СПОСОБ И УСТАНОВКА ДЛЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ ТРАНСПЛАНТАТОВ СУХОЖИЛИЙ Российский патент 2023 года по МПК A61L2/20 A01N1/02 A61L27/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинским биотехнологиям, и может быть использовано для получения стерильного криоконсервированного аллогенного трансплантата сухожилия для последующего применения в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, реконструктивной микрохирургии.

Уровень техники

Обеспечение биологической безопасности является важным критерием при производстве трансплантатов на основе аллогенных тканей. Неотъемлемой характеристикой биологически безопасных изделий является их стерильность, отсутствие инфекционных и иммунологических осложнений при использовании трансплантата. Многие трансплантаты на основе аллогенных тканей (кость, твердая мозговая оболочка, перикард) выполняют барьерную и биомеханическую функции, без активной функциональной нагрузки. Напротив, использование аллогенных сухожилий подразумевает их активное участие в работе опорно-двигательного аппарата, что требует сохранения структурно-функциональных свойств сухожилия после всех процедур производства трансплантата, включая стерилизацию, в результате которой происходит значимое повреждение структуры соединительной ткани трансплантата [G.C. Soaresa, D.A. Learmonth, M.C. Vallejo, S. P. Davila, P. González, R.A. Sousa, A.L. Oliveira, Supercritical CO2 technology: The next standard sterilization technique? // Materials Science and Engineering. 2019. 99: 520-540]. В этой связи, актуальным является разработка эффективного способа стерилизации сухожилий, обеспечивающего сохранение биомеханических функций, включая сохранение прочностных характеристик и целостности соединительной ткани сухожилия, структуры волокон в составе трансплантата. Кроме того, распространенные способы стерилизации медицинских изделий, как правило, необратимо нарушают способность ДНК к репликации и транскрипции в связи с воздействием стерилизующих факторов, которые в равной степени затрагивают как патогенные микроорганизмы, так и собственные клетки трансплантата. В этой связи важным является разработка способа, обеспечивающего сохранение жизнеспособности клеток сухожилия в процессе стерилизации для обеспечения нормального приживления и функционирования трансплантата.

Из уровня техники известны способ и установка для стерилизации трансплантатов сухожилий с помощью гамма-излучения и пучка электронов [E.Y. Elenes, S.A. Hunter Soft-tissue allografts terminally sterilized with an electron beam are biomechanically equivalent to aseptic, nonsterilized tendons //J Bone Joint Surg Am. 2014. Vol.96, №16. Р. 1321-1326]. Воздействие на сухожилия проводят излучением 17,1-21,0 КГр с последующей лиофилизацией полученных трансплантатов. При этом для стерилизации используется промышленная установка с линейным ускорителем частиц Electron Beam Accelerator (LAE-10; 10 MeV), содержащая излучатель, линейный ускоритель, систему СВЧ-питания, высоковольтного питания, блок автоматизированной системы управления, теплообменник с термостатированной водой, теплообменник с нетермостатированной водой, пост форвакуумный ТВП-К (передвижной). Линейный ускоритель содержит рабочую камеру с подвижной лентой для размещения трансплантата. Для стерилизации трансплантаты помещают в индивидуальные непроницаемые пакеты. Процесс стерилизации проводят при температуре около -70°С, поддерживаемой с использованием сухого льда. Средняя продолжительность процедуры стерилизации составляет 30 секунд. Однако данный способ требует предварительного высушивания сухожилий, не учитывает при обработке возможное повреждение топографии коллагена, образования белковых сшивок под действием излучения, не содержит данных гистологической картины трансплантатов после стерилизации. Кроме того, лиофилизация сухожилия, используемая при производстве трансплантата, вызывает ломкость коллагеновых волокон, что приводит к значительному снижению биомеханических свойств трансплантатов сухожилий. Показано, что после лиофилизации в сухожилиях наблюдается распад и фрагментация коллагеновых волокон, нарушается исходная топография коллагена, происходит гомогенизация коллагена на больших участках трансплантата и образование многочисленных участков разрушенной ткани, приводит к гибели клеток. Лиофилизированные сухожилия теряют до 40% исходной прочности, при этом диаметр волокон изменяется в 3-4 раза по сравнению с исходным - лиофилизация и регидротации вызывают как истончение волокон, так и их резкое набухание. Все это приводит к значительному нарушению исходной архитектоники волокон и негативно влияет на конечный клинический эффект аллотрансплантатов.

Перспективным для стерилизации аллотрансплантатов является использование сверхкритического диоксида углерода (СК СО₂). Сверхкритическая среда (СКС) представляет собой особую агрегатную форму вещества при давлении и температуре выше его критической точки. СКС сочетают свойства жидкости и газа. В частности, СКС, благодаря низкой вязкости, обладают высокой проникающей способностью, близкой к газам, вследствие чего могут легко диффундировать в ткани. В то же время СКС обладают плотностью, близкой к жидкостям, обладают высоким растворяющим потенциалом и могут рассматриваться как экологически чистая, нетоксичная замена органическим растворителям. Стерилизация в среде СК СО₂ позволяет добиться такого же эффекта инактивации вирусов, бактерий, микроскопических грибов и спор, что и при ионизирующем излучении.

В частности, из уровня техники известен способ и установка для стерилизации трансплантатов сухожилий [T. Baldini, K. Caperton, M. Hawkins, E. McCarty Effect of a novel sterilization method on biomechanical properties of soft tissue allografts // Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 2016. Vol. 24. P. 3971-3975], включающие воздействие на упакованные трансплантаты сверхкритическим диоксидом углерода. Стерилизацию проводят на установке, содержащей пневмоуправляемый газ-бустер, подсоединенный к баллону с СО₂; краны, капилляры и манометр для подачи СО₂ в реактор; реактор 600 мл с контролем температуры и краном для сброса давления. Однако в данной публикации отсутствует информация об условиях стерилизации, включая параметры обработки сверхкритическим диоксидом углерода, не показано влияние стерилизации на структуру соединительной ткани.

Из уровня техники известен способ и установка для стерилизации сухожилий с использованием сверхкритического диоксида углерода в жидкой среде [A. White, D. Burns, T. W. Christensen Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide // Journal of Biotechnology. 2006. 123: 504-515]. Стерилизацию аллогенных трансплантатов на основе мягких тканей проводят в присутствии специального реагента, содержащего перуксусную кислоту в концентрации от 13,5% до 18,5% и перекись водорода в концентрации от 4,5% до 6%, перед процедурой стерилизации осуществляют увлажнение камеры с трансплантатами в течение 2 часов. Стерилизацию трансплантатов сухожилий проводят при температуре 35°С в течение 2 часов при давлении 97 атм. Способ осуществляют с использованием аппарата для стерилизации, который включает стандартный баллон с двуокисью углерода, воздушный компрессор, систему клапанов и фильтров, реактор, систему для отведения диоксида углерода.

