Способ выделения флавоноидов из лекарственного растительного сырья Российский патент 2024 года по МПК A61K36/72 B01D11/00 

Изобретение относится к фармации и медицинской промышленности, а именно к способу получения биологически активных веществ из культивируемого лекарственного растительного сырья, и в частности может быть использовано для получения суммы флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной.

Известен ряд способов получения фенольных соединений из листьев облепихи крушиновидной [RU 2197978, А61К 35/78, 2001; RU 2118163, А61К 35/78, 1994; RU 2098111, А61К 35/78, 1994; SU1805967, А61К 35/78, 1987]. Недостатком известных способов является применение токсичных растворителей на одной из стадий экстракции (гексан, петролейный эфир, нефрас, хлороформ и др.).

Известен способ получения флавоновых соединений из листьев облепихи крушиновидной с применением СВЧ-излучения [CN 108272837, А61К 36/185, 2018]. В качестве исходного сырья используют высушенные листья облепихи, которые измельчают, замачивают в растворе ионной жидкости (бромированная-1-этилпиридиновая соль, бромированная-1 -бутилпиридиновая соль 0,2-1 моль/л) в соотношении 1:50-100 при температуре 40-60°С в течение 0,5-1 ч, с последующим микроволновым воздействием в течение 5 мин, мощностью 400 Вт, температурой 50°С. Выщелачивание продолжают еще в течение 0,5-1 часа. Центрифугированием получают фильтрат. Очистка осуществляется добавлением в концентрат в 4-6 раз больше воды (по отношению к концентрату) и элюированием через колонку, заполненную адсорбционной смолой. Полученный элюат выпаривают на водяной бане с получением суммы флавоноидов облепихи. Выход продукта - около 3,1%.

Недостатком известного способа является использование токсичных растворителей (ионная жидкость), трудоемкость процесса, наличие примесей и низкий выход готового продукта.

Известен способ получения флавоноидов из ветвей и листьев облепихи [CN 107595902, А61К 36/185, 2017], включающий получение спиртовых извлечений из сухих измельченных ветвей и листьев облепихи экстракцией 30-60% этанолом (температура экстракции 70°С) в соотношении сырье-экстрагент 1:12 в течение 60 мин. с последующей фильтрацией и повторной экстракцией водой (температура экстракции 100°С) в соотношении сырье-экстрагент 1:10 или 1:12 в течение 30 или 90 мин. Выход продукта составляет 9,294%.

Недостатком известного способа является большое количество примесей в готовом продукте.

Известен способ получения комплекса бифлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота [RU 2711728, А61К 36/72, 2019], заключающийся в непрерывной экстракции полифенольных веществ из шрота (продукт переработки плодов облепихи) 86-96%) этиловым спиртом в аппарате Сокслета в соотношении 30:240 (1:8) в течение 6 часов, с последующим удалением растворителя из экстракта, разбавлении вакуум-концентрата водой в соотношении 1:3, фильтровании и высушивании выпавшего осадка комплекса биофлавоноидов. Выход целевого продукта - 3,0%. По второму варианту к сырью добавляют воду 30:600 (1:20) и к подогретой до 40°С смеси прибавляют мультиэнзимную композицию (смесь ферментных препаратов Брюзайм BGX и Ультрафло XL в соотношении 1:1) 0,04% к массе, нагревают до 50-55°С и выдерживают 1,5 часа (с целью ускорения процесса экстракции). Далее фильтруют и фильтрат отправляется в аппарат Сокслета по методике, описанной выше (непрерывная экстракция 4 ч). Выход целевого продукта - 3,4%.

Недостатком описанного способа является длительность процесса, низкий выход целевого продукта (3,4%) и использование строго определенных ферментных препаратов.

