и включают ферментативные метки, такие как глюкозооксидаза; радиоактивные изотопы, такие как йод (¹²⁵1, ¹²¹I), углерод (¹⁴С), сера (³⁵S), тритий (³Н), индий (¹²¹In) и технеций (⁹⁹Тс); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.

Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ обнаружения и диагностики VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у человека. В одном из воплощений диагностика включает: а) введение (например, парентерально, подкожно или внутрибрюшинно) субъекту эффективного количества меченого антитела, которое связывается с PSGL-1; b) выжидание в течение некоторого промежутка времени после введения с целью обеспечения возможности меченому антителу сконцентрироваться у субъекта предпочтительно в местах экспрессии PSGL-1 (и чтобы содержание несвязавшихся меченых молекул достигло фонового уровня); с) определение фонового уровня; и d) детектирование меченого антитела у субъекта, при этом детектирование меченого антитела выше фонового уровня указывает на то, что данный субъект имеет PSGL-1-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние. Фоновый уровень может быть определен различными методами, включая сравнение количества обнаруженных меченых молекул со стандартным значением, ранее определенным для конкретной системы.

В данной области техники будет понятно, что размер субъекта и используемая система визуализации будут определять количество визуализирующей группировки, необходимое для получения диагностического изображения. Для субъекта-человека, в случае группировки радиоактивного изотопа, количество вводимого радиоактивного соединения обычно будет лежать в диапазоне примерно от 5 до 20 милликюри для ⁹⁹Тс. Затем меченое антитело будет предпочтительно накапливаться в месте расположения клеток, которые содержат этот конкретный белок. Визуализация опухоли in vivo описана в S.W. Burchiel et at., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (глава 13 в Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

В зависимости от нескольких показателей, включая тип используемой метки и способ введения, промежуток времени после введения с целью обеспечения возможности меченому антителу сконцентрироваться у субъекта предпочтительно в местах экспрессии антигена и чтобы содержание несвязавшегося меченого антитела достигло фонового уровня, составляет от 6 до 48 часов, или от 6 до 24 часов, или от 6 до 12 часов. В другом воплощении промежуток времени после введения составляет от 5 до 20 суток или от 5 до 10 суток.

В некоторых воплощениях мониторинг VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния осуществляют, повторяя применение способа диагностики VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, например, через один месяц после проведения первоначальной диагностики, через шесть месяцев после проведения первоначальной диагностики, через один год после проведения первоначальной диагностики и так далее.

Присутствие меченой молекулы у субъекта можно обнаружить, используя методы, известные в данной области техники для сканирования in vivo. Эти методы зависят от типа используемой метки. Специалисты в данной области будут в состоянии определить соответствующий метод детектирования конкретной метки. Методы и устройства, которые могут быть использованы в диагностических способах, предложенных в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, компьютерную томографию (СТ), сканирование всего тела, как например, позитронно-эмиссионную томографию (PET), магнитно-резонансную визуализацию (MRI) и эхографию.

В одном из воплощений молекулу метят радиоактивным изотопом и детектируют у пациента с использованием чувствительного к излучению хирургического инструмента (Thurston и др., патент США №5441050). В другом воплощении молекулу метят флуоресцентным соединением и детектируют у пациента с использованием чувствительного к флуоресценции сканирующего устройства. В другом воплощении молекулу метят испускающим позитроны металлом и детектируют у пациента с использованием позитронно-эмиссионной томографии. В еще одном воплощении молекулу метят парамагнитной меткой и детектируют у пациента с использованием магнитно-резонансной визуализации (MRI).

АНТИ-VISTA ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ

В первом воплощении анти-VISTA терапевтическим агентом является агент, который ингибирует функцию ингибитора контрольной точки VISTA. Ингибирование ингибирующей функции VISTA может осуществляться на уровне ДНК, РНК или белка. В некоторых воплощениях для ингибирования экспрессии VISTA можно использовать ингибирующую нуклеиновую кислоту (например, двухцепочечную РНК (дцРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или малую шпилечную РНК (мшРНК)). В других воплощениях ингибитором VISTA-ингибирующего сигнала является полипептид, например, растворимый лиганд (например, PSGL-1-Fc), либо антитело или его антиген-связывающий фрагмент (также обозначаемые в данном описании как "молекула антитела"), которое(ый) связывается с VISTA. Предпочтительно, анти-VISTA терапевтическим агентом является антитело.

Антитела, ингибирующие функцию VISTA, особенно полезны для лечения рака. Ранее авторы настоящего изобретения описывали антитела, направленные против VISTA, которые вызывают сильное подавление опухолевого роста (см. заявки WO 2014/197849 и WO 2016/094837; обе они включены в данное описание посредством ссылки). В данной области техники также описаны и другие антитела к VISTA, обладающие противораковыми свойствами (см., например, WO 2014/039983 А1, WO 2015/145360 А1, WO 2015/097536, WO 2017/137830, WO 2017/181139; все они тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте).

Такие высокоспецифичные и/или специфичные к VISTA антитела (называемые в данном описании как "антитела к VISTA") могут быть поликлональными ("PAb к VISTA") или моноклональными ("MAb к VISTA"), хотя для терапевтических применений и, в некоторых случаях, диагностических или других применений in vitro предпочтительны моноклональные антитела.

В конкретных воплощениях антитело представляет собой гуманизированное антитело, моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или любую их комбинацию. В конкретных воплощениях антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое описано в WO 2016/094837 (например, 5В, 46А, 97А, 128А, 146С, 208А, 215А, 26А, 164А, 230А, 76Е1, 53А, 259А, 33А, 39А, 124А, 175А, 321D, 141А, 51А, 353А или 305А, описанные там (например, в Таблицах 12-33 заявки WO 2016/094837), содержащие V_H-домен, V_L-домен, V_H CDR1, V_H CDR2, V_H CDR3, V_L CDR1, V_L CDR2 и/или V_L CDR3), или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с полипептидом VISTA (например, экспрессированным на клеточной поверхности или растворимым VISTA), фрагментом VISTA или эпитопом VISTA.

В других воплощениях, антителами к VISTA, используемыми в способе по изобретению являются антитела, (1) которые конкурентно блокируют (например, дозозависимым образом) связывание антитела к VISTA, описанного в WO 2016/094837, с полипептидом VISTA (например, экспрессированным на клеточной поверхности или растворимым VISTA), фрагментом VISTA или эпитопом VISTA, и/или (2) которые связываются с эпитопом VISTA, который связывается с антителом к VISTA (например, с гуманизированными антителами к VISTA), описанным в WO 2016/094837. В других воплощениях данное антитело конкурентно блокирует связывание (например, дозозависимым образом) моноклонального антитела 5В, 46А, 97А, 128А, 146С, 208А, 215А, 26А, 164А, 230А, 76Е1, 53А, 259А, 33А, 39А, 124А, 175А, 321D, 141А, 51А, 353А или 305А, описанного там (например, в Таблицах 12-33), или его гуманизированного варианта с полипептидом VISTA (например, экспрессированным на клеточной поверхности или растворимым VISTA), фрагментом VISTA или эпитопом VISTA. В других воплощениях данное антитело связывается с эпитопом VISTA, который связывается с (например, распознается) моноклональным антителом 5В, 46А, 97А, 128А, 146С, 208А, 215А, 26А, 164А, 230А, 76Е1, 53А, 259А, 33А, 39А, 124А, 175А, 321D, 141А, 51А, 353А или 305А, описанным в WO 2016/094837 (например, в Таблицах 12-33), или его гуманизированным вариантом (например, с гуманизированными антителами к VISTA).

Более предпочтительно, антитело к VISTA из способа по данному изобретению представляет собой антитело 26А, описанное в WO 2016/094837. В первом воплощении это антитело содержит тяжелую цепь, содержащую 3 CDR, и легкую цепь, содержащую 3 CDR, при этом указанные CDR показаны в Таблице 4. В другом воплощении антитело к VISTA содержит тяжелую цепь, содержащую 3 CDR, и легкую цепь, содержащую 3 CDR, при этом указанные CDR показаны в Таблице 5.

Моноклональные антитела к VISTA по изобретению включают как интактные молекулы, так и фрагменты антител (такие как, например, фрагменты Fab и F(ab')₂), которые обладают способностью специфически связываться с VISTA. У фрагментов Fab и F(ab')₂ отсутствует Fc фрагмент интактного антитела, они быстрее выводятся из кровотока животного или из растения и могут характеризоваться меньшим неспецифическим связыванием с тканью, чем интактное антитело (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med., 24: 316). Поэтому фрагменты антител можно использовать в терапевтическим целях, среди других применений.

Термин "фрагмент антитела" относится к части полноразмерного антитела, обычно к области связывания с мишенью или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты. Фрагмент "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания мишени и связывания с ней. Этот участок представляет собой димер, составленный из одного вариабельного домена тяжелой и одного вариабельного домена легкой цепи в плотной нековалентной ассоциации (в виде димера VH-VL). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют друг с другом с образованием сайта связывания с мишенью на поверхности димера VH-VL. Зачастую шесть CDR придают антителу специфичность связывания с мишенью. Однако, в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к мишени) может обладать способностью распознавать мишень и связываться с ней, хотя с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания. "Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител содержат VH- и VL-домены антитела, при этом такие домены присутствуют в виде единой полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания с мишенью. "Однодоменные антитела" состоят из одиночных VH- или VL-доменов, которые проявляют достаточную аффинность к VISTA. В конкретном воплощении однодоменное антитело представляет собой верблюжье антитело (см., например, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods, 231: 25-38).

Фрагмент Fab содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен тяжелой цепи (СН1). Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab несколькими добавленными остатками на карбоксильном конце домена тяжелой цепи СН1, в том числе наличием одного или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. Фрагменты F(ab') образуются в результате расщепления дисульфидной связи между содержащимися в шарнирной области остатками цистеина в продукте F(ab')₂, полученном после расщепления пепсином. Дополнительные химические реакции сочетания фрагментов антител известны специалистам средней квалификации в данной области техники.

Моноклональные антитела к VISTA по изобретению могут представлять собой химерные антитела. Термин "химерное" антитело, использованный в данном описании, относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, происходящие из иммуноглобулинов видов, не являющихся человеком, как например, крысиного или мышиного антитела, и константные области иммуноглобулинов человека, обычно выбранные из матрицы иммуноглобулинов человека. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison, 1985, Science, 229(4719): 1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; патенты США №№5807715, 4816567 и 4816397, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Моноклональные антитела к VISTA по изобретению могут быть гуманизированными. "Гуманизированными" формами нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие связывающиеся с мишенью подпоследовательности антител), которые содержат минимальные последовательности, происходящие из иммуноглобулинов видов, не являющихся человеком. В общем случае, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из вариабельных доменов, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют таковым иммуноглобулина вида, не являющегося человеком, и все или по существу все FR области являются такими же, как консенсусная последовательность иммуноглобулина человека, и могут называться "CDR-привитыми". Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), в типичном случае, часть консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Способы гуманизации антител, включая способы конструирования гуманизированных антител, известны в данной области техники. См., например, Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77; Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res., 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol., 40: 101-111; Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-7; патенты США №№:5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370 за авторством Queen и др.; ЕР 239400; РСТ публикацию заявки WO 91/09967; патент США №5225539; ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng., 7: 805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 969-973; и патент США №5565332, все они тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте.

ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛО

Кроме того, согласно данному изобретению предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, предложенное в данной заявке, которое связывается с PSGL-1 (например, с полипептидом PSGL-1, фрагментом полипептида PSGL-1, эпитопом PSGL-1). Кроме того, согласно данному изобретению предложены полинуклеотиды, которые гибридизуются в условиях гибридизации высокой жесткости, промежуточной или низкой жесткости, например, как определено выше, с полинуклеотидами, которые кодируют антитело или модифицированное антитело, предложенное в данной заявке.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, предложенное в данной заявке, которое связывается с VISTA (например, полипептидом VISTA, фрагментом полипептида VISTA, эпитопом VISTA). Кроме того, согласно данному изобретению предложены полинуклеотиды, которые гибридизуются в условиях гибридизации высокой жесткости, промежуточной или низкой жесткости, например, как определено выше, с полинуклеотидами, которые кодируют антитело или модифицированное антитело, предложенное в данной заявке.

В некоторых воплощениях молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в данной заявке, содержат нуклеиновокислотную последовательность или состоят из нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность VH и/или VL, приведенную в данном описании, или любую их комбинацию (например, такую, как нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело, предложенное в данной заявке, например, полноразмерное антитело, тяжелую и/или легкую цепь антитела или одноцепочечное антитело, предложенное в данной заявке).

РЕКОМБИНАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ АНТИТЕЛА

Для экспрессии антител по настоящему изобретению, например, антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA, описанных в данной заявке, можно использовать разнообразные системы для экспрессии. Согласно одному из аспектов такие системы для экспрессии представляют собой носители, с помощью которых могут быть получены и впоследствии очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, но также представляют собой клетки, которые после временной трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями экспрессируют in situ антитело по изобретению.

Согласно изобретению предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, описанные в данной заявке. В одном из воплощений вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь IgG антитела по изобретению, т.е. антитела, которое несет мутацию в Fc домене. В другом воплощении указанный полинуклеотид кодирует легкую цепь IgG антитела по изобретению. Согласно изобретению также предложены векторы, содержащие молекулы полинуклеотидов, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.

Чтобы осуществить экспрессию тяжелой и/или легкой цепи антитела, описанного в данной заявке, такого как антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA, полинуклеотиды, кодирующие указанные тяжелую и/или легкую цепи, встраивают в экспрессирующие векторы, в результате чего гены оказываются функционально связанными с регулирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями.

Термин "функционально связанные" последовательности включает в себя как контролирующие экспрессию последовательности, которые примыкают к представляющему интерес гену, так и контролирующие экспрессию последовательности, которые для регулирования представляющего интерес гена являются транс-регуляторными или действуют на расстоянии. Термин "контролирующая экспрессию последовательность", использованный в данном описании, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации транскрипции, промотора и энхансера; эффективные сигналы, управляющие процессингом РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белков; и при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белков. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; такие контролирующие последовательности у прокариот обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; такие контролирующие последовательности у эукариот обычно включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Подразумевается, что термин "контролирующие последовательности" включает в себя, как минимум, все компоненты, присутствие которых важно для экспрессии и процессинга, и также могут включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности и последовательности партнеров слияния.

Термин "вектор", использованный в данном описании, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, обладающей способностью переносить другую нуклеиновую кислоту, которая к ней присоединена. Одним из типов вектора является "плазмида", обозначающая кольцевую петлю из двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы для клеток млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы для клеток млекопитающих) после введения в клетку хозяина могут интегрироваться в геном клетки хозяина и тем самым реплицироваться наряду с геномом хозяина.

Некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном описании "рекомбинантными экспрессирующими векторами" (или просто "экспрессирующими векторами"). Как правило, экспрессирующие векторы, используемые в методах рекомбинантной ДНК, находятся в форме плазмид. В описании настоящего изобретения "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Тем не менее, подразумевается, что данное изобретение включает такие формы экспрессирующих векторов, как бактериальные плазмиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), космиды, ретровирусы, происходящие из EBV (вирус Эпштейна-Барр) эписомы и все другие векторы, которые, как будет известно квалифицированному специалисту, удобны для обеспечения экспрессии тяжелых и/или легких цепей антител по изобретению. Квалифицированному специалисту будет понятно, что полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, можно клонировать в разные векторы или в один и тот же вектор. В предпочтительном воплощении указанные полинуклеотиды клонированы в два вектора.

Полинуклеотиды по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы, можно использовать для трансформации подходящей клетки хозяина. Подразумевается, что термин "клетка-хозяин", использованный в данном описании, относится к клетке, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор для того, чтобы экспрессировать антитело по настоящему изобретению (например, антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA). Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной подвергаемой воздействию клетки, но также и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить некоторые модификации вследствие либо мутаций, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может быть не идентично родительской клетке, но все же будет включено в объем термина "клетка-хозяин", использованного в данном описании.

Трансформация может быть осуществлена любым методом, известным для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Такие методы хорошо известны специалисту в данной области техники и включают декстран-опосредуемую трансформацию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредуемую трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида в липосомы, введение методом биолистики и микроинъекцию ДНК непосредственно в ядра.

Клетка-хозяин может быть совместно трансфицирована двумя или более экспрессирующими векторами, в том числе вектором, экспрессирующим белок по изобретению. В частности, другие экспрессирующие векторы могут кодировать ферменты, вовлеченные в посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование. Например, клетка-хозяин может быть трансфицирована первым вектором, кодирующим антитело, описанное выше (например, антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA), и вторым вектором, кодирующим полипептид - гликозилтрансферазу. Альтернативно, клетка-хозяин может быть трансфицирована первым вектором, кодирующим антитело (например, антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA), вторым вектором, кодирующим гликозилтрансферазу, описанную выше, и третьим вектором, кодирующим другую гликозилтрансферазу. Для экспрессии рекомбинантных терапевтических иммуноглобулинов обычно используются клетки млекопитающих, особенно для экспрессии целых рекомбинантных антител. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки HEK293 (почки эмбриона человека, линии 293) или яичников китайского хомячка (СНО), вместе с вектором содержащим сигнал экспрессии, таким как вектор, несущий главный промоторный элемент немедленно раннего гена из цитомегаловируса человека, являются эффективной системой для экспрессии антитела по настоящему изобретению, в первую очередь антитела к PSGL-1 или антитела к VISTA (Foecking et al., 1986, Gene, 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology, 8: 2).

Кроме того, можно выбрать клетку хозяина, которая модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и осуществляет процессинг генного продукта конкретным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг белковых продуктов могут быть важны для функционирования данного белка. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Для обеспечения корректной модификации и процессинга представляющего интерес экспрессируемого белка выбирают соответствующие клеточные линии или системы хозяев. По этой причине можно использовать эукариотические клетки хозяина, которые обладают клеточным механизмом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования генного продукта. Такие клетки хозяина в случае млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, клетки СНО, COS, HEK293, NS0, BHK (почки новорожденного сирийского хомячка), Y2/0, 3Т3 или клетки миеломы (все эти клеточные линии доступны в государственных депозитных учреждениях, таких как Национальная коллекция культур микроорганизмов, Париж, Франция, или в Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США).

Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительна стабильная экспрессия. В одном из воплощений изобретения могут быть сконструированы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют антитело (например, антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA). Вместо использования экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации, клетки хозяина трансфицируют ДНК, контролируемой соответствующими регулирующими экспрессию элементами, включая промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и другие соответствующие последовательности, известные специалисту в данной области техники, и содержащей селектируемый маркер. После введения чужеродной ДНК сконструированные клетки можно оставить расти в течение одних-двух суток в обогащенной среде, после чего перевести их на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость, необходимую для отбора, и его присутствие дает возможность клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и расти до получения клеточной линии. В данной области техники известны и другие способы создания стабильных клеточных линий. В частности, разработаны методы сайт-специфической интеграции. Согласно этим способам трансцифированную ДНК под контролем соответствующих регулирующих экспрессию элементов, включая промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и другие соответствующие последовательности, интегрируют в геном клетки хозяина в конкретный целевой сайт, по которому заранее было проведено расщепление (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; US 5792632; US 5830729; US 6238924; WO 2009/054985; WO 03/025183; WO 2004/067753, все они включены в данное описание посредством ссылки).