Данный способ позволяет получать биологически безопасные трансплантаты, однако требует использования реагентов, способных нарушать структуру коллагена в составе сухожилий. В данной публикации также отсутствует информация об условиях стерилизации, включая продолжительность и уровень давления при стерилизации, не показано влияние стерилизации на структуру соединительной ткани, отсутствуют данные гистологической картины трансплантатов после стерилизации. Кроме того, известный способ не может быть использован для стерилизации трансплантатов, предназначенных для криохранения, не учитывает необходимость карантинизации трансплантатов.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ и установка для стерилизации аллогенных тканевых трансплантатов [Perrut, M. (2012). Sterilization and virus inactivation by supercritical fluids (a review). The Journal of Supercritical Fluids, 66, 359-371. doi:10.1016/j.supflu.2011.07.007], основанные на обработке сверхкритическим диоксидом углерода биомедицинских изделий, находящихся внутри специального контейнера (корзины). Для стерилизации газообразный диоксид углерода сжимают с помощью компрессора до определенного давления. После чего газ под давлением поступает в автоклав с термостатом, который предварительно нагревают до температуры перехода диоксида углерода в сверхкритическое состояние с возможным введением стерилизующей добавки (этанол, перекись водорода, уксусная или надуксусная кислота, вода). Исходный образец (биополимеры, аллогенные трансплантаты) помещают в реактор, который представляет собой емкость, оборудованную системой быстрого закрытия и имеющую контейнер (корзину) для загрузки и выгрузки материала. Реактор также оборудован фильтрами, непроницаемыми для патогенов, через которые пропускают сверхкритический флюид диоксида углерода с заданной температурой (от 20 до 80°С) и давлением (от 150-300 атм), время стерилизации составляет от 10 до 170 мин. По окончании стерилизации давление сбрасывают до атмосферного. Результаты исследования показали, что полученный после обработки материал не содержит жизнеспособных вирусных патогенов (HIV-1, Sindbis, Polio Sabin 1 типа, Pseudorabies), а также большого спектра исследуемых бактериальных патогенов. Такой подход позволяет стерилизовать нелиофилизированные трансплантаты внутри стерильных контейнеров и получать биобезопасные изделия. В публикации отмечено, что проблемы использования данного способа стерилизации аллогенных трансплантатов заключаются в потере стерильных свойств материала при его извлечении из реактора (контейнера), что не позволяет готовить стерильные трансплантаты, пригодные для длительного хранения путем криоконсервирования, требует использования специальных контейнеров (корзин). Кроме того, в способе не указаны режимы декомпрессии, отсутствует информация о полученной структурной целостности тканей трансплантата, жизнеспособности клеток в их составе, функциональных свойствах мягкотканных трансплантатов.

Технической проблемой является устранение перечисленных выше недостатков известных технических решений и разработка способа и установки для стерилизации трансплантатов аллогенных сухожилий, пригодных для криоконсервирования, с получением безопасного аллогенного трансплантата сухожилия, имеющего структурные и механические свойства, сходные с нативным сухожилием, сохраняющего жизнеспособность клеток и ткани после стерилизации и при длительном (до 1 года) хранении при сверхнизких температурах.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение стерильного аллогенного трансплантата сухожилия с возможностью длительного хранения при сверхнизких температурах, при этом сохраняющего нативную структуру ткани и физико-механические свойства.

Технический результат достигается при использовании способа стерилизации трансплантатов сухожилий, согласно которому сухожилия обрабатывают (пропитывают) криоконсервирующим раствором, упаковывают, помещая трансплантат сначала в первый полиэтиленовый криопакет с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости, затем во второй криопакет, выполненный, по меньшей мере с одним отверстием, расположенным предпочтительно в верхней части криопакета, также выполненным проницаемым для газа и жидкости, затем криопакеты с трансплантатом помещают в медицинские пакеты, предназначенные для стерилизации в газообразной среде, проницаемые в закрытом виде для соответствующего стерилизующего агента и непроницаемые для микроорганизмов; медицинские пакеты с трансплантатом герметично запаивают с последующей стерилизацией упакованного трансплантата в реакторе в среде сверхкритического диоксида углерода в течение не менее 1 часа, при этом в процессе стерилизации давление повышают по меньшей мере до 100 атм. (10,13 Мпа), завершают процесс стерилизации понижением давления до исходного значения со скоростью не более не более 0,4 атм (0,041 Мпа) в минуту.

Сухожилия обрабатывают консервирующим раствором вне криопакета в стерильных условиях (в ламинарном шкафу). В качестве консервирующего раствора используют раствор, обеспечивающий криопротекцию живых клеток от заморозки при минус 80°С, например, 10% раствор ДМСО, или 10 % раствор ПЭГ- 400, или их комбинацию. Для обработки трансплантат сухожилия погружают в криоконсервант и выдерживают примерно в течение 30 минут, периодически встряхивая. После пропитки сухожилия консервирующим раствором излишки криопротектора с поверхности ткани удаляют стерильной салфеткой. Затем трансплантаты сухожилий переносят в криопакеты. В качестве криопакетов используют пакеты, характеризующиеся устойчивостью к сверхнизким температурам, обеспечивающие прозрачность и эластичность, а также стойкость к механическим воздействиям, например, контейнеры серии CryoStore (Origen Biomedical Inc., США), артикулы CS50N, CS250N, CS500N, CS750N, CS1000N, CS2000N, https://www.delrus.ru/catalog/kletochnye-tekhnologii/raskhodnye-materialy-dlya-kletochnykh-tekhnologiy/2-raskhodnye-materialy-dlya-podgotovki-stvolovykh-kletok-k-zamorozke/41740-meshok-dlya-glubokoy-zamorozki-kletok-i-tkaney-196-s-obyem-750-ml/. В качестве медицинских упаковочных пакетов для стерилизации используют пакеты из бумаги высокой плотности, например, 60 гр/м², с двойным слоем пленки из полиэстера/полипропилена, например, пакеты комбинированные в рулонах «СтериТ®» (Винар, Россия), ТУ 9398-083-11764404-2011, https://www.deznet.ru/catalog/upakovochnyy_material/rulony_ploskie/83688/, или https://www.sigma-med.ru/catalog/emkosti-i-pakety-dlia-sterilizatcii-i-dezinfektcii/rulon_kombinirovannyy_so_skladkoy_sterit_400mm_kh_80mm_kh_100m/. Для эффективной стерилизации упакованных трансплантатов криопакеты должны содержать перфорации или отверстия для свободного выхода влаги и газов в процессе стерилизации, а также при последующей разморозке после криохранения. В одном из вариантов осуществления изобретения размеры отверстий первого криопакета для упаковки сухожилий составляют предпочтительно от 0,5 - 1,2 мм, которые относительно равномерно распределены по длине трансплантата. Отверстие во втором криопакете может быть сформировано в виде незапаянной части пакета, длиной 0,5 - 5,0 см.

