Область техники, к которой относится изобретение
В настоящем документе описываются конъюгаты антител с лекарственными веществами, в которых антитело является специфичным к рецептору трансферрина TfR, а лекарственное вещество предпочтительно выбирают из цитотоксических веществ. Такие конъюгаты антител с лекарственными веществами полезны, в частности, при лечении пролиферативных заболеваний, включая раковые заболевания, например лимфомы или лейкозы.
Уровень техники
Конъюгаты антител с лекарственными веществами (далее сокращенно обозначаются ADC) - это новая группа терапевтических агентов, в частности противораковых терапевтических средств. ADC для лечения ракового заболевания, включает по меньшей мере антитело, нагруженное лекарственным веществом (например, цитотоксическим агентом), причем как антитело, так и лекарственное вещество, связаны с линкером. Таким образом в ADC объединены специфичность антитела к его мишени и эффективность лекарства (например, цитотоксичность химиотерапевтического агента). Эффективный ADC должен обладать высокой специфичностью и низкой токсичностью.
Что касается токсичности, то входящее в состав ADC антитело должно специфично и прочно связываться с соответствующим ему антигеном, в качестве которого пригоден антиген, предпочтительно и исключительно экспрессирующийся на клетках-мишенях.
Линкеры, которые можно использовать для создания ADC, описаны в ряде патентов и патентных заявок, например в патенте США № 6 214 345, а также в публикациях WO 03/026577, WO 03/043583, WO 2004/010957, WO 2005/082023 и WO 2015/001117. Примеры линкеров, которые использовались для связывания антитела и цитотоксического вещества или иного лекарственного средства, включают (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера): гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфидные соединения и линкерные молекулы, содержащие пептиды. Линкеры выбирают, например, из соединений, способных расщепляться при низких рН, свойственных внутреннему содержимому лизосом, или под воздействием протеаз, предпочтительно экспрессирующихся в опухолевых тканях, например катепсинов (например, катепсинов B, C, D). Эффективный линкер обеспечивает высвобождение лекарственного вещества из ADC в нужном месте и в нужное время. Для проявления токсичности содержащегося в ADC лекарственного вещества существенна стабильность линкера, даже если сам линкер не способствует токсичности. В самом деле, если линкер стабилен, то более вероятно, что высвобождение лекарственного вещества произойдет специфично в отношении мишени, тогда как высвобождение лекарственного средства из ADC с нестабильным линкером скорее произойдет не там и не тогда, где и когда нужно, что приведет к неспецифической токсичности.
В ADC используются мощные лекарства - часто это цитотоксические агенты, которые эффективны в пикомолярном диапазоне. Например, широко используются агенты, подавляющие образование сети микротрубочек (например, такие производные майтанзина, как DM1/DM4, или ауристатины (MMAE/MMAF)), ингибиторы синтеза ДНК (например, калихеамицин, доксорубицин, пирролобензодиазепины, индолинобензодиазепины или производные дуокармицина) или ингибитор топоизомеразы (например, SN-38).
Хотя ADC представляются многообещающими терапевтическими средствами, некоторые из них могут оказаться слишком токсичными, что ограничивает терапевтическое окно или препятствует дальнейшей клинической разработке.
Для создания действенных ADC, обладающих высокой специфичностью, максимальной эффективностью и низкой токсичностью, требуется правильная комбинация каждого из составляющих его компонентов.
Рецептор трансферрина (CD71; далее в настоящем документе сокращенно обозначаемый также TfR) - это трансмембранный гликопротеин, представляющий собой гомодимер, состоящий из двух соединенных дисульфидной связью мономеров с молекулярной массой приблизительно 90 кДа и длиной 760 аминокислотных остатков каждый. Рецептор трансферрина играет очень важную роль в регуляции клеточного усвоения железа и в клеточном росте (Gill M.D. et al., N. Engl. J. Med., 332,1744-1748, 1995; Hermine O. et al., N. Engl. J. Med., 332, 1749-1751, 1995). Когда трансферрин, несущий два иона трехвалентного железа, связывается со своим рецептором на поверхности клетки, происходит его интернализация через окаймленные клатрином ямки, которые превращаются в окаймленные пузырьки с кислым содержимым, где комплекс трансферрина с железом диссоциирует. Высвободившиеся рецептор и апотрансферрин возвращаются на поверхность клетки.
Рецептор трансферрина конститутивно экспрессируется на плазматической мембране клеток в постоянно обновляющихся тканях, например предшественников клеток крови в костном мозге, гепатоцитов в печени, кератиноцитов в эпидермисе и энтероцитов в криптах эпителия кишечника.
В ряде исследований было показано, что в злокачественных тканях рецептор трансферрина экспрессируется интенсивнее, чем в соответствующих нормальных тканях (Gatter K.C. et al., J. Clin. Pathol.., 36,539-545, 1983; Faulk W.P. et al., Lancet., 2,390-392, 1980; Shindelman J.E. et al., Int. J. Cancer, 27,329-334, 1981). Некоторые авторы сообщали об основанных на этом факте терапевтических подходах, предполагающих использование антител против рецептора трансферрина или самого трансферрина, конъюгированного с лекарственными агентами, предназначенными уничтожать злокачественные клетки. Также предлагалось использовать антитела против рецептора трансферрина, чтобы блокировать взаимодействие трансферрина с его рецептором и, следовательно, предотвращать клеточное усвоение железа, что должно приводить к его дефициту в клетках и подавлению клеточного роста. Однако, хотя во многих публикациях описывается получение антител против рецептора трансферрина, очень мало сообщений о моноклональных антителах против рецептора трансферрина, обладающих антипролиферативной активностью.
Авторы данного изобретения в работе, опубликованной ранее (Moura I.C. et al., J. Exp. Med., 194, 417-425, 2001), сообщали о моноклональных мышиных иммуноглобулинах класса G (IgG2κ), обозначенных A24, которые связывались с человеческим рецептором трансферрина.
В публикации WO 2005/111082 описываются мышиные антитела A24, блокирующие пролиферацию Т-лимфоцитов, причем эти антитела подавляли пролиферацию Т-клеток эффективнее, чем ранее описанные моноклональные антитела mAb 42/6. Антитела A24 также вызывали снижение уровня экспрессии рецептора трансферрина на клеточной поверхности и нарушали циркулирование молекул TfR. Кроме того, ex vivo антитела A24 блокировали пролиферацию злокачественных Т-лимфоцитов при острых и хронических формах Т-клеточного лейкоза-лимфомы взрослых (ATL) (Moura I.C. et al., Blood, 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callens С. et al., 2010; J. Exp. Med., Vol. 207 No. 4, pp. 731-750). Сообщалось также, что эти антитела способны предотвращать развитие лимфомы из клеток мантийной зоны лимфатического узла как in vitro, так и in vivo (Lepelletier Y. et al. Cancer. Res. 2007; 67:1145-1154; Callens С. et al. 2008, Leukemia, 22, 42-48).
В публикации WO 2017/013230 описываются также гуманизированные варианты антител А24 и их использование при лечении пролиферативных расстройств. В этой работе также описываются антитела против рецептора трансферрина, конъюгированные с терапевтическим агентом, например цитотоксическим веществом или иным лекарственным средством. Однако в публикации WO 2017/013230 не говорится о специфичных конъюгатах антител с лекарствами.
Следовательно, существует потребность в таких конъюгатах антител с лекарственными веществами, содержащих антитела против рецептора трансферрина, которые были бы эффективны, высоко специфичны и мало токсичны.
Авторы данного изобретения разработали такие конъюгаты антител с лекарственными веществами. Данное изобретение базируется на полученных превосходящих ожидания результатах, показывающих, что ADC по данному изобретению (то есть содержащие специфичные антитела против рецептора трансферрина, которые через специальные линкеры соединены с лекарственными агентами) обладают следующими преимуществами:
- Антитела A24 и ADC по данному изобретению характеризуются близкой эффективностью связывания с клетками, в которых экспрессируется рецептор трансферрина;;
- ADC по данному изобретению вызывают апоптоз только клеток, несущих маркер CD71 (рецептор трансферрина);
- ADC по данному изобретению действуют в клетках многих линий;
- ADC по данному изобретению эффективны как in vitro, так и in vivo;
- ADC по данному изобретению не оказывают ненаправленного действия (например, не вызывают высвобождения провоспалительных цитокинов) или токсических эффектов in vivo.
Раскрытие изобретения
Настоящее описание касается конъюгатов антител с лекарственными веществами, описываемых формулой (I): Ab-L-Z-X-D, где
- Ab - это антитело против рецептора трансферрина;
- L - линкер, связанный с указанным антителом и описываемый формулой (II):
, где n - целое число от 2 до 20,
- Z - дипептид валин-цитруллин, связанный с L;
- X - саморасщепляющаяся группа аминобензилового эфира, которая связана с Z;
- D - лекарственное вещество, связанное с X.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, D является цитотоксическим агентом. Предпочтительно D - это цитотоксическое вещество монометилауристатин E (далее в настоящем документе сокращенно обозначается MMAE).
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, X - это группа пара-аминобензилового эфира, которая ковалентно связана с Z, причем указанная X-группа описывается следующей формулой (III):
, где J - заместитель (при необходимости), выбираемый из фтора (F), хлора (Cl), брома (Br), -NO2, -NHCOCH3, -N(CH3)2, -NHCOCF3, алкильных групп и галогеналкильных групп, причем m - это целое число от 0 до 4. Предпочтительно X - это группа пара-аминобензилового эфира, а m = 0.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, L ковалентно связана с одной или более тиольных групп аминокислотных остатков молекулы указанного антитела. Предпочтительно L соответствует линкерной молекуле, описываемой формулой (IV):
.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело включает полноразмерное антитело или фрагмент антитела, содержащий участок связывания антигена.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело специфично связывается с рецептором трансферрина, имеющим последовательность SEQ ID NO:16.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело связывается с рецептором трансферрина с константой диссоциации KD = 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело вызывает апоптоз в клетках линии HL-60 на урове, равном или превышающим уровень индукции апоптоза, определенного для соответствующего химерного антитела с вариабельными областями исходного мышиного антитела, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность SEQ ID NO:9 и вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность SEQ ID NO:10.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело является моноклональным.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело является гуманизированным.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело содержит константную область человеческого иммуноглобулина изотипа IgG4 или мутантную либо химически модифицированную константную область, которая обеспечивает для этого антитела отсутствие антитело-зависимой клеточно-опосредованной циитотоксичности (ADCC) или таковая понижена по сравнению с ADCC для антитела с константной областью IgG1 дикого типа. Или же указанное антитело содержит константную область человеческого иммуноглобулина изотипа IgG1 или мутантную либо химически модифицированную константную область, которая обеспечивает для этого антитела ADCC более высокую, чем таковая для соответствующего антитела с константной областью IgG1 дикого типа.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело против рецептора трансферрина является моноклональным гуманизированным антителом изотипа IgG4.
В другом конкретном воплощении данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, указанное антитело против рецептора трансферрина содержит либо:
(a) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий HCDR1 последовательности SEQ ID NO:1, HCDR2 последовательности SEQ ID NO:2, HCDR3 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий LCDR1 последовательности SEQ ID NO:4, LCDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и LCDR3 последовательности SEQ ID NO:6;
(b) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий HCDR1 последовательности SEQ ID NO:1, HCDR2 последовательности SEQ ID NO:2, HCDR3 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий LCDR1 последовательности SEQ ID NO:4, LCDR2 последовательности SEQ ID NO:8 и LCDR3 последовательности SEQ ID NO:6;
(c) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:13;
(d) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:14;
(e) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:15;
(f) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:13;
(g) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:14;
(h) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий VL последовательности SEQ ID NO:15.
Примеры антител, которые можно использовать в ADC по данному изобретению, включают гуманизированные антитела против рецептора трансферрина, моноклональные антитела mAb1 - mAb16 (см. ниже, в частности таблицу 1). Предпочтительно по данному изобретению используются mAb1, содержащие тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO:18 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO:17.