Можно использовать ряд систем селекции, включая, но не ограничиваясь этим, гены тимидинкиназы (tk) вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell, 11: 223, 1977), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (hgprt) (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 202, 1992), глутаматсинтазы, с селекцией в присутствии метионинсульфоксимида (Adv. Drug Del. Rev., 58: 671, 2006 и web-сайт или список литературы от Lonza Group Ltd.), и аденинфосфорибозилтрансферазы (aprt) (Lowy et al., Cell, 22. 8-17, 1980), которые могут быть применены в tk-, hgprt- или aprt-несущих клетках, соответственно. Кроме того, в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам в случае следующих генов: dhfr (гена дигидрофолатредуктазы), который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 357, 1980); gpt (гена глутамат-пируваттрансаминазы), который придает устойчивость к микофенольной кислоте (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072, 1981); neo (гена неомицинфосфотрансферазы), который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu et al., Biotherapy, 3: 87, 1991; и hygro (гена устойчивости к гигромицину), который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene, 30: 147, 1984). Для селекции желаемого рекомбинантного клона можно неизменно применять методы, общеизвестные в области технологии рекомбинантной ДНК, и такие методы описаны, например, в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993). Уровни экспрессии антитела могут быть повышены с применением амплификации вектора. Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, способен амплифицироваться, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре, будет вызывать увеличение числа копий маркерного гена. Поскольку амплифицированный участок связан с геном, кодирующим целевое антитело (например, антитело к PSGL-1 или антитело к VISTA), продуцирование указанного антитела также будет усиливаться (Crouse et al., Mol. Cell. Biol., 3: 257, 1983). Существуют альтернативные способы экспрессии гена по изобретению, и они известны специалистам в данной области техники. Например, можно сконструировать модифицированный ген белка с цинковыми пальцами, который способен связываться с регулирующими экспрессию элементами, располагающимися вверх по течению от гена по изобретению; экспрессия указанного сконструированного белка с цинковыми пальцами (ZFN) в клетке хозяина по изобретению приводит к усилению продуцирования белка (см., например, Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5), 1180-1189, 2006). Более того, ZFN может стимулировать интеграцию ДНК в заранее заданное место генома, что приводит к высокоэффективному сайт-специфическому присоединению гена (Moehle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 3055, 2007).

Антитело по изобретению может быть получено путем выращивания культуры трансформированных клеток хозяина в условиях культивирования, необходимых для экспрессии желаемого антитела. Затем полученное экспрессированное антитело может быть очищено из культуральной среды или клеточных экстрактов. Растворимые формы антитела можно извлечь из культурального супернатанта. Затем их можно подвергнуть очистке любым методом, известным в данной области техники для очистки молекул иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности, за счет аффинности к Fc после очистки на носителе с иммобилизованным белком А и так далее), центрифугированием, с использованием дифференциальной растворимости или любым другим стандартным методом, применяемым для очистки белков. Подходящие методы очистки будут очевидны специалистам средней квалификации в данной области техники.

КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ И СЛИТЫЕ БЕЛКИ

В некоторых воплощениях, антитела, предложенные в данной заявке, конъюгированы или слиты рекомбинантным путем с диагностическим, детектируемым или терапевтическим агентом или любой другой молекулой. Конъюгированные или слитые рекомбинантным путем антитела могут быть полезны, например, для мониторинга или прогнозирования начала, развития, прогрессирования и/или тяжести VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния в качестве части процедуры клинических испытаний, таких как определение эффективности конкретной терапии.

Подобная диагностика и детекция могут быть выполнены, например, посредством осуществления реакции сочетания антитела (например, антитела к PSGL-1) с детектируемыми веществами, включая, но не ограничиваясь этим, различные ферменты, такие как, но не ограничиваясь этим, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; простетические группы, такие как, но не ограничиваясь этим, стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные вещества, такие как, но не ограничиваясь этим, умбеллиферон флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные вещества, такие как, но не ограничиваясь этим, люминол; биолюминесцентные вещества, такие как, но не ограничиваясь этим, люцифераза, люциферин и экворин; хемилюминесцентное вещество как, но не ограничиваясь этим, соединение на основе акридиния или HALOTAG; радиоактивные материалы, такие как, но не ограничиваясь этим, йод (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I и ¹²¹I), углерод (¹⁴С), сера (³⁵S), тритий (³Н), индий (¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In и ¹¹¹In), технеций (⁹⁹Тс), таллий (²⁰¹Ti), галлий (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), палладий (¹⁰³Pd), молибден (⁹⁹Мо), ксенон (¹³³Хе), фтор (¹⁸F), ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁴⁷Sc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru, ⁶⁸Ge, ⁵⁷Co, ⁶⁵Zn, ⁸⁵Sr, ³²P, ¹⁵³Gd, ¹⁶⁹Yb, ⁵¹Cr, ⁵⁴Mn, ⁷⁵Se, ¹¹³Sn и ¹¹⁷Sn; и испускающие позитроны металлы при использовании различных видов позитронно-эмиссионной томографии, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены антитела, которые конъюгированы или слиты рекомбинантным путем с терапевтической группировкой (либо одной или более чем одной терапевтической группировкой), а также их применения. Антитело может быть конъюгировано или слито рекомбинантным путем с терапевтической группировкой, такой как цитотоксин, например, цитостатический или разрушающий клетки агент, терапевтический агент или ион радиоактивного металла, например, источники альфа-излучения. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является губительным для клеток. Терапевтические группировки включают, но не ограничиваются этим, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин); алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BCNU обозначает бис-хлорэтилнитрозомочевину) и ломустин (CCNU обозначает 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевину), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину(II) (DDP) и цисплатин); антрациклины (например, даунорубицин (прежде дауномицин) и доксорубицин); антибиотики (например, актиномицин D (прежде актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)); молекулы на основе ауристатина (например, ауристатин РНЕ, ауристатин F, монометилауристатин Е, бриостатин 1 и соластатин 10; см. Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother., 46: 3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother., 45: 3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs, 12: 735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266: 76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol., 15: 367-72 (1999), все они включены в данное описание посредством ссылки); гормоны (например, глюкокортикоиды, прогестины, андрогены и эстрогены), ингибиторы ферментов репарации ДНК (например, этопозид или топотекан), ингибиторы киназ (например, соединение ST1571, иматиниба мезилат (Kantarjian et al., Clin. Cancer Res., 8(7): 2167-76 (2002)); цитотоксические агенты (например, паклитаксел, цитохалазин В, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи и соединения, раскрытые в патентах США №№6245759, 6399633, 6383790, 6335156, 6271242, 6242196, 6218410, 6218372, 6057300, 6034053, 5985877, 5958769, 5925376, 5922844, 5911995, 5872223, 5863904, 5840745, 5728868, 5648239, 5587459); ингибиторы фарнезилтрансферазы (например, R115777, BMS-214662 и ингибиторы, описанные, например, в патентах США №№:6458935, 6451812, 6440974, 6436960, 6432959, 6420387, 6414145, 6410541, 6410539, 6403581, 6399615, 6387905, 6372747, 6369034, 6362188, 6342765, 6342487, 6300501, 6268363, 6265422, 6248756, 6239140, 6232338, 6228865, 6228856, 6225322, 6218406, 6211193, 6187786, 6169096, 6159984, 6143766, 6133303, 6127366, 6124465, 6124295, 6103723, 6093737, 6090948, 6080870, 6077853, 6071935, 6066738, 6063930, 6054466, 6051582, 6051574 и 6040305); ингибиторы топоизомеразы (например, камптотецин; иринотекан; SN-38; топотекан; 9-аминокамптотецин; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; рубитекан; пиразолоакридин; XR-5000; сентопин (saintopin); UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518 В; КТ6006; КТ6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506 и ребеккамицин); булгареин (bulgarein); вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК, такие как краситель Hoescht 33342 и краситель Hoechst 33258; нитидин; фагаронин; эпиберберин; коралин; бета-лапахон; ВС-4-1; бифосфонаты (например, алендронат, цимадронат, клодронат, тилудронат, этидронат, ибандронат, неридронат, олпандронат, ризедронат, пиридронат, памидронат, золедронат); ингибиторы HMG-CoA (3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А) редуктазы (например, ловастатин, симвастатин, аторвастатин, правастатин, флувастатин, статин, церивастатин, лескол, липитор, розувастатин и аторвастатин); антисмысловые олигонуклеотиды (например, описанные в патентах США №№6277832, 5998596, 5885834, 5734033 и 5618709); ингибиторы аденозиндезаминазы (например, флударабина фосфат и 2-хлордезоксиаденозин); ибритутомаб тиуксетан (Zevalin®); тозитумомаб (Bexxar®)) и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, клатраты и пролекарства.

Кроме того, антитело, предложенное в данной заявке, может быть конъюгировано или слито рекомбинантным путем с терапевтической группировкой или группировкой лекарственного средства, которая модифицирует определенный биологический ответ. Терапевтические группировки или группировки лекарственного средства не должны истолковываться как ограниченные классическими химическими терапевтическими агентами. Например, группировка лекарственного средства может представлять собой белок, пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин синегнойной палочки, холерный токсин или дифтерийный токсин; такой белок, как фактор некроза опухоли (TNF), γ-интерферон, α-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, апоптотический агент, например, TNF-γ, TNF-γ, AIM (молекула-индуктор активации) I (см. международную публикацию №WO 97/33899), AIM II (см. международную публикацию № WO 97/34911), Fas лиганд (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567-1574) и VEGF (см. международную публикацию № WO 99/23105), антиангиогенный агент, например, ангиостатин, эндостатин или компонент каскада коагуляции (например, тканевой фактор); или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин (например, интерферон-гамма, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-5 ("IL-5"), интерлейкин-6 ("IL-6"), интерлейкин-7 ("IL-7"), интерлейкин 9 ("IL-9"), интерлейкин-10 ("IL-10"), интерлейкин-12 ("IL-12"), интерлейкин-15 ("IL-15"), интерлейкин-23 ("IL-23"), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF") и гранул о цитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF")) или фактор роста (например, гормон роста ("GH")), или вызывающий коагуляцию агент (например, кальций, витамин K, тканевые факторы, такие как, но не ограничиваясь этим, фактор Хагемана (фактор XII), высокомолекулярный кининоген (HMWK), прекалликреин (PK), вызывающие коагуляцию белковые факторы II (протромбин), фактор V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, фосфолипид и мономер фибрина).

Кроме того, согласно данному изобретению предложены антитела, которые слиты рекомбинантным путем или химически конъюгированы (посредством ковалентного или нековалентного конъюгирования) с гетерологичным белком или полипептидом (или его фрагментом, например, с полипептидом, состоящим из примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 80, примерно 90 или примерно 100 аминокислот) с образованием слитых белков, а также их применение. В частности, согласно данному изобретению предложены слитые белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, предложенного в данной заявке (например, Fab фрагмент, Fd фрагмент, Fv фрагмент, F(ab)₂ фрагмент, VH-домен, VH CDR, VL-домен или VL CDR), и гетерологичный белок, полипептид или пептид. В одном из воплощений гетерологичный белок, полипептид или пептид, с которым слито антитело, полезен для направленного воздействия антитела на клетку конкретного типа, например, клетку, которая экспрессирует PSGL-1 или VISTA. Например, антитело, которое связывается с рецептором на клеточной поверхности, экспрессированным клеткой конкретного типа (например, иммунной клеткой), может быть слито или конъюгировано с модифицированным антителом, предложенным в данной заявке.

Помимо этого, антитело, предложенное в данной заявке, может быть конъюгировано с такими терапевтическими группировками, как ион радиоактивного металла, например, источниками альфа-излучения, такими как ²¹³Bi, либо макроциклическими хелаторами, полезными для конъюгирования ионов радиоактивных металлов, включая, но не ограничиваясь этим, ¹³¹In, ¹³¹Lu, ¹³¹Y, ¹³¹Но, ¹³¹Sm, с полипептидами. В некоторых воплощениях макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусную кислоту (DOTA), которая может быть присоединена к антителу через линкерную молекулу. Такие линкерные молекулы широко известны в данной области техники и описаны в работах Denardo et al., 1998, Clin. Cancer Res., 4(10): 2483-90; Peterson et al, 1999, Bioconjug. Chem., 10(4): 553-7; и Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol., 26(8): 943-50, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Кроме того, для облегчения очистки антитела, предложенные в данной заявке, могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептиды. В конкретных воплощениях маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, предусмотренный в векторе pQE (QIAGEN, Inc.), который, среди многих прочих, имеется в продаже. Как описано в Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 821-824, например, наличие гексагистидина обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, полезные для очистки, включают, но не ограничиваются этим, гемагглютининовую ("НА") метку, которая соответствует эпитопу белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., 1984, Cell, 37: 767), и метку "FLAG".

Способы слияния или конъюгирования терапевтических группировок (в том числе полипептидов) с антителами хорошо известны, см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al, (eds.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press, 1985), Thorpe et al. 1982, Immunol. Rev., 62: 119-58; патенты США №№5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095 и 5112946; ЕР 307434; ЕР 367166; ЕР 394827; публикации РСТ WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 и WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11337-11341, 1992, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Слитые белки могут быть получены, например, с помощью методов перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов и/или перетасовки кодонов (в совокупности называемых "перетасовкой ДНК"). Перетасовка ДНК может быть использована для изменения активности антител, предложенных в данной заявке (например, для получения антител с более высокой аффинностью и более низкими константами скорости диссоциации). В общем случае см. патенты США №№5605793, 5811238, 5830721, 5834252 и 5837458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol., 16(2): 76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287: 265-76; и Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques, 24(2): 308-313 (каждый из этих патентов и каждая из этих публикаций тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте). Антитела или кодируемые антитела могут быть в результате подвергания методикам случайного мутагенеза с применением допускающей ошибки ПЦР, случайной вставки нуклеотидов или других методов перед проведением рекомбинации. Полинуклеотид, кодирующий антитело, предложенное в данной заявке, может быть повторно объединен с одним или более компонентами, мотивами, секциями, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или более чем одной из гетерологичных молекул.

Антитело, предложенное в данной заявке, также может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела, как описано в патенте США №4676980, который включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Терапевтическая группировка или лекарственное средство, конъюгированное или слитое рекомбинантным путем с антителом, предложенным в данной заявке, которое связывается с PSGL-1, должно быть выбрано с целью достижения желаемого(ых) профилактического(их) или терапевтического(их) эффекта(ов). В некоторых воплощениях антитело представляет собой модифицированное антитело. Лечащий врач или другой медицинский работник при принятии решения о том, какую терапевтическую группировку или лекарственное средство следует конъюгировать или рекомбинантным путем сливать с антителом, предложенным в данной заявке, должен учитывать следующее: природу заболевания, тяжесть заболевания и состояние здоровья субъекта.

Антитела, предложенные в данной заявке, (например, антитело к PSGL-1 или к VISTA) также могут быть присоединены к твердым подложкам, которые особенно полезны для проведения иммуноанализов или очистки целевого антигена. Такие твердые подложки включают, но не ограничиваются этим, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Фармацевтические композиции, в том числе терапевтические композиции, содержащие один или более терапевтических агентов, предложенных в данной заявке (например, анти-VISTA терапевтический агент, такой как антитело к VISTA), могут быть приготовлены для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с возможными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, например на основе фосфата, цитрата и других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид, бензетонийхлорид; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ион натрия; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONIC™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Кроме того, анти-VISTA терапевтические агенты, предложенные в данной заявке, в первую очередь антитела к VISTA, могут быть, например, введены в состав липосом. Липосомы, содержащие представляющую интерес молекулу, готовят способами, известными в данной области техники, как например, описано в Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030; и патентах США №№4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем нахождения в кровотоке описаны в патенте США №5013556.

В частности, методом обращенно-фазового выпаривания могут быть образованы полезные иммунолипосомы с липидным составом, в который входят фосфатидилхолин, холестерин и производное фосфатидилэтаноламина и PEG (PEG-PE). Липосомы продавливают через фильтры с порами определенного размера, получая липосомы желаемого диаметра. Fab' фрагменты антитела, предложенного в данной заявке, могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в Martin et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 286-288, посредством реакции дисульфидного обмена. Внутри такой липосомы возможно содержится химиотерапевтический агент (такой как доксорубицин); см. Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst., 81(19): 1484.

Композиции, как например, описанные в данной заявке, также могут содержать больше одного активного соединения, которое необходимо для конкретного подвергаемого лечению показания. В некоторых воплощениях композиции содержат предложенный в данной заявке анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) и одно или более активных соединений с дополняющими активностями, которые не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Соответственно, такие молекулы представлены в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели. Например, антитело, предложенное в данной заявке, может быть скомбинировано с одним или более чем одним другим терапевтическим агентом. Такую комбинированную терапию можно вводить пациенту периодически либо совместно или последовательно.

Предложенный в данной заявке анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) также может быть заключен в микрокапсулу, приготовленную, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и микрокапсулу из поли(метилметакрилата), соответственно; в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

Композиции, предназначенные для использования посредством введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается с помощью фильтрования, например, через стерилизующие фильтрационные мембраны.

Также можно изготовить препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептид, при этом матрицы представлены в форме штампованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают матрицы из сложных полиэфиров, гидрогелей (например, из поли-2-гидроксиэтил-метакрилата или поливинилового спирта), полилактидов (патент США №3773919), сополимеров L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, неразлагаемого этиленвинилацетата, разлагаемых сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты, таких как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляной кислоты. В то время как полимеры, такие как полимеры на основе этиленвинилацетата и молочной кислоты-гликолевой кислоты, позволяют осуществлять высвобождение молекул в течение более 100 суток, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия водного окружения при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. В зависимости от вовлекаемого механизма могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации. Например, если обнаружено, что механизм агрегации заключается в образовании межмолекулярных S--S связей через тиодисульфидный обмен, то стабилизация может быть достигнута посредством модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислотных растворов, регулирования содержания влаги, использования соответствующих вспомогательных веществ и разработки специфических композиций на основе полимерных матриц.

В некоторых воплощениях фармацевтические композиции, предложенные в данной заявке, содержат терапевтически эффективные количества одного или нескольких предложенных в данной заявке анти-VISTA терапевтических агентов (например, антител к VISTA) и возможно одного или более дополнительных профилактических или терапевтических агентов в фармацевтически приемлемом носителе. Такие фармацевтические композиции полезны в предупреждении, лечении или облегчении одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния.

Фармацевтические носители, подходящие для введения соединений, предложенных в данной заявке, включают любые такие носители, известные специалистам в данной области техники как подходящие для конкретного режима введения.

Помимо этого, предложенные в данной заявке анти-VISTA терапевтические агенты, в первую очередь антитела к VISTA, могут быть приготовлены в составе композиции в виде единственного фармацевтически активного ингредиента или могут быть скомбинированы с другими активными ингредиентами (как например, с одним или более чем одним другим профилактическим или терапевтическим агентом).