Для стерилизации одновременно с трансплантатом, например, размером до 20 см формируют, по меньшей мере, два образца сухожилия размером до 1 см для последующего исследования образцов на стерильность и токсичность после их заморозки, при этом образцы упаковывают и обрабатывают одновременно с трансплантатом в аналогичных условиях.

Для стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода упакованный трансплантат погружают в реактор повышенного давления, представляющий собой емкость из нержавеющей стали с герметичной крышкой, содержащей клапан для подачи СО₂. В одном из вариантов осуществления изобретения для стерилизации реактор нагревают до температуры 35°С, после чего в него через клапан в крышке подают диоксид углерода при помощи компрессора до итогового давления в реакторе 100 атм., продолжительность стерилизации составляет по меньшей мере 1 час при указанной температуре, завершают процесс стерилизации понижением давления (декомпрессией) до исходного значения со скоростью от 0,1 до 0,4 атм. в минуту, например, со скоростью 0,125 атм. в минуту.

После стерилизации сухожилия замораживают и хранят при температуре минус 80°С.

Технический результат достигается также при использовании установки для стерилизации трансплантатов сухожилий, включающей, по меньшей мере, один реактор, снабженный крышкой, выполненный с возможностью размещения в нем упакованного трансплантата сухожилия и проведения стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода при давлении до 100 атм.; генератор давления или электрический насос, с одной стороны подключенный к источнику СО₂, с другой - к реактору через клапан, или штуцер, или капилляр, снабженный исполнительным механизмом, выполненным с возможностью подачи диоксида углерода в реактор под давлением для обеспечения процесса стерилизации и сброса давления в реакторе по окончании процесса стерилизации со скоростью не более 0,125 атм/мин.

Реактор выполнен в виде вертикально ориентированной цилиндрической емкости из нержавеющей стали с возможностью размещения упакованного трансплантата, имеющего длину не менее 25 см, ширину - не менее 8 см, толщину - не менее 3 см, при этом трансплантата помещен сначала в первый полиэтиленовый криопакет с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости. Первый пакет с трансплантатом помещен во второй криопакет, выполненный, по меньшей мере, с одним отверстием, проницаемым для газа и жидкости. Упакованный в криопакеты трансплантат помещен в медицинский упаковочный пакет, предназначенный для стерилизации в газообразной среде, проницаемый в закрытом виде для соответствующего стерилизующего агента и непроницаемый для микроорганизмов.

Установка может содержать блок из нескольких реакторов, соединенных между собой системой клапанов и капилляров (штуцеров).

Реактор выполнен с возможностью подогрева до температуры перехода диоксида углерода в сверхкритическое состояние, при этом он может быть снабжен средством его электрического нагрева, или водяной рубашкой, или ПИД-регулятором температуры, или жидкостным термостатом. Реактор также может быть снабжен манометром для контроля давления сверхкритического диоксида углерода в ходе проведения стерилизации.

Установка может быть снабжена исполнительным механизмом для регулирования давления в компрессоре, выполненным, например, в виде вентиля тонкой регулировки высокого давления или регулятора давления.

Установка может быть снабжена интерфейсом для обеспечения возможности дистанционного управления процессом стерилизации с периферийных устройств, блоком управления насосом подачи высокого давления в реактор.

Таким образом, технический результат изобретения достигается за счет использования определенных условий проведения стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода, включая использование «медленной» декомпрессии, в ходе которой не допускается повреждение тканей и нарушения целостности предлагаемой системы упаковки. При этом применение последовательной «тройной» упаковки трансплантата в пакеты, два из которых выполнены с отверстиями, позволяет сохранять пропитку трансплантата криопроектором до, после и в ходе всего процесса стерилизации без нарушения режима стерильности для последующего хранения при отрицательных температурах.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами и фотографиями, где на фигуре 1 представлена схема промышленной установки для стерилизации трансплантатов сухожилий, на фигуре 2 - портативный вариант выполнения установки, который был изготовлен для проведения исследования; на фигуре 3 представлена фотография изготовленной портативной установки для стерилизации трансплантата сухожилий, на фиг. 4 - 11 - фотографии трансплантата сухожилий, демонстрирующие этапы его упаковки перед стерилизацией.

Позициями на фигурах обозначены: 1 - источник диоксида углерода (например, баллон с СО₂), 2 - вентиль для подачи диоксида углерода к распределительному узлу или насосу; 3 - генератор давления или электрический насос высокого давления, который может быть выполнен с блоком управления, 4 - исполнительный механизм, выполненный с возможностью подачи диоксида углерода в реактор под давлением для обеспечения процесса стерилизации, который в частном случае может представлять собой вентиль регулировки высокого давления, или распределительный узел с манометром для подачи СО₂ в реактор, 5 - реактор, который может быть снабжен клапанами для нагнетания давления и его сброса, а также системой контроля и управления температурой и давлением, 6 - ламинарный шкаф для размещения реакторов, 7 - исполнительный механизм, выполненный с возможностью сброса давления в реакторе по окончании процесса стерилизации (автоматизированная система сброса давления), 8 - интерфейс обмена данными для дистанционного управления установкой с периферийных устройств, 9 - периферийное устройство с программной средой контроля параметров установки (например, компьютер, или планшет, или смартфон), 10 - средство нагрева реактора (термостат).

Осуществление изобретения

Способ может быть реализован с использованием установки для стерилизации сверхкритическим диоксидом углерода, как показано на фигурах 1 и 2. На фигуре 1 представлен вариант выполнения промышленной установки с набором реакторов и системой дистанционного управления процессом стерилизации, на фигуре 2 - портативный (или лабораторный) вариант выполнения установки.