В настоящем документе также описываются указанные выше конъюгаты антител с лекарственными веществами для использования в качестве медикаментозного средства, а именно при лечении раковых заболеваний. К раковым заболеваниям, подлежащим такому лечению, относятся предпочтительно гематологические раковые заболевания, говоря конкретнее лимфомы или лейкозы. Или же указанные ADC могут применяться при лечении солидных опухолей.
Настоящее описание также относится к фармацевтическим композициям, содержащим ADC по данному изобретению в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями, а также при необходимости содержащим другие активные ингредиенты.
Настоящее описание также относится к фармацевтической композиции, содержащей ADC по данному изобретению и гистидин и имеющей рН 6,5. Такая композиция может также содержать сахарозу и полисорбат-80.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения указанная композиция представляет собой лиофилизованный препарат или указанные ADC в терапевтически приемлемом количестве находятся в заранее заполненном шприце или иной подходящей емкости.
Настоящее описание также относится к способу получения ADC по данному изобретению, который включает
- культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотидов, колирующих описанные выше антитела,
- выделение этих антител,
- синтез монометилауристатина Е, связанного с линкером L-Z-X формулы (V):
,
- конъюгирование указанных антител с монометилауристатином Е, связанным с линкером L-Z-X формулы (V).
Краткое описсние фигур
Фигура 1 - схематическое изображение ADC, обозначенного INA01-SDV1 или INA01-SDV#1. INA01 соответствует Ab; APN соответствует L; VC-PAB соответствует Z-X; MMAE соответствует D.
Фигура 2 представляет сравнение связывания INA01-SDV1 и A24 с клетками гемопоэтических линий. На фиг. 2А приведены данные с клетками линии THP-1; на фиг.2В с клетками линии MEC-1.
Фигура 3 представляет результаты индукции апоптоза (запрограммированной смерти клеток) в клетках CHO, трансфецированных и не трансфецированных человеческим CD71, На фиг. 3А - данные для клеток, не имеющих рецептора трансферрина (CD71-); на фиг.3В - данные для клеток, несущих рецептор трансферрина (CD71+).
Фигура 4 демонстрирует эффект подавления пролиферации клеток различных линий in vitro под действием INA01-SDV#1. На фиг. 4A опыт с клетками линии Ramos, на фиг. 4B - с клетками линии THP-1.
Фигура 5 демонстрирует эффективность INA01-SDV#1 in vivo. Изображена кривая Каплана-Мейера отражающая процент не несущих опухоли мышей, которым делали ксенотрансплантацию клеток THP-1, после лечения. Лечения состояло из единственного введения ADC обозначаемого INA01-SDV#1. Его вводили путем внутрибрюшинной инъекции когда опухоль достигала в объеме приблизительно 100 мм3. Исследовались две дозы: 5 мг на 1 кг массы тела либо 0,5 мг/кг. n - количество подопытных животных. Контроль - вместо INA01-SDV#1 вводили PBS.
Фигура 6 представляет результаты токсикологического анализа для INA01-SDV#1 на мышах дикого типа B6 (WT) и на мышах с двойным нокаутом CD71/трансферрина (TfR/Tf2Ki). Животным вводили внутрибрюшинно 5 раз INA01-SDV#1 в дозе 3 мг/кг с интервалом 4 суток (q4dx5). На фиг. 6А представлен макроскопический вид внутренних органов у мышей дикого типа, на фиг. 6В - у мышей TfR/Tf2Ki. Данные гистологического исследования органов, показанных на фиг. 6A и 6B, приведены в таблице 7.
Фигура 7 демонстрирует пролиферацию клеток линии HL-60 (острый миелоидный лейкоз), которые инкубировали в течение 72 часов при 37°C с ADC обозначенным INA01-SDV#1 в десяти различных концентрациях от 0,02 мкг/мл до 10 мкг/мл. По полученным данным строили аппроксимирующую кривую и рассчитывали IC50 , которая оставила 0,08 мкг/мл.
Фигура 8 демонстрирует образование TNF-α мононуклеарами периферической крови (PBMC) после инкубации с ADC обозначенным INA01-SDV#1, взятого в трех различных концентрациях (0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл) и в трех различных условиях - с относительно толстой оболочкой (высушивание воздухом), с более тонкой (покрытие влажным методом) и в растворе (водном).
Фигура 9 демонстрирует эффективность INA01-SDV#1 in vivo. Изображена кривая Каплана-Мейера процента не несущих опухоли мышей, которым делали ксенотрансплантацию клеток линии THP-1, после лечения. Лечение заключалось в 4 введениях с интервалом в 4 дня ADC обозначенного INA01-SDV#1. Терапию вводили путем внутрибрюшинной когда опухоль остигала в объеме примерное 100 мм3. Исследовались две дозы (1 мг/кг и 0.5 мг/кг). n - количество подопытных животных. Контроль - вместо INA01-SDV#1 вводили PBS. Значение p определяли с помощью логарифмического рангового критерия; *P= 0,025.
Фигура 10 демонстрирует эффективность INA01-SDV#1 in vivo. Изображена кривая Каплана-Мейера процента не несущих опухоли мышей, которым делали ксенотрансплантацию клеток линии THP-1, после лечения. Лечение заключалось в 4 введениях с интервалом в 4 дня ADC обозначенного INA01-SDV#1. Терапию вводили путем внутрибрюшинной когда опухоль остигала в объеме примерное 100 мм3. Исследовались две дозы (3 мг/кг и 0.5 мг/кг).; n - количество подопытных животных. Контроль - вместо INA01-SDV#1 вводили PBS. Значение p определяли с помощью логарифмического рангового критерия; *P= 0,0015.
Подробное описание
Определения
Для того, чтобы настоящее раскрытие было более понятным, сначала приведены определения некоторых терминов. Дополнительные определения даются далее по ходу изложения.
Термин «рецептор трансферрина», обозначаемый также CD71 или TfR, относится к человеческому TfR имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 (если не указано иного). Эта последовательность соответствует изоформе 1 рецептора трансферрина 1 человека (homo sapiens) (референсная последовательность NCBI NP_003225.2).
Термин «антитело» в настоящем документе включает полноразмерные антитела и любые их антиген-связывающие фрагменты (то есть антиген-связывающий участок), или их отдельные цепи. Природные антитела представляют собой гликопротеины, молекула которых включает по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L), связанные между собой дисульфидными связями. В каждой тяжелой цепи имеется вариабельная область (в настоящем документе сокращенно обозначается VH) и константная область. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, обозначаемых CH1, CH2 и CH3. В каждой легкой цепи имеется вариабельная область (в настоящем документе сокращенно обозначается VL) и константная область. Константная область легкой цепи представлена одним доменом, обозначаемым CL. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей подразделяются на гипервариабельные участки, называемые также участками, определяющими комплементарность (обозначаются CDR), между которыми находятся более консервативные участки, называемые каркасными (обозначаются FR). Каждая вариабельная область как в тяжелых цепях, так и в легких цепях содержат три CDR и четыре FR, располагающихся в следующем порядке амино конца к карбоксильному концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области как в тяжелых, так и в легких цепях содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулиновых молекул с клетками тканей или с факторами организма-хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, с эффекторными клетками) и с первым компонентом классической системы комплемента (Clq). Термин «антиген-связывающий участок» в антителе в настоящем документе относится к полноразмерной молекуле антитела или к одному (или более) из его фрагментов, сохраняющих способность специфично связываться с антигеном (например, с участком TfR). Показано, что функцию связывания антигена антителом могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примерами связывающих фрагментов, которые охватываются термином «антиген-связывающий участок», включают моновалентный фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; бивалентный фрагмент F(ab)2, состоящий из двух фрагментов Fab, соединенных дисульфидной связью в шарнирном участке; фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного «плеча» молекулы антитела; унитело, состоящее из одного плеча молекулы антитела с модифицированной тяжелой цепью IgG (например, IgG4 в шарнирном участке), такого фрагмента как доменное антитело (Ward E.S. et al., 1989 Nature 341:544-546), или такого фрагмента как нанотело, которые состоят из домена VH); и изолированных участков, определяющих комплементарность (CDR); а также любые слитые белки, содержащие указанный антиген-связывающий участок. Кроме того, два домена фрагмента Fv (VL и VH), хотя и кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью методов рекомбинантной ДНК синтетическими линкерными структурами, позволяющими получить одноцепочечный белок, в котором области VL и VH вместе образуют моновалентную молекулу, называемую одноцепочечным фрагментом Fv (scFv); см., например, работы Bird R.E. et al., 1988 Science 242:423-426; Huston J.S. et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антиген-связывающий участокн». Эти антительные фрагменты получают, применяя обычные, известные специалистам в данной области техники методы; полученные фрагменты проверяют на их функциональность так же, как и интактные антитела.
Термин «изолированное антитело» в настоящем документе относится к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих иную актигенную специфичность (например, изолированное антитело, специфично связывающееся с TfR, по существу не содержит антител, специфично связывающихся с антигенами, отличными от TfR). Однако изолированное антитело, специфично связывающееся с TfR, может обладать перекрестной реактивностью к другим антигенам, например, к молкулам TfR другого вида. Кроме того, изолированное антитело по существу не содержит другого клеточного материала и/или химических веществ.
Выражения «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфичное к антигену» в настоящем документе употребляются взаимозаменяемо с выражением «антитело, специфично связывающее антиген».
Термин «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител» в настоящем документе относится к препарату антительных молекул одного молекулярного состава. Единство состава молекул моноклонального антитела проявляется в одинаковой специфичности связывания и одинаковом сродстве связывания определенного эпитопа.
Термин «изотип» в настоящем документе относится к классу антител, например к IgE, IgM, IgG (например, IgG1 или IgG4), который определяется генами константной области тяжелой цепи.
Выражение «специфично связывается с антигеном» (например, специфично связывается с TfR) в настоящем документе употребляется применительно к антителу или белку, которые связываются с данным антигеном (например, с человеческим TfR, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16) с константой диссоциации KD = 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 1 нМ или меньше.
Термин «KD» в настоящем документе относится к константе диссоциации, измеряемой отношением Kd к Ka (Kd/Ka ) (и выражаемой в единицах молярной концентрации (M)). Значения KD для антител определяют стандартными методами, известными в данной области техники. Так, для измерения KD для антител применяют метод поверхностного плазмонного резонанса или используют биосенсорную систему типа Biacore®.
Термин «константа ассоциации» или «Ka» в настоящем документе относится к скорости взаимодействия конкретного антитела-антигена. В свою очередь термин «константа диссоциации» или «Kd» относится к скорости дисссоциации комплекса конкретного антитела-антигена.
Термин «аффинность» в настоящем документе относится к силе взаимодействия между антигеном и антителом в одном антиген-связывающем участке. В каждом антиген-связывающем участке антитела происходит образование множества слабых нековалентных связей между вариабельной областью плеча антитела и антигеном; чем больше этих взаимодействий, тем сильнее аффинность.
В настоящем документе обозначение HL-60 относится к линии промиелоцитов, полученных в работе Collins et al. PNAS 1978, 75:2458-1462, и описанных также в работе Gallagher R. et al. Blood, 1979, 54:713-733; такие клетки имеются, например, в коллекции ATCC® под номером по каталогу CCL-240™.
В настоящем документе термин «клетка-хозяин» относится к прокариотическим или эукариотическим клеткам. По данному изобретению предпочтительны эукариотические клетки, например клетки млекопитающих, дрожжей или филаментных грибов; особенно предпочтительны клетки млекопитающих, потому что они более склонны к ассоциации, нежели клетки прокариот, и способны секретировать иммунологически активные антитела должной структуры.
В настоящем документе обозначение A24 относится к антителу, описанному в публикации WO 2005/111082.