Данные композиции могут содержать одно или более антител, предложенных в данной заявке. В некоторых воплощениях на основе предложенных в данной заявке анти-VISTA терапевтических агентов (например, антител к VISTA) готовят подходящие фармацевтические препараты, такие как растворы, суспензии, таблетки, диспергируемые таблетки, пилюли, капсулы, порошки, композиции с длительным высвобождением или эликсиры, для перорального введения либо стерильные растворы или суспензии для парентерального введения, а также препарат в форме трансдермального пластыря и ингаляторов сухого порошка. В некоторых воплощениях на основе предложенных в данной заявке анти-VISTA терапевтических агентов (например, антител к VISTA), описанных выше, готовят фармацевтические композиции, используя методы и методики, хорошо известные в данной области техники (см., например, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4^th ed, p.126).

В некоторых воплощениях композиций один или несколько анти-VISTA терапевтических агентов (например, одно антитело к VISTA) в эффективных концентрациях смешивают с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых воплощениях содержание соединений в композициях является эффективным для доставки количества, после их введения, которое лечит, предупреждает либо ослабляет VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние либо его симптом.

В некоторых воплощениях композиции готовят для введения в виде однократной дозы. Для приготовления композиции массовую долю соединения в эффективной концентрации растворяют, суспендируют, диспергируют в выбранном носителе или иным образом смешивают с ним с тем, чтобы имело место облегчение, предупреждение подвергаемого лечению состояния или ослабление одного или более чем одного симптома.

В некоторых воплощениях предложенный в данной заявке анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) вводят в фармацевтически приемлемый носитель в эффективном количестве, достаточном для оказания терапевтически полезного действия в отсутствие нежелательных побочных эффектов на подвергаемого лечению пациента. Терапевтически эффективную концентрацию можно определить эмпирически путем тестирования соединений в системах in vitro и in vivo с использованием рутинных методов и затем экстраполировать эти данные к дозировкам для людей.

Содержание анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) в фармацевтической композиции будет зависеть, например, от физико-химических характеристик терапевтического агента, схемы применения и вводимого количества, а также от других факторов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых воплощениях терапевтически эффективная дозировка обеспечивает достижение концентрации анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) в сыворотке крови от примерно 0,1 нг/мл до примерно 50-100 мкг/мл. Фармацевтические композиции, в другом воплощении, обеспечивают достижение дозировки терапевтического агента от примерно 0,001 мг до примерно 2000 мг на килограмм массы тела в сутки. Можно приготовить фармацевтические стандартные лекарственные формы, обеспечивающие достижение от примерно 0,01 мг; 0,1 мг или 1 мг до примерно 500 мг; 1000 мг или 2000 мг; и в некоторых воплощениях, от примерно 10 мг до примерно 500 мг анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) и/или комбинации других возможных необходимых ингредиентов на одну стандартную лекарственную форму.

Препарат на основе анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) можно вводить за один раз или можно разделять на несколько более мелких доз, подлежащих введению через интервалы времени. Очевидно, что точная дозировка и продолжительность лечения зависят от подвергаемого лечению заболевания и могут быть определены эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или посредством экстраполяции на основе данных тестирования in vivo или in vitro. Следует отметить, что величины концентраций и дозировок также могут варьировать в зависимости от тяжести подлежащего облегчению состояния. Также следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы введения можно корректировать с течением времени с учетом индивидуальных потребностей и профессионального суждения человека, осуществляющего введение или контролирующего введение композиций, и что диапазоны концентраций, указанные в данном описании, являются всего лишь типичными и не предназначены для ограничения объема или практического применения заявленных композиций.

После смешивания или добавления анти-VISTA терапевтического агента полученная смесь может представлять собой раствор, суспензию, эмульсию или тому подобное. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, включая предполагаемый режим введения и растворимость соединения в выбранном носителе или разбавителе. Эффективной концентрации достаточно для ослабления симптомов подвергаемого лечению заболевания, расстройства или состояния, и она может быть определена эмпирически.

В некоторых воплощениях предложены фармацевтические композиции для введения людям и животным в стандартных лекарственных формах, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и пероральные растворы или суспензии и эмульсии типа "масло-вводе", содержащих подходящие количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA), в некоторых воплощениях, готовят и вводят в однодозовых лекарственных формах или многодозовых лекарственных формах. Термин "однодозовые лекарственные" формы, использованный в данном описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим для субъектов, являющихся людьми и животными, и упакованным индивидуально, как это известно в данной области техники. Каждая единица дозы содержит заранее заданное количество терапевтического агента, достаточное для получения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем, наполнителем или разбавителем. Примеры однодозовых лекарственных форм включают ампулы и шприцы и индивидуально упакованные таблетки или капсулы. Однодозовые лекарственные формы можно вводить, разделяя их на доли или кратные количества. "Многодозовая лекарственная" форма представляет собой множество идентичных однодозовых лекарственных форм, упакованных в одном контейнере, вводимых в отдельной однодозовой лекарственной форме. Примеры многодозовых лекарственных форм включают флаконы, бутылочки с таблетками или капсулами либо бутылочки с пинтовыми или галлонными контейнерами. Следовательно, многодозовая лекарственная форма представляет собой множество однодозовых форм, которые находятся в одной упаковке.

В некоторых воплощениях один или несколько предложенных в данной заявке анти-VISTA терапевтических агентов (например, одно антитело к VISTA) находятся в составе жидкой фармацевтической композиции. Жидкие фармацевтические композиции для введения могут быть приготовлены, например, путем растворения, диспергирования или иного смешивания активного соединения, которое определено выше, и возможных фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, физиологический раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, гликоли, этанол и тому подобное, с образованием тем самым раствора или суспензии. При желании, фармацевтическая композиция, подлежащая введению, также может содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты, солюбилизирующие агенты, поддерживающие рН агенты и тому подобное, например, солей уксусной кислоты, цитрата натрия, производных циклодекстринов, сорбитана монолаурата, триэтаноламина, ацетата натрия, триэтаноламина олеата и других подобных агентов.

Современные способы приготовления таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области техники; например, см. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

Можно приготовить лекарственные формы или композиции, содержащие терапевтический агент, конкретно антитело, в диапазоне от 0,005% до 100%, при этом остальная часть будет составленной из нетоксичного носителя. Способы приготовления таких композиций известны специалистам в данной области техники.

Фармацевтические лекарственные формы для перорального применения находятся либо в твердой, либо гелевой, либо жидкой форме. Лекарственные формы в твердой форме включают таблетки, капсулы, гранулы и нерасфасованные порошки. Типы таблеток для перорального применения включают таблетки, полученные путем прессования, жевательные пастилки и таблетки, которые могут иметь энтеросолюбильное покрытие, сахарное покрытие или пленочное покрытие. Капсулы могут представлять собой твердые или мягкие желатиновые капсулы, в то время как гранулы и порошки могут быть предложены в нешипучей или шипучей форме, содержащей комбинацию других ингредиентов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых воплощениях композиции представляют собой лекарственные формы в твердой форме. В некоторых воплощениях композициями являются капсулы или таблетки. Таблетки, пилюли, капсулы, лепешки и тому подобное могут содержать один или более чем один из следующих ингредиентов или соединений схожей природы: связующее вещество; смазывающее вещество; разбавитель; глидант; разрыхлитель; краситель; подсластитель; ароматизатор; увлажняющий агент; вызывающее рвоту покрытие и пленочное покрытие. Примеры связующих веществ включают микрокристаллическую целлюлозу, трагакантовую камедь, раствор глюкозы, аравийскую камедь, раствор желатина, мелассу, поливинилпирролидин, повидон, кросповидоны, сахарозу и крахмальную пасту. Смазывающие вещества включают тальк, крахмал, стеарат магния или кальция, ликоподий и стеариновую кислоту.

Разбавители включают, например, лактозу, сахарозу, крахмал, каолин, соль, маннит и дикальция фосфат. Глиданты включают, но не ограничиваются этим, коллоидный диоксид кремния. Разрыхлители включают натриевую соль кроскармелозы, натрия крахмала гликолят, альгиновую кислоту, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, бентонит, метилцеллюлозу, агар и карбоксиметилцеллюлозу. Красители включают, например, любые одобренные к применению сертифицированные водорастворимые красители для применения в пищевых продуктах, лекарственных и косметических средствах (FD & С dyes), их смеси; и нерастворимые в воде FD и С красители, суспендированные в гидрате оксида алюминия. Подсластители включают сахарозу, лактозу, маннит и искусственные подсластители, такие как сахарин, и любое число высушенных распылением ароматизаторов. Ароматизаторы включают природные ароматизаторы, полученные экстракцией из растений, например, из фруктов, и смеси синтетических соединений, которые вызывают приятные вкусовые ощущения, таких как, но не ограничиваясь этим, мятное масло и метилсалицилат. Увлажняющие агенты включают пропиленгликольмоностеарат, сорбитанмоноолеат, диэтиленгликольмонолаурат и полиоксиэтиленлауриловый эфир. Покрытия из вызывающих рвоту веществ включают жирные кислоты, жиры, воски, шеллак, аммиачный шеллак и ацетатфталаты целлюлозы. Пленочные покрытия включают гидроксиэтилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликоль 4000 и ацетатфталат целлюлозы.

Предложенные в данной заявке анти-VISTA терапевтические агенты (например, антитела к VISTA) могут быть предусмотрены в составе композиции, которая защищает их от кислотной среды в желудке. Например, композиция может быть приготовлена с энтеросолюбильным покрытием, которое поддерживает ее целостность в желудке и позволяет высвобождать активное соединение в кишечнике. Композиция также может быть приготовлена в комбинации с нейтрализующим кислоту веществом или другим таким ингредиентом.

В том случае, когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, помимо вещества описанного выше типа, жидкий носитель, такой как нелетучее жидкое масло. Помимо этого стандартные лекарственные формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму стандартной дозировки, например, оболочки из сахара и других энтеросолюбильных агентов. Соединения также могут быть введены в качестве компонента эликсира, суспензии, сиропа, облатки, вскрываемой капсулы, жевательной резинки или тому подобного. Помимо активного соединения сироп может содержать сахарозу в качестве подсластителя и некоторые консерванты, красители и окрашивающие агенты и ароматизаторы.

Терапевтический агент также можно смешивать с другими активными веществами, которые не ухудшают желаемого действия, или с веществами, которые дополняют желаемое действие, такими как нейтрализующие кислоту вещества, блокаторы гистаминовых рецепторов 2 типа (Н2) и диуретики. Активным ингредиентом является анти-VISTA терапевтический агент, в первую очередь антитело или его фармацевтически приемлемое производное, описанное в данной заявке. Активный ингредиент может быть включен в более высоких концентрациях, до примерно 98% по массе.

В некоторых воплощениях на композиции в форме таблеток и капсул могут быть нанесены покрытия, как известно специалистам в данной области техники, с целью изменения или обеспечения растворения активного ингредиента. Так, например, на них может быть нанесено традиционное усваиваемое в кишечнике покрытие, например, фенилсалицилат, воски и ацетатфталат целлюлозы.

В некоторых воплощениях композиции представляют собой жидкие лекарственные формы. Жидкие лекарственные формы для перорального применения включают водные растворы, эмульсии, суспензии, растворы и/или суспензии, получаемые в результате повторного разведения из нешипучих гранул, и шипучие препараты, получаемые в результате повторного разведения из шипучих гранул. Водные растворы включают, например, эликсиры и сиропы. Эмульсии представляют собой эмульсии либо типа масло-в-воде, либо типа вода-в-масле.

Эликсиры представляют собой прозрачные, подслащенные, водноспиртовые препараты. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в эликсирах, включают растворители. Сиропы представляют собой концентрированные водные растворы сахара, например, сахарозы, и могут содержать консервант. Эмульсия представляет собой двухфазную систему, в которой одна жидкость диспергируется в форме небольших капель в другой жидкости. Фармацевтически приемлемыми носителями, используемыми в эмульсиях, являются неводные жидкости, эмульгирующие агенты и консерванты. В суспензиях применяют фармацевтически приемлемые суспендирующие агенты и консерванты. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в нешипучих гранулах, подлежащих разведению с получением жидкой пероральной лекарственной формы, включают разбавители, подсластители и увлажняющие агенты. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в шипучих гранулах, подлежащих разведению с получением жидкой пероральной лекарственной формы, включают органические кислоты и источник двуокиси углерода. Красители и ароматизаторы используют во всех вышеупомянутых лекарственных формах.

Растворители включают глицерин, сорбит, этиловый спирт и сироп. Примеры консервантов включают глицерин, метил- и пропилпарабен, бензойную кислоту, бензоат натрия и спирт. Примеры неводных жидкостей, применяемых в эмульсиях, включают минеральное масло и хлопковое масло. Примеры эмульгирующих агентов включают желатин, аравийскую камедь, трагакант, бентонит и поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилен-сорбитанмоноолеат. Суспендирующие агенты включают натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, пектин, трагакант, вигум и аравийскую камедь. Подсластители включают сахарозу, сиропы, глицерин и искусственные подсластители, такие как сахарин. Увлажняющие агенты включают пропиленгликольмоностеарат, сорбитанмоноолеат, диэтиленгликольмонолаурат и полиоксиэтиленлауриловый эфир. Органические кислоты включают лимонную и винную кислоту. Источники двуокиси углерода включают бикарбонат натрия и карбонат натрия. Красители включают любые одобренные к применению сертифицированные водорастворимые FD и С красители и их смеси. Ароматизаторы включают природные ароматизаторы, полученные экстракцией из растений, например, из фруктов, и смеси синтетических соединений, которые вызывают приятные вкусовые ощущения.

В некоторых воплощениях, чтобы приготовить твердую лекарственную форму, раствор или суспензию, например, в пропиленкарбонате, растительных маслах или триглицеридах, инкапсулируют в желатиновую капсулу. Такие растворы и их приготовление и инкапсулирование описаны в патентах США №№4328245, 4409239 и 4410545. Чтобы приготовить жидкую лекарственную форму, раствор, например, в полиэтиленгликоле, может быть разбавлен достаточным количеством фармацевтически приемлемого жидкого носителя, например, воды, чтобы его было легко отмерить для введения.

Альтернативно, жидкие или полутвердые композиции для перорального применения могут быть приготовлены путем растворения или диспергирования активного соединения или его соли в растительных маслах, гликолях, триглицеридах, сложных эфирах пропиленгликоля (например, пропиленкарбонате) и других подобных носителях и инкапсулирования этих растворов или суспензий в оболочки твердых или мягких желатиновых капсул. Другие полезные композиции включают композиции, приведенные в патентах США №№RE28819 и 4358603. Кратко, такие композиции включают, но не ограничиваются этим, композиции, содержащие соединение, предложенное в данной заявке, диалкилированный моно- или полиалкиленгликоль, в том числе, но не ограничиваясь этим, 1,2-диметоксиметан, диглим, триглим, тетраглим, простой диметиловый эфир полиэтиленгликоля-350, простой диметиловый эфир полиэтиленгликоля-550, простой диметиловый эфир полиэтиленгликоля-750, где 350, 550 и 750 относятся к приблизительной средней молекулярной массе полиэтиленгликоля, и один или более антиоксидантов, таких как бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), бутилированный гидроксианизол (ВНА), пропилгаллат, витамин Е, гидрохинон, гидроксикумарин, этаноламин, лецитин, кефалин, аскорбиновая кислота, яблочная кислота, сорбит, фосфорная кислота, тиодипропионовая кислота и ее сложные эфиры и дитиокарбаматы.

Другие композиции включают, но не ограничиваются этим, водноспиртовые растворы, содержащие фармацевтически приемлемый ацеталь. Спирты, используемые в этих композициях, представляют собой любые фармацевтически приемлемые смешивающиеся с водой растворители, имеющие одну или более гидроксильных групп, включая, но не ограничиваясь этим, пропиленгликоль и этанол. Ацетали включают, но не ограничиваются этим, ди(низший алкил)ацетали (низший алкил)альдегидов, такие как диэтилацеталь ацетальдегида.

Парентеральное введение, в некоторых воплощениях, характеризуется инъекцией, и данным описанием также охвачено введение либо подкожно, либо внутримышечно, либо внутрь опухоли, либо внутривенно. Инъекционные препараты могут быть приготовлены в традиционных формах, либо в виде растворов или суспензий в жидкости, либо в виде твердых форм, подходящих для приготовления раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Инъекционные препараты, растворы и эмульсии также содержат один или более эксципиентов. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин или этанол. Помимо этого, при желании, фармацевтические композиции, подлежащие введению, также могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН агенты, стабилизаторы, усилители растворимости и другие подобные агенты, такие как, например, ацетат натрия, сорбитанмонолаурат, триэтаноламинолеат и циклодекстрины.

Имплантация системы с медленным высвобождением или с длительным высвобождением, позволяющая поддерживать постоянный уровень дозировки (см., например, патент США №3710795), также включена в данное описание. Кратко, соединение, предложенное в данной заявке, диспергируют в твердой внутренней матрице, например, из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, пластифицированного или непластифицированного поливинилхлорида, пластифицированного нейлона, пластифицированного полиэтилентерефталата, природного каучука, полиизопрена, полиизобутилена, полибутадиена, полиэтилена, сополимеров этилена и винилацетата, силиконовых каучуков, полидиметилсилоксанов, сополимеров на основе силиконкарбоната, гидрофильных полимеров, таких как гидрогели сложных эфиров акриловой и метакриловой кислот, коллаген, перекрестно сшитый поливиниловый спирт и перекрестно сшитый частично гидролизованный поливинилацетат, которая (матрица) окружена внешней полимерной мембраной, например, из полиэтилена, полипропилена, сополимеров на основе этилена/пропилена, сополимеров на основе этилена/этилакрилата, сополимеров на основе этилена/винилацетата, силиконовых каучуков, полидиметилсилоксанов, неопренового каучука, хлорированного полиэтилена, поливинилхлорида, сополимеров винилхлорида с винилацетатом, винилиденхлоридом, этиленом и пропиленом, ионсодержащего полиэтилентерефталата, бутилкаучука, эпихлоргидриновых каучуков, сополимера на основе этилена/винилового спирта, тройного сополимера на основе этилена/винилацетата/винилового спирта и сополимера на основе этилена/винилоксиэтанола, которая (мембрана) является нерастворимой в жидкостях организма. Терапевтический агент (например, антитело) диффундирует через внешнюю полимерную мембрану на стадии высвобождения с регулируемой скоростью. Количество терапевтического агента, содержащегося в таких парентеральных композициях, сильно зависит от его конкретной природы, а также активности соединения и потребностей субъекта.

Препараты для парентерального введения включают стерильные растворы, готовые для инъекций, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые для объединения с растворителем непосредственно перед применением, в том числе таблетки для подкожных инъекций, стерильные суспензии, готовые для инъекций, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые для объединения с разбавителем непосредственно перед применением, и стерильные эмульсии. Растворы могут быть либо водными, либо неводными.

В случае внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и растворы, содержащие загущающие и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль и их смеси.

Фармацевтически приемлемые носители, используемые в парентеральных препаратах, включают водные разбавители, неводные разбавители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты, комплексообразующие или хелатирующие агенты и другие фармацевтически приемлемые вещества.