Установка содержит, по меньшей мере, один реактор 5 с крышкой, генератор давления или электрический насос 3, соединенный с источником диоксида углерода 2, с одной стороны, с другой - подключенный через исполнительный механизм 4 к реактору с возможностью подачи диоксида углерода под давлением для обеспечения процесса стерилизации при давлении не ниже 100 атм с возможностью контроля давления и скорости подачи в реактор диоксида углерода.

В одном из вариантов осуществления изобретения в установке может быть использован генератор давления, например, генератор высокого давления HiP (https://www.highpressure.com/products/pump-products-and-systems/specialty-pumps-and-controllers/manual-pressure-pump-generators/), представляющий собой поршневой винтовой насос с ручным управлением.

В другом варианте осуществления изобретения в установке может быть использован электрический высокопроизводительный двухпоршневой насос, например, насос SFT-25, снабженный средствами контроля давления (https://www.supercriticalfluids.com/products/supercritical-fluid-extraction-products/sft-25/ )

В качестве источника СО₂ в портативном варианте исполнения установки может выступать баллон объемом 40 л с мембранным вентилем. В промышленном варианте осуществления установки в качестве источников СО₂ могут быть использованы иные емкости и резервуары, снабженные средствами управляемой подачи газа в генератор.

Используемый в установке реактор 5 выполнен с возможностью размещения в нем упакованного трансплантата сухожилия и проведения стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода при давлении не менее 100 атм. (10,13 Мпа). В одном из вариантов осуществления изобретения реактор выполнен в виде вертикально ориентированной цилиндрической емкости из нержавеющей стали с возможностью подогрева до температуры не ниже 35°С. Реактор снабжен стрелочным манометром для контроля давления сверхкритического диоксида углерода в ходе проведения стерилизации. При необходимости увеличения производительности установки может быть использован блок из нескольких реакторов, соединенных между собой с помощью системы вентилей и капилляров (например, https://www.highpressure.com/products/valves-fittings-tubing/taper-seal-valves-fittings-and-tubing/low-pressure-tubing/). Для нагрева реактора до температуры перехода СО₂ в сверхкритическое состояние и поддержания необходимой температуры в течение заданного времени реактор снабжен соответствующим средством 10, который может иметь различное конструктивное решение, известное из уровня техники, обеспечивающее предписанную ему функцию. В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве такого средства могут быть использованы металлические, керамические, или сопловые электрические нагреватели или тэны, например, хомутовые или кольцевые, размещаемые со стороны внешней поверхности реактора с обеспечением плотного прилегания нагревателя к нагреваемой поверхности и контакта нагревательных элементов с корпусом реактора. Нагревательным элементом в данных устройствах является проволока высокого сопротивления. Фиксация хомутовых электрических нагревателей к реактору осуществляется стяжными креплениями двух типов (стяжка и «ушки»). Электрические нагреватели, как правило, укомплектованы термопарой для обеспечения контроля температуры нагреваемой поверхности. Возможные варианты электрических нагревателей, которые могут быть использованы в заявленном изобретении, представлены на сайтах их производителей (см. например, https://electro-nagrev.ru/catalog/promyshlennye_nagrevateli/homutovye-nagrevateli/). Мощность нагрева в одном из вариантов осуществления установки может контролироваться с помощью ПИД-регулятора ТРМ10 с RS-485 (см. например, https://owen.ru/product/trm10). Нагрев реактора может осуществляется с помощью иных средств, например, посредством погружения его в ванну с водой, снабженной жидкостным термостатом (см. например, https://www.lauda.de/ru/termostatirujushchee-oborudovanie/termostaty/nagrevajushchie-termostaty/eco-s-prozrachnoi-vannoi/product/ECO-ET-15-S) с обеспечением нагрева воды в ванной до требуемой температуры (не ниже 35°С).

Реактор имеет конфигурацию, позволяющую размещать в нем упакованные трансплантаты размером не менее 20x8x3 см, как показано на фиг.11. При этом упаковка, по существу, является тройной - состоит из трех пакетов, помещенных один в другой: первого, полиэтиленового криопакета с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости, в который помещен трансплантат; второго криопакета, снабженного, по меньшей мере, одним отверстием, проницаемым для газа и жидкости, и выполненного с возможностью размещения в нем первого пакета с трансплантатом; третьего пакета - медицинского упаковочного пакета, выполненного с возможностью размещения в нем второго пакета. Этапы упаковки трансплантата представлены на фиг. 4 - 11.

Установка оснащена исполнительными механизмами 4 и 7 для регулирования давления и скорости подачи диоксида углерода из компрессора в реактор и сброса давления. В одном из вариантов осуществления изобретения установка оснащена исполнительным механизмом контроля давления (не ниже 100 атм) и скорости сброса давления (не грубее 0,125 атм/мин. или 0,041 Мпа) в ходе процесса стерилизации, представляющим собой вентиль тонкой регулировки высокого давления (например, https://www.highpressure.com/products/valves-fittings-tubing/taper-seal-valves-fittings-and-tubing/taper-seal-needle-valves/), отдельно или совместно с регулятором давления (например, https://mvif.ru/regulyatory-davleniya-go-serii-b-pr50), либо же автоматическим регулятором давления (например, https://bimedis.com/thar-abpr-200-m506058), снабженным датчиком давления, клапаном тонкой регулировки с приводом от шагового двигателя с системой управления на основе ПИД-регулятора и возможностью дистанционного управления и контроля с периферийных устройств через интерфейс обмена данными. Исполнительный механизм может быть установлен непосредственно на крышку реактора, либо подключен к реактору с помощью системы кранов и капилляров высокого давления.

Управление работой установки может осуществляться дистанционно, для чего она может быть оснащена соответствующими средствами приема-передачи соответствующих сигналов с использованием сети Интернет. В частности, установка может быть снабжена интерфейсом обмена данных 8 с периферийными устройствами 9 для обеспечения возможности дистанционного управления процессом стерилизации с периферийных устройств, введения управляющих параметров всех включенных в установку устройств и исполнительных механизмов, а именно, генератора давления (насоса), реактора и механизма контроля давления и скорости сброса давления, в одну программную среду.

Установка может работать от сетевого или автономного источника питания.

Перед стерилизацией образцы сухожилий механически очищают от подкожной жировой клетчатки и мышечной ткани. Кровь донора тканей направляют на исследование наличия гемотрансмиссивных инфекций. До получения результатов исследований отобранные для последующей обработки аллотрансплантаты размещают в физиологическом растворе антибиотика, например, ванкомицина в количестве 1 г на 100 мл физ. раствора - 0,9% натрия хлора. При отсутствии гемотрансмиссивных инфекций, сухожилия обрабатывают криопротектором, стерилизуют, замораживают и хранят при температуре -80°С.

