Способ повышения реакционной способности левана и формирования белково-полисахаридных пленок Российский патент 2024 года по МПК C08J5/18 C08B37/00 C12N9/76 C08K5/53 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению реакционноспособных, биоразлагаемых и биосовместимых полисахаридных матриц для привития (иммобилизации) ферментов и других биологически активных соединений (БАС) – белков, антиоксидантов, антибактериальных препаратов и т.д. с целью изготовления пленок, косметических масок, раневых покрытий и перевязочных материалов.

Из уровня техники известно, что для изготовления медицинских перевязочных и ранозаживляющих средств во всем мире используются материалы из природных полисахаридов (ПСХ). Изделия из ПСХ обладают отличными санитарно-гигиеническими свойствами. Они химически не взаимодействуют с биологическими жидкостями и тканями. Таким образом, медицинские материалы из природных ПСХ пассивно участвуют в процессе очищения раны, сорбируя продукты распада тканей, защищают рану от аэрогенной контаминации и сохраняют термальный режим в раневой среде.

Привитие БАС путем образования новых химических связей является в настоящее время доминирующим способом получения перевязочных медицинских препаратов пролонгированного действия. Важнейшим условием получения высокоактивных препаратов, иммобилизованных БАС, является участие в образовании ковалентных связей с носителем тех функциональных групп БАС, которые не являются ответственными за его биологические свойства (в случае иммобилизованных ферментов – каталитические свойства), то есть не входят в состав активного центра БАС и не располагаются в непосредственной близости от него.

Преимущество данного метода заключается в том, что БАС, как правило, не переходят в раствор даже при очень длительном использовании. Для ковалентного связывания БАС с такими носителями (матрицами) как ПСХ требуется; чтобы носитель был предварительно активирован, благодаря чему стало бы возможным его химическое связывание с молекулами БАС. Для химического связывания белков с носителями используется большой арсенал различных методов. Выбор в качестве носителей ПСХ связан, в первую очередь, с широким использованием в медицине, а также биосовместимостью и биоразлагаемостью. Среди ПСХ целлюлозные волокна пока доминируют на текстильном рынке (52 %), весомое место занимают и синтетические полиамидные волокна (9 %).

Известна медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, состоящая из химически модифицированной целлюлозы, содержащей иммобилизованный хитозан, к которой за счет образования химических связей присоединены ферменты, в том числе протеолитические, эластолитические и коллагенолитические, входящие в ферментный комплекс гепатопанкреаса краба. Описан также способ получения повязки. Медицинская повязка проявляет улучшенные механические свойства (RU 2323748, МПК A61L 15/16, A61L 15/32, A61L 15/38, A61L 15/40, опубл. 10.05.2008).

Недостатком данного изобретения является сложность в изготовлении, и, кроме того, нет однозначной информации, сохраняют ли активность ферменты.

Известен текстильный материал для остановки кровотечений, содержащий диальдегидцеллюлозу со степенью окисления 6,5±0,33 % 1 г, желатиноль 60±3 мг (0,75 мл), ε-аминокапроновую кислоту 50±0,25 мг, лизоцим 5±0,25 мг, воду 5,75 мл и способ его получения, заключающийся в том, что в дистиллированной воде растворяют последовательно ε-аминокапроновую кислоту, желатиноль и лизоцим при комнатной температуре, после полного растворения компонентов в полученный раствор помещают диальдегидцеллюлозу со степенью окисления 6,5±0,33 % в виде полотна и выдерживают в течение 2 часов, далее полотно отжимают, сушат на воздухе до остаточной влажности не более 10 % и раскраивают на салфетки весом около 1 г и размером 7,5×5,0 см, затем запаивают в полиэтиленовые пакеты и стерилизуют гамма-облучением в дозе 25 кГр (RU 2380117, МПК A61L 15/28, A61K 38/36, A61L 15/32, A61K 31/197, A61L 15/38, A61P 7/04, A61K 47/38, опубл. 27.01.2010).

Недостатками данного изобретения являются сложность технологии, наличие в препарате бионесовместимых и сложно биодеградируемых компонентов, таких как ε-аминокапроновоя кислота.