Примеры водных разбавителей включают раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильную воду для инъекций, раствор Рингера с декстрозой и лактатом для инъекций. Неводные парентеральные разбавители включают нелетучие масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. В препараты для парентерального введения, упакованные в многодозовые контейнеры, могут быть добавлены антимикробные агенты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, которые включают фенолы или крезолы, соединения ртути, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый сложные эфиры л-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, бензалконийхлорид и бензетонийхлорид. Изотонические агенты включают хлорид натрия и декстрозу. Буферы включают фосфатный и цитратный буферы. Антиоксиданты включают бисульфат натрия. Местные анестетики включают прокаина гидрохлорид. Суспендирующие и диспергирующие агенты включают натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгирующие агенты включают полисорбат 80 (TWEEN® 80). Комплексообразующий или хелатирующий ионы металлов агент включает EDTA. Фармацевтически приемлемые носители также включают этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль в случае смешивающихся с водой разбавителей; и гидроксид натрия, соляную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для подведения рН.

Концентрацию фармацевтически активного анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) подводят таким образом, чтобы после инъекции обеспечить достижение эффективного количества для получения желаемого фармакологического эффекта. Точная доза зависит от возраста, массы и состояния здоровья пациента или животного, как известно в данной области техники.

Однодозовые парентеральные препараты могут быть упакованы в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения могут быть стерильными, как известно и как практикуется в данной области техники.

В качестве иллюстрации, эффективным способом введения считается внутривенная или интраартериальная инфузия стерильного водного раствора, содержащего активное соединение. Другим воплощением является стерильный(ая) водный или масляный раствор либо суспензия в воде или масле, содержащий(ая) активное вещество, вводимый(ая) путем инъекции по мере необходимости для получения желаемого фармакологического эффекта.

Инъекционные препараты предназначены для местного и системного введения. В некоторых воплощениях препарат в терапевтически эффективной дозировке готовят таким образом, чтобы в подвергаемой(ых) обработке ткани(ях) активное соединение содержалось в концентрации, составляющей по меньшей мере от примерно 0,1% (масс./масс.) до примерно 90% (масс./масс.) или выше, в определенных воплощениях, выше 1% (масс./масс.).

Терапевтический агент, такой как антитело, может быть суспендирован с получением микронизированной или другой подходящей формы. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, включая предполагаемый способ введения и растворимость соединения в выбранном носителе или разбавителе. Эффективной концентрации достаточно для ослабления симптомов VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, и она может быть определена эмпирически.

В некоторых воплощениях фармацевтические композиции представляют собой лиофилизированные порошки, которые можно повторно разводить для введения в виде растворов, эмульсий и других смесей. Кроме того, их можно повторно разводить и на их основе готовить композиции в виде твердых веществ или гелей.

Лиофилизированный порошок готовят путем растворения терапевтического агента, такого как антитело, предложенное в данной заявке, или его фармацевтически приемлемого производного в подходящем растворителе. В некоторых воплощениях лиофилизированный порошок является стерильным. Растворитель может содержать эксципиент, который улучшает стабильность, или другой фармакологический компонент порошка или раствора, приготовленного повторным разведением из данного порошка. Эксципиенты, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются этим, декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу или другой подходящий агент. Растворитель также может содержать буфер, такой как буфер на основе цитрата, фосфата натрия или калия либо другой такой буфер, известный специалистам в данной области техники, в некоторых воплощениях примерно с нейтральным значением рН. Последующие стерильная фильтрация раствора, затем лиофилизация в стандартных условиях, известных специалистам в данной области техники, обеспечивают получение желаемой композиции. В некоторых воплощениях полученный раствор будет разлит порциями во флаконы для проведения лиофилизации. Каждый флакон будет содержать однократную дозировку или несколько дозировок соединения. Лиофилизированный порошок можно хранить в соответствующих условиях, как например, при температуре от примерно 4°С до комнатной температуры.

В результате повторного разведения этого лиофилизированного порошка водой для инъекций получают композицию для применения при парентеральном введении. Для осуществления повторного разведения лиофилизированный порошок добавляют к стерильной воде или любому другому подходящему носителю. Точное количество зависит от выбранного соединения. Такое количество может быть определено эмпирически.

Смеси для местного применения готовят так, как описано для местного и системного введения. Полученная смесь может представлять собой раствор, суспензию, эмульсии или тому подобное и может быть приготовлена в виде кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, лосьонов, суспензий, настоек, паст, пенок, аэрозолей, жидкостей для промываний, спреев, суппозиториев, перевязочных материалов, дермальных пластырей или какой-либо другой композиции, подходящей для местного введения.

На основе терапевтических агентов, предложенных в данной заявке, могут быть приготовлены аэрозоли для местного применения, например, посредством ингаляции (см., например, патенты США №№4044126, 4414209 и 4364923, в которых описываются аэрозоли для доставки стероидного соединения, полезного для лечения воспалительных заболеваний, в частности, астмы). Эти композиции для введения в дыхательные пути могут быть в форме аэрозоля или раствора для небулайзера либо в виде микроизмельченного порошка для инсуффляций, по отдельности или в комбинации с инертным носителем, таким как лактоза. В таком случае частицы композиции будут, в некоторых воплощениях, иметь диаметр меньше 50 микрон, в некоторых воплощениях, меньше 10 микрон.

На основе этих терапевтических агентов могут быть приготовлены композиции для локального или местного применения, например, для местного нанесения на кожу и слизистые оболочки, например, глаза, в форме гелей, кремов и лосьонов, и для внесения в глаз, либо для интрацистернального или интраспинального применения. Местное введение предназначено для трансдермальной доставки, а также для введения в глаза или слизистую оболочку, либо для ингаляционных терапий. Кроме того, можно вводить назальные растворы активного соединения, по отдельности или в комбинации с другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Такие растворы, в частности, предназначенные для офтальмического применения, могут быть приготовлены в виде 0,01%-10%-ных изотонических растворов, рН примерно 5-7, с использованием соответствующих солей.

Другие пути введения, например, с использованием трансдермальных пластырей, в том числе ионофоретических и электрофоретических средств, и ректальное введение, также включены в данное описание.

Трансдермальные пластыри, в том числе ионофоретические и электрофоретические средства, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, такие пластыри описаны в патентах США №№6267983, 6261595, 6256533, 6167301, 6024975, 6010715, 5985317, 5983134, 5948433 и 5860957.

Фармацевтическими лекарственными формами для ректального введения являются ректальные суппозитории, капсулы и таблетки для оказания системного действия. Термин "ректальные суппозитории", используемый в данном описании, означает твердые формы для введения в прямую кишку, которые плавятся или размягчаются при температуре тела, высвобождая один или более фармакологически или терапевтически активных ингредиентов. Фармацевтически приемлемыми веществами, применяемыми в ректальных суппозиториях, являются основы или наполнители и агенты для повышения точки плавления. Примеры основ включают масло какао (масло какао-бобов), смесь глицерин-желатин, карбовакс (полиоксиэтиленгликоль) и соответствующие смеси моно-, ди- и триглицеридов жирных кислот. Можно использовать комбинации различных основ. Агенты для повышения точки плавления суппозиториев включают спермацет и воск. Ректальные суппозитории могут быть приготовлены либо способом прессования, либо формования. Масса ректального суппозитория, в некоторых воплощениях, составляет примерно 2-3 грамма.

Таблетки и капсулы для ректального введения могут быть приготовлены с использованием одного и того же фармацевтически приемлемого вещества и теми же способами, как и в случае композиций для перорального введения.

Терапевтические агенты (например, антитела) и другие композиции, предложенные в данной заявке, также могут быть приготовлены для направленного воздействия на конкретную ткань, рецептор или другую область организма подлежащего лечению субъекта. Многие из таких способов направленного воздействия хорошо известны специалистам в данной области техники. Все такие способы направленного воздействия включены в данную заявку для применения в композициях по настоящему изобретению. В качестве неограничивающих примеров способов направленного воздействия см., например, патенты США №№6316652, 6274552, 6271359, 6253872, 6139865, 6131570, 6120751, 6071495, 6060082, 6048736, 6039975, 6004534, 5985307, 5972366, 5900252, 5840674, 5759542 и 5709874.

В одном из воплощений, в качестве фармацевтически приемлемых носителей также могут быть использованы липосомальные суспензии, в том числе липосомы, направленно воздействующие на ткани, как например, липосомы, направленно воздействующие на опухоли. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. Например, липосомные композиции могут быть приготовлены так, как описано в патенте США №4522811. Кратко, липосомы, такие как многослойные везикулы (MLV), могут быть образованы в результате высушивания яичного фосфатидилхолина и фосфатидилсерина из головного мозга (в молярном соотношении 7:3) на внутренней поверхности колбы. Добавляют раствор соединения, предложенного в данной заявке, в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), не содержащем двухвалентных катионов, и колбу встряхивают, пока не диспергирует липидная пленка Полученные везикулы промывают для удаления неинкапсулированного соединения, собирают центрифугированием и затем ресуспендируют в PBS.

СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ, ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И/ИЛИ ОБЛЕГЧЕНИЯ

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у пациента. Согласно данному изобретению предложена анти-VISTA-терапия (например, антителом к VISTA, предложенным в данной заявке) для применения в предупреждении, лечении и/или облегчении одного или более чем одного симптома заболевания, расстройства или состояния, такого как VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние, в первую очередь VISTA-опосредуемый рак. Предпочтительно, указанное VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние установлено или диагностировано заранее одним из способов, предложенных в данной заявке.

В одном из воплощений настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у пациента, при этом указанное VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние установлено или диагностировано заранее одним из способов, предложенных в данной заявке. Другими словами, данное изобретение относится, таким образом к анти-VISTA терапевтическому агенту для лечения VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у пациента, при этом анти-VISTA терапевтический агент вводят пациенту, у которого диагностировано VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние с использованием описанного выше способа.

В некоторых воплощениях данного изобретения предложены композиции, содержащие одно или более чем одно антитело (например, антитело к VISTA), предложенное в данной заявке, для применения в сдерживании развития, предупреждении или лечении VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или для облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния. Типичные VISTA-опосредуемые заболевания, расстройства или состояния включают нарушение клеточной пролиферации, рак и болезнь "трансплантат-против-хозяина" (GVHD) или их симптомы. Предпочтительно, указанным VISTA-опосредуемым заболеванием, расстройством или состоянием является рак.

Таким образом, в данном изобретении предложен анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с нуклеиновой кислотой PSGL-1 или белком PSGL-1; и

b) количественное определение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом, с определением таким образом уровня экспрессии PSGL-1 в указанном образце.

Согласно предпочтительному воплощению применение по настоящему изобретению дополнительно включает стадию оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю дающих положительный ответ клеток.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает предварительное определение PSGL-1-статуса указанной опухоли, как описано выше. Согласно этому воплощению опухоль, имеющая статус [PSGL-1 (+)], показывает наличие VISTA-опосредуемого рака и таким образом восприимчива к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом (например, антителом к VISTA).

Согласно другому предпочтительному воплощению, применение по настоящему изобретению дополнительно включает сравнение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Согласно этому предпочтительному воплощению анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) предусмотрен(о) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) определение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта, например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли в указанном биологическом образце;

b) сравнение уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем; и

c) выявление VISTA-опосредуемого рака, когда уровень экспрессии на стадии а) выше референсного уровня.

Согласно другому предпочтительному воплощению анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) предусмотрен(о) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) определение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта, например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли в указанном биологическом образце;

b) сравнение уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем; и

c) диагностирование VISTA-опосредуемого рака, когда уровень экспрессии на стадии а) выше референсного уровня.

Предпочтительно, способ по изобретению включает обе стадии:

• оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток; и

• сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Предпочтительно, упомянутое выше применение анти-VISTA терапевтического агента будет дополнительно включать определение уровня экспрессии по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8, как подробно описано выше. В таких случаях уровень экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительные уровни их экспрессии, превышающий(ие) референсный уровень, показывает(ют) наличие VISTA-опосредуемого рака.

Согласно другому воплощению изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с кодирующей PSGL-1 нуклеиновой кислотой или белком PSGL-1; и

b) количественное определение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом, с определением таким образом уровня экспрессии PSGL-1 в указанном образце; и

c) адаптирование лечения анти-VISTA терапевтическим агентом с учетом уровня на стадии а).

Согласно предпочтительному воплощению применение по настоящему изобретению дополнительно включает стадию оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю дающих положительный ответ клеток.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает предварительное определение PSGL-1-статуса указанной опухоли, как описано выше. Согласно этому воплощению опухоль, имеющая статус [PSGL-1 (+)], показывает наличие VISTA-опосредуемого рака и таким образом восприимчива к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом (например, антителом к VISTA).

Согласно другому предпочтительному воплощению, применение по настоящему изобретению дополнительно включает сравнение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Указанная адаптация лечения анти-VISTA терапевтическим агентом может состоять в:

- сокращении или приостановке указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент не восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту, или

- продолжении указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту.

Пациент считается восприимчивым к указанному лечению, если имеется разница в экспрессии PSGL-1, наблюдаемая между уровнем экспрессии на стадии а) и референсным уровнем. Например, разница в экспрессии PSGL-1, наблюдаемая между уровнем экспрессии на стадии а) и уровнем экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце от пациента, полученном до подвергания лечению, указывает на то, восприимчив ли указанный пациент к указанному лечению. Предпочтительно, более высокий уровень экспрессии PSGL-1 на стадии а) по сравнению с уровнем экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце от пациента, полученном до подвергания лечению, указывает на то, что указанный пациент восприимчив к указанному лечению.

В некоторых воплощениях упомянутое выше применение включает определение уровня экспрессии по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8, помимо PSGL-1, и сравнение уровня экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительных уровней их экспрессии в первом биологическом образце с уровнем экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительными уровнями их экспрессии во втором биологическом образце от пациента, полученном до подвергания лечению. В этом случае, отличие в уровне экспрессии или относительных уровнях экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 в первом биологическом образце по сравнению с уровнем экспрессии или относительными уровнями экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 во втором биологическом образце указывает на то, что пациент восприимчив к лечению.

Согласно некоторым аспектах этого способа, лечение включает введение антитела к VISTA и/или антитела к PSGL-1, описанных в данной заявке.

Согласно некоторым аспектам, способ включает случаи, где первый биологический образец содержит иммунные инфильтраты микроокружения опухоли.

В одном из воплощений данного изобретения предложены способы предупреждения или лечения заболевания, расстройства или состояния, изложенного в данном описании, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA), в том числе агента, описанного в данной заявке, или композиции на его основе. В некоторых воплощениях способ лечения заболевания, расстройства или состояния включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело к VISTA и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент и/или стабилизатор. В способе, предложенном в данной заявке, также может быть возможно применен по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, как например агенты, описанные в данной заявке (например, антитело к VISTA), либо в виде отдельного лечения, либо в виде комбинации. Кроме того, в данной заявке описаны композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA), предложенный в данной заявке, для применения в лечении, предупреждении и/или облегчении одного или более чем одного симптома заболевания, расстройства или состояния, такого как VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние. Типичное VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние включает нарушение клеточной пролиферации (например, рак или опухоль) или его симптом.

В некоторых воплощениях данной заявки описаны композиции, содержащие анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA), для применения в предупреждении, лечении и/или облегчении одного или более симптомов VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, такого как нарушение клеточной пролиферации. Нарушение клеточной пролиферации включает рак или опухолеобразование или его симптом. В некоторых воплощениях нарушение клеточной пролиферации ассоциировано с усилением экспрессии и/или повышением активности VISTA. В некоторых воплощениях нарушение клеточной пролиферации ассоциировано с усилением экспрессии VISTA на поверхности раковой клетки.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого заболевания расстройства или состояния у пациента. Согласно данному изобретению предложена анти-VISTA-терапия (например, антителом к VISTA, предложенным в данной заявке) для применения в предупреждении, лечении и/или облегчении одного или более чем одного симптома заболевания, расстройства или состояния, такого как PSGL-1-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние, в первую очередь PSGL-1-опосредуемый рак. Предпочтительно, указанное PSGL-1-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние установлено или диагностировано заранее одним из способов, предложенных в данной заявке.

В одном из воплощений настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у пациента, при этом указанное PSGL-1-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние установлено или диагностировано заранее одним из способов, предложенных в данной заявке. Другими словами, изобретение относится, таким образом, к анти-VISTA терапевтическому агенту для лечения PSGL-1-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния у пациента, при этом анти-VISTA терапевтический агент вводят пациенту, у которого диагностировано PSGL-1-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние с использованием способа, описанного выше.

В некоторых воплощениях данного изобретения предложены композиции, содержащие одно или более чем одно антитело (например, антитело к VISTA), предложенное в данной заявке, для применения в сдерживании развития, предупреждении или лечении PSGL-1-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и/или для облегчения одного или более чем одного симптома PSGL-1-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния. Типичные PSGL-1-опосредуемые заболевания, расстройства или состояния включают нарушение клеточной пролиферации, рак и болезнь "трансплантат-против-хозяина" (GVHD) или их симптомы. Предпочтительно, указанным PSGL-1-опосредуемым заболеванием, расстройством или состоянием является рак.

Таким образом, согласно данному изобретению предложен анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с PSGL-1 нуклеиновой кислотой или белком PSGL-1; и

b) количественное определение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом, с определением таким образом уровня экспрессии PSGL-1 в указанном образце.

Согласно предпочтительному воплощению применение по настоящему изобретению дополнительно включает стадию оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю дающих положительный ответ клеток.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает предварительное определение PSGL-1-статуса указанной опухоли, как описано выше. Согласно этому воплощению опухоль, имеющая статус [PSGL-1 (+)], показывает наличие PSGL-1-опосредуемого рака и таким образом восприимчива к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом (например, антителом к VISTA).

Согласно другому предпочтительному воплощению, применение по настоящему изобретению дополнительно включает сравнение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Согласно этому предпочтительному воплощению анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) предназначен(о) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

а) определение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта, например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли в указанном биологическом образце;

b) сравнение уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем; и

c) установление PSGL-1-опосредуемого рака, если уровень экспрессии на стадии а) превышает референсный уровень.

Согласно другому предпочтительному воплощению анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) предназначено) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) определение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от указанного субъекта, например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли в указанном биологическом образце;

b) сравнение уровня экспрессии на стадии а) с референсным уровнем; и

c) диагностирование PSGL-1-опосредуемого рака, если уровень экспрессии на стадии а) превышает референсный уровень.

Предпочтительно, способ по изобретению включает обе стадии:

• оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток; и

• сравнение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Предпочтительно, вышеупомянутое применение анти-VISTA терапевтического агента будет включать дополнительно определение уровня экспрессии по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8, как подробно описано выше. В таких случаях уровень экспрессии PSGL-1 и по меньшей мере одного из VISTA, CD11b, CD33, CD4 и CD8 или относительные уровни их экспрессии, превышающий(ие) референсный уровень, показывает(ют) наличие PSGL-1-опосредуемого рака.

Согласно другому воплощению изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает:

a) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с PSGL-1 нуклеиновой кислотой или белком PSGL-1; и

b) количественное определение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом, с определением таким образом уровня экспрессии PSGL-1 в указанном образце; и

c) адаптирование лечения анти-VISTA терапевтическим агентом с учетом уровня на стадии а).