В настоящем документе термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к активности элиминации клеток. ADCC определяют с помощью имеющихся в продаже аналитических наборов, например ADCC Reporter Bioassay, продаваемый фирмой Promega под каталожным номером G7015.
В настоящем документе термин «апоптоз» относится к процессу запрограммированной гибели клеток. Информацию об апоптозе можно найти в работе “Apoptosis: A Review c последовательностью Programmed Cell Death, Susan Elmore, Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516.
В настоящем документе термин «EC50 относится к концентрации антитела, вызывающей после определенного времени экспозиции ответ по уровню на середине между исходным и максимальным значениями. Такую величину можно определять с помощью, например, компьютерной программы GraphPad.
В настоящем документе термин «индивид» включает людей и животных. Термин «животное не являющееся человеком» включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, а также овец, собак, кошек, крупный рогатый скот, кур, земноводных и пресмыкающихся. Термин «индивид» включает в себя также термин «пациент».
В настоящем документе термин «лекарственное средство» также обозначаемое «груз», то есть группа, которая конъюгирована с антителом (или его фрагментом). Понятие D не ограничивается химиотерапевтическими агентами в обычном представлении. Например, под D может подразумеваться белок, пептид или полипептид, обладающий нужной биологической активностью. Предпочтительно термин «лекарственное средство» (D) относится к обладающему терапевтическим действием веществу, например к цитотоксическому веществу. Термин «цитотоксическое вещество/агент» включает любой агент, приносящий вред клеткам, например вызывающий их гибель.
В настоящем документе термин «линкерная молекула» относится к соединениям, описываемым формулами (II) или (IV). Такие линкерные молекулы подходят для связывания с веществами, содержащими тиоловую группу, например с антителами.
В настоящем документе термин «дипептид валин-цитруллин» (далее дипептид VC) относится к линкеру, состоящему из двух аминокислотных остатков - валина и цитруллина. Этот пептид описывается формулой (VI):
.
В настоящем документе термин «саморасщепляющаяся группа аминобензилового эфира» относится к аминобензиловой эфирной группе, которая функционирует как саморасщепляющаяся. Такая группа представлена соединением, описываемым формулой (III). Саморасщепляющейся группе можно дать следующее определение: это бифункциональная химическая группа, которая (i) способна ковалентно связывать вместе по меньшей мере две другие химических группы с образованием стабильной молекулы, (ii) может отделяться от одной из связанных ею химических групп, между которыми она находится, в результате ферментативного расщепления и (iii) после ферментативного расщепления спонтанно отделяется от оставшейся части молекулы, так что освобождается другая из указанных химических групп, между которыми она находилась.
В настоящем документе термин «алкил» относится к моновалентным насыщенным углеводородным цепям разветвленным или не разветвленным). Например, этот термин относится к таким углеводородным цепям, содержащим 1-20 атомов углерода, называемым (C1-C20)-алкилами. По данному изобретению алкилы предпочтительно низшие, то есть это алкильные группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода (разветвленные или не разветвленные (C1-C6)-алкильные группы). Они включают, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.
В настоящем документе термин «галогеналкил» относится к алкилам, в которых один или более атомов водорода заменены на один или более атомов галогенов. По данному изобретению галогеналкил - это предпочтительно низший галогеналкил, то есть галогеналкильная группа, содержащая 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода (разветвленные или не разветвленные (C1-C6)-галогеналкильные группы). Они включают, например, CF3, CF2Br, CH2F, CHFCH3, CF3CH2, CF3CF2, CHF2CF2, CH2Cl или CH2CH2C1.
В настоящем документе термин «связанный» относится к химической связи. В формуле (I) связи изображены черточками «-». Химическая связь может быть ковалентной или нековалентной, например, за счет взаимодействия электростатических сил. По данному изобретению связи предпочтительно ковалентные. В настоящем документе волнистыми линиями в формулах представлены места соединения частей (Ab, L, Z, X и D) в ADC по данному изобретению.
В настоящем документе термин «терапевтически приемлемое количество» относится к количеству субстанции, достаточному для того, чтобы вызвать желаемый результат (например, сокращение размеров опухоли, подавление опухолевого роста, предотвращение возникновения метастазов, индукцию апоптоза и др.).
Рекомбинантные антитела
Антитела по данному изобретению - это анти-TfR антитела. Предпочтительно эти антитела включают изолированные. гуманизированные рекомбинантные антитела mAb1-mAb16, структура которых характеризуется аминокислотными последовательностями вариабельных областей тяжелых и легких цепей и изотипом человеческой константной области, представленными е в приведенной нижтаблице 1.
Аминокислотная последовательность
Аминокислотная последовательность
Соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности константных областей изотипов IgG4, IgG1 и их мутантных вариантов IgG1 АА и IgG1 N297A, которые используются для получения моноклональных антител mAb1-mAb16, хорошо известны в данной области техники. Полноразмерные легкие и тяжелые цепи и соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности mAb1 приведены в таблице 2 ниже.
SEQ ID NO:18
легкая цепь -
SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:20
легкая цепь -
SEQ ID NO:19
Примеры аминокислотных последовательностей участков вариабельной области тяжелой цепи VH CDR1 (также обозначается HCDR1), VH CDR2 (HCDR2), VH CDR3 (HCDR3) и легкой цепи VL CDR1 (LCDR1), VL CDR2s (LCDR2), VL CDR3s (LCDR3) некоторых антител по данному изобретению показаны в таблице 3.
В таблице 3 гипервариабельные участки (CDR) некоторых антител по данному изобретению определены согласно системе Chothia C., Lesk A.M. 1987, J. Mol. Biol. 196, 901-917. Чтобы облегчить чтение настоящего документа, участки CDR тяжелых цепей далее обозначаются HCDR1, HCDR2, HCDR3, легких цепей - соответственно LCDR1, LCDR2, LCDR3.
mAb5
mAb9
mAb13
mAb6
mAb10 mAb14
mAb7
mAb11 mAb15
mAb8
mAb12 mAb16
В таблицах 4, 5 и 6 представлены полезные аминокислотные и нуклеотидные последовательности, относящиеся к антителам, используемым в ADC по данному изобретению.
В одном из воплощений данного изобретения в молекуле изолированного рекомбинантного антитела имеются следующие части: вариабельная область тяжелой цепи, содержащая участок HCDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, участок HCDR2 c последовательностью SEQ ID NO: 2, участок HCDR3 c последовательностью SEQ ID NO: 3; вариабельная область легкой цепи, содержащая участок LCDR1 c последовательностью SEQ ID NO: 4; участок LCDR2 c последовательностью SEQ ID NOs: 5 или 8 и участок LCDR3 c последовательностью SEQ ID NO: 6; причем указанное антитело специфично связывается с рецептором трансферрина, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16.
В определенных воплощениях данного изобретения изолированное рекомбинантное антитело содержит одну из следующих частей:
(a) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий участки HCDR1 c последовательностью SEQ ID NO:1, HCDR2 c последовательностью SEQ ID NO:2, HCDR3 c последовательностью SEQ ID NO:3, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий участки LCDR1 c последовательностью SEQ ID NO:4, LCDR2 c последовательностью SEQ ID NO:5 и LCDR3 c последовательностью SEQ ID NO:6;
(b) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий участки HCDR1 c последовательностью SEQ ID NO:1, HCDR2 c последовательностью SEQ ID NO:2, HCDR3 c последовательностью SEQ ID NO:3 и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий участки LCDR1 c последовательностью SEQ ID NO:4, LCDR2 c последовательностью SEQ ID NO:8 и LCDR3 c последовательностью SEQ ID NO:6;
(c) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:11 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:13;
(d) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:11 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:14;
(e) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:11 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:15;
(f) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:12 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:13;
(g) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:12 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:14; или
(h) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH c последовательностью SEQ ID NO:12 и вариабельный полипептид легкой цепи VL c последовательностью SEQ ID NO:15.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения указанное рекомбинантное анти-TfR антитело, описанное выше, обладает одним или более из следующих свойств::
(i) его связывание с рецептором трансферрина характеризуется KD = 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее (по измерениям методом SPR);
(ii) его связывание с рецептором трансферрина характеризуется EC50 = 0,1 мкг/мл или меньше, предпочтительно 0,05 мкг/мл или меньше (по данным, полученным методом ELISA; подробнее см. PCT/EP2016/067465);
(iii) вызывает апоптоз в клетках линии HL-60 до уровня, равного или превышающего уровень индукции апоптоза, измеренного для соответствующего референсного химерного антитела, содержащего вариабельные области исходного мышиного антитела, а именно вариабельную область тяжелой цепи (VH) с последовательностью SEQ ID NO:9 и вариабельную область тяжелой цепи (VL) с последовательностью SEQ ID NO:10 (по результатам аналитического определения индукции апоптоза в клетках HL-60). Как правило, для анализа индукции апоптоза в клетках линии HL-60 берут рекомбинантное антитело по данному изобретению в концентрации 10 мкг/мл и сравнивают с эффектом такого же количества референсных химерных антител, содержащих вариабельные области исходных мышиных антител A24, а именно VH с последовательностью SEQ ID NO:9 и VL с последовательностью SEQ ID NO:10. При анализе в клетках HL-60 индукция апоптоза для испытываемого антитела считается такой же, как для референсного антитела, если доля (в процентах) клеток с положительной реакцией в случае испытываемого антитела лишь незначительно ниже, чем в случае референсного антитела.
В настоящем документе выражение «соответствующее референсное химерное антитело» относится к референсному антителу, у которого изотип константной области на 100% идентичен изотипу константной области того антитела, у которого определяют те или иные свойства, например индукцию апоптоза.
В некоторых воплощениях данного изобретения, которые можно комбинировать с ранее указанными воплощениями, предлагаемое в настоящем документе антитело - это фрагмент описанных выше антител. Антительные фрагменты включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, Унитела, scFv, диаантитела, однодоменные антитела или нанотела и другие фрагменты. Термин «диаантитела» относится к малым фрагментам антител с двумя антиген-связывающими участками, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в составе единой полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкерных структур, слишком коротких для того, чтобы пару образовывали два домена одной и той же цепи, эти домены вынуждены образовывать пару с соответствующими доменами другой полипептидной цепи, так что получаются два антиген-связывающих центра. Однодоменные антитела - это фрагменты антител, содержащие полностью или частично вариабельный домен тяжелой цепи либо полностью или частично вариабельный домен легкой цепи. В некоторых воплощениях данного изобретения однодоменное антитело представлено однодоменным антителом человеческого происхождения (Domantis, Inc., Уолтем, шт. Массачусетс, США; см., например, патент США № 6,248,516 B1). Фрагменты антител получают различными методами, в том числе (указанное здесь не имеет ограничительного характера) путем протеолитического расщепления интактных антител, а также путем продуцирования рекомбинантными клетками-хозяевами, как описано в настоящем документе.
В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые антитела являются гуманизированными. Как правило, антитела нечеловеческого происхождения гуманизируют, чтобы снизить иммуногенность для людей; при этом антитело по меньшей мере сохраняет такую же афинность, как у исходного нечеловеческого антитела, или обладает более высокой аффинностью. В предпочтительных воплощениях данного изобретения предлагаемые антитела являются гуманизированными антителами А24. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых гипервариабельные участки (CDR) целиком или частично происходят из нечеловеческого антитела (например, из мышиного антитела А24), а каркасные участки (FR) целиком или частично происходят из человеческих антител. При необходимости гуманизированное антитело содержит также по меньшей мере частично константную область человеческого происхождения. В некоторых воплощениях данного изобретения некоторые аминокислотные остатки каркасных (FR) участков гуманизированного антитела заменены на соответственные аминокислотные остатки нечеловеческих антител, например антител А24, из которых происходят участки CDR данного антитела; это делается для того, чтобы восстановить или улучшить специфичность или аффинность данного антитела. В некоторых конкретных воплощениях данного изобретения некоторые аминокислотные остатки в участках CDR гуманизированного антитела тоже заменены, например для того, чтобы восстановить или улучшить специфичность или аффинность данного антитела. Гуманизированные антитела и способы их получения описаны, например, в обзоре Almagro J.C., Fransson C., Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и подробнее, например, в работах Riechmann L. et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen C. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), а также в патентах США №№ 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 и 7,087,409 и в работах Kashmiri S.V. et al., Methods 36:25-34 (2005) (описывается «пересадка» участков, определяющих специфичность (SDR)); Padlan E.A., Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описание ремоделирование поверхности антитела); Dall'Acqua W.F. et al., Methods 36:43-60 (2005) (описание перегруппировки каркасных участков); Osbourn M.J. et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka А. et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описание направленного отбора для перегруппировки каркасных участков). Рекомбинантные антитела по данному изобретению предпочтительно являются гуманизированными антителами с подавленной активностью, предпочтительно гуманизированными антителами с подавленной активностью изотипов IgG1 или IgG4.