Приготовление раствора консерванта ведут с соблюдением правил асептики и антисептики в условиях ламинарного шкафа. Криоконсервант 99,8 % ДМСО разводят средой DMEM до конечной его концентрации 10%, 100% ПЭГ-400 также средой DMEM доводят до концентрации 10% или 15%. В качестве криоконсерванта может быть использована смесь растворов ДМСО и ПЭГ-400. Для приготовления смеси, например, 10 мл 100% ПЭГ-400 смешивают с 5 мл или 10 мл 99,8 % ДМСО и доводят до необходимой концентрации (10% ПЭГ-400 + 5 % или 10% ДМСО) средой DMEM до получения 100 мл. итогового раствора криоконсерванта. Пропитка сухожилий раствором криоконсерванта может проводиться в отдельных емкостях. Для более качественной пропитки емкости с трансплантатами могут быть помещены на шейкер примерно на 20-30 минут.

Через 30 минут в стерильных условиях бокса трансплантаты извлекают из раствора криоконсерванта, подсушивают салфетками, удаляя излишнюю влагу, и размещают в полиэтиленовые криопакеты с перфорациями (фиг.5 и фиг.8), например, контейнер CryoStore (Origen Biomedical Inc., США), артикулы CS750N (https://www.delrus.ru/catalog/kletochnye-te khnologii/raskhodnye-materialy-dlya-kletochnykh-tekhnologiy/2-raskhodnye-materialy-dlya-podgotovki-stvolovykh-kletok-k-zamorozke/41740-meshok-dlya-glubokoy-zamorozki-kletok-i-tkaney-196-s-obyem-750-ml/). После чего криопакеты с трансплантатом размещают в медицинские пакеты для стерилизации, например, пакет комбинированный 250 мм «СтериТ®» (Винар, Россия), ТУ 9398-083-11764404-2011 (https://www.deznet.ru/catalog/upakovochnyy_material/rulony_ploskie/83688/, или https://www.sigma-med.ru/catalog/emkosti-i-pakety-dlia-sterilizatcii-i-dezinfektcii/rulon_kombinirovannyy_so_skladkoy_sterit_400mm_kh_80mm_kh_100m/), и герметично запаивают (фиг.11). При этом для стерилизации одновременно с трансплантатом размером до 20 см формируют, по меньшей мере, два образца сухожилия размером до 1 см для последующего исследования образцов на стерильность и токсичность после их заморозки, образцы упаковывают и обрабатывают одновременно с трансплантатом (фиг. 6-7, 9-10) в аналогичных условиях.

После упаковки трансплантаты отправляют на стерилизацию. Для чего в реактор из нержавеющей стали загружают трансплантаты, упакованные в пакеты, закрывают герметичной крышкой, снабженной клапаном для подачи давления. Реактор нагревают до температуры 35°С, после чего в ректор подают диоксид углерода при помощи компрессора до итогового давления в реакторе 100 атм. Продолжительность стерилизации составляет по меньшей мере 1 час.

Завершают процесс стерилизации с использованием медленной декомпрессии реактора до исходного давления со скоростью 0,1 - 0,4 атм. в минуту, предпочтительно 0,125 атм. в минуту, что может занимать от 12 до 24 часов. По завершении сброса давления реактор в условиях ламинарного бокса вскрывают, извлекают пакеты с сухожилиями и проверяют на наличие видимых повреждений. При отсутствии повреждений, трансплантаты маркируют и отправляют в морозильную камеру с температурой -80°С для дальнейшего хранения.

Заявляемым способом с помощью изготовленной портативной стерилизационной установки (см. фиг.2, 3) был получен ряд трансплантатов при различных условиях обработки в сверхкритическом диоксиде углерода.

Портативная установка содержала баллон с диоксидом углерода 1, вентиль для подачи диоксида углерода 2 (High Pressure Equipment Co. (США), артикул 15-11AF1) к распределительному узлу 4 (High Pressure Equipment Co. (США) артикул 15-15AF1) с манометром (МП-2У, НПО "Манометр" (Россия)), а также подключенный к нему насос высокого давления 3 (High Pressure Equipment Co. (США), артикул 68.5.75-15), установленными в ламинарном шкафу 6 (Holten Maxi Safe производства Thermo Fisher Scientific (США)), термостат 10 (Lauda ECO ET 15S, артикул L001098, производства Lauda Dr. R. Wobser Gmbh & Co (Германия)) с погруженными в него реакторами 5 (High Pressure Equipment Co. (США) артикул OC-5), оснащенными вентилями для нагнетания и сброса давления 7 (High Pressure Equipment Co. (США), артикул 15-12AF1), измерителем потока СО₂ (LZTM-15 (КНР)) и зажимом (тисками) для вскрытия реакторов (Мастер 32721, Зубр (Россия)). Баллон с диоксидом углерода под давлением при помощи вентиля для подачи диоксида углерода подключали с помощью капилляра из нержавеющей стали к распределительному узлу, который посредством таких же трубочек и вентилей из нержавеющей стали соединялся с насосом повышенного давления и реакторами. Реакторы располагали в автоклаве с термостатом, которые в свою очередь размещали в ламинарном шкафу. Вентиль подачи диоксида углерода после охлаждения насоса повышенного давления открывали и заполняли цилиндрическую емкость компрессора, после чего диоксид углерода подавался в реакторы и сжимался до давления 100 атм. Вентили на распределительном узле и на клапане подачи диоксида углерода в реактор перекрывали и начинали процесс стерилизации. Через 1 час вентиль на клапане подачи диоксида углерода с манометром открывали с обеспечением контролируемого сброса давления. Как только давление в реакторе сравнивалось с атмосферным, клапаны подачи и сброса давления перекрывали, обработанный трансплантат извлекали из реактора.

Эксперименты по стерилизации сухожилия проводили в несколько этапов.