Согласно предпочтительному воплощению, применение по настоящему изобретению дополнительно включает стадию оценивания опухоли путем сравнения уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) по соответствующей шкале, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к анти-VISTA терапевтическому агенту (например, антителу к VISTA) для применения в лечении PSGL-1-опосредуемого рака у пациента, при этом указанное применение включает предварительное определение PSGL-1-статуса указанной опухоли, как описано выше. Согласно этому воплощению опухоль, имеющая статус [PSGL-1 (+)], показывает наличие PSGL-1-опосредуемого рака и таким образом восприимчива к лечению анти-VISTA терапевтическим агентом (например, антителом к VISTA).

Согласно другому предпочтительному воплощению, применение по настоящему изобретению дополнительно включает сравнение уровня экспрессии PSGL-1 в биологическом образце от субъекта (например, с использованием иммунных инфильтратов микроокружения опухоли) с референсным уровнем.

Указанная адаптация лечения анти-VISTA терапевтическим агентом может состоять в:

- сокращении или приостановке указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент не восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту, или

- продолжении указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту.

Пациент считается восприимчивым к указанному лечению, если имеется разница в экспрессии PSGL-1, наблюдаемая между уровнем экспрессии на стадии а) и референсным уровнем. Например, разница в экспрессии PSGL-1, наблюдаемая между уровнем экспрессии на стадии а) и уровнем экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце от пациента, полученном до подвергания лечению, указывает на то, восприимчив ли указанный пациент к указанному лечению. Предпочтительно, более высокий уровень экспрессии PSGL-1 на стадии а) по сравнению с уровнем экспрессии PSGL-1 во втором биологическом образце от пациента, полученном до подвергания лечению, указывает на то, что указанный пациент восприимчив к указанному лечению.

Примеры нарушений клеточной пролиферации, которые подлежат лечению, предотвращению или симптомы которых можно облегчить с использованием антител, предложенных в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, гематологические злокачественные опухоли (например, лейкозы, лимфомы или миеломы), рак или саркому мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, соединительной ткани, прямой кишки, желудка, пищевода, легкого, гортани, почки, полости рта, яичников или предстательной железы, меланомы или глиомы либо метастазы любого из этих видов рака. Типичные гематологические злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются этим, острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый моноцитарный лейкоз (AMoL), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, плазмацитому, локализованную миелому или экстрамедуллярную миелому.

В некоторых воплощениях гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лимфому. В других воплощениях гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз. В некоторых воплощениях гематологическая злокачественная опухоль представляет собой миелому. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML). В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL). В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой хронический миелогенный лейкоз (CML). В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой острый моноцитарный лейкоз (AMoL). В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лимфому Ходжкина. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой неходжкинскую лимфому. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой плазмацитому. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой локализованную миелому. В другом воплощении гематологическая злокачественная опухоль представляет собой экстра медуллярную миелому.

В некоторых воплощениях гематологическая злокачественная опухоль представляет собой миелодиспластический синдром, острый лейкоз, например, острый Т-клеточный лейкоз, острый миелогенный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток, острый лимфобластный лейкоз из предшественников Т-клеток, лейкоз Беркитта (лимфому Беркитта) или острый бифенотипический лейкоз; хронический лейкоз, например, хроническую миелоидную лимфому, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический моноцитарный лейкоз, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому или В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; волосато клеточную лимфому; Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; или лимфому, например, гистиоцитарную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому (например, макроглобулинемию Вальденстрема), лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, плазмоклеточную опухоль (например, плазмоклеточную миелому, плазмацитому, моноклональную иммуноглобулинопатию или болезнь тяжелых цепей), экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (лимфому, возникающую из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT)), нодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, круп но клеточную В-клеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую круп но клеточную В-клеточную лимфому, первичную лимфому серозных полостей, Т-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов, агрессивный NK-клеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз/Т-клеточную лимфому взрослых, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому назального типа, Т-клеточную лимфому типа энтеропатии, гепатолиенальную Т-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, грибовидный микоз (синдром Сезари), первичное кожное CD30-позитивное Т-клеточное лимфопролиферативное нарушение (например, первичную кожную круп но клеточную анапластическую лимфому или лимфоматоидный папулез), ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, лимфому из клеток с иммунофенотипом периферических Т-клеток, неуточненную, анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому Ходжкина или лимфому Ходжкину нодулярного типа с большим количеством лимфоцитов.

Анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA), описанный в данной заявке, можно вводить человеку в терапевтических целях. Кроме того, анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) можно вводить не являющемуся человеком млекопитающему, экспрессирующему VISTA, с которым данное антитело перекрестно взаимодействует (например, примату, свинье, крысе или мыши), в ветеринарных целях или в качестве животной модели заболевания у человека. Что касается последнего, то такие животные модели могут быть полезны для оценки терапевтической эффективности антител, предложенных в данной заявке (например, для тестирования дозировок и временной динамики при введении).

В некоторых воплощениях анти-VISTA терапевтический агент представляет собой антитело, которое можно использовать в способе модулирования функции Т-клеток, опосредуемой связыванием VISTA с PSGL-1. Такие способы могут включать приведение в контакт данной Т-клетки с антителом к VISTA, описанным в данной заявке. В некоторых воплощениях антитело к PSGL-1 не блокирует или не ингибирует связывание PSGL-1 с Р-селектином, L-селектином или Е-селектином. В некоторых воплощениях способ модулирования функции Т-клеток включает введение эффективного количества композиции, содержащей антитело к VISTA, предложенное в данной заявке, субъекту. Согласно некоторым аспектам, функция Т-клеток, подвергаемая модулированию, представляет собой усиление активации Т-клеток. Такая активация Т-клеток также может включать усиление пролиферации Т-клеток. Методы анализа модулирования иммунного ответа хорошо известны специалисту в данной области техники, и очевидно, что специалист в данной области сможет легко выполнить такие анализы.

В некоторых воплощениях анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) или композицию, содержащую анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA), в том числе агент, описанный в данной заявке, можно использовать либо по отдельности, либо в комбинации с другим соединением или способом лечения. Например, в некоторых воплощениях другим соединением является антагонист коингибирующей молекулы или агонист костимулирующей молекулы. В таких воплощениях комбинированная терапия приводит к возобновленному укреплению или активации de novo иммунной системы посредством активированных Т-клеток, что дает больший эффект, чем введение по отдельности либо соединения, либо другой терапии. Такая активация иммунной системы будет приводить к высокоэффективному физиологическому ответу при лечении VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе в контексте лечения рака (например, лечения гематологической злокачественной опухоли).

В некоторых воплощениях способы, описанные в данной заявке, могут включать введение терапевтически эффективного количества антитела к VISTA в комбинации с терапевтически эффективным количеством антагониста коингибирующей молекулы. В некоторых воплощениях коингибирующая молекула выбрана из группы, состоящей из CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, В7-НЗ, В7-Н4, бутирофилина, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, Т1М1, галекгина 9, TIM3, CD48, 2 В4, CD155, CD112, CD113 и TIGIT. Антагонист коингибирующей молекулы включает антитело к данной коингибирующей молекуле. Общепризнано, что антагонисты других коингибирующих молекул хорошо известны в данной области техники, как например, таковые, описанные в Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6: 418 (2015), Kyi et al., FEBS Letters, 588: 368-376 (2014) и Pardoll, Nature Reviews, 12: 252-264 (2012). Согласно этому воплощению изобретение относится к использованию анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемой опухоли, как описано выше, причем указанное применение дополнительно включает введение антагониста коингибирующей молекулы, при этом указанная коингибирующая молекула выбрана из группы, состоящей из CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, В7-НЗ, В7-Н4, бутирофилина, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, Т1М1, галектина 9, TIM3, CD48, 2 В4, CD155, CD112, CD113 и TIGIT.

В некоторых воплощениях способы, описанные в данной заявке, могут включать введение терапевтически эффективного количества антитела к VISTA в комбинации с терапевтически эффективным количеством агониста костимулирующей молекулы. В некоторых воплощениях костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из CD154, TNFRSF25, GITR, 4-1ВВ, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CD40, TL1A, GITRL, 41BBL, OX40L, CD70, HHLA2, ICOSL, цитокина, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, В7-Н2, CD80, CD86, CD40L, TIM4, Т1М1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2 и CD226. Агонист костимулирующей молекулы включает агонистическое антитело к костимулирующей молекуле. Общепризнано, что агонисты других костимулирующих молекул хорошо известны в данной области техники, как например, таковые, описанные в Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6: 418 (2015), Kyi et al., FEBS Letters, 588: 368-376 (2014) и Саресе et al., J. Biomed. Biotechnol., 2012: 926321, 17, pages (2012). Согласно этому воплощению изобретение относится к использованию анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемой опухоли, как описано выше, причем указанное применение дополнительно включает введение агониста костимулирующей молекулы, при этом указанная костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из CD154, TNFRSF25, GITR, 4-1ВВ, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CD40, TL1A, GITRL, 41BBL, OX40L, CD70, HHLA2, ICOSL, цитокина, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, В7-Н2, CD80, CD86, CD40L, TIM4, Т1М1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2 и CD226.

В некоторых воплощениях способы, описанные в данной заявке, могут включать введение терапевтически эффективного количества анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) в комбинации с традиционной формой терапии для лечения рака, как например, введение терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента, описанного в данной заявке, или применение лучевой терапии, описанной в данной заявке. Согласно этому воплощению изобретение относится к использованию анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) для применения в лечении VISTA-опосредуемой опухоли, как описано выше, причем указанное применение дополнительно включает введение традиционной формы терапии для лечения рака, как например, введение терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента, описанного в данной заявке, или применение лучевой терапии, описанной в данной заявке.

Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA, описанного в данной заявке), включая, но не ограничиваясь этим, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, применение рекомбинантных клеток, способных экспрессировать данное антитело, рецептор-опосредуемого эндоцитоза (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и так далее. Методы введения терапевтического агента (например, антитела к VISTA, предложенного в данной заявке) или фармацевтической композиции включают, но не ограничиваются этим, парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутриопухолевое и подкожное), эпидуральное и мукозальное (например, интраназальным и пероральным путями). В некоторых воплощениях терапевтический агент (например, антитело к VISTA, предложенное в данной заявке) или фармацевтическую композицию вводят интраназально, внутримышечно, внутривенно, внутрь опухоли или подкожно. Терапевтические агенты или композиции можно вводить любым удобным путем, например, посредством инфузии или болюс-инъекции, посредством всасывания через эпителиальные или кожнослизистые выстилки (например, через слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку носовой полости, слизистые оболочки прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Помимо этого также можно использовать легочное введение, например, посредством применения ингалятора или небулайзера и композиции с аэрозолирующим агентом. См., например, патенты США №№6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации РСТ №№WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый(ая) из которых вкпючен(а) в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых воплощениях желательным может оказаться местное введение терапевтического агента или фармацевтической композиции, предложенных в данной заявке, в область, нуждающуюся в лечении. Этого можно достичь, например, и не в качестве ограничения, посредством местной инфузии, путем местного введения (например, с помощью интраназального спрея), посредством инъекции (в первую очередь, инъекции внутрь опухоли) или с использованием имплантата, при этом имплантат представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны или волокна. В некоторых воплощениях, когда вводят антитело, предложенное в данной заявке, следует соблюдать осторожность при использовании материалов, которые не абсорбируют данное антитело.

В некоторых воплощениях терапевтический агент, предложенный в данной заявке, может быть доставлен в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533; Treat и др. в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, там же, стр. 317-327; в целом см. там же).

В некоторых воплощениях терапевтический агент, предложенный в данной заявке, может быть доставлен в системе с регулируемым высвобождением или с длительным высвобождением. В некоторых воплощениях для достижения регулируемого или длительного высвобождения можно использовать насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery, 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med., 321: 574). В другом воплощении для достижения регулируемого или длительного высвобождения терапевтического агента (например, антитела, предложенного в данной заявке) или композиции, предложенных в данной заявке, можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61; также см. Levy et al., 1985, Science, 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol., 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg., 71:105); патент США №5679377; патент США №5916597; патент США №5912015; патент США №5989463; патент США №5128326; публикацию РСТ №WO 99/15154; и публикацию РСТ №WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых в композициях с длительным высвобождением, включают, но не ограничиваются этим, поли-2-гидроксиэтилметакрилат, полиметилметакрилат, полиакриловую кислоту, сополимер этилена и винилацетата, полиметакриловую кислоту, полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), полилактид-ко-гликолиды (PLGA) и сложные полиортоэфиры. В некоторых воплощениях полимер, используемый в композиции с длительным высвобождением, является инертным, не содержащим вымываемых примесей, стабильным при хранении, стерильным и биоразлагаемым. В еще одном воплощении система с регулируемым или длительным высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, например, в носовых проходах или легких, в результате чего потребуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Системы с регулируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science, 249: 1527-1533). Для приготовления композиций с длительным высвобождением, содержащих одно или более антител, предложенных в данной заявке, можно использовать любой метод, известный специалисту в данной области техники. См., например, патент США №4526938, публикацию РСТ WO 91/05548, публикацию РСТ WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology, 39:179-189, Song et al., 1995, Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 50: 372-397, Cleek et at., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 853-854 и Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24: 759-760.

В некоторых воплощениях композиция, используемая в способе, предложенном в данной заявке, содержит одно, два или больше антител, предложенных в данной заявке (например, антитело к VISTA). В другом воплощении композиция, используемая в способе, предложенном в данной заявке, содержит одно, два или больше антител, предложенных в данной заявке, и терапевтический агент, отличающийся от антитела, предложенного в данной заявке. В некоторых воплощениях данные агенты, как известно, полезны или использовались либо используются в настоящее время для предупреждения, лечения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния. Помимо терапевтических агентов, композиции, предложенные в данной заявке, также могут содержать носитель.

Композиции, предложенные в данной заявке, включают нерасфасованные лекарственные композиции, полезные при изготовлении фармацевтических композиций (например, композиций, подходящих для введения субъекту или пациенту), которые можно использовать для приготовления стандартных лекарственных форм. В некоторых воплощениях композиция, предложенная в данной заявке, представляет собой фармацевтическую композицию. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более чем одного терапевтического агента (например, анти-VISTA терапевтического агента, такого как антитело к VISTA, предложенное в данной заявке, или другого терапевтического агента) и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции приготовлены такими, чтобы они подходили для конкретного пути введения субъекту.

В некоторых воплощениях данная композиция приготовлена в соответствии с общепринятыми методиками в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Обычно, композициями для внутривенного введения являются растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция также может включать в себя солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин или лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Такие композиции, однако, можно вводить отличным от внутривенного введения путем.

Ингредиенты композиций, предложенных в данной заявке, могут поставляться либо по отдельности, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если данная композиция подлежит введению посредством инфузии, то ее можно распределять с использованием инфузионного флакона, содержащего стерильные фармацевтической степени чистоты воду или физиологический раствор. Если такую композицию вводят путем инъекции, то должно быть предусмотрено наличие ампулы со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данной заявке, упаковано в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества антитела. В одном из воплощений антитело поставляется в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере и может быть повторно разведено, например, водой или физиологическим раствором до концентрации, целесообразной для введения субъекту. В некоторых воплощениях антитело поставляется в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере в стандартной лекарственной дозировке, составляющей по меньшей мере 0,1 мг; по меньшей мере 0,5 мг; по меньшей мере 1 мг; по меньшей мере 2 мг; или по меньшей мере 3 мг; например, по меньшей мере 5 мг; по меньшей мере 10 мг; по меньшей мере 15 мг; по меньшей мере 25 мг; по меньшей мере 30 мг; по меньшей мере 35 мг; по меньшей мере 45 мг; по меньшей мере 50 мг; по меньшей мере 60 мг; по меньшей мере 75 мг; по меньшей мере 80 мг; по меньшей мере 85 мг; по меньшей мере 90 мг; по меньшей мере 95 мг; или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированное антитело можно хранить при температуре от 2 до 8°С в его первоначальном контейнере, и данное антитело можно вводить в срок не более 12 часов, например, в срок не более 6 часов, в срок не более 5 часов, в срок не более 3 часов или в срок не более 1 часа после повторного разведения. В альтернативном воплощении антитело поставляется в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации антитела. В некоторых воплощениях антитело в жидкой форме поставляется в герметично закрытом контейнере в концентрации по меньшей мере 0,1 мг/мл, по меньшей мере 0,5 мг/мл или по меньшей мере 1 мг/мл, например, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 60 мг/мл, по меньшей мере 70 мг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл, по меньшей мере 90 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл.

Количество анти-VISTA терапевтического агента (например, антитела к VISTA) или композиции, предложенных в данной заявке, которое будет эффективным в предупреждении, лечении и/или облегчении одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, может быть определено стандартными клиническими методами.

Соответственно, для предупреждения, лечения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния человеку можно вводить анти-VISTA терапевтический агент (например, антитело к VISTA) или композицию в дозировке, которая приводит к получению титра сыворотки крови, составляющего от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 450 мкг/мл и в некоторых воплощениях по меньшей мере 0,1 мкг/мл, по меньшей мере 0,2 мкг/мл, по меньшей мере 0,4 мкг/мл, по меньшей мере 0,5 мкг/мл, по меньшей мере 0,6 мкг/мл, по меньшей мере 0,8 мкг/мл, по меньшей мере 1 мкг/мл, по меньшей мере 1,5 мкг/мл, по меньшей мере 2 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 15 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 25 мкг/мл, по меньшей мере 30 мкг/мл, по меньшей мере 35 мкг/мл, по меньшей мере 40 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 75 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл, по меньшей мере 125 мкг/мл, по меньшей мере 150 мкг/мл, по меньшей мере 200 мкг/мл, по меньшей мере 250 мкг/мл, по меньшей мере 300 мкг/мл, по меньшей мере 350 мкг/мл, по меньшей мере 400 мкг/мл, по меньшей мере 450 мкг/мл. Помимо этого, чтобы облегчить идентификацию оптимальных диапазонов дозировок, возможно использование результатов анализов in vitro. Точная доза, применяемая в композиции, также будет зависеть от пути введения и тяжести VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, и ее выбор должен быть сделан в соответствии с заключением практикующего врача и состояния каждого пациента.

Значения эффективных доз могут быть определены экстраполированием с использованием кривой зависимости доза-ответ, полученной из экспериментов в тест-системах in vitro или на животных моделях.

Для антител, предложенных в данной заявке, вводимая пациенту дозировка в некоторых воплощениях может составлять от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. В некоторых воплощениях вводимая пациенту дозировка составляет от примерно 1 мг/кг до примерно 75 мг/кг массы тела пациента. В некоторых воплощениях вводимая пациенту дозировка составляет от 1 мг/кг до 20 мг/кг массы тела пациента, например, от 1 мг/кг до 5 мг/кг массы тела пациента. В общем случае, человеческие антитела имеют более длительный полупериод существования в организме человека, чем антитела из других видов, вследствие наличия иммунного ответа на чужеродные полипептиды. По этой причине часто возможно использование более низких дозировок человеческих антител и менее частое введение. Кроме того, дозировка и частота введения антител, предложенных в данной заявке, могут быть снижены благодаря усилению поглощения и проникновения антител в ткани, обусловленного модификациями, такими как, например, липидизация.