В настоящем документе термин «молчащее» антитело относится к антителам, у которых отсутствует активность ADCC по данным аналитического определения ADCC (или этот эффект очень мал).
В одном из воплощений данного изобретения выражение «эффект ADDC отсутствует или очень мал» означает, что «молчащее» антитело вызывает ADCC, составляющую по меньшей мере ниже 10% от ADCC (например, ниже 50%), наблюдаемой для соответствующего антитела человеческого изотипа IgG1 дикого типа.
Подавление эффекторных функций антител достигается путем мутаций в константной Fc-области антитела, как описано в работах Strohl W. 2009 (AA & N297A); Baudino L. 2008, D265A (Baudino L. et al., J. Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl W., CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). Примеры молчащих антител изотипа IgG1 включают так называемые АА-мутанты, у которых в аминокислотной последовательности домена Fc имеются мутации L234A и L235A Другие молчащие антитела изотипа IgG1 несут мутацию N297A, из-за которой молекулы антитела не гликозилированы.
Антитела с мутантными аминокислотными последовательностями получают путем мутагенеза (например, сайт-направленного мутагенеза или мутагенеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)) в нуклеотидных последовательностях, кодирующих аминокислотные последовательности антитела, и последующей проверки эффекторной функции (см. выше) у измененных антител осуществляется аналитическими методами, описанными в настоящем документе.
Антитела с консервативными изменениями
В некоторых воплощениях данного изобретения в предлагаемом антителе (или связывающем белке, который содержит антиген-связывающий участок данного антитела) имеются вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем одна или более из этих CDR-последовательностей имеет определенные аминокислотные последовательности на основе антител mAb1-mAb16, описанных в настоящем документе, или их консервативные модификации, и, кроме того, указанное антитело или белок сохраняют нужные функциональные свойства анти-TfR антител по данному изобретению.
Нужные функциональные свойства анти-TfR антител включают (указанное здесь не имеет ограничительного характера)
(i) связывание антитела с рецептором трансферрина характеризуется KD = 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее (по данным измерения методом SPR, например с помощью биосенсорной системы Biacore®);
(ii) связывание антитела с рецептором трансферрина характеризуется EC50 = 0,1 мкг/мл или меньше, предпочтительно 0,05 мкг/мл или меньше (по данным, полученным методом ELISA; подробнее см. PCT/EP2016/067465 );
(iii) антитело вызывает апоптоз в клетках линии HL-60 на уровне, равном или превышающем уровень индукции апоптоза, наблюдаемый для соответствующего референсного химерного антитела, содержащего вариабельные области исходного мышиного антитела, а именно вариабельную область тяжелой цепи (VH) с последовательностью SEQ ID NO:9 и вариабельную область легкой цепи (VL) с последовательностью SEQ ID NO:10 (по результатам, например, аналитического определения индукции апоптоза в клетках HL-60). Как правило, для анализа индукции апоптоза в клетках линии HL-60 берут рекомбинантное антитело по данному изобретению в концентрации 10 мкг/мл и сравнивают с эффектом такого же количества референсных химерных антител, содержащих вариабельные области исходных мышиных антител A24, а именно VH с последовательностью SEQ ID NO:9 и VL с последовательностью SEQ ID NO:10. При анализе в клетках HL-60 индукция апоптоза для испытываемого антитела считается такой же, как для референсного антитела, если процент клеток с положительной реакцией в случае испытываемого антитела лишь незначительно ниже, чем в случае референсного антитела.
В настоящем документе термины «консервативные изменения аминокислотной последовательности» и «консервативно модифицированная аминокислотная последовательность» относятся к аминокислотным заменам, при которых остаток какой-либо аминокислоты заменяется на остаток другой аминокислоты, у которой боковая цепь сходна с таковой заменяемого остатка. Группы аминокислот со сходными боковыми цепями четко определены в данной области техники. Это следующие группы: аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); аминокислоты с кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); аминокислоты с полярными боковыми цепями, не несущими электрического заряда (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан); аминокислоты с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин); аминокислоты, имеющие разветвление боковой цепи у β-атома углерода (например, треонин, валин, изолейцин); аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в гипервариабельных участках антитела по данному изобретению могут быть заменены на остатки других аминокислот из той же группы по боковым цепям; у измененного антитела проверяют, сохранилась ли у него нужная функция, аналитическими методами, описанными в настоящем документе.
Изменения в антителах по данному изобретению могут быть созданы с помощью стандартных методов, известных в данной области техники, например путем сайт-направленного мутагенеза и мутагенеза с использованием ПЦР
Конструирование каркасных участков или Fc
Сконструированные антитела по данному изобретению включают такие антитела, в которых изменены аминокислотные остатки в каркасных участках вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, например, для усовершенствования свойств антитела. Как правило, модификации каркасных участков создаются с целью снизить иммуногенность антитела. Например, один из подходов в этом состоит в обратном мутировании одного или более аминокислотных остатков в каркасных участках в соответствующий остаток зародышевой линии. Говоря конкретно, антитело, претерпевшее соматическую мутацию, может содержать в каркасных участках аминокислотные остатки, отличные от аминокислотных остатков, занимающих те же положения в аминокислотной последовательности зародышевой линии, из которой происходит данное антитело. Эти остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасных участков данного антитела и соответствующих последовательностей зародышевой линии, из которой данное антитело происходит. Чтобы в последовательностях каркасных участков восстановилась конфигурация зародышевой линии, соматические мутации надо «обратить», то есть вернуть на свои места те аминокислотные остатки, которые находятся в этих положениях в последовательностях зародышевой линии, что достигается, например, путем сайт-направленного мутагенеза или мутагенеза с помощью ПЦР. Такие антитела с обратными мутациями также входят в объем данного изобретения.
Другой тип модификаций каркасных участков включает мутирование одного или более аминокислотных остатков в каркасных участках или даже в одном или более CDR для того, чтобы устранить Т-клеточные эпитопы и тем самым снизить потенциальную иммуногенность антитела.
В частности, в компании Antitope (Кембридж, Великобритания) разработан ряд методов, пригодных для оценки и устранения иммуногенности, основанных на идентификации расположения Т-клеточных эпитопов в антителах и белках терапевтического назначения. Эти методы перечислены ниже.
- iTope™ - in silico технология для предсказания связывания пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II (Perry L.C. et al. 2008 Drugs in R&D, 9(6):385-396).
- TCED™ - база данных известных Т-клеточных эпитопов, идентифицированных в исследованиях с использованием метода картирования Т-клеточных эпитопов (в частности, вариабельных областей антител) EpiScreen™ (Bryson С.J. et al. 2010 Biodrugs 24(1):1-8). В этой базе данных можно вести поиск общих мотивов с помощью программ BLAST (Altschul S.F. et al. 1997 Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402).
Дополнением или альтернативой модификациям каркасных или гипервариабельных участков вариабельной области антител по данному изобретению являются изменения Fc области, как правило, для того, чтобы повлиять на одно или более функциональных свойств антитела, например на время полужизни в сыворотке крови, связывание комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.
Кроме того, антитела по данному изобретению можно модифицировать химически (например, к молекуле антитела можно присоединить одну или более химических групп) или изменить паттерн и/или уровень гликозилирования, что делается тоже с целью повлиять на одно или более функицональных свойств антитела. Воплощения данного изобретения, в которых реализуются эти варианты модификации антител, подробнее описаны ниже.
В настоящем документе термины «константная область изотипа (антитела)» и «область Fc» употребляются взаимозаменяемо и относятся к С-концевой части тяжелой цепи иммуноглобулиновой молекулы, включая природные последовательности области Fc и варианты этой области. Как правило, считается, что область Fc тяжелой цепи человеческих IgG включает аминокислотные остатки от положения C226 или от P230 до самого С-конца тяжелой цепи антитела IgG. Обычно нумерация аминокислотных остатков в Fc-области осуществляется по системе нумерации EU, согласованной с системой Кэбота (EU index of Kabat).) В области Fc C-концевой остаток лизина (K447) может быть удален, например в ходе получения или очистки антитела. Соответственно, суммарно антитела по данному изобретению включают популяцию антител, в которых остатки K447 удалены; популяцию антител, в которых остатки K447 присутствуют, и смешанную популяцию антител, в которой у одних антительных молекул остатки K447 имеются, а у других - нет.
В одном конкретном воплощении данного изобретения шарнирный участок домена CH1 модифицирован таким образом, что изменилось количество остатков цистеина в нем, например, оно увеличилось или уменьшилось. Этот подход впервые описан в патенте США № 5,677,425 (авторы Bodmer et al.). Количество остатков цистеина в домене CH1 изменяют, например, для того, чтобы ускорить сборку легких и тяжелых цепей или чтобы повысить либо понизить стабильность антитела.
В другом воплощении данного изобретения в определенном участке области Fc делается мутация для уменьшения времени полужизни антитела в организме. Говоря конкретнее, в участке соединения доменов СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи один или более аминокислотных остатков мутируют так, что антитело связывается со стафилококковым белком А (SpA) хуже, чем аналогичный природный участок Fc. Этот подход описан подробнее в патенте США № 6,165,745 (авторы Ward E.S. et al.).
В еще одном воплощении данного изобретения антитело модифицируют для того, чтобы увеличить время полужизни антитела в организме.. При этом возможны различные подходы. Например, создаются одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США № 6,277,375 (автор Ward E.S.). Или же для увеличения времени полужизни антитела в организме вносят такие изменения в домен CH1 или в константную область легкой цепи (CL), что возникает участок связывания рецептора реутилизации, взятый из двух петель полипептидной цепи домена CH2 области Fc IgG, как описано в патентах США №№ 5,869,046 и 6,121,022 (авторы Presta L.G. et al.)
В еще одном воплощении данного изобретения область Fc модифицируется путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, одну или более аминокислотных замен делают таким образом, что изменяется сродство связывания антитела с эффекторным лигандом, но сохраняется способность связываться с антигеном, свойственная исходному антителу. Эффекторным лигандом, к которому изменяется аффинность антитела, может быть, например, рецептор Fc или компонент С1 системы комплемента. Этот подход описан подробнее в патентах США №№ 5,624,821 и 5,648,260; (авторы Winter et al.).
В еще одном воплощении данного изобретения одну или более аминокислотных замен делают таким образом, что изменяется связывание антитела с компонентом C1q системы комплемента и/или уменьшается или отсутствует комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). Этот подход описан подробнее в патенте США № 6,194,551 (авторы Idusogie et al.).
В еще одном воплощении данного изобретения одну или более аминокислотных замен делают таким образом, что изменяется способность антитела вызывать фиксацию комплемента. Этот подход описан подробнее в публикации PCT WO 94/29351 (авторы Bodmer et al.).
В еще одном воплощении данного изобретения область Fc модифицируют путем изменения одного или более аминокислотных остатков для того, чтобы усилить способность антитела вызывать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или чтобы увеличить сродство связывания антитела с рецептором Fcγ. Этот подход описан подробнее в публикации PCT WO 00/42072 (автор Presta L.G.). Кроме того, картированы участки связывания человеческих антител IgG1 с рецепторами Fc (FcγRl, FcγRII, FcγRIII и FcRn), а также описаны варианты антител с улучшенным связыванием (см. работу Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604).