На первом этапе проводили выбор эффективного криопротектора для совместного использования при стерилизации с использованием сверхкритического диоксида углерода, который позволяет хранить трансплантаты сухожилий при сверхнизкой температуре без потери ими структурно-функциональных характеристик. В работе использовали трансплантаты сухожилий m. tibialis anterior, забранных от доноров тканей. Для хранения при сверхнизких температурах использовали эндоцеллюлярные/проникающие криопротекторы (диметилсульфоксид (ДМСО), полиэтиленгликоль (ПЭГ-400), глицерол) и экзоцеллюлярные/непроникающие криопротекторы (раствор глюкозы, раствор альбумина). Для оценки сохранности сухожилий после размораживания определяли свойства трансплантатов на разрыв и растяжение-сдвиг, микроскопически оценивали общую морфологию сухожилий, топографию, компактизацию и целостность коллагеновых волокон, сохранность клеточных элементов. В присутствии 10% ДМСО, 10% или 15% ПЭГ-400, комбинации 5% или 10% ДМСО и 10% ПЭГ- 400 структура коллагеновых волокон и клеток не претерпевала видимых изменений по сравнению с контролем, тогда как во всех опытах с непроникающими криоконсервантами топография и ориентация волокон были явно нарушены, наблюдалась деформация многих клеток в составе сухожилий. Таким образом, проникающие криконсерванты на основе 10% ДМСО, 10 % или 15% ПЭГ-400, комбинации (в виде смеси) 5% или 10% ДМСО с 10% ПЭГ-400 являются наиболее эффективными для криохранения трансплантатов сухожилий.

Упаковка трансплантатов перед стерилизацией

При подборе упаковки для стерилизации сухожилий сверхкритическим диоксидом углерода первоначально использовали неперфорированные криопакеты. При этом было отмечено, что сверхкритический флюид диоксида углерода не поступал в криопакеты, а трансплантаты по итогам бактериального посева оказались не стерильными. В этой связи были проведены эксперименты с использованием криопакета с перфорациями, как показано на фиг. 4., и медицинского пакета из бумаги высокой плотности. При декомпрессии криопротектор в результате относительно быстрого (>1 атм/мин) понижения давления диоксида углерода выходил из перфораций и бумажный пакет намокал. Такие пакеты расстерилизовывались или рвались при извлечении из реактора. В связи с чем была использована дополнительная упаковка, а именно еще один криопакет с отверстием. Такая трехслойная упаковка обеспечивала полноценную стерилизацию биологического материала без нарушения герметичности внешней упаковки после декомпрессии. Таким образом, качественная стерилизация сухожилия в сверхкритическом диоксиде углерода возможна при его размещении в тройной упаковке - сначала в криопакете с перфорациями, затем в криопакете с отверстием размером 0,5-5,0 см, и затем в медицинском пакете из бумаги высокой плотности, например, 60 гр/м2, с двойным слоем пленки из полиэстера/полипропилена.

На следующем этапе определяли условия стерилизации трансплантатов сухожилий с помощью сверхкритического диоксида углерода. Технология стерилизации сверхкритическим диоксидом углерода характеризуется отсутствием токсичности, высокой проникающей способностью, патогенинактивацией, а также минимальным повреждающим воздействием на структуру тканей и клеток. [A. Bernhardt, M.Wehrl, B. Paul, T. Hochmuth, M. Schumacher, K. Schütz, M. Gelinsky Improved Sterilization of Sensitive Biomaterials with Supercritical Carbon Dioxide at Low Temperature // PLoS One. 2015; 10(6): e0129205]. При этом в публикациях присутствует противоречивая информация относительно влияния условий осуществления стерилизации на биомеханические характеристики получаемого трансплантата.

Для выявления значимых параметров стерилизации сухожилий в сочетании с выбранными криоконсервантами были проведены бактериологические, гистологические исследования и опыты на животных.

Трансплантаты сухожилий были разделены на 2 группы в зависимости от условий декомпрессии: одну половину образцов стерилизовали в условиях медленной декомпрессии, (сброс давления осуществлялся в режиме от 0,1 до 0,4 атм. в минуту), другую половину - в условиях быстрой декомпрессии (сброс давления осуществлялся в режиме 10 атм. в минуту и более). Внутри каждой группы выделяли дополнительные подгруппы для оценки влияния продолжительности стерилизации (1 час, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 72 часа). Перед стерилизацией образцы сухожилий на 30 минут погружали в криоконсервант, заранее приготовленный в необходимых концентрациях как описано ранее. После стерилизации сухожилия замораживали и хранили при температуре - 80°С в течение 14 суток. В дальнейшем трансплантаты размораживали и оценивали: стерильность, внешний вид ткани, физико-механические свойства, а также структурную целостность и токсичность полученных сухожилий. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Оценка качества трансплантатов сухожилий после разных режимов стерилизации Время обработки сверхкритическим флюидом диоксида углерода 1час 3 часа 6 часов 12 часов 24 часа 72 часа Параметры оценки Медленный сброс давления Стерильность + + + + + + Токсичность ткани - - - - - - Структурная целостность на гистологических препаратах + + + + + + Физико-механические свойства (прочность на разрыв) + + + + + + Сохранность клеток сухожилия + + + + + + Быстрый сброс давления Стерильность - - - - - - Токсичность ткани Не проводилось Структурная целостность на гистологических препаратах - - - - - - Физико-механические свойства (прочность на разрыв) - - - - - - Сохранность клеток сухожилия - - - - - -

Исследование трансплантатов сухожилий на стерильность

Готовые к испытаниям на стерильность трансплантаты разделили на 3 группы: трансплантаты после стерилизации с медленным (1 группа) и быстрым (2 группа) сбросом давления, и контрольная группа - сухожилия, которые не были простерилизованы. После вскрытия пакетов с трансплантатами в условиях ламинарного шкафа с соблюдением правил асептики и антисептики, образцы погружались в 2 бактериологические среды - бульон Сабуро, тиогликолевая среда.

Следует отметить, что во 2 группе упаковки трансплантатов были либо с микроповреждениями, либо, ввиду процесса кавитации, с влажной бумажной подложкой. Оценку стерильности ткани проводили на 7 и 14 сутки.

Выявлено наличие бактериальной и грибковой флоры во 2, 3 группах, независимо от времени стерилизации, как на 7, так и на 14 сутки. Это свидетельствует о том, что способ стерилизации ткани с быстрым сбросом давления не обеспечивает стерильность итогового трансплантата. Напротив, в 1 группе на 7 и 14 сутки, роста флоры не выявили, что доказывает эффективность способа стерилизации аллогенных сухожилий сверхкритическим флюидом диоксида углерода с медленной декомпрессией. Также было доказано, что время стерилизации не влияет на итоговый результат. Однако, учитывая условия создания сверхкритической среды (температура в реакторе 35°С) и токсическое действие на ткань криоконсервантов, достаточно минимального времени обработки трансплантата в реакторе - 1 час.