В одном из воплощений антитело, предложенное в данной заявке, вводят 5 раз, 4 раза, 3 раза, 2 раза или 1 раз в дозе приблизительно 100 мг/кг или меньше, приблизительно 75 мг/кг или меньше, приблизительно 50 мг/кг или меньше, приблизительно 25 мг/кг или меньше, приблизительно 10 мг/кг или меньше, приблизительно 5 мг/кг или меньше, приблизительно 1 мг/кг или меньше, приблизительно 0,5 мг/кг или меньше либо приблизительно 0,1 мг/кг или меньше для предупреждения, лечения или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния. В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данной заявке, вводят примерно 1-12 раз, причем эти дозы можно вводить по необходимости, например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раза в два месяца, один раза в три месяца и т.д., как определено врачом. В некоторых воплощениях можно чаще (например, 3-6 раз) осуществлять введение более низкой дозы (например, 1-15 мг/кг). В других воплощениях можно реже (например, 1-3 раза) вводить более высокую дозу (например, 25-100 мг/кг). Однако, что будет очевидно специалистам в данной области техники, другие дозировочные количества и схемы введения легко поддаются определению, и они включены в объем данного изобретения.

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данной заявке, в составе композиции с длительным высвобождением вводят субъекту, такому как человек, в дозе приблизительно 100 мг/кг, приблизительно 75 мг/кг или меньше, приблизительно 50 мг/кг или меньше, приблизительно 25 мг/кг или меньше, приблизительно 10 мг/кг или меньше, приблизительно 5 мг/кг или меньше, приблизительно 1 мг/кг или меньше, приблизительно 0,5 мг/кг или меньше, приблизительно 0,1 мг/кг или меньше для предупреждения, лечения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания. В другом из некоторых воплощений антитело, предложенное в данной заявке, вводят субъекту, такому как человек, не в составе композиции с длительным высвобождением, а в виде болюса, составляющего приблизительно 100 мг/кг, приблизительно 75 мг/кг или меньше, приблизительно 50 мг/кг или меньше, приблизительно 25 мг/кг или меньше, приблизительно 10 мг/кг или меньше, приблизительно 5 мг/кг или меньше, приблизительно 1 мг/кг или меньше, приблизительно 0,5 мг/кг или меньше либо приблизительно 0,1 мг/кг или меньше, для предупреждения, лечения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния и через определенный период времени субъекту вводят (например, интраназально или внутримышечно) один раз, два, три или четыре раза антитело, предложенное в данной заявке, в составе композиции с длительным высвобождением в дозе приблизительно 100 мг/кг, приблизительно 75 мг/кг или меньше, приблизительно 50 мг/кг или меньше, приблизительно 25 мг/кг или меньше, приблизительно 10 мг/кг или меньше, приблизительно 5 мг/кг или меньше, приблизительно 1 мг/кг или меньше, приблизительно 0,5 мг/кг или меньше либо приблизительно 5 мг/кг или меньше. Согласно этому воплощению "определенный период времени" может составлять от 1 до 5 суток, неделю, две недели или месяц.

В некоторых воплощениях разовую дозу антитела, предложенного в данной заявке, вводят пациенту для предупреждения, лечения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе одну или несколько доз, например, два, три, четыре раза, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять или двадцать шесть раз, в том числе с периодичностью один раз в две недели (например, приблизительно через 14 суток) в течение годового курса лечения, причем данная доза выбрана из группы, состоящей из доз примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 55 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 65 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 85 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно 95 мг/кг, примерно 100 мг/кг или их комбинации (например, каждая вводимая один раз в месяц доза может быть или может не быть одинаковой).

В некоторых воплощениях разовую дозу антитела, предложенного в данной заявке, вводят пациенту для лечения, предупреждения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе один или несколько раз, например, два, три, четыре раза, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать раз, в том числе с периодичностью примерно один раз в месяц (например, приблизительно через 30 суток) в течение годового курса лечения, причем данная доза выбрана из группы, состоящей из доз примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 55 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 65 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 85 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно 95 мг/кг, примерно 100 мг/кг или их комбинации (например, каждая вводимая один раз в месяц доза может быть или может не быть одинаковой).

В некоторых воплощениях разовую дозу антитела, предложенного в данной заявке, вводят пациенту для лечения, предупреждения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе один или несколько раз, например, два, три, четыре, пять или шесть раз, в том числе с периодичностью приблизительно один раз в два месяца (например, приблизительно через 60 суток) в течение годового курса лечения, причем данная доза выбрана из группы, состоящей из доз примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 55 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 65 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 85 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно 95 мг/кг, примерно 100 мг/кг или их комбинации (например, каждая вводимая один раз в два месяца доза может быть или может не быть одинаковой).

В некоторых воплощениях разовую дозу антитела, предложенного в данной заявке, вводят пациенту для лечения, предупреждения и/или облегчения одного или более чем одного симптома VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе один или несколько раз, например, два, три или четыре раза, с периодичностью приблизительно один раз в три месяца (например, приблизительно через 120 суток) в течение годового курса лечения, причем данная доза выбрана из группы, состоящей из доз примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 55 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 65 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 85 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно 95 мг/кг, примерно 100 мг/кг или их комбинации (например, каждая вводимая один раз в три месяца доза может быть или может не быть одинаковой).

В некоторых воплощениях путь введения пациенту дозы антитела, предложенного в данной заявке, является интраназальным, внутримышечным, внутривенным или их комбинацией, но также приемлемы и другие пути, описанные в данной заявке. Каждая доза может быть введена с использованием одного и того же пути введения или нет. В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данной заявке, можно вводить с использованием многих путей введения одновременно с другими дозами или после других доз этого же или другого антитела, предложенного в данной заявке.

В некоторых воплощениях анти-VISTA терапевтические агенты (например, антитела к VISTA), предложенные в данной заявке, вводят субъекту в профилактических или терапевтических целях. Анти-VISTA терапевтические агенты (например, антитела к VISTA) можно вводить субъекту в профилактических или терапевтических целях с тем, чтобы предотвратить, ослабить или облегчить VISTA-опосредуемое заболевание, расстройство или состояние или его симптомы.

НАБОРЫ

Согласно данному изобретению также предложены фармацевтическая упаковка или фармацевтический набор, содержащая(ий) один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций, предложенных в данной заявке, например, одним или более чем одним антителом (например, антителом к PSGL-1 и/или к VISTA), предложенным в данной заявке. Возможно, что вместе с таким(и) контейнером(ами) может находиться указание в форме, предписываемой государственным учреждением по регулированию производства, применению или продаже фармацевтических средств или биологических продуктов, причем это указание отражает разрешение данного учреждения на производство, применение или продажу для введения человеку. В некоторых воплощениях набор содержит листовку-вкладыш. Используемый термин "листовка-вкладыш" относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предостережениях относительно применения таких терапевтических продуктов, а также к инструкциям по применению.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены наборы, которые можно использовать в описанных выше способах. В одном из воплощений набор содержит антитело (например, антитело к PSGL-1 и/или к VISTA), предложенное в данной заявке, такое как выделенное антитело (например, антитело к PSGL-1 и/или к VISTA), в одном или нескольких контейнерах. В некоторых воплощениях наборы, предложенные в данной заявке, содержат по существу выделенный PSGL-1 или VISTA в качестве контроля. В некоторых воплощениях наборы, предложенные в данной заявке, дополнительно содержат контрольное антитело, которое не взаимодействует с PSGL-1 и/или VISTA. В некоторых воплощениях наборы, предложенные в данной заявке, содержат средство для детектирования связывания модифицированного антитела с PSGL-1 и/или VISTA (например, антитело может быть конъюгировано с детектируемым субстратом, таким как флуоресцентное соединение, субстрат для ферментов, радиоактивное соединение или люминесцентное соединение, либо с детектируемым субстратом может быть конъюгировано второе антитело, которое распознает первое антитело). В некоторых воплощениях набор может включать в себя полученный рекомбинантным путем или химически синтезированный PSGL-1 и/или VISTA. PSGL-1 и/или VISTA, предусмотренный в таком наборе, также может быть присоединен к твердой подложке. В некоторых воплощениях детектирующее средство из описанного выше набора включает твердую подложку, к которой присоединен PSGL-1 и/или VISTA. Такой набор также может включать неприсоединенное репортер-меченное антитело к антителу человека. В некоторых воплощениях связывание антитела с PSGL-1 и/или VISTA может быть обнаружено посредством связывания с антителом, меченным репортером.

Очевидно, что модификации, которые по существу не затрагивают активности различных воплощений данного изобретения, также предложены в данной заявке. Соответственно, следующие далее примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР I

Идентификация рецептора к VISTA

В этом примере впервые описывается идентификация рецептора к VISTA с использованием методики CAPTIREC™, системы захвата лиганд-рецептор на основе TRICEPS™ (Dualsystems Biotech AG).

Методику CAPTIREC™ со слитым белком VISTA-Fc в качестве представляющего интерес лиганда и антителом к CD28 в качестве контрольного лиганда осуществляли на наивных Т-клетках, выделенных из первичных Т-клеток человека. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности конструкции слитого белка vista-fc, использованной в приведенных далее экспериментах, показаны ниже.

Нуклеотидная последовательность слитого белка vista-fc (подчеркнутая последовательность кодирует VISTA; выделенная жирным шрифтом последовательность кодирует Fc-фрагмент антитела IgG1 человека):

Аминокислотная последовательность слитого белка vista-fc (подчеркнутая последовательность относится к VISTA; выделенная жирным шрифтом последовательность относится к Fc-фрагменту антитела IgG1 человека):

Общее описание методики CAPTIREC™ представлено на ФИГ. 1. Кратко, слитый белок vista-fc и антитело к CD28 по отдельности связывали с TRICEPS™. Наивные Т-клетки человека выделяли из имеющихся в продаже первичных Т-клеток человека. Поверхностные гликопротеины наивных Т-клеток избирательно окисляли. Проводили связывание лиганда и присоединение рецептора к клеточной поверхности окисленных наивных Т-клеток. Затем прореагировавшие Т-клетки подвергали лизису и осуществляли аффинную очистку конечного лизата с получением лиганд-рецепторных белковых комплексов. Далее проводили расщепление очищенных белков путем переваривания трипсином с высвобождением тем самым пептидов рецептора. Полученные пептиды анализировали посредством жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Чтобы провести статистический анализ, биохимические эксперименты проводили в трех повторах.

Выделение наивных Т-клеток проводили путем негативной селекции наивных Т-клеток из первичных Т-клеток человека от здоровых доноров, которые приобретали у ALLCELLS (Alameda, CA). Для проведения негативной селекции желаемых клеток использовали набор для выделения наивных пан-Т-клеток от Miltenyi (№130-097-095) в соответствии с протоколом производителя. Кратко, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) ресуспендировали в рабочем буфере для магнитно-активированного клеточного сортинга (MACS) и инкубировали в течение 5 мин со смесью конъюгированных с биотином моноклональных антител к HLA-DR, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD36, CD56, CD57, CD45RO, CD123, CD244, CD235a и антител к Т-клеточному рецептору (TCR) у/б человека, после чего инкубировали в течение 10 мин с антибиотиновыми магнитными гранулами, конъюгированными с моноклональными антителами к CD61 и к биотину. Затем осуществляли негативную селекцию наивных Т-клеток, используя автоматический сортер autoMACS® (Miltenyi Biotech, San Diego, CA). В реакции захвата лиганда использовали 100×10⁶ наивных Т-клеток на TRICEPS™.

Остальные стадии методики CAPTIREC™, которые включали связывание слитого белка vista-fc или антитела к CD28 с TRICEPS™, избирательное окисление гликопротеинов, расположенных на поверхности наивных Т-клеток, связывание лиганда и связывание рецептора с клеточной поверхностью "окисленных" Т-клеток, лизис этих Т-клеток, аффинную очистку клеточного лизата и переваривание трипсином, осуществляли в соответствии с модифицированными методиками, описанными в Frei et al., Nat. Protoc., 8(7): 1321-1336 (2013) и Frei et al., Nat. Biotechnol., 30(10): 997-1001 (2012).

Анализ полученных пептидов рецептора проводили посредством LC-MS/MS на спектрометре Thermo LTQ Orbitrap XL, снабженном элекгрораспылительным источником ионов. Образцы измеряли в информационно-зависимом режиме сбора данных, используя градиент продолжительностью 120 мин и упакованную С18 колонку длиной 10 см. Анализировали шесть отдельных образцов из набора данных CAPTIREC™ с применением статистической модели дисперсионного анализа (ANOVA). Согласно этой модели предполагается, что ошибка измерения описывается распределением Гаусса и что отдельные характеристики рассматриваются как следствие избытка белка, и эта избыточность учитывается непосредственно. Эта модель позволяет тестировать каждый белок на предмет индивидуального избытка во всех попарных сравнениях образцов с лигандом и контрольных образцов и приводить р-значения. Далее р-значения корректируют для множественных сравнений, чтобы контролировать уровень ложноположительных результатов (FDR) в масштабе всего эксперимента.

Идентифицированные пептиды отфильтровывали в соответствии с FDR ≤ 1% и выполняли количественное определение, используя основанный на MS1 подход без применения метки. Для проведения количественного определения согласно MS1 использовали нелинейное программное обеспечение для протеомных исследований DYNAMICS Progenesis QI с установкой для учета всех уникальных пептидов. Идентифицированные белки отфильтровывали с учетом ассоциации с мембраной, секрецией, гликозилированием, используя информацию, предоставляемую базой данных Uniprot (Universal Protein Resource). Белки, идентифицированные только по одному пептиду, не учитывали при проведении анализа.

Обработанные данные CAPTIREC™ приводили в форме графика рассеяния для большого массива данных на уровне белка, который показывает кратность изменения в зависимости от статистической значимости. Для скорректированного р-значения, полученного для каждого белка, строят график зависимости от величины кратности улучшения (fold enrichment) при сравнении двух экспериментальных условий. Круг кандидатов в рецепторы определяют в соответствии с повышением более, чем в 4 раза фактора улучшения, и со статистической значимостью (р-значение < 0,01 с коррекцией на FDR).

Среди обнаруженных гликопротеинов для идентификации CD28 использовали 5 пептидов из контрольного набора данных. Это свидетельствует об успешной работе CAPTIREC™. Для идентификации PSGL-1 использовали 6 пептидов, и кроме того, для идентификации собственно VISTA использовали 12 пептидов из набора данных для слитого белка vista-fc (см. Таблицу 6).

Для идентифицированного партнера по связыванию, PSGL-1, создавали изображение с использованием приложения Protter (ФИГ. 2) с указанием сайтов N-гликозилирования (в виде остатков, заключенных в квадраты) и экспериментально обнаруженных пептидов (в виде закрашенных кружков) (Omasits et al., Bioinformatics: advance online pub., October, 2013). Такое картирование показывает, что все шесть обнаруженных пептидов локализуются во внутриклеточном домене PSGL-1. Анализ внеклеточного домена PSGL-1 показывает, что несмотря на размер данного домена, во внеклеточном домене существуют несколько сайтов расщепления трипсином пептидных связей. PSGL-1 содержит три сайта N-гликозилирования, и пептиды с этими сайтами могли быть потеряны при проведении описанного выше анализа с применением LC-MS/MS. Остальные возможные пептиды либо являются слишком большими, либо слишком маленькими, либо подвергаются процессингу во время сортировки белка, что является разумным объяснением факта обнаружения только пептидов, картированных во внутриклеточном домене PSGL-1.

С учетом проведенного выше анализа было установлено, что PSGL-1 является гетерофильным партнером по связыванию с VISTA. Поскольку ранее было показано, что VISTA является отрицательным регулятором контрольных точек широкого спектра действия, который экспрессируется на гемопоэтических клетках (Lines et al, Cancer Res., 74(7), 1924-1932 (2014)), то приведенные выше результаты демонстрируют, что взаимодействие VISTA с PSGL-1, по-видимому, приводит к супрессии Т-клеток. Следовательно, вмешательство (например, ингибирование или блокирование) в это взаимодействие с использованием агентов, направленно воздействующих на PSGL-1 и/или VISTA, таких как антитела к PSGL-1 и/или к VISTA, может приводить к возобновленному укреплению или активации de novo иммунной системы посредством активированных Т-клеток. Результатом такой активации иммунной системы будет высокоэффективный физиологический ответ при лечении VISTA-опосредуемого заболевания, расстройства или состояния, в том числе в контексте лечения рака (например, лечения гематологической злокачественной опухоли).

ПРИМЕР II

Связывание VISTA с PSGL-1

В этом примере описываются свойства, относящиеся к связыванию VISTA с PSGL-1.

Слитый белок vista-fc (например, описанный в примере I) иммобилизовали на твердой поверхности и проводили анализ на предмет его связывания с внеклеточным доменом PSGL-1. Для проведения этих экспериментов создавали две разные конструкции, содержащие внеклеточный домен PSGL-1. Выполняли слияние обеих конструкций с сигнальной последовательностью каппа-цепи IgG и Fc фрагментом. Кроме того, добавляли пропептидную последовательность или элемент тандемного повтора, которые важны для правильного функционирования (см., например, Cummings R.D., Brazilian J. Med. Biol. Res., 32: 519-28 (1999)). Клетки совместно трансфицировали конструкциями, экспрессирующими гликозилтрансферазы GCNT1 (глюкозаминил-(N-ацетил)-трансфераза 1) и FUT3 (фукозилтрансфераза 3), для обеспечения надлежащей посттрансляционной модификации белка, которая, как известно, важна для высокоаффинного связывания PSGL-1 с Р-селектином (Sako et al., Cell, 75(6): 1179-86 (1993); Yang et al., Thrombosis and Haemostasis, 81(1): 1-7 (1999); Carlow et al., Immunol. Rev., 230(1): 75-96 (2009); Kumar et at., Blood, 88(10): 3872-9 (1996); Cummings R.D., Brazilian J. Med. Biol. Res., 32: 519-28 (1999)). Аминокислотные последовательности конструкций на основе PSGL-1 показаны ниже.

Конструкция А на основе PSGL-1 - аминокислотная последовательность (PSGL-1, слитый с Fc и с сигнальной последовательностью каппа-цепи IgG и пропептидной последовательностью). Сигнальная последовательность каппа-цепи IgG показана курсивом; пропептидная последовательность выделена жирным шрифтом; Fc-последовательность подчеркнута:

Конструкция В на основе PSGL-1 - аминокислотная последовательность (PSGL-1, слитый с Fc и с сигнальной последовательностью каппа-цепи IgG и элементом тандемного повтора). Сигнальная последовательность каппа-цепи IgG показана курсивом; последовательность элемента тандемного повтора выделена жирным шрифтом; Fc-последовательность подчеркнута:

Для проведения этих экспериментов конструкцию А на основе PSGL-1 (PSGL-1А) и конструкцию В на основе PSGL-1 (PSGL-1В) тестировали в отношении связывания с иммобилизованной конструкцией vista-fc.

Образец иммобилизованной конструкции vista-fc уравновешивали в забуференном HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) физиологическом растворе (HBS), содержащем ионы кальция (1,5 мМ хлорид кальция) и магния (1,0 мМ хлорид магния). Этот же буфер использовали в качестве рабочего буфера. Образцы, содержащие PSGL-1A или PSGL-1В, которые также содержали ионы кальция и магния, пропускали над твердой поверхностью с иммобилизованной на ней конструкцией vista-fc со скоростью 60 мкл/мин, при этом время контакта составляло 120 секунд, а интервал, необходимый для диссоциации после регенерации поверхности посредством 3-секундной импульсной подачи раствора глицина (рН 1,5), составлял 300 секунд. Анализ проводили для шести разных концентраций PSGL-1A и PSGL-1В (0,3 мкМ, 0,60 мкМ, 1,20 мкМ, 2,4 мкМ, 4,8 мкМ и 9,6 мкМ).