В еще одном воплощении данного изобретения область Fc модифицируют путем изменения одного или более аминокислотных остатков для того, чтобы уменьшить способность антитела вызывать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или чтобы снизить сродство связывания антитела с рецептором Fcγ. Такие антитела с ослабленными эффекторными функциями, в частности с пониженной способностью вызывать ADCC, включают «молчащие» антитела.
В некоторых воплощениях данного изобретения используется домен Fc изотипа IgG1. В некоторых конкретных вариантах воплощения данного изобретения используется мутантный вариант фрагмента Fc изотипа IgG1, например «молчащий» Fc IgG1, который ослабляет или нивелирует способность слитого полипептида ососредовать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или способность связывать рецептор Fcγ. Примером «молчащих» мутантных вариантов изотипа IgG1 является IgG1, в котором в положениях 234 и 235остаток лейцина заменен на остаток аланина, как описано в работе Hezareh М. et al. J. Virol. 2001 Dec;75(24):12161-8 .
В некоторых воплощениях данного изобретения домен Fc представлен молчащим мутантным Fc, в котором не происходит гликозилирования в положении 297 домена Fc. Например, этот мутантный домен Fc содержит замену остатка аспарагина в положении 297. Например, остаток аспарагина в положении 297 заменен на остаток глицина или аланина (N297G или N297A соответственно ).
В другом воплощении данного изобретения модификация антитела касается его гликозилирования. Например, можно получить агликозилированное антитело (то есть в молекуле антитела отсутствует гликозилирования). Гликозилирование антител изменяют, например, для того, чтобы увеличить его афинность к антигену. Такая модификация достигается, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в аминокислотной последовательности антитела. Например, могут быть сделаны одна или более аминокислотных замен, в результате чего исчезает один или более сайтов гликозилирования в каркасных участках вариабельных областей антитела и гликозилирования в этих сайтах не происходит. В результате агликозилирования может увеличиться афинность антитела к антигену. Такой подход описан подробнее в патентах США №№ 5,714,350 и 6,350,861 (авторы Co Man Sung et al.).
В дополнение или в качестве альтернативы к описанному выше можно изменять характер гликозилирования антитела, например можно получать гипофукозилированные антитела, в которых сокращено количество остатков фукозы, присоединенных к полипептидным цепям, или же антитела с увеличенным количеством разветвляющихся структур GlcNac. Было показано, что такое изменение характера гликозилирования приводит к усилению способности антитела вызывать ADCC.
Подобную модификацию углеводных остатки, можно осуществить, например, если проводить экспрессию антител в клетках-хозяевах с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования известны и описаны в данной области техники, и их можно использовать в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител по данному изобретению и таким образом получать антитела с измененным характером гликозилирования. Например, в ЕР № 1 176 195 (авторы Hang et al.) описывается линия клеток с функционально дефектным геном FUT8, кодирующим фукозилтрансферазу, из-за чего антитела, экспрессирующиеся в клетках этой линии оказываются гипофукозилированными. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые антитела получают рекомбинантным путем в клетках линии с нарушенным фукозилированием полипептидов, например в клетках млекопитающих с дефектной экспрессией гена FUT8, кодирующего фукозилтрансферазу. В публикации PCT WO 03/035835 (автор Presta L.G.) описывается вариант клеточной линии CHO, а именно клетки Lecl3, у которых ослаблена способность присоединять фукозу к углеводам, связанным с Asn297, что приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в таких клетках-хозяевах (см. также Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации PCT WO 99/54342 (Umana P. et al.) описывается линия клеток, в которых генно-инженерным путем создана экспрессия модифицирующих гликопротеины гликозилтрансфераз, (например, β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (GnTIII)), в результате чего антитела, экспрессирующиеся в этих клетках несут увеличенное количество разветвляющихся структур GlcNac, что приводит к усилению эффекта ADCC антител (см. также Umana P. et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).
В настоящем документе обсуждается также другая модификация антител, а именно ПЭГилирование и присоединеник ГЭК (HES), или подобные методы. Антитела ПЭГилируют с целью, например, увеличить время полужизни антитела в организме (например, в сыворотке крови). Для ПЭГилирования антитела, антитело или его фрагмент взаимодействует с реакционноспособным эфирным или альдегидным производным ПЭГ в условиях, в которых с антителом или его фрагментом оказывается связанной одна или более групп ПЭГ. Для ПЭГилирования антител проводят реакцию ацилирования или алкилирования, используя реакционноспособные молекулы ПЭГ (или аналогичные реакционно-способные водорастворимые полимеры). В настоящем документе термин «полиэтиленгликоль» включает любые формы ПЭГ, использовавшиеся для присоединения к другим белкам, например моно(C1-C10)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль, или полиэтиленгликоль-малеимид . В некоторых воплощениях данного изобретения антитело, которое ПЭГилируют, является негликозилированное антитело. Методы ПЭГилирования белков известны в данной области техники и применимы к антителам по данному изобретению. См. также Европейские патенты № 0 154 316 (авторы Nishimura H. et al.) и 0 401 384 (авторы Ishikawa S. et al.).
Другая модификация антител, входящая в объем данного изобретения, - это конъюгаты или слитые белки, состоящие из по меньшей мере одного антиген-связывающего участка антитела по данному изобретению и белка сыворотки крови, например сывороточного альбумина человека, или его фрагментов для увеличения времени полужизни полученной молекулы. Этот подход описан, например, в Европейском патенте № 0 322 094 (авторы Ballance D.J. et al.).
Также возможно слияние по меньшей мере антиген-связывающего участка антитела по данному изобретению с белками, способными связываться с белками сыворотки крови, например с сывороточным альбумином, с целью увеличить время полужизни полученной молекулы. Этот подход описан, например, в Европейском патенте № 0 486 525 (авторы Nygren P.-A. et al.).
В одном из частных вариантов воплощения данного изобретения достигалось ослабление или нивелирование эффекторной функции или функции активации комплемента у антител по данному изобретению по сравнению с антителами дикого типа итого же изотипа. В частности, эффекторная функция антитела ослабляется или нивелируется с помощью метода, выбираемого из снижения степени гликозилирования антитела; модификации, приводящей к изменению изотипа антитела на такой изотип, которому от природы свойственна ослабленная эффекторная функция (или эта функция вообще отсутствует); модификации области Fc. В близком к указанному воплощении данного изобретения антитело, у которого эффекторная функция ослаблена или отсутствует, имеет изотип IgG4.
Получение антител по данному изобретению
Антитела по данному изобретению получают с помощью известных методов, обычно применяемых в данной области техники. Подробную информацию о полинуклеотидах, кодирующих указанные антитела, и о получении продуцирующих эти антитела трансфектом специалист в данной области техники найдет в международной заявке PCT/EP2016/067465.
Линкеры
ADC по данному изобретению содержат три различных линкера - L, Z и X. Общая формула, описывающая эти три линкера, соединенные вместе, представлена формулой (V). Линкеры создают связь между антителом и лекарственным веществом. Предпочтительно, эта связь ковалентная. Так, в одном из воплощений данного изобретения лекарственное вещество (D) ковалентно связано с X, и/или X связан с Z, и/или Z ковалентно связан с L, и/или L ковалентно связан с антителом (Ab). Более предпочтительно лекарственное вещество (D) ковалентно связано с X, X ковалентно связан с Z, Z ковалентно связан с L и L ковалентно связан с антителом (Ab).
L - это линкерная молекула, описываемая формулой (II) или (IV), где n - целое число от 2 до 20. L является PEG-арилпропиолонитрилом (APN). В настоящем документе n включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20. L придает конъюгату антитела с лекарственным веществом стабильность в широком спектре условий. Более подробно L описывается в заявке PCT/EP2014/064387.
В одном из воплощений данного изобретения, которое можно комбинировать с другими его воплощениями, L соединен с молекулой антитела по меньшей мере через одну тиоловую группу (принадлежащую остатку цистеина в полипептидной цепи антитела). В одном из воплощений данного изобретения связь между L и молекулой антитела находится со стороны двойной связи C=C в формуле (II) или (IV).
Z - это дипептид валин-цитруллин, связанный с L. Связь между Z и L находится со стороны карбонильной группы L. В одном из воплощений данного изобретения связь между L и Z находится между карбонильной группой L и аминогруппой Z (например, аминогруппой остатка валина). Дипептид валин-цитруллин (VC) является расщепляемым линкером. Расщепляемые линкеры позволяют использовать различия в условиях между кровотоком и внутриклеточной средой клеток-мишеней (особенно в раковых клетках). Дипептид валин-цитруллин расщепляется в кислом содержимом лизосом под действием лизосомальных протеаз, например катепсина В. После того, как ADC оказывается внутри клетки-мишени, вступает в действие внутриклеточный механизм расщепления катепсином В связи между Z и X (например, расщепление происходит между цитруллином и саморасщепляющейся группой аминобензилового эфира, со стороны аминогруппы (см. стрелку 
в формуле (VII):
Образуется соединение X--лекарственное вещество, которое нестабильно и спонтанно расщепляется (1,6-расщепление (саморасщепление)), так что высвобождается молекула лекарственного вещества. Подробнее о дипептиде валин-цитруллин и механизме его внутриклеточного расщепления катепсином В см., например, работу Dubowchik G.M., Firestone R.A., Padilla L., Willner D., Hofstead S.J., Mosure K. et al. Bioconjug. Chem. 2002;13:855-69.
X - это саморасщепляющаяся группа аминобензилового эфира, которая связана с Z и описывается формулой (III). X связана с Z со стороны карбоксильной (карбонильной) группы Z. В одном из воплощений данного изобретения связь между Z и X образуется карбонильной группой Z и аминогруппой Х. Подробнее о саморасщепляющейся группе аминобензилового эфира, см. публикацию WO 03/026577 или WO 2004/010957. Как сказано в настоящем документе, X является бифункциональной химической группой (спейсером), которая (i) способна ковалентно связывать вместе по меньшей мере две другие химические группы с образованием стабильной молекулы (конкретно говоря, D и Z); (ii) способна отделяться от одной из химических групп, соединенных ею в стабильную молекулу, в результате ферментативного расщепления под действием катепсина B (после расщепления катепсином B освобождается X-D); (iii) способна после ферментативного расщепления спонтанно отделиться от оставшейся части молекулы, в результате чего освобождается другая из двух соединявшихся ею химических групп (в итоге освобождается D).
Груз
В одном из воплощений данного изобретения D представляет собой груз, связанный с X со стороны карбонильной группы X. В одном из воплощений данного изобретения связь между X и D образована карбонильной группой X и аминогруппой D.
В одном из частных вариантов воплощения данного изобретения ADC по данному изобретению D является цитотоксическим агентом.
В одном из воплощений данного изобретения цитотоксическое лекарственное вещество выбирают из группы, состоящей из таксанов, цитохалазина В, ауристатина, грамицидина D, этидия бромида, эметина, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, доксорубицина, даунорубицина, дигидроксиантрациндиона, митоксантрона, митрамицина, актиномицина D, 1-дегидротестостерона, глюкокортикоидов, прокаина, тетракаина, лидокаина, пропранолола и пуромицина, а также веществ, аналогичных или гомологичных указанным. Цитотоксические агенты, используемые по данному изобретению, включают также антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, дакарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU)), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С, цис-дихлордиаминплатина (II) (DDP), цисплатин, антрациклины (например, даунорубицин, называвшийся ранее дауномицином, и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, ранее называвшийся актиномицином, блеомицин, митрамицин и антрамицин АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Предпочтительно лекарственным веществом в составе конъюгата с антителом по данному изобретению является монометилауристатин Е (ММАЕ).