Исследование токсичности трансплантатов в культуре клеток

Исследование токсичности трансплантатов сухожилий проводилось в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга тканевых доноров 3-9 пассажа. Для оценки токсичности использовали только трансплантаты с доказанной стерильностью (медленная декомпрессия). Фрагменты трансплантатов сухожилий длиной 1,0-1,5 см помещали в опытные лунки 6-луночного планшета и вносили суспензию, содержащую 50 тыс. ММСК. Параллельно 50 тыс. ММСК вносили в лунки без трансплантатов сухожилий (контроль). Клетки культивировали в среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) при 37°С и концентрации CO₂ 5% в течение 3 суток. Для микроскопического анализа клетки окрашивали витальным флуорохромным красителем на основе трипафлавина и родамина. Оценивали общее число клеток (тыс/см²), их морфологию, целостность клеточных мембран (ЦКМ, в баллах).

Исследование in vitro показало, что все исследуемые типы трансплантатов не оказывали токсического действия на клетки. В контроле и во всех опытных лунках через 3 суток культивирования формировался субконфлюэнтный монослой с плотностью клеток 17-18 тыс/см². ММСК имели характерный веретенообразный вид, уровень ЦКМ во всех опытных составлял 34-36 баллов и достоверно не отличался от аналогичного показателя в контроле.

Исследование стерильности и токсичности аллогенных сухожилий на модели животных (крыс)

Исследование проводили на 4 лабораторных животных (крысах) с разрешения локального этического комитета ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ. Заранее подготовленные аллогенные пяточные сухожилия лап крыс, стерилизовали сверхкритическим диоксидом углерода и криоконсервировали. Режим стерилизации - 100 атм., 35°С 1 час, медленный сброс давления 0, 125 атм. в минуту. После размораживания аллогенные сухожилия трансплантировали крысам в область двуглавой мышцы бедра, в специально сформированную полость на правой лапе - опытная лапа. Левую лапу не подвергали никаким воздействиям - контрольная лапа. Перед трансплантацией сухожилие отмывали в течение 15 минут в физиологическом растворе 0,9 % NaCl от криоконсерванта. Оценку стерильности и токсичности проводили на 14 сутки. На 14 сутки животные были активны, питание не нарушено, физиологические отправления в норме. При осмотре области вмешательства: послеоперационные раны без признаков воспаления, нормальной окраски.

Данное исследование показало, что трансплантируемое сухожилие не обладает токсичностью, а также не вызывает нагноения или некроза близлежащих тканей.

Макро- и микроскопический анализ ткани трансплантатов после стерилизации

Макроскопический анализ трансплантатов и их внешний вид отличался от нативной ткани только в группе, где использовали быстрый сброс давления. Образцы сухожилий, независимо от времени стерилизации, были отечными, увеличенными в размерах, в некоторых случаях были заметны повреждения волокон.

Гистологический анализ показал, что в группе с медленной декомпрессией коллагеновые волокна сохраняли свою целостность и топографию, были параллельно ориентированы и содержали лишь локальные незначительные разрывы. Интенсивность автофлуоресценции коллагена по всей длине волокон соответствовала норме. Напротив, в группе с быстрой декомпрессией в трансплантатах наблюдалась выраженная отечность, многие волокна были деконденсированы с распадом на отдельные фибриллы и формированием обширных разрывов. Интенсивность автофлуоресценции коллагена по всей длине волокон была в 2,1-3,5 раза снижена по сравнению с нативными образцами.

В гистологических препаратах также оценивали сохранность клеток сухожилия.

Гистологическое исследование показало, что после процедур стерилизации и криохранения в составе трансплантатов сухожилий выявляются клетки-тендиноциты с нормальной структурной организацией. У большинства клеток структура клеточных ядер и хроматина в их составе, структура цитоплазмы не претерпевает видимых изменений по сравнению с нативной тканью. Число клеток с пикнотизированным (нефункциональным) ядром, с деформациями цитоплазмы не превышают 10-15% от их общего числа в трансплантате. Таким образом, предложенные методики обработки сухожилий не вызывают выраженной гибели клеток в составе готовых трансплантатов.

Исследование физико-механических свойств аллогенных трансплантатов

Механические свойства образцов оценивали на испытательной машине LLOYD Instruments LR5K Plus со скоростью растяжения 5 мм/мин. Ввиду того, что трансплантаты группы с быстрой декомпрессией не удовлетворяли параметрам исследования по стерильности и структурной целостности, было принято решение не включать их в исследование прочностных характеристик. В группе с медленной декомпрессией трансплантаты размораживали и отмывали в физиологическом растворе хлорида натрия в течение получаса. В процессе исследования определяли следующие параметры: нагрузка при разрыве, Н; предельная деформация, %; жесткость, Н/мм, предельное напряжение, Мпа. Было установлено, что при разных сроках обработки сухожилий сверхкритическим флюидом во всех экспериментальных образцах жесткость и предельное напряжение достоверно не отличались от аналогичных значений в контроле (нативные сухожилия). Уровень предельной деформации во всех экспериментальных образцах был достоверно ниже, чем в контроле (табл. 2). Нагрузка при разрыве в образцах, обработанных в течение 1 часа, достоверно не отличалась от контроля, тогда как во всех остальных опытных группах (обработка 3-10 часов) нагрузка при разрыве была в 1,6-1,8 раз ниже, чем в контроле и в образцах, обработанных в течение 1 часа (р<0,05). Таким образом, оптимальным является стерилизация сверхкритическим флюидом диоксида углерода по меньшей мере в течение 1 часа.

Таблица 2. Влияние продолжительности стерилизации сверхкритическим флюидом диоксида углерода на механические характеристики трансплантатов сухожилий Время обработки, ч Нагрузка при разрыве, Н Предельная деформация, % Жесткость, Н/мм Предельное напряжение, МПа контроль 601±100 63±20 65±10 80±10 1 623±100 34±20* 70±10 85±10 3 427±60* 28±15* 80±10 82±10 6 363±50* 38±15* 78±10 69±10 10 332±50* 31±10* 83±10 75±10 *р<0,05 относительно контроля

При сравнении механических свойств сухожилий, стерилизованных способом, указанном в прототипе, и предложенным нами способом установлено, что стерилизация сверхкритическим флюидом диоксида углерода в течение 1 часа по разработанному способу позволяет лучше сохранять исходные механические параметры сухожилий (табл. 3), одновременно позволяет осуществлять их длительное хранение.

Таблица 3. Сравнение методик стерилизации сухожилий сверхкритическим флюидом диоксида углерода Время обработки, ч Нагрузка при разрыве, Н Предельная деформация, % Жесткость, Н/мм Предельное напряжение, МПа контроль 601±100 63±20 65±10 80±10 Способ-прототип 330±79* 40±10* 77±32* 90±15 Предлагаемый-способ 623±100** 34±10* 70±10 85±10 *р<0,05 относительно контроля
**р<0,05 относительно способа-прототипа

Таким образом, предложенный способ позволяет получать стерильные и функционально эффективные трансплантаты аллогенных сухожилий.