Анализ результатов экспериментов проводили двумя разными способами: с использованием (1) модели связывания с двумя состояниями; и (2) анализа равновесного связывания (модель 1:1). Для PSGL-1A в модели связывания с двумя состояниями была показана аффинность связывания, соответствующая K_D 32,1 мкМ, в то время как в модели 1:1 было показано значение K_D 3,01 мкМ (ФИГ. 3). Для PSGL-1В в модели связывания с двумя состояниями было показано значение K_D 5,09 мкМ, в то время как в модели 1:1 было показано значение K_D 4,76 мкМ (ФИГ. 4).

Результаты приведенных выше анализов продемонстрировали наличие чистого ответного сигнала для обеих конструкций PSGL-1A и PSGL-1В. На полученных сенсограммах видны особенности, ассоциированные со связыванием и диссоциацией. Следует отметить, что оценки аффинности носили качественный характер. Количественная оценка связывания может быть возможна в случае, когда связанная с поверхностью активность выше активности в настоящих экспериментах (например, >0,5% при использовании очищенной конструкции на основе PSGL-1). Кроме того, в этих экспериментах использование введения PSGL-1A приводило к переносу образца в последующие циклы. В этих экспериментах оцененные значения аффинности между VISTA и PSGL-1 оказались сравнительно одинаковыми, в случае PSGL-1A (примерно 3 мкМ) и в случае PSGL-1В (примерно 5 мкМ).

ПРИМЕР III

Связывание VISTA с PSGL-1 на клетках

В этом примере описывается связывание VISTA с PSGL-1, экспрессируемым клеточной линией промиелоцитарного лейкоза (HL-60; ATCC, CCL-240), с использованием подхода с бифункциональным перекрестным сшиванием.

В этих экспериментах экспрессию PSGL-1 оценивали с применением конъюгированного с фикоэритрином (РЕ) моноклонального антитела к PSGL-1 (Abeam; ab78188), получившего название KPL-1. Детектирование экспрессии PSGL-1 клетками HL-60 осуществляли посредством проточной цитометрии, используя стандартные методы (ФИГ. 5). По оценкам число копий белка PSGL-1 составляло приблизительно 263000±2800 на одну клетку.

Кроме того, в этих экспериментах осуществляли ковалентное связывание с бифункциональным линкером (sulfo-SBED (сульфо-N-гидроксисукцинимидил-2-(6-[биотинамидо]-2-(п-азидо-бензамидо)-гексаноамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат), ThermoFisher Scientific; 33073) образцов слитого белка vista-fc (описанного в примере I), а также антитела к CD28 (BioXcell, BE0248) и IgG1-Fc (R&D Systems; 110-HG-100) в качестве отрицательных контролей, используя рекомендованные производителем условия. Полученные образцы инкубировали с клетками HL-60 в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Перекрестное сшивание фотоактивировали, применяя источник ультрафиолетового (УФ) излучения в течение 20 мин. Затем проводили лизис клеток и осуществляли осаждение, используя Сефарозу с иммобилизованным белком А. Образцы анализировали посредством вестерн-блоттинга с использованием поликлонального антитела к PSGL-1 (R&D Systems; AF3345) или конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) стрептавидина.

Как показано на ФИГ. 6, VISTA-Fc взаимодействует с PSGL-1, но не с отрицательным изотипическим контролем IgG-Fc или антителом к CD28.

Проводили дополнительные эксперименты, подтверждающие специфичность этого взаимодействия. Вышеупомянутый эксперимент повторяли, за исключением того, что перед инкубацией меченных sulfo-SBED белков с клетками HL-60 к этим клеткам добавляли моноклональное антитело к VISTA. Анализ проводили, используя программное обеспечение ImageQuant.

Как показано на ФИГ. 7, инокуляция антителом к VISTA приводила к ослаблению взаимодействия между VISTA и PSGL-1.

Эти эксперименты показывают, что PSGL-1, экспрессированный на клетках HL-60, является партнером по связыванию для VISTA. Эти эксперименты также показывают, что данное взаимодействие является специфичным и ослабляется под действием блокирующих антител к VISTA.

ПРИМЕР IV

Связывание VISTA с PSGL-1 на РВМС

В этом примере описывается связывание VISTA с PSGL-1, экспрессируемым мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС), с использованием подхода с перекрестным сшиванием.

В этих экспериментах экспрессию PSGL-1 оценивали с применением РЕ-конъюгированного моноклонального антитела к PSGL-1 (Abeam; ab78188), получившего название KPL-1. Детектирование экспрессии PSGL-1 клетками РВМС осуществляли посредством проточной цитометрии, используя стандартные методы (ФИГ. 8). По оценкам число копий белка PSGL-1 составляло приблизительно 38000 на одну клетку.

Кроме этого, РВМС либо оставляли без обработки, либо инкубировали с перекрестно сшивающим агентом (10 мМ бис(сульфосукцинимидил)субератом (BS³); ThermoFisher Scientific; 21580) в течение 90 мин на льду. После гашения реакции перекрестного сшивания, где это необходимо, выполняли лизис клеток и полученные лизаты предварительно осветляли, используя герцептин и сефарозу GammaBind™ Plus (GE Healthcare; 17-0886-01). Полученные образцы подвергали иммунопреципитации либо антителом к VISTA, либо антителом к PSGL-1 (KPL-1) в течение ночи. Подвергнутые иммунопреципитации образцы анализировали посредством вестерн-блоттинга, используя поликлональное антитело к PSGL-1 (R&D Systems; AF3345).

Как показано на ФИГ. 9, дорожка 4, после проведения перекрестного сшивания, никаких PSGL-1-специфичных зон не было обнаружено после иммунопреципитации антителом к VISTA. Например, это может быть обусловлено блокированием специфических эпитопов при образовании комплекса VISTA-PSGL-1 и, вследствие этого, предотвращением иммунопреципитации. Антитело к PSGL-1 вызывало преципитацию нескольких более высокомолекулярных комплексов (приблизительно 250-450 кДа) в обработанных BS3 РВМС (ФИГ. 9, последняя дорожка), которые также были PSGL-1-положительными.

В этих экспериментах оба антитела к VISTA и к PSGL-1 вызывали преципитацию белка с молекулярной массой приблизительно 240 кДа из РВМС, не обработанных ни одним из перекрестие сшивающих агентов. Этот комплекс был PSGL-1-положительным, и это демонстрирует, что PSGL-1 взаимодействует с VISTA (ФИГ. 9, дорожки 3 и 5). Иммунопреципитация антителом, взятым в качестве изотипического контроля, не давала такой зоны (ФИГ. 9, дорожки 1 и 2).

Эти эксперименты показывают, что PSGL-1, экспрессированный на РВМС, является партнером по связыванию для VISTA.

ПРИМЕР V

Экспрессия PSGL-1

В этом примере описывается экспрессия PSGL-1 в различных подгруппах Т-клеток.

В этих экспериментах экспрессию PSGL-1 оценивали, используя РЕ-конъюгированное антитело к CD162 человека. Оценивали следующие подгруппы Т-клеток: наивные и покоящиеся клетки (например, описанного фенотипа: CD45RO^- / CD45RA⁺ / CCR7⁺ / CD62L⁺ / CD27⁺ / CD28⁺ / CD127⁺), эффекторные клетки (например, описанного фенотипа: CD45RO⁺ / CD57⁺ / CD279^- / CD95⁺ / CCR7^- / CD62L^-), истощенные эффекторные клетки (например, описанного фенотипа: CD45RO⁺ / CD57⁺ / CD279⁺ / CD95⁺ / CD45RA^- / CCR7^- / CD62L^-) и циркулирующие клетки памяти (например, описанного фенотипа: центральные: CD45RO⁺ / CD45RA^- / CCR7⁺ / CD62L⁺ или эффекторные: CD45RO⁺ / CD45RA⁺ / CCR7^- / CD62L⁺).

В этих экспериментах образцы РВМС человека получали от ALLCELLS (Emeryville, CA). Две панели Т-клеточных маркеров готовили так, как приведено ниже. а. Панель 1: Т-клеточные маркеры + специфические маркеры для эффекторных/истощенных эффекторных клеток

1. CD45RA-FITC (флуоресцеинизотиоцианат),

2. CD45RO-PerCP-eFluor710,

3. CD197 (CCR7)-(краситель бриллиантовый фиолетовый 510),

4. CD62L-APC-eFluor 780, АРС означает аллофикоцианин,

5. CD57-(краситель тихоокеанский синий),

6. CD95 (Fas)-PE-Cy7 (цианин 7),

7. CD279-APC,

8. CD162-PE.

b. Панель 2: Т-клеточные маркеры + специфические маркеры для наивных/покоящихся клеток

1. CD45RA-FITC,

2. CD45RO-PerCP-eFluor710,

3. CD197 (CCR7)-(краситель бриллиантовый фиолетовый 510),

4. CD62L-APC-eFluor780,

5 CD27-(краситель тихоокеанский синий),

6. CD28-PE-Cy7,

7. CD127-APC,

8. CD162-PE.

В этих экспериментах в каждую панель добавляли приблизительно 10⁶ клеток и реагент, блокирующий Fc-рецептор (FcR) (Miltenyi Biotec, 130-092-247), вместе с соответствующими изотипическими контролями для каждого антитела и инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте. Затем клетки промывали и для каждого образца с использованием анализатора MACSQuant рассчитывали средние значения интенсивности флуоресценции (MFI). Количественное определение значений MFI проводили, используя антитела к IgG мыши из набора Quantum™ Simply Cellular® (Bangs Laboratories, 815В). Для жизнеспособной популяции (при отрицательном окрашивании 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)) собирали данные по флуоресценции для 105 событий и передавали на анализ с использованием программного пакета FlowJo.

Как показано на ФИГ. 10 и 11, PSGL-1 присутствует в подгруппах наивных/покоящихся, эффекторных, истощенных эффекторных Т-клеток, а также в обеих подгруппах циркулирующих (центральных и эффекторных) Т-клеток. Также на ФИГ. 10 и 11 показано, что экспрессия PSGL-1 повышалась в эффекторных подтипах Т-клеток по сравнению с наивными и истощенными Т-клетками. Самый высокий уровень экспрессии обнаруживали в подгруппе эффекторных клеток, в то время как самый низкий уровень экспрессии оказался в подгруппе наивных/покоящихся клеток. В Таблице 7 приведено число копий для экспрессируемого PSGL-1 в каждой подгруппе.

Эти эксперименты показывают, что PSGL-1 по-разному экспрессируется среди различных подгрупп Т-клеток в РВМС человека.

ПРИМЕР VI

Анализ in silico экспрессии VISTA и PSGL-1

В этом примере демонстрируется, что экспрессия VISTA коррелирует с PSGL1 по нескольким показателям.

Атлас ракового генома (TCGA) предоставляет возможность проведения; всестороннего анализа профилей генома рака с использованием высокопроизводительных технологий, включая методы секвенирования следующего поколения и методы, основанные на применении микрочипов. Депонированные в TCGA данные содержат информацию как о нуклеотидной последовательности, так и об экспрессии генов. Сайт cBioportal по геномике рака (http://www.cbioportal.org/), таким образом, предоставляет возможность просмотра, анализа и скачивания крупномасштабных наборов данных по геномике рака. Он охватывает исследования по геномике и транскриптомике из TCGA.

По каждому показателю делали запрос в TCGA на сайт cBioportal для идентификации мРНК, экспрессия которых больше всего коррелирует с VISTA. Этот корреляционный анализ проводили, используя критерий Спирмена. Результаты статистического анализа (р-значение <0,05) приводятся в Таблице 8; мРНК ранжируют с учетом их корреляции с VISTA.

В Таблице 8 показано, что экспрессия PSGL1 сильно коррелирует с экспрессией VISTA при нескольких видах рака. Самая высокая корреляция наблюдается в случаях NSCLC. Для сравнения, другие возможные рецепторы (т.е. VSIG3 и VSIG8) демонстрировали лишь слабую корреляцию.

ПРИМЕР VII

Оценка экспрессии мРНК VISTA и PSGL1 с использованием технологии RNAscope®

В этом примере показана картина экспрессии мРНК и совместной локализации VISTA и PSGL1 с использованием тканевых микрочипов (ТМА) в случае плоскоклеточной карциномы (SCC) и аденокарциномы (ADK) легких.

Материалы и методы

Из залитых парафином ТМА-блоков с образцами SCC и ADK легких (по 3 блока в каждом случае) готовили свежие срезы и помещали на предметные стекла, после чего проводили технические стадии гибридизации in situ (ISH). Образцы иссеченных тканей помещали в свежеприготовленный 10%-ный забуференный до нейтрального значения рН формалин (NBF) на 16-32 часа при комнатной температуре (КТ). Затем образцы дегидратировали, заливали парафином и готовили срезы толщиной по 5±1 мкм, которые далее помещали на предметные стекла Superfrost® Plus. Эти предметные стекла выдерживали в сушильном шкафу в течение 1 часа при 60°С.

Тканевые срезы толщиной 5 мкм депарафинизировали в ксилоле, после чего проводили серию процедур дегидратации в этаноле. Затем тканевые срезы инкубировали в цитратном буфере (10 нмоль/л, рН 6), поддерживаемом при температуре кипения (от 100°С до 103°С) с использованием плитки, в течение 15 минут, промывали в деионизованной воде и незамедлительно обрабатывали протеазой (10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) при 40°С в течение 30 минут в гибрид изационной камере HybEZ (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA).

Далее на обработанных тканевых срезах проводили гибридизацию с зондами на PSGL-1 или VISTA с использованием набора для анализа RNAscope® 2.5 (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA), следуя инструкциям производителя.

Срезы окрашивали гематоксилином и эозином с целью проверки качества и проведения оценки под микроскопом для каждого ядра. Исследование осуществляли, используя стандартный световой микроскопа с 20-40-кратным увеличением. Для записи собранных данных использовали лист Excel.

Проверки отрицательного и положительного контролей выполняли, используя 2 специфичных зонда. С целью подтверждения отсутствия загрязнения (в случае зондов для отрицательного контроля) и наличия доступной мРНК (в случае зондов для положительного контроля) осуществляли оценку в баллах этих контролей. Протокол заполняли вручную.

Оценку меченых тканей проводили, применяя полуколичественный метод с использованием двойной шкалы оценки для каждой мишени.

Баллы по шкале оценки распределения в тканях варьировали в диапазоне от 0 до 3 и отображали содержание положительно меченых клеток в пределах популяции (в иммунном инфильтрате) и рассматривались как баллы по шкале Immunoscore.

Оценочная шкала Immunoscore: в диапазоне от 0 до 3, как приведено ниже:

• 0: отсутствие,

• 1: низкое содержание,

• 2: умеренное содержание.

• 3: высокое содержание.

Для оценки количества пятен РНК внутри клеток использовали оценочную шкалу ACD, т.е. оценочную шкалу, рекомендованную производителем набора для анализа RNAscope® 2.5 (Advanced Cell Diagnostics (ACD), Hayward, CA). Каждое пятно представляет собой единичную молекулу РНК, поскольку в анализе с использованием RNAscope® 2.5 детектируются индивидуальные молекулы РНК. В этой системе оценка измеряется в диапазоне от 0 до 4 в зависимости от количества пятен и/или кластеров (0: ни одного пятна; 4: многочисленные пятна и кластеры) в цитоплазме, и ее можно рассматривать как систему оценивания применительно к внутреннему содержимому клетки.

Результаты

ТМА в случае SCC легких

В случае SCC легких проводили анализ с применением трех ТМА. Для каждого пациента выполняли оценку ядер в трех повторах.

Факт мечения мРНК как в случае VISTA, так и PSGL-1 наблюдали главным образом в микроокружении опухоли (в инфильтратах иммунных клеток). Положительно меченые клетки имели миелоидную морфологию (связанную с макрофагами). Однако, иногда некоторое количество "положительных" пятен отмечали в лимфоцитах (обе мРНК) и нейтрофилах (только для VISTA).

мРНК для VISTA преобладала в инфильтратах микроокружения опухоли. Эта мишень в той или иной степени экспрессировалась во всех ядрах клеток в случае SCC легких. В цитоплазме наблюдали небольшие и многочисленные пятна. В отдельных случаях соответствующие VISTA пятна просматривались в эндотелиальных клетках. Положительные по мРНК VISTA опухолевые клетки наблюдали более чем для 80% ядер.

По сравнению с VISTA уровень экспрессии мРНК PSGL-1 в инфильтратах микроокружения опухоли был ниже. Наблюдали более крупные пятна, но их в цитоплазме было меньше, чем пятен в случае VISTA. Опухолевые клетки экспрессировали мРНК PSGL-1 в отдельных случаях (для 30% ядер); большей частью оценка по шкале ACD (т.е. количество пятен в цитоплазме) была довольно низкой.

Почти во всех ядрах наблюдали положительное мечение мРНК VISTA с уровнем от умеренного до высокого по сравнению с 35% для мРНК PSGL-1. Ни одно из ядер не оказалось меченым отрицательно для обеих мишеней, т.е. каждое из ядер было "положительным" в отношении либо VISTA, либо PSGL-1, либо их обоих. Эти результаты суммированы в Таблице 10.

В заключение:

• совместную локализацию мРНК VISTA и PSGL-1 наблюдали в микроокружении опухоли, один из примеров чего показан на ФИГ. 12;

• почти все PSG Li-положительные клетки были расположены вблизи VISTA-положительных клеток;

• в каждом ядре по меньшей мере некоторых клеток наблюдали экспрессию как PSGL-1, так и VISTA;

• VISTA-положительные клетки можно было наблюдать в отсутствие расположенных вблизи них PSGL-1-положительных клеток. Некоторые VISTA-положительные клетки можно было наблюдать при явном отсутствии расположенных вблизи них PSGL-1-положительных клеток. Однако, ни одной PSGL-1-положительной клетки не наблюдали без расположенной вблизи нее VISTA-положительной клетки, и это означает, что PSGL-1-положительные клетки всегда располагались вблизи VISTA-положительных клеток. Частично это было связано с тем, что в иммунном инфильтрате VISTA-положительные клетки преобладали.

ТМА в случае ADK легких

В случае ADK легких проводили анализ с применением трех ТМА. Для каждого пациента выполняли оценку ядер в четырех повторах.

Как и в случае с SCC легких, факт мечения мРНК VISTA и PSGL-1 отмечали в микроокружении опухоли (в инфильтратах иммунных клеток). Положительно меченые клетки имели миелоидную морфологию (связанную с макрофагами). Однако, иногда некоторое количество "положительных" пятен отмечали в лимфоцитах (обе мишени) и нейтрофилах (только для VISTA).

Картина экспрессии как VISTA, так и PSGL-1 в случае ADK легких была очень схожа стой, которую наблюдали при SCC легких.

Более чем в 50% ядер наблюдали высокий уровень положительного мечения для мРНК VISTA, в то время как приблизительно в 50% ядер наблюдали положительное мечение для мРНК PSGL1. В случае PSGL-1 незначительное число ядер оказалось мечеными отрицательно (7%). Эти результаты суммированы в Таблице 12.