ADC по данному изобретению
В одном из воплощений данного изобретения предлагаются ADC, в которых анти-TfR антитело связано с лекарственным веществом, (особенно с MMAE). Линкерами в этих конъюгатах являются L, Z и X, описанные выше. Предпочтительно ADC по данному изобретению избирательно доставляют эффективную дозу монометилауристатина Е в опухолевые ткани, в которых экспрессируется TfR.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаются ADC по формуле (I), описанные выше.
В одном из более предпочтительных воплощений данного изобретения ADC характеризуются следующими признаками:
- антитело является анти-TfR антителом, особенно моноклональным антителом mAb1, описанным выше,
- L - это линкерная молекула, связанная с указанным антителом и описываемая формулой (IV),
- Z - это дипептид валин-цитруллин, связанный с L,
- X связан с Z и представляет собой саморасщепляющуюся группу аминобензилового эфира, и описываемую формулой (III) где m=0,
- D - это лекарственное вещество, связанное с X, особенно MMAE.
В другом более предпочтительном воплощении данного изобретения ADC, обозначенный INA01-SDV1, характеризуется следующими признаками:
- антитело является анти-TfR антителом mAb1, характеризующимся тем, что тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и легкая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17,
- L - это линкерная молекула, связанная с указанным антителом и описываемая формулой (IV),
- Z - это дипептид валин-цитруллин, связанный с L,
- X связан с Z и представляет собой саморасщепляющуюся группу аминобензилового эфира, и описываемую формулой (III) где m=0,
- D - это монометилауристатин MMAE.
На фиг. 1 схематически изображен один из предпочтительных ADC по данному изобретению, обозначенный INA01-SDV1 или INA01-SDV#1. К остатку цистеина в полипептидной цепи гуманизированного антитела INA01 присоединены линкер APN (L), , дипептидная последовательность валин-цитруллин (VC), расщепляемый катепсином B (Z), пара-аминобензиловый формулы (III), где m = 0 (X) и цитотоксический агент (D), представленный монометилауристатином E (MMAE).
Хотя для конкретного ADC соотношение антитела и лекарственного вещества имеет точное значение, при описании образца содержащего множество молекул ADC это значение чаще всего является средней величиной, вследдствие некоторой степени негомогененности, как правило связанной со стадией получения конъюгата. В настоящем документе средняя лекарственная нагрузка образца ADC называется отношением лекарственное вещество:антитело (сокращенно DAR). В некоторых воплощениях данного изобретения DAR составляет от около 1 до около 8 (то есть 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 и 8); предпочтительно эта величина составляет в среднем около 4.
Фармацевтические композиции - препараты
В другом аспекте данного изобретения предлагается композиция, например фармацевтическая композиция, которая содержит один ADC по данному изобретению или комбинацию ADC (например, один ADC, выбираемый из группы, состоящей из mAb1-mAb16, конкретнее mAb1, связанный с линкерной структурой по формуле (IV), в свою очередь связанной с Z, в свою очередь связанным с X, представляющим собой саморасщепляющуюся группу пара-аминобензилового эфира, описываемую формулой (III), где m = 0, в свою очередь связанную с лекарственным веществом, например ММАЕ, причем указанная композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения предлагаемая композиция (например, фармацевтический препарат) содержит (i) один ADC, описанный в настоящем документе, или комбинацию таких ADC (например, один ADC, выбираемый из группы, состоящей из mAb1-mAb16, конкретнее mAb1, связанный с линкерной структурой по формуле (IV), в свою очередь связанной с Z, в свою очередь связанным с X, представляющим собой саморасщепляющуюся группу пара-аминобензилового эфира, описываемую формулой (III), где m = 0, в свою очередь связанную с лекарственным веществом, например с MMAE; (ii) гистидин; (iii) при необходимости фармацевтически приемлемый носитель, причем рН указанной композиции составляет 6,5. В другом воплощении данного изобретения предлагаемая композиция (например, фармацевтический препарат) содержит (i) один ADC, описанный в настоящем документе, или комбинацию таких ADC (ii) гистидин (iii) сахарозу, (iv) полисорбат 80, причем рН указанной композиции составляет 6,5. Предпочтительно молярная концентрация гистидина составляет 20 мМ. В другом воплощении данного изобретения предлагаемая композиция (например, фармацевтический препарат) содержит (i) один ADC, описанный в настоящем документе, или комбинацию таких ADC (ii) 20 мМ гистидина (iii) 6% сахарозы (6 г на 100 мл буферного раствора); (iv) 0,02% полисорбата 80, причем рН указанной композиции составляет 6,5. Предпочтительно такая композиция стабильна при температуре 40°C; это значит, что среднее значение отношения лекарственного вещества к антителу в их конъюгате (DAR) составляет от 4 до 4,5. Величину pH определяют любым предназначенным для этой цели методом, известным в данной области техники.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить пациентам в порядке комбинированной терапии, то есть в сочетании с другими лекарствами. Например, комбинированная терапия может включать ADC по данному изобретению в сочетании с по меньшей мере одним противовирусным или противовоспалительным агентом, или с антипролиферативным агентом другого типа. Примеры терапевтических агентов, которые можно использовать в такой комбинированной терапии описаны подробнее ниже в разделе о применении ADC по данному изобретению.
В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые/все растворители; дисперсионные среды; покрытия; антибактериальные и противогрибковые агенты; изотонические средства, агенты, замедляющие всасывание и другие физиологически совместимые субстанции. Носитель по данному изобретению должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального или эпидермального введения в организм, а также для введения в спинальное пространство (например, путем инъекции или инфузии). В одном из воплощений данного изобретения носитель должен быть пригодным для подкожного введения. В зависимости от пути введения препарата в организм активное вещество, то есть ADC, может быть покрыто материалом, защищающим его от воздействия кислот и других условий окружающей среды, из-за которых это вещество может потерять свою активность. Одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя по данному изобретению является стерильный натрий-фосфатный буферный раствор. Другие пригодные носители хорошо известны в данной области техники (см., например, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)). Препараты по данному изобретению могут также включать один или более эксципиентов, консервантов, солюбилизирующих агентов, забуферивающих соединений, альбумина для предотвращения потерь белка на поверхности сосудов.
Формы фармацевтических композиций, путь введения их в организм, дозировка и режим введения зависят, разумеется, от того, какое конкретно состояние подлежит лечению, от степени тяжести заболевания, от возраста, массы тела и пола индивида.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут иметь состав, пригодный для местного, перорального, парентерального, внутрибрюшинного, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазничного и другого введения, предпочтительно внутрибрюшинного или внутривенного.
Фармацевтические композиции по данному изобретению предпочтительно содержат носители, фармацевтически приемлемые для препаратов, вводимых в организм путем инъекции. В частности, носителем может быть изотонический стерильный солевой раствор (раствор дву- или однозамещенного фосфата натрия, хлорида натрия, калия, кальция или магния и других солей или их смесей) или сухой композицией, в частности в лиофилизованных композициях, которые после добавления стерильной воды или физиологического раствора (в зависимости от конкретного случая) приобретают консистенцию, пригодную для введения путем инъекции.
Дозы, в которых вводят фармацевтические композиции по данному изобретению, подбирают в зависимости от ряда различных факторов, в частности от способа введения препарата, сопутствующих патологий или же от желаемой продолжительности лечения.
Для приготовления фармацевтических композиций по данному изобретению эффективное количество ADC растворяют или диспергируют в фармацевтически приемлемом носителе или в водной среде.
Лекарственные формы, пригодные для введения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии; составы, содержащие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; стерильные порошки и лиофилизаты для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением индивиду. В любом случае лекарственная форма должна быть стерильной и достаточно жидкой, чтобы ее легко было набирать и вводить с помощью шприца. Лекарственная форма фармацевтических композиций по данному изобретению должна быть стабильной в условиях ее изготовления и хранения, а также она должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, например бактериями и грибками.
Растворы активных веществ в виде свободных оснований или фармакологически приемлемых солей готовят на воде с добавлением подходящих поверхностно-активных агентов, например гидроксипропилцеллюлозы. Дисперсии готовят на глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также на маслах. При обычных условиях хранения и применения в состав этих препаратов включают консерванты для предотвращения размножения микроорганизмов.
ADC по данному изобретению включают в состав фармацевтической композиции в нейтральной форме или в виде соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образуемые доступными аминогруппами белка) и которые образуются с неорганическими кислотами, например соляной или фосфорной, или же с органическими кислотами, например уксусной, щавелевой, винно-каменной, миндальной и др. Соли, образуемые доступными карбоксильными группами также могут происходить из неорганических оснований, например гидроксида натрия, калия, аммония, кальция или железа, а также таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и др.
Носитель может быть также растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этиловый спирт, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и др.) и их пригодные смеси, а также растительные масла. Должная текучесть препарата поддерживается, например, путем использования агентов, образующих кроющий слой (например, лецитина), или путем поддержания нужного размера частиц (в случае дисперсии) или путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвратить воздействие микроорганизмов можно с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и проч. Во многих случаях предпочтительно включать в состав композиции по данному изобретению изотонические соединения, например сахара или хлорид натрия. Продление всасывания композиции при введении путем инъекции достигается добавлением в нее агентов, замедляющих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Для приготовления стерильных растворов для инъекций активные вещества вносят в требующееся количество подходящего растворителя вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, после чего раствор стерилизуют путем фильтрации. Как правило, для приготовления дисперсий различные стерилизованные активные ингредиенты вносят в стерильную несущую среду, содержащую основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа упомянутых выше. Для изготовления стерильных порошков, из которых делают стерильные растворы для инъекций, предпочтительны такие методы, как высушивание в вакууме и лиофилизация, которые позволяют получать порошок активного ингредиента вместе с любыми желаемыми дополнительными ингредиентами из их раствора, предварительно профильтрованного в стерильных условиях.
Рассматривается также приготовление более концентрированных или высоко концентрированных растворов для прямого введения, когда ожидается, что при использовании в качестве растворителя диметилсульфоксида (DMSO) препарат будет проникать в ткань-мишень очень быстро, так что создастся высокая концентрация активных веществ в небольшой по площади опухоли.
Приготовленные растворы вводят в организм способом, подходящим для данной лекарственной формы, и в терапевтически эффективном количестве. Препараты по данному изобретению без труда вводятся в организм в различных лекарственных формах, например в виде описанных выше растворов для инъекций, но также могут применяться капсулы с высвобождением содержимого и др.
Для парентерального введения в виде водного раствора этот раствор при необходимости должен быть соответственно забуферен, а в жидком разбавителя нужно предварительно создать должное осмотическое давление с помощью достаточного количества солей или глюкозы. Такие водные растворы пригодны, в частности, для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи пригодные для указанных путей введения водные среды должны быть известны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одну дозу препарата растворяют в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) и добавляют жидкость для гиподермоклизиса до объема 1000 мл или препарат вводят путем инъекции в место предполагаемой инфузии (см., например, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15-е издание, стр. 1035-1038 и 1570-1580). В зависимости от состояния пациента, подлежащего лечению по данному изобретению, могут потребоваться некоторые изменения дозировки. Тот, кто отвечает за введение препарата больному, должен в любом случае определить индивидуальную дозу, адекватную данному случаю.
ADC по данному изобретению могут входить в состав терапевтической смеси в количестве от около 0,0001 мг до около 1,0 мг на одну дозу, или от около 0,001 мг до около 0,1 мг, или от около 0,1 мг до около 1,0 мг, или даже от около 1,0 мг до около 10 мг. Возможно многократное введение.
Помимо смесей для парентерального введения, например внутривенных или внутримышечных инъекций, фармацевтически приемлемые лекарственные формы композиций по данному изобретению включают, например, таблетки или иные твердые формы для перорального введения, капсулы с замедленным высвобождением содержимого и любые другие современные лекарственные формы.
В некоторые воплощения данного изобретения входит использование липосом и/или наночастиц. Получение и применение липосом и/или наночастиц известно специалистам в данной области техники.