Изобретение относится к медицинским биотехнологиям и может быть использовано для получения стерильного криоконсервированного аллогенного трансплантата сухожилия для последующего применения в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, реконструктивной микрохирургии. Способ стерилизации трансплантатов сухожилий характеризуется тем, что сухожилия пропитывают криоконсервирующим раствором, упаковывают, помещая трансплантат сначала в первый полиэтиленовый криопакет с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости, затем во второй криопакет, выполненный, по меньшей мере, с одним отверстием, проницаемым для газа и жидкости, затем криопакеты с трансплантатом помещают в медицинский пакет, предназначенный для стерилизации в газообразной среде, проницаемый в закрытом виде для соответствующего стерилизующего агента и непроницаемый для микроорганизмов, медицинский пакет с трансплантатом запаивают с последующей стерилизацией в среде сверхкритического диоксида углерода. При этом в процессе стерилизации давление повышают до 100 атм, завершают процесс стерилизации понижением давления до исходного значения со скоростью не более 0,4 атм в минуту. Также раскрывается установка для стерилизации трансплантатов сухожилий. Изобретение направлено на получение стерильного аллогенного трансплантата сухожилия с возможностью длительного хранения при сверхнизких температурах, при этом сохраняющего нативную структуру ткани и физико-механические свойства. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл.

1. Способ стерилизации трансплантатов сухожилий, характеризующийся тем, что сухожилия пропитывают криоконсервирующим раствором, упаковывают, помещая трансплантат сначала в первый полиэтиленовый криопакет с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости, затем во второй криопакет, выполненный, по меньшей мере, с одним отверстием, проницаемым для газа и жидкости, затем криопакеты с трансплантатом помещают в медицинский пакет, предназначенный для стерилизации в газообразной среде, проницаемый в закрытом виде для соответствующего стерилизующего агента и непроницаемый для микроорганизмов, медицинский пакет с трансплантатом запаивают с последующей стерилизацией в среде сверхкритического диоксида углерода, при этом в процессе стерилизации давление повышают до 100 атм, завершают процесс стерилизации понижением давления до исходного значения со скоростью не более 0,4 атм в минуту.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что сухожилия в криопакетах с консервирующим раствором выдерживают для пропитки до 30 минут предпочтительно с периодическим встряхиванием.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве консервирующего раствора используют раствор, обеспечивающий криопротекцию живых клеток при минус 80°С.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве консервирующего раствора используют 10% раствор ДМСО, или 10% раствор ПЭГ-400, или 15% раствор ПЭГ-400, либо смесь упомянутых растворов ДМСО и ПЭГ-400, либо смесь, содержащую растворы 10% ПЭГ-400 и 5% ДМСО.

5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что после пропитки сухожилий консервирующим раствором перед их упаковкой с поверхности удаляют влагу.

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве первого и второго криопакетов используют прозрачные эластичные пакеты, стойкие к механическим воздействиям, характеризующиеся устойчивостью к сверхнизким температурам.

7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве медицинских пакетов для стерилизации используют пакеты из бумаги с двойным слоем пленки из полиэстера или полипропилена.

8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для стерилизации одновременно с трансплантатом размером до 25 см формируют, по меньшей мере, два образца сухожилия размером до 1 см для последующего исследования образцов на стерильность и токсичность после их заморозки, при этом образцы упаковывают и обрабатывают одновременно с трансплантатом в аналогичных условиях.

9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода упакованный трансплантат погружают в реактор повышенного давления, представляющий собой емкость из нержавеющей стали с герметичной крышкой, содержащей клапан, или штуцер, или капилляр для подачи газа СО₂.

10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что для стерилизации реактор нагревают до температуры 35°С, после чего в него через клапан в крышке подают газ при помощи компрессора до итогового давления в реакторе 100 атм, продолжительность стерилизации составляет, по меньшей мере, 1 час при указанной температуре, завершают процесс стерилизации понижением давления до исходного значения со скоростью 0,125 атм в минуту.

11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что отверстия первого криопакета для упаковки сухожилий имеют размеры от 0,5-1,2 мм, которые равномерно распределены по длине трансплантата.

12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что отверстие во втором криопакете представляет собой незапаянную часть пакета длиной до 5,0 см.

13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что после стерилизации сухожилия хранят при температуре минус 80 °С.

14. Установка для стерилизации трансплантатов сухожилий, включающая

по меньшей мере, один реактор, снабженный крышкой, выполненный с возможностью размещения упакованного трансплантата, помещенного сначала в первый полиэтиленовый криопакет с перфорациями, проницаемыми для газа и жидкости, затем во второй криопакет, выполненный, по меньшей мере, с одним отверстием, проницаемым для газа и жидкости, затем в медицинский упаковочный пакет, и проведения стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода при давлении до 100 атм,

генератор давления или электрический насос, с одной стороны подключенный к источнику диоксида углерода (СО₂), с другой – к реактору через исполнительный механизм с возможностью подачи диоксида углерода в реактор под давлением для обеспечения процесса стерилизации и сброса давления в реакторе по окончании процесса стерилизации со скоростью не более 0,4 атм/мин.

15. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что реактор выполнен в виде вертикально ориентированной цилиндрической емкости из нержавеющей стали.

16. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что содержит более одного реактора, соединенных между собой системой клапанов и капилляров.

17. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что реактор выполнен с возможностью подогрева до температуры перехода диоксида углерода в сверхкритическое состояние.

18. Установка по п.17, характеризующаяся тем, что реактор снабжен средством его электрического нагрева, или водяной рубашкой, или ПИД-регулятором температуры, или жидкостным термостатом.

19. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что исполнительный механизм представляет собой вентиль регулировки высокого давления или регулятор давления.

20. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что реактор снабжен манометром для контроля давления сверхкритического диоксида углерода в ходе проведения стерилизации.

21. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что она снабжена интерфейсом обмена данных для обеспечения возможности дистанционного управления процессом стерилизации с периферийных устройств.

22. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что она снабжена блоком управления насосом подачи высокого давления в реактор.

23. Установка по п.14, характеризующаяся тем, что реактор выполнен с возможностью размещения упакованного трансплантата, имеющего длину не менее 25 см, ширину – не менее 8 см, толщину – не менее 3 см.