В случае ADK легких, как и в случае SCC легких, наблюдали совместную локализацию или взаимосвязанные картины экспрессии для мРНК VISTA и PSGL-1.

Полуколичественный анализ картин экспрессии мРНК VISTA и PSGL-1 с использованием двойного RNAscope® выявил, что данные мишени часто локализовались совместно или экспрессировались в расположенных близко друг от друга клетках в микроокружении опухоли. Оказалось, что мРНК VISTA экспрессировалась чаще, чем мРНК PSGL1. Однако, все ядра в случае SCC легких и 83% ядер в случае ADK легких экспрессировали обе мишени.

С использованием RNAscope® выявлено, что PSGL-1 может экспрессироваться в тех же клетках или вблизи клеток, которые экспрессируют VISTA.

ПРИМЕР VIII

Высвобождение IL-2 из CD4⁺ Т-клеток в присутствии PSGL-1-Fc +/- антител к VISTA или антител к PSGL1 (72 ч)

В этом примере описывается PSGL-1-опосредуемое ингибирование активации Т-клеток.

Методы

Эксперименты проводили в трех повторах.

Выделение CD⁺ Т-клеток от двух здоровых доноров проводили посредством отрицательной селекции с использованием наборов от Milenyi.

Лунки 96-луночных планшетов покрывали антителом к CD3 (выпускаемым eBiosciences, BioxCell, номер по каталогу ВЕ0001-2, клон ОКТЗ, партия 640417J1 (mIgG2a; мышиный IgG2a)) в концентрации 2,5 мкг/мл в объеме 100 мкл в течение 4 ч при 37°С. Затем планшеты 2 раза промывали PBS. Покрытие антителом c9G4 и слитым белком PSGL-1-Fc проводили в течение ночи при 4°С в 224 нМ концентрации в объеме 100 мкл в трех повторах.

Эти планшеты 4 раза промывали PBS. В каждую лунку добавляли по 100000 CD4⁺ Т-клеток в 200 мкл среды, содержащей антитело к CD28 (2,5 мкг/мл) с добавлением или без добавления антитела к VISTA 26A (10 мкг/мл), которое описано в WO 2014/197849 (более конкретно, используемое антитело представляло собой гуманизированное антитело, имеющее приведенные далее последовательности CDR, описанные в WO 2014/197849: CDRH1: SEQ ID NO 1297, CDRH2: SEQ ID NO 1559, CDRH3: SEQ ID NO 1394, CDRL1: SEQ ID NO 1432, CDRL2: SEQ ID NO 1477 и CDRL3: SEQ ID NO 1499), или контрольного антитела c9G4 (описанного в WO 2015/162292 A).

После инкубирования в течение 72 ч супернатанты извлекали и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об./мин. После центрифугирования супернатанты переносили в новые 96-луночные планшеты и замораживали при -80°С до проведения анализа на IL-2.

Концентрацию IL-2 в супернатантах измеряли, используя имеющийся в продаже набор (универсальную систему для определения IL2 человека с использованием массива гранул для цитометрического анализа BD™ (СВА Human IL2 Flex Set), №по каталогу 558270).

Результаты

Чтобы проверить наличие иммуносупрессивных свойств у PSGL-1, исследовали акгивационный статус Т-клеток после стимуляции в присутствии или в отсутствие данного белка. С этой целью сначала конструировали слитый белок PSGL-1-Fc, состоящий из внеклеточного домена PSGL-1 и Fc-области IgG человека. Затем осуществляли активацию CD4⁺ Т-клеток антителами к CD3 и CD28 в присутствии PSGL-1-Fc или контрольного IgG. Проводили мониторинг высвобождения IL-2, как маркера активации этих клеток.

Как показано на ФИГ. 13, инкубирование Т-клеток в присутствии PSGL-1 вызывает 2-кратное снижение высвобождения IL-2, маркера активации Т-клеток, по сравнению с контролем, т.е. нерелевантным белком, использованным для покрытия в той же концентрации (c9G4). Полученные результаты оказались аналогичными для двух разных доноров. Таким образом, PSGL-1 ингибирует активацию Т-клеток.

Добавление антител к VISTA частично устраняет это ингибирование (см. ФИГ. 13). Действительно, в присутствии антител к VISTA ингибирование ослаблялось более чем на 50%. Добавление контрольного антитела (c9G4) не влияло на ингибирование высвобождения IL-2 под действием psgl1-fc, что подчеркивает специфичность данного эффекта, обнаруженного с использованием антител к VISTA. Такая специфическая реверсия в результате добавления антител к VISTA демонстрирует, что PSGL-1-зависимое ингибирование активации Т-клеток по меньшей мере частично опосредуется VISTA.

Эти результаты подтверждают, что VISTA и PSGL1 взаимодействуют как на физическом, так и на функциональном уровнях. Нарушение этого взаимодействия (в данном случае с использованием антител к VISTA) усиливает высвобождение IL-2 и, следовательно, активацию Т-клеток.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT

FERRE, Pierre

CRUZALEGUI, Francisco

LOUKILI, Noureddine

<120> РЕЦЕПТОР ДЛЯ VISTA

<130> B3764799PCTD38601

<150> PCT IB2018/000983

<151> 2018-07-20

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 311

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser

1 5 10 15

Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

100 105 110

Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn

115 120 125

Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr

130 135 140

Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val

145 150 155 160

His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser

165 170 175

Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr

180 185 190

Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu

195 200 205

Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn

210 215 220

Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile

225 230 235 240

Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser

260 265 270

Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro

275 280 285

Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp

290 295 300

Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> ДНК

<213>  

<400> 2

atgggcgtcc ccacggccct ggaggccggc agctggcgct ggggatccct gctcttcgct 60

ctcttcctgg ctgcgtccct aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120

ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180

gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240

cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300

catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360

tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420

agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480

catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540

tacccatcct cctcccagga tagtgaaaac atcacggctg cagccctggc tacgggtgcc 600

tgcatcgtag gaatcctctg cctccccctc atcctgctcc tggtctacaa gcaaaggcag 660

gcagcctcca accgccgtgc ccaggagctg gtgcggatgg acagcaacat tcaagggatt 720

gaaaaccccg gctttgaagc ctcaccacct gcccagggga tacccgaggc caaagtcagg 780

caccccctgt cctatgtggc ccagcggcag ccttctgagt ctgggcggca tctgctttcg 840

gagcccagca cccccctgtc tcctccaggc cccggagacg tcttcttccc atccctggac 900

cctgtccctg actctccaaa ctttgaggtc atctag 936

<210> 3

<211> 402

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu

20 25 30

Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr

35 40 45

Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg

50 55 60

Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser

65 70 75 80

Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu

100 105 110

Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala

115 120 125

Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr

130 135 140

Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro

165 170 175

Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala

195 200 205

Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu

225 230 235 240

Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro

245 250 255

Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu

260 265 270

Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met

275 280 285

Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His

290 295 300

Ile Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val

305 310 315 320

Ala Thr Ile Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser

325 330 335

Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met

340 345 350

Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala

355 360 365

Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro

370 375 380

Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe

385 390 395 400

Leu Pro

<210> 4

<211> 2226

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

atggggtgtg ggctgtcaca tggccctgcc taagtaacca cattctcgct tcctccttcc 60

acacacagcc attgggggtt gctcggatcc gggactgccg cagggggtgc cacagcagtg 120

cctggcagcg tgggctggga ccttgtcact aaagcagaga agccacttct tctgggccca 180

cgaggcagct gtcccatgct ctgctgagca cggtggtgcc atgcctctgc aactcctcct 240

gttgctgatc ctactgggcc ctggcaacag cttgcagctg tgggacacct gggcagatga 300

agccgagaaa gccttgggtc ccctgcttgc ccgggaccgg agacaggcca ccgaatatga 360

gtacctagat tatgatttcc tgccagaaac ggagcctcca gaaatgctga ggaacagcac 420

tgacaccact cctctgactg ggcctggaac ccctgagtct accactgtgg agcctgctgc 480

aaggcgttct actggcctgg atgcaggagg ggcagtcaca gagctgacca cggagctggc 540

caacatgggg aacctgtcca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcaaccagc 600

agccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacaa ctcgactgac 660

ggccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacca ctccaccagc 720

agccacggaa gcacagacca ctcaacccac aggcctggag gcacagacca ctgcaccagc 780

agccatggag gcacagacca ctgcaccagc agccatggaa gcacagacca ctccaccagc 840

agccatggag gcacagacca ctcaaaccac agccatggag gcacagacca ctgcaccaga 900

agccacggag gcacagacca ctcaacccac agccacggag gcacagacca ctccactggc 960

agccatggag gccctgtcca cagaacccag tgccacagag gccctgtcca tggaacctac 1020

taccaaaaga ggtctgttca tacccttttc tgtgtcctct gttactcaca agggcattcc 1080

catggcagcc agcaatttgt ccgtcaacta cccagtgggg gccccagacc acatctctgt 1140

gaagcagtgc ctgctggcca tcctaatctt ggcgctggtg gccactatct tcttcgtgtg 1200

cactgtggtg ctggcggtcc gcctctcccg caagggccac atgtaccccg tgcgtaatta 1260

ctcccccacc gagatggtct gcatctcatc cctgttgcct gatgggggtg aggggccctc 1320

tgccacagcc aatgggggcc tgtccaaggc caagagcccg ggcctgacgc cagagcccag 1380

ggaggaccgt gagggggatg acctcaccct gcacagcttc ctcccttagc tcactctgcc 1440

atctgttttg gcaagacccc acctccacgg gctctcctgg gccacccctg agtgcccaga 1500

ccccattcca cagctctggg cttcctcgga gacccctggg gatggggatc ttcagggaag 1560

gaactctggc cacccaaaca ggacaagagc agcctggggc caagcagacg ggcaagtgga 1620

gccacctctt tcctccctcc gcggatgaag cccagccaca tttcagccga ggtccaaggc 1680

aggaggccat ttacttgaga cagattctct cctttttcct gtcccccatc ttctctgggt 1740

ccctctaaca tctcccatgg ctctccccgc ttctcctggt cactggagtc tcctccccat 1800

gtacccaagg aagatggagc tcccccatcc cacacgcact gcactgccat tgtcttttgg 1860

ttgccatggt caccaaacag gaagtggaca ttctaaggga ggagtactga agagtgacgg 1920

acttctgagg ctgtttcctg ctgctcctct gacttggggc agcttgggtc ttcttgggca 1980

cctctctggg aaaacccagg gtgaggttca gcctgtgagg gctgggatgg gtttcgtggg 2040

cccaagggca gacctttctt tgggactgtg tggaccaagg agcttccatc tagtgacaag 2100

tgacccccag ctatcgcctc ttgccttccc ctgtggccac tttccagggt ggactctgtc 2160

ttgttcactg cagtatccca actgcaggtc cagtgcaggc aataaatatg tgatggacaa 2220

acgata 2226

<210> 5

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 5

Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 6

Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 7

Gly Tyr Thr Met Asn

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 8

Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 9

Thr Gly Tyr Thr Met Asn

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 10

Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 11

Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 12

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 12

Pro Tyr Asn Gly

1

<210> 13

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 13

Trp Ile Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 14

Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 15

Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 16

Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 17

Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 18

Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 19

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 20

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 21

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 21

Ser Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 22

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 22

Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 23

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 24

<211> 3

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 24

Asp Thr Ser

1

<210> 25

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 25

Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 26

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 27

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 27

Trp Ser Ser Tyr Pro Phe

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 28

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe

1 5

<210> 29

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 29

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 30

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 31

Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 32

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 32

Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr

1 5

<210> 33

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 33

Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 34

Trp Ile Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 35

Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser

1 5 10

<210> 36

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 36

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 1260

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> слитый белок VISTA-Fc

<400> 37

atgggcgtgc ccacagccct ggaagctggc agctggaggt ggggaagcct gctgttcgcc 60

ctgtttctgg ccgcctccct gggacctgtg gccgccttta aggtcgccac cccttacagc 120

ctgtacgtgt gccccgaggg ccagaacgtg accctgacct gcagactgct gggccctgtg 180

gacaagggcc acgacgtgac cttctacaag acctggtaca ggagcagcag gggcgaggtc 240

cagacctgca gcgagaggag gcccatcagg aacctgacct tccaggacct gcacctgcac 300

cacggaggcc atcaggccgc caacacctcc cacgacctgg ctcagaggca cggactggag 360

agcgccagcg atcaccacgg caacttcagc atcaccatga ggaacctcac cctgctggac 420

agcggcctgt actgttgcct ggtggtggag atcaggcacc accacagcga gcacagagtg 480

cacggcgcca tggaactgca ggtgcagacc ggaaaggacg cccccagcaa ctgcgtggtg 540

taccccagca gctcccagga cagcgagaac atcaccgccg ccagatctgt ggagtgccca 600

ccttgcccag caccacctgt ggcaggacct tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 660

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 720

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 780

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 840

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 900

ccatcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 960

tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1020

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1080

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1140

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1200

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1260

<210> 38

<211> 416

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> слитый белок VISTA-Fc

<400> 38

Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser

1 5 10 15

Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

100 105 110

Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn

115 120 125

Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr

130 135 140

Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val

145 150 155 160

His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser

165 170 175

Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Arg

180 185 190

Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

195 200 205

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

210 215 220

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

225 230 235 240

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

245 250 255

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

260 265 270

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

275 280 285

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

290 295 300

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

305 310 315 320

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

325 330 335

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

340 345 350

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

355 360 365

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

370 375 380

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

385 390 395 400

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

405 410 415

<210> 39

<211> 521

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Fc-слитый PSGL-1 с сигнальной последовательностью IgG kappa и пропептидной последовательностью

<400> 39

Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu

20 25 30

Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr

35 40 45

Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg

50 55 60

Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser

65 70 75 80

Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu

100 105 110

Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala

115 120 125

Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr

130 135 140

Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro

165 170 175

Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala

195 200 205

Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu

225 230 235 240

Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro

245 250 255

Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu

260 265 270

Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met

275 280 285

Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Ala Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys

290 295 300

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

305 310 315 320

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

325 330 335

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

340 345 350

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

355 360 365

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

370 375 380

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

385 390 395 400

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

405 410 415

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

420 425 430

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

435 440 445

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

450 455 460

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

465 470 475 480

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

485 490 495

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

500 505 510

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520

<210> 40

<211> 523

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Fc-слитый PSGL-1 с сигнальной последовательностью каппа-цепи IgG и элементом тандемного повтора

<400> 40

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp

35 40 45

Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu

50 55 60

Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly Gly Ala Val Thr

65 70 75 80

Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu Ser Thr Asp Ser

85 90 95

Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln

100 105 110

Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala

115 120 125

Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr

130 135 140

Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro

165 170 175

Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln

180 185 190

Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala

195 200 205

Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr

210 215 220

Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu

225 230 235 240

Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro

245 250 255

Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr

260 265 270

His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro

275 280 285

Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Ala Arg Ser Val Glu Cys Pro

290 295 300

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

305 310 315 320

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

325 330 335

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

340 345 350

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

355 360 365

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

370 375 380

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

385 390 395 400

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

405 410 415

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

420 425 430

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

435 440 445

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

450 455 460

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

465 470 475 480

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

485 490 495

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

500 505 510

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ in vitro диагностики опухоли, вызванной или иным образом ассоциированной с клетками, экспрессирующими V-доменный иммуноглобулиновый супрессор активации Т-клеток (VISTA), у субъекта и применение анти-VISTA терапевтического агента для приготовления лекарственного средства для лечения рака, вызванного или иным образом ассоциированного с VISTA-экспрессирующими клетками, у пациента, при этом указанное лечение включает предварительную стадию диагностирования указанного рака у указанного пациента с использованием вышеуказанного способа in vitro диагностики опухоли. Способ включает стадии приведения в контакт биологического образца от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с нуклеиновой кислотой гликопротеинового лиганда 1 P-селектина (PSGL-1) или белком PSGL-1; и количественное определение связывания указанного реагента с указанным биологическим образцом, определяя таким образом уровень экспрессии PSGL-1 в указанном образце. Изобретение расширяет арсенал средств диагностики опухоли, вызванной или иным образом ассоциированной с клетками, экспрессирующими VISTA. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 13 ил., 12 табл., 8 пр.

1. Способ in vitro диагностики опухоли, вызванной или иным образом ассоциированной с клетками, экспрессирующими V-доменный иммуноглобулиновый супрессор активации Т-клеток (VISTA), у субъекта, включающий стадии, на которых:

a) приводят в контакт биологический образец от указанного субъекта с реагентом, способным специфично связываться с нуклеиновой кислотой гликопротеинового лиганда 1 P-селектина (PSGL-1) или белком PSGL-1; и

b) количественно определяют связывание указанного реагента с указанным биологическим образцом, определяя таким образом уровень экспрессии PSGL-1 в указанном образце.

2. Способ по п. 1, где указанный реагент выбран из ДНК-зонда, РНК-зонда и антитела к PSGL-1.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где связывание с PSGL-1 в иммунных инфильтратах микроокружения опухоли определено количественно.

4. Способ по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий стадию оценки опухоли путем сравнения уровня стадии (b) с соответствующей шкалой, основанной на двух параметрах, представляющих собой интенсивность окрашивания и процентную долю положительных клеток.

5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий стадию сравнения уровня экспрессии на стадии b) с референсным уровнем, при этом повышение анализируемого уровня PSGL-1 на стадии b) по сравнению с референсным уровнем указывает на наличие VISTA-опосредуемой опухоли.

6. Способ по п. 5, где указанный референсный уровень представляет собой уровень экспрессии PSGL-1 в образцах нормальной ткани.

7. Способ по любому из пп. 5 или 6, где VISTA-опосредуемая опухоль выбрана из группы, состоящей из гематологических злокачественных опухолей, рака или саркомы мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, соединительной ткани, прямой кишки, желудка, пищевода, легкого, гортани, почки, ротовой полости, яичников или предстательной железы, меланом или глиом либо метастаз любого из этих видов рака.

8. Способ по п. 7, где гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, лимфому или миелому.

9. Применение анти-VISTA терапевтического агента для приготовления лекарственного средства для лечения рака, вызванного или иным образом ассоциированного с VISTA-экспрессирующими клетками, у пациента, при этом указанное лечение включает предварительную стадию диагностирования указанного рака у указанного пациента по пп. 1-8,

где указанный анти-VISTA терапевтический агент выбран из группы, состоящей из:

a) антитела к VISTA, при этом указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую 3 определяющих комплементарность участка (CDR) с последовательностями SEQ ID NO: 7, 10 и 15, определенными по Kabat; и легкую цепь, содержащую 3 CDR с последовательностями SEQ ID NO: 19, 23 и 26, определенными по Kabat; и

b) антитела к VISTA, при этом указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую 3 CDR с последовательностями SEQ ID NO: 17, 31 и 15, определенными по Kabat; и легкую цепь, содержащую 3 CDR с последовательностями SEQ ID NO: 19, 23 и 26, определенными по Kabat.

10. Применение по п. 9, где указанное антитело к VISTA представляет собой гуманизированное антитело.

11. Применение по любому из пп. 9 или 10, где указанное лечение дополнительно включает стадию адаптирования лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, и при этом указанная адаптация лечения представляет собой:

- сокращение или приостановку указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент не восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту, или

- продолжение указанного лечения анти-VISTA терапевтическим агентом, если установлено, что пациент восприимчив к анти-VISTA терапевтическому агенту.