Известна раневая повязка с антимикробными свойствами, содержащая текстильный носитель на основе диальдегидцеллюлозы (ДАН) с иммобилизированными протеолитическим ферментом и антимикробным препаратом. В качестве антимикробного препарата используют наноструктурированный порошок бентонита, интеркалированный ионами металлов Ag⁺, или/и Cu²⁺, или/и Zn²⁺. Раневая повязка имеет следующее содержание в ней компонентов, мас.%: протеолитический фермент – 0,03-0,1, наноструктурированный порошок бентонита, интеркалированный ионами Ag⁺, или/и Сu²⁺, или/и Zn²⁺  – 2,0-10,0, диальдегидцеллюлоза – остальное (RU 2426558, МПК A61L 15/18, A61L 15/38, A61L 15/28, A61F 13/15, B82B 1/00, опубл. 20.08.2011).

Недостатком данного изобретения является высокая адгезия текстильных материалов к ране.

Известен способ получения аппликации атравматической одноразовой, включающий окисление медицинской марли с получением диальдегидцеллюлозы, последующую иммобилизацию на нее лекарственных средств, причем окисление марли ведут до степени 6,0+0,33 %, затем полученную смесь размалывают до получения микроволокнистой формы, модифицированной лекарственными компонентами, смешивают с порошком образующего гель реагента, смесь интенсивно перемешивают с водой, далее раствор заливают в формы, высушивают и полученные гелевые пластины швейным способом соединяют с бумажными слоями, изготовленными из древесной целлюлозы (RU 2448738, МПК A61L 15/28, A61L 15/32, A61K 31/717, A61K 38/54, A61P 17/02, A61L 15/38, A61F 13/15, A61K 31/197, A61K 31/4412, опубл. 27.04.2012).

Недостатком данного изобретения является высокая адгезия древесной целлюлозы к ране, низкая биодеградация.

Как известно, нативный леван имеет большое количество гидроксильных групп, что обеспечивает его высокую адгезионную способность. Однако, леван является химически инертным полисахаридом, т.е. не имеет реакционноспособных групп и поэтому с белками и с другими БАС не образует прочные связи. Для придания левану новых свойств проводят его модификацию. Данный процесс позволяет ввести в структуру левана новые функциональные группы и получить таким образом принципиально новый материал со свойствами, отличными от свойств нативного полисахарида.

Для придания реакционной способности левану разработаны различные методы, позволяющие получить производные левана. Среди них особый интерес представляют леван с альдегидной группой, поскольку альдегиды образуют прочные азометиновые связи с аминогруппами белков.

Гель-пленку можно использовать как носитель для иммобилизованных биологически активных соединений, без предварительной модификации, для иммобилизации методом адсорбции. Адсорбция – слабый метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на активность иммобилизованного БАС. Главный недостаток этого метода состоит в том, что БАС может связываться с носителем недостаточно прочно. Во взаимодействии БАС с носителем, кроме солевых (ионных) связей, могут участвовать и другие слабые взаимодействия, например, водородные или Ван-дер-Ваальсовые связи. Десорбцию БАС может вызвать даже незначительное изменение экспериментальных условий, таких как: рН, ионной силы, температуры и природы растворителя, а также сам субстрат. Как известно, сорбционные способности тел определяются в ряде случаев не столько химической природой, сколько их физической структурой. Эти недостатки можно исключить, если гель-пленку бактериальной целлюлозы активировать методом периодатного окисления. При этом в гель-пленке образуются альдегидные группы, способные образовывать прочные азометиновые связи с аминогруппами многих БАС, например, с трипсином, пепсином, антибиотиками и т.д.

Известен способ получения диальдегидпроизводной гель-пленки бактериальной целлюлозы, включающий культивирование штамма бактерии Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267 на послеспиртовой зерновой барде или на нативной молочной сыворотке в течение 3-5 сут при 28±2 °C. Полученную бактериальную целлюлозу высушивают при 80 °С и обрабатывают 0,2-0,5 Н раствором периодата натрия в течение 6 ч (RU 2720099, МПК C12P 19/04, C08B 16/00, A61K 35/74, опубл. 24.04.2020).

Недостатком данного изобретения является низкий выход бактериальной целлюлозы – 8-10 г/л и, как следствие, высокая стоимость препарата.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения клеевой композиции на основе модифицированного экзополисахарида левана, содержащей глицерин, борную кислоту и культуральную жидкость на основе модифицированного экзополисахарида левана. Клеящая способность экзополисахарида увеличивается путем озонирования культуральной жидкости штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787, вследствие чего модифицируется полисахарид леван, что способствует улучшению физико-химических характеристик адгезива (RU 2746621, МПК C12P 19/04, C09J 105/00, опубл. 19.04.2021).

Недостатками прототипа является низкий выход левана, использование, сложной аппаратуры, сложность проведения процесса модификации левана, отсутствие контроля количества образовавшихся альдегидных групп и их вовлечения в реакции связывания с белками.