В нанокапсулы обычно удается заключать нужные вещества стабильным и воспроизводимым образом. Во избежание побочных эффектов из-за перегрузки полимерами внутреннего пространства клеток такие сверхмалые частицы (размер которых составляет около 0,1 мкм) делают, как правило, из полимеров, способных к деградации in vivo. B объем данного изобретения входит использование удовлетворяющих этим требованиям наночастиц из полиалкил-цианоакрилатов, способных к расщеплению в организме; получение таких частиц не составляет особого труда.
Липосомы образуются из фосфолипидов, диспергированных в водной среде и спонтанно формирующих многослойные концентрические везикулы из бислоев, также называемые многослойными везикулами (MLV). Диаметр таких везикул обычно составляет от 25 нм до 4 мкм. В результате воздействия ультразвука на многослойные везикулы образуются маленькие однослойные везикулы (SUV) диаметром 200-500 Å, содержащие водный раствор в своем внутреннем пространстве. Физические свойства липосом зависят от pH и ионной силы среды и от присутствия двухвалентных катионов.
Применения и способы связанные с ADC по данному изобретению
ADC по данному изобретению имеют разнообразное применение в диагностических и терапевтических целях in vitro и in vivo Например, ADC можно вводить в культивируемые клетки, например in vitro или in vivo, или же индивиду, например in vivo, для лечения, предотвращения или диагностирования различных заболеваний.
ADC по данному изобретению способны не только подавлять пролиферацию клеток, но и вызывать апоптоз интенсивно пролиферирующих клеток, например активированных Т-лимфоцитов.
В настоящем документе рассматривается применение ADC по данному изобретению в качестве лекарства, в частности при лечении, предотвращении или диагностировании пролиферативных расстройств, например опухолей, в которых высокий уровень экспрессии TfR, конкретнее - гематологических опухолей, например лимфом, в частности мантийноклеточной лимфомы (MCL), Т-клеточной лимфомы (ATL), болезни Ходжкина, В-клеточной крупноклеточной лимфомы, периферической Т-клеточной лимфомы, острых лейкозов (миелоидных и лимфоидных), а также солидных опухолей, например почечной карциномы, мелкоклеточного рака легких, рака молочной железы.
Также здесь описывается применение ADC по данному изобретению при лечении солидных опухолей.
При описанных выше применениях ADC вводят в организм как отдельный активный ингредиент или вместе, например, в качестве вспомогательного средства или в комбинации, с другими лекарствами, например противовирусными, противовоспалительными, цитотоксическими, антипролиферативными, химиотерапевтическими или противоопухолевыми агентами, например для лечения или предотвращения заболеваний, указанных выше. Например, при описанных выше применениях ADC можно использовать в комбинации с азидотимидином (AZT), α-интерфероном, моноклональными антителами против CD20, моноклональными антителами против CD25, моноклональными антителами против PD1, мноклональными антителами против PDL-1, химиотерапевтическими агентами. Для комбинированного применения с ADC по данному изобретению пригодны следующие антинеопластические агенты (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера): алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, мехлорэтамин, хлорамбуцил, мелфалан, нитрозомочевина, темозоломид), антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, валрубицин), таксаны (например, паклитаксел, доцетаксел), эпотилоны, ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан или топотекан), ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, тенипозид или тафлупозид), аналоги нуклеотидов и их предшественников (например, азацитидин, азатиоприн, капецитабин, цитарабин, фторурацил, гемицитабин, гидроксимочевина, меркаптопурин, метотрексат или тиогуанин), пептидные антибиотики (например, карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин), ретиноиды (например, третиноин, алитретиноин, бексаротен), алкалоиды барвинка и их производные (например, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин), средства таргетной терапии, например ингибиторы киназ (например, ибрутиниб, иделализиб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, вемурафениб, висмодегиб), ингибиторы протеасом (например, бортезомиб, карфилзомиб), ингибиторы деацетилаз гистонов (например, вориностат или ромидепсин).
Соответственно сказанному выше в другом аспекте данного изобретения предлагается способ, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества ADC, описанного в настоящем документе.
Соответственно сказанному выше в другом аспекте данного изобретения предлагается способ, включающий совместное, например одновременное или последовательное, введение индивиду терапевтически эффективного количества ADC, описанном в настоящем документе, и по меньшей мере одного лекарственного вещества другого типа, причем указанное другое лекарственное вещество является противовирусным или противовоспалительным агентом, например из числа указанных выше.
В объем данного изобретения входят также наборы, состоящие из композиции (например, содержащей ADC), описанной в настоящем документе, и инструкций по ее применению. Такой набор кроме того может содержать по меньшей мере один дополнительный реагент либо одно (или более) дополнительное антитело или один (или более) дополнительный белок (например, антитело с комплементарной активностью, которое связывает эпитоп антигена-мишени, отличный от того эпитопа, который связывает первое антитело). Набор по данному изобретению, как правило, включает этикетку с указанием должного применения содержимого набора. Термин «этикетка» здесь включает любую надпись на наборе или иным способом зафиксированную информацию, приложенную к набору или сопровождающую его иным образом. Указанный набор может также содержать средства для диагностики, чтобы определять, принадлежит ли данный индивид к группе, поддающейся лечению с использованием конъюгатов антител с лекарственными веществами, описанными выше.
Способ получения ADC по данному изобретению
По данному изобретению антитела соединяют с лекарственными веществами (по меньшей мере с одним) посредством линкерных структур L-Z-X любым известным в данной области техники методом. Такие методы описаны, например, в патентах США №№ 7,811,572; 7,368,565; 2011/0003969; 2011/0166319; 2012/0253021 и 2012/0259100. Более подробные сведения о методах конъюгирования терапевтических агентов с антителами см. также обзор в работе Panowksi S. et al. 2014 Jan. 1; 6(1): 34-45.
В одном из воплощений данного изобретения способ получения ADC включает следующие этапы:
- культивирование клеток-хозяев в условиях, пригодных для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитела, описанные выше;
- выделение антител;
- синтез монометилауристатина Е, связанного с линкерной структурой L-Z-X , формулы (V),
- присоединение антитела к монометилауристатину Е, связанному с линкерной структурой L-Z-X , формулы (V).
Антитела получают, как указано выше. Молекула антитела содержит четыре дисульфидные связи между полипептидными цепями, которые могут потенциальными сайтами конъюгации.. Эти четыре дисульфидные связи восстанавливают с помощью, например, трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) или дитиотреитола (DTT), в результате чего возникают восемь тиольных групп, доступных для присоединения.
Линкер L получают, как описано в заявке PCT/EP2014/064387. Линкер X получают, как описано в публикации WO 03/026577 или WO 2004/010957. Что касается линкера Z, то его получение известно специалистам в данной области техники.
Ниже приведены примеры, которые только иллюстрируют данное описание и не имеют ограничительного характера.
Примеры
Пример 1. Сравнение связывания антитела A24 и конъюгата INA01-SDV1 на линиях гемопоэтических клеток
Готовили серийные разведения (5 - 0,05 мкг/мл) обоих биотинилированных антител (антитела A24 и антитела в составе конъюгата INA01-SDV1) и инкубировали с клетками линий THP-1 и MEC-1. Связывание антител в указанных разведения определяли методом проточной цитометрии с использованием стрептавидина, и флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 (предоставляются компанией ThermoFisher scientific).
Как антитело A24, так и конъюгат INA01-SDV1 проявляли одинаковую аффинность к клеткам, несущим рецептор трансферрина (CD71+ ) (фиг. 2A и 2B).
Пример 2. Апоптоз
Клетки CHO трансфецировали человеческим hCD71 и отбирали нужные клоны методом FACS. Нативные клетки CHO (не несущие человеческий CD71) и клетки hCD71+ инкубировали с INA01-SDV#1 в различных концентрациях в течение 96 часов в полной среде при температуре 37°C. На 4-е сутки клетки инкубировали с аннексином V и флуорофором Topro 3. Методом FACS выявляли клетки с апоптозом (аннексин V)+/(Topro 3)+.
Полученные результаты представлены на фиг. 3A и 3B. Столбики представляют долю (в процентах) погибших клеток.
Пример 3. Эффективность INA01-SDV#1 с различными линиями клеток in vitro
Определяли ингибирование пролиферации клеток при помощи набора для определения количества жизнеспособных клеток в клеточных культурах CellTiter-Glo® (производство Promega) согласно инструкциям производителя. Коротко говоря, клетки высевали на 48-луночный планшет и инкубировали в течение 96 часов с конъюгатом INA01-SDV1 в различных концентрациях (от 0 до 20 мкг/мл).
Полученные результаты представлены на фиг. 4A и 4B. Наблюдалось нарушение жизнеспособности клеток линий Ramos и THP-1
Пример 4. Эффективность конъюгата INA01-SDV1 in vivo
Для определения эффективности конъюгата INA01-SDV#1 in vivo голым мышам вводили подкожно клетки ТНР-1 в количестве 5x106. Когда образовавшиеся в результате этого опухоль достигала объема 100 мм3, животному вводили внутрибрюшинно либо указанный конъюгат в дозе 5 мг на 1 кг массы тела или 0,5 мг/кг, либо солевой (физиологический) раствор, забуференный фосфатом (PBS). Затем ежедневно регистрировали рост опухоли и, когда она достигала объема 1000 мм3, мышь умерщвляли.
На фиг. 5 представлены данные о выживании мышей в период после однократной инъекции INA01-SDV#1.
Пример 5. Токсикологический анализ
Токсикологический анализ для конъюгата INA01-SDV#1 проводили на мышах линии B6 дикого типа (WT) и на мышах с двойным нокаутом CD71/трансферрина (TfR/Tf 2Ki). Животным вводили внутрибрюшинно 5 раз INA01-SDV#1 в дозе 3 мг на 1 кг массы тела с интервалом 4 суток и через 2 суток после пятой инъекции умерщвляли.
На фиг. 6 представлен макроскопический вид внутренних органов у мышей дикого типа (фиг. 6А) и у мышей TfR/Tf 2Ki (фиг. 6B). В таблице 7 представлены результаты независимого гистологического исследования каждого из органов, показанных на фиг. 6A и 6B.
в ядрах кардиомиоцитов. Неравномерность
плотности клеток
в ядрах кардиомиоцитов. Неравномерность
плотности клеток
макрофагов
макрофагов
Некроза нет
Стеатоза нет
Фиброза нет
Некроза нет
Стеатоза нет
Фиброза нет
Пример 6. Препараты
Сравнивали четыре различных препарата. Препараты 1 и 2 отличались друг от друга только значением рН, так же, как и препараты 3 и 4. Все препараты содержали ADC, гистидин (20 мМ) либо цитрат (20 мМ), сахарозу (6% - 6 г на 100 мл буферного раствора) и полисорбат 80 (0,02%).
Препарат 1 содержал ADC по данному изобретению, а именно INA01, и гистидин; рН этого состава 5,5. Препарат 2 содержал ADC по данному изобретению, а именно INA01, и гистидин; рН этого состава 6,5. Препарат 3 содержал ADC по данному изобретению, а именно INA01, и цитрат; pH этого состава 5,5. Препарат 4 содержал ADC по данному изобретению, а именно INA01, и цитрат; pH этого состава 6,5.
Полученные результаты представлены в таблице 8 ниже. Приведены значения отношения лекарственное вещество:антитело (DAR) для препаратов 1-4 при хранении в течение T=0, T=2 недели при температуре 5°C и 40°C, T=4 недели при температуре 5°C и 25°C. Для температуры 40°C наблюдалось снижение DAR в препаратах 1, 3 и 4. По сравнению с ними препарат 2 стабилен.