Недостатки, имеющиеся у аналогов и прототипа, можно устранить, если леван получать культивированием штамма Paenibacillus polymyxa на отходах пищевой промышленности (RU 2740710, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01, опубл. 20.01.2021). При этом выход левана может составить 60-80 г/л, а модификацию левана проводить с использованием периодата натрия.

Технический результат заключается в увеличении связывающей способности диальдегидпроизводного левана по отношению к биологически активным соединениям белковой природы, и способности образовывать белково-полисахаридную пленку.

Сущность изобретения заключается в способе формирования белково-полисахаридных пленок, заключающемся в том, что к обработанному периодатом натрия левану добавляют протеолитический фермент трипсин и глицерин и формируют белково-полисахаридные пленки, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

обработанный периодатом натрия леван 54-56 протеолитический фермент трипсин 39-41 глицерин 5-6

В табл. представлены физико-механические и химические показатели белково-полисахаридных пленок.

На фиг. 1 представлены ИК-спектры контрольного и опытных (окисление 0,1 и 0,15 Н периодатом натрия) образцов левана; фиг. 2 – ИК-спектры леван-белковых смесей опытного (окисление 0,1 Н периодатом натрия) и контрольного (нативный) полисахарида левана с белком; фиг. 3 – внешний вид: А – нативного левана; Б – модифицированного 0,15 Н периодатом натрия; В – пленка – модифицированный леван в комплексе с белком.

Пример.

Леван в количестве 0,1 г, полученный при культивировании штамма Paenibacillus polymyxa 2020, обрабатывают 20 мл 0,1-0,15 Н раствором периодата натрия в течение 6 ч. Выдерживают при комнатной температуре (18-23°С) периодически помешивая.

Наличие образовавшихся альдегидных групп определяют по появлению полосы поглощения в области 870-900 см^-1 (фиг. 1), при этом количество образовавшихся альдегидных групп определяют йодометрическим методом (табл.).

Выделенный и подверженный периодатному окислению леван, смешивают с протеолитическим ферментом трипсином и глицерином в соотношении, мас. %: 54-56 – леван; 39-41 – протеолитический фермент трипсин; 5-6 – глицерин. Полученные образцы пленок анализируют с применением ИК-спектроскопии, а также определяют физико-механические показатели (табл.).

Об образовании химических (азометиновых) связей между альдегидными группами модифицированного левана и аминогруппами белка судят по появлению в ИК-спектрах полосы поглощения в области 1631 см^-1 (фиг. 2).

Внешний вид определяют визуально (фиг. 3), прочность, в МПа (Н/мм²), растяжение (%) в соответствии с ГОСТ 17035-86 и ASTM с использованием универсальной испытательной машины с электромеханическим приводом XLW (PC) Auto (ГОСТ 7855-84; ASTM). Толщину пленок определяют на автоматическом толщиномере высокого разрешения CHY-C2 (табл.).

По сравнению с известным решением заявленное изобретение позволяет повысить реакционную способность левана за счет образующихся альдегидных групп и его можно использовать для получения белково-полисахаридных пленок.

Таблица

Физико-механические и химические показатели Показатели для пленок исходный леван с белком пленка на основе левана, обработанного 0,1 Н периодатом натрия, протеолитического фермента трипсина и глицерина пленка на основе левана, обработанного 0,15 Н периодатом натрия, протеолитического фермента трипсина и глицерина Прочность, МПа - 6,0-6,4 3,8-4,0 Растяжение, % - 3,9-4,3 5,1-5,7 Количество альдегидных групп – степень замещения, отн.ед./содержание в % - 102,1-124,3 /
14,2-16,4 122,9-147,9 /
16,8-19,4

Изобретение относится к области химии, косметологии и медицины, а именно к способу формирования белково-полисахаридных пленок, заключающемуся в том, что к обработанному периодатом натрия левану добавляют протеолитический фермент трипсин и глицерин и формируют белково-полисахаридные пленки, при следующем соотношении компонентов, мас. %: обработанный периодатом натрия леван 54-56; протеолитический фермент трипсин 39-41; глицерин 5-6. Технический результат заключается в образовании белково-полисахаридной пленки. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ формирования белково-полисахаридных пленок, заключающийся в том, что к обработанному периодатом натрия левану добавляют протеолитический фермент трипсин и глицерин и формируют белково-полисахаридные пленки, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

обработанный периодатом натрия леван 54-56; протеолитический фермент трипсин 39-41; глицерин 5-6.