(гистидин, pH 5,5)
(гистидин, pH 6,5)
(цитрат, pH 5,5)
(цитрат, pH 6,5)
Пример 7. Определение IC50
Клетки линии HL-60 (острый миелоидный лейкоз), в которых экспрессируется CD71, инкубировали при температуре 37°C с конъюгатом INA01-SDV#1 в десяти различных концентрациях от 0,02 мкг/мл до 10 мкг/мл. Фиг. 7 демонстрирует влияние указанного ADC на пролиферацию клеток. Построив аппроксимирующую кривую, рассчитывали IC50. Полученное таким образом значение IC50 для конюгата INA01-SDV#1 составляет 0,08 мкг/мл.
Пример 8: Секреция TNF-α
Для того, чтобы выяснить, индуцирует ли конъюгат INA01-SDV#1 синдром высвобождения цитокинов (CRS) у больных, определяли секрецию TNF-α мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC). Образование TNF-α определяли после инкубации PBMC с INA01-SDV#1 в трех различных вариантах, дававших три разные концентрации конъюгата - препарат с толстой оболочкой (сушка воздухом), с более тонкой оболочкой (влажный метод покрытия) и в растворе (водном).
Материалы и методы
PBMC выделяли с помощью фиколла и суспендировали в культуральной среде с указанными вариантами препарата INA01-SDV#1 (высушенный воздухом, покрытый влажным методом и водный раствор), взятых в количестве 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл или 10 мкг/мл, как ранее сообщалось для ряда способов активации (Findlay L. et al. J. Immunol. Meth 2008; Stebbings R. et al. J. Immunol. 2007). Полученную смесь инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C. После этого определяли TNF-α методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Du Set ELISA Devel°pment kit, который содержит ключевые реагенты «сэндвич»-варианта метода ELISA для определения природного и рекомбинантного TNF-α.
Покрытие препарата INA01-SDV#1
Конъюгат INA01-SDV#1 контактировал с клетками PBMC в трех разных вариантах - высушенный воздухом, с покрытием влажным методом и в виде видного раствора.
- Высушенный воздухом препарат INA01-SDV#1 в 5-кратной рабочей концентрации добавляли в объеме 50 мкл (конечные концентрации 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл). Планшет держали закрытым в течение ночи, затем промывали два раза.
- Препарат INA01-SDV#1 с покрытием влажным методом в 5-кратной рабочей концентрации добавляли в объеме 200 мкл (конечные концентрации 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл)). Лунки заклеивали во избежание высыхания. Промывали два раза.
- Водный препарат INA01-SDV#1 смешивали с клетками PBMC в культуральной среде.
Результаты
Результаты этого эксперимента, представленные на фиг. 8, показывают, что во всех вариантах инкубации INA01-SDV#1 с PBMC высвобождения TNF-α не было. А в случае 24-часовой инкубации PBMC с липополисахаридом (LPS) наблюдалось значительное высвобождение TNF-α.
Пример 9. Эффективность конъюгата INA01-SDV#1 in vivo при внутрибрюшинном введении
Для выяснения эффективности INA01-SDV#1 in viv° голым мышам вводили путем подкожной инъекции 5×106 клеток линии THP-1. Когда образовавшаяся опухоль достигала в объеме 100 мм3, животному вводили путем внутрибрюшинной инъекции препарат ADC 4 раза с интервалом 4 суток в дозе 1 мг на 1 кг массы тела или 0,5 мг/кг; контрольным особям вводили PBS. Ежедневно регистрировали рост опухоли и, когда она достигала в объеме 1000 мм3, животное умерщвляли.
На фиг. 9 представлены данные о выживаемости мышей после четырех внутрибрюшинных инъекций INA01-SDV#1.
Пример 10. Эффективность конъюгата INA01-SDV#1 in vivo при внутривенном введении
Для выяснения эффективности INA01-SDV#1 in vivo голым мышам вводили путем подкожной инъекции 5×106 клеток линии THP-1. Когда образовавшаяся опухоль достигала в объеме 100 мм3, животному вводили путем внутривенной инъекции препарат ADC 4 раза с интервалом 4 суток в дозе 3 мг на 1 кг массы тела или 0,5 мг/кг; контрольным особям вводили PBS. Ежедневно регистрировали рост опухоли и, когда она достигала в объеме 1000 мм3, животное умерщвляли.
На фиг. 10 представлены данные о выживаемости мышей после четырех внутривенных инъекций INA01-SDV#1.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> INATHERYS
<120> Antib dy-drug c njugates and their uses f r the treatment f
cancer
<130> INA03
<150> EP18305427.9
<151> 2018-04-10
<160> 20
<170> PatentIn versi n 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ser Thr Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Gln Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 16
<211> 760
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pr Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pr Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pr Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pr Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pr Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pr Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 17
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pr Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Asn Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Glu Pr Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser
100 105 110
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 18
<211> 462
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pr Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Gln Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455 460
<210> 19
<211> 724
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
aagcttgccg ccaccatgtc cgtgcctacc caggtgctgg gactgctgct gctgtggctg
60
accgatgcca ggtgccagat cgtgctgacc cagtctcctg ccaccctgtc tgtgtctccc
120
ggcgagagag ctaccctgtc ctgctccgcc tcctcctccg tgaactacat gcactggttc
180
cagcagaagc ccggccagtc ccccagactg ctgatctact ccacctccaa ccgggccacc
240
ggcatccctg ccagattttc cggctctggc tccggcacct cctataccct gaccatctcc
300
agcctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agcggtcctc ctaccccctg
360
acctttggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc
420
atcttccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg
480
aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc
540
ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc
600
agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg
660
acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctgatga
720
attc
724
<210> 20
<211> 1411
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
aagcttgccg ccaccatgga atggtcctgg gtgttcctgt tcttcctgtc cgtgaccacc
60
ggcgtgcact cccaggtgca gctggtgcag tctggccccg agctgaagaa acctggcgcc
120
tccgtgaagg tgtcctgcaa ggcttccggc tacaccttta caaaccaggg catgaactgg
180
gtcaagcagg cccctggcaa gggcctgaag tggatgggct ggatcaacac ctacaccggc
240
gagcccatca acgccgacga cttcaagggc agattcgtga tctccctgga cacctccgcc
300
tccaccgcct acctgcagat cagctctctg aaggccgagg ataccgccgt gtacttctgc
360
gtgcgggaag gctgggactc catggactat tggggccagg gcacctccgt gaccgtgtct
420
agcgcttcta caaagggccc aagcgtgttc cccctggccc cctgctccag aagcaccagc
480
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg
540
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc
600
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcaccaag
660
acctacacct gtaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagggtggag
720
agcaagtacg gcccaccctg ccccccctgc ccagcccccg agttcctggg cggacccagc
780
gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg
840
acctgtgtgg tggtggacgt gtcccaggag gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg
900
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggagcagtt taacagcacc
960
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac
1020
aagtgtaagg tctccaacaa gggcctgcca agcagcatcg aaaagaccat cagcaaggcc
1080
aagggccagc ctagagagcc ccaggtctac accctgccac ccagccaaga ggagatgacc
1140
aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct acccaagcga catcgccgtg
1200
gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac
1260
agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg ctgaccgtgg acaagtccag atggcaggag
1320
ggcaacgtct ttagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag
1380
agcctgagcc tgtccctggg ctgatgaatt c
1411
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD79b, КОНЪЮГАТЫ С ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2805251C2 |
| НАЦЕЛЕННЫЕ НА uPARAP КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2017 |
|
RU2740311C2 |
| МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ сМЕТ, ИХ КОНЪЮГАТЫ С ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СРЕДСТВАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2017 |
|
RU2744914C2 |
| АНТИТЕЛА К C10ORF54 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2714232C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2764740C1 |
| Антитела против CXCR2 и их применение | 2019 |
|
RU2807067C2 |
| АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ММР9 | 2015 |
|
RU2714043C2 |
| ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ROR2 | 2018 |
|
RU2784586C2 |
| АНТИ-IL-5 АНТИТЕЛА | 2017 |
|
RU2758008C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD3E/BCMA И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2800164C2 |
Изобретение относится к конъюгатам антител с лекарственными веществами, где антитела специфично связываются с рецептором трансферрина TFR, а лекарственное вещество представляет собой монометилауристатин E. Такие конъюгаты антител с лекарственными веществами можно использовать, в частности, при лечении пролиферативных заболеваний, включая раковые заболевания, например, лимфом или лейкозов. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 табл., 10 пр.
1. Конъюгат антитела с лекарственным веществом формулы (I): Ab-L-Z-X-D, где
Ab - анти-TfRантитело;
L - линкерная молекула, связанная с указанным антителом, причем указанная линкерная молекула представлена формулой (II):
,
где n целое число от 2 до 20,
Z - дипептид валин-цитруллин, связанный с L,
X - саморасщепляющаяся группа аминобензилового эфира, которая связана с Z, причем указанный X описывается формулой (III):
,
где J необязательный заместитель, выбираемый из F, Cl, Br, NO2 NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3, алкилов и галогеналкилов; m - целое число 0;
D - лекарственное вещество монометилауристатин E, связанное с X, и где указанное анти-TfR антитело содержит один из следующих вариантов:
(а) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий HCDR1 последовательности SEQ ID NO:1, HCDR2 последовательности SEQ ID NO:2, HCDR3 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий LCDR1 последовательности SEQ ID NO:4, LCDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и LCDR3 последовательности SEQ ID NO:6;
(b) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий HCDR1 последовательности SEQ ID NO:1, HCDR2 последовательности SEQ ID NO:2, HCDR3 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий LCDR1 последовательности SEQ ID NO:4, LCDR2 последовательности SEQ ID NO:8 и LCDR3 последовательности SEQ ID NO:6;
(c) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:13;
(d) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:14;
(e) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:15;
(f) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:13;
(g) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:14;
(h) вариабельный полипептид тяжелой цепи, содержащий область VH последовательности SEQ ID NO:12, и вариабельный полипептид легкой цепи, содержащий область VL последовательности SEQ ID NO:15.
2. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по п. 1, в котором L ковалентно связана с одной или более тиоловых групп указанного антитела, причем предпочтительно указанная L соответствует линкерной молекуле, описываемой формулой (IV):
.
3. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1, 2, в котором указанное антитело включает полноразмерное антитело или фрагмент антитела, содержащий участки связывания антигена.
4. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-3, в котором указанное антитело специфично связывается с рецептором трансферрина последовательности SEQ ID NO:16.
5. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-4, в котором связывание указанного антитела с рецептором трансферрина характеризуется KD = 10 нМ или меньше, предпочтительно 1 нМ или меньше.
6. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-5, в котором указанное антитело является моноклональным и/или гуманизированным.
7. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-6, в котором
- указанное антитело содержит константную область человеческого антитела изотипа IgG4, или мутантную, или химически модифицированную константную область, причем антитела с указанной мутантной или химически модифицированной константной областью не обладают или обладают пониженной ADCC по сравнению с соответствующим антителом с константной областью дикого типа изотипа IgG1, или
- указанное антитело содержит константную область человеческого антитела изотипа IgG1, или мутантную, или химически модифицированную константную область, причем антитела с указанной мутантной или химически модифицированной константной областью обладают повышенной ADCC по сравнению с соответствующим антителом с константной областью дикого типа изотипа IgG1.
8. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-7, в котором указанное анти-TfR антитело является mAb1, содержащим тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO:18, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO:17.
9. Конъюгат антитела с лекарственным веществом по любому из пп. 1-8, для применения при лечении солидных опухолей или гематологических опухолей, говоря конкретнее лимфом или лейкозов.
10. Способ получения конъюгатов антител с лекарственными веществами по любому из пп. 1-8, включающий следующие этапы:
- культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, описанное в пп. 1-8,
- выделение антитела,
- синтез монометилауристатина Е, связанного с линкером L-Z-X , описываемой формулой (V):
,
- присоединение указанного антитела к монометилауристатину Е, связанному с линкером L-Z-X, описываемой формулой (V).
| WO 2017013230 A1, 26.01.2017 | |||
| WO 2015001117 A1, 08.01.2015 | |||
| JP 2013158294 A, 19.08.2013 | |||
| WO 2003026577 A2, 03.04.2003. |