Известен способ циркуляционной сверхзвуковой экстракции флавоноидов из плодов облепихи крушиновидной [CN 1900098 А], заключающийся в отжиме плодов облепихи для удаления кожуры и семян, удалении воды центрифугированием с целью получения чистой мякоти и высушивании. Полученный шрот в соотношении экстрагент : сырье 3 : 1 (объем: вес) заливают этанолом в концентрации 90-95%об. в циркуляционном экстракторе и экстрагируют 30-35 минут при 45-50°С, затем обезжиривают, промывают водой, фильтруют и сушат для получения готового продукта. Кроме флавоноидов таким способом экстрагируются и другие БАВ, отделение которых требует дополнительную очистку экстракта. Содержание флавоноидов определяется с использованием ВЭЖХ.

Недостаток описанного способа заключается в длительности процесса, извлечение не только целевой группы БАВ, сложность и стоимость оборудования для количественной оценки, а также использовании липофильного растворителя (неполный выход флавоноидов в извлечение). Согласно литературным данным, флавоноиды лучше экстрагируются водно-спиртовыми смесями (70%об.).

Известен способ получения порошка из плодов облепихи крушиновидной [CN 101439124 A], заключающийся в сублимационной сушке сырья (плоды облепихи, индиго синего, винограда горного и черники) с целью последующей экстракции этанолом (70%об.) в соотношении сырье : экстрагент 1 г: 20-40 мл в ультразвуковой бане (20-40 минут). Для разделения экстракты центрифугировали, далее смешивали и гомогенизировали с целью получения высушенного сублимационной сушкой конечного продукта.

Недостатком описанного способа является расход экстрагента и использование дополнительного оборудования.

Известен способ выделения очищенных флавоноидов из крупных плодов облепихи крушиновидной [CN 102579516 A], заключающийся в экстракции порошка плодов петролейным эфиром в течение 2 ч при 70°С и удалении растворителя с целью дальнейшей экстракции флавоноидов этанолом (70-95%об.) в соотношении сырье: экстрагент 1 г: 10-15 мл этанола ультразвуком при 50°С и очисткой с использованием комплексообразования (соль цинка) в слабо-щелочной среде при центрифугировании. Полученный осадок растворяли в этаноле (30-50%об.) с добавлением ЭДТА на водяной бане с температурой 40-60°С и фильтровали при пониженном давлении с целью высушивания конечного экстракта флавоноидов.

Недостатками описанного способа является использование токсичного экстрагента (петролейный эфир), длительность процесса и многостадийность.

Известен способ получения экстракта из плодов облепихи крушиновидной [CN 105456311 А], заключающийся в замачивании порошка высушенных плодов в воде (в соотношении 1:2-1:15) при 25°С в течение 1-10 ч, экстракции ультразвуком 10 мин-6 ч, фильтровании и четырехкратном повторении экстракции с дальнейшим объединением экстракта, его концентрированием и сушкой.

Недостатком описанного способа является длительность процесса.

Известен способ получения биологически активных веществ (в т.ч. флавоноидов) из семян и масла облепихи крушиновидной, с использованием непрерывной экстракции [CN105362310A], заключающийся в непрерывной экстракции этанолом (50-80%об.; в соотношении сырье: экстрагент 1: 5-30) облепихового масла в течение 5-40 минут, при температуре 20-50°С и частотой 30-80 кГц с целью получения неочищенного экстракта, который переводили в суспензию путем растворения экстракта в н-бутаноле или этилацетате. Суспензию экстрагировали 5-8 раз и выпаривали досуха с целью получения суммы флавоноидов из семян облепихи крушиновидной.

Недостатком описанного способа является длительность процесса, расход экстрагента, использование токсичных растворителей (н-бутанол).

Известен способ экстракции и количественного определения флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной [Ковалева Н.А., Тринеева О.В., Чувикова И.В., Сливкин А.И. Разработка и валидация методики количественного определения флавоноидов в листьях облепихи крушиновидной методом спектрофотометрии. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств, https://doi.org/10.30895/1991-2919-2023-531],

выбранный в качестве прототипа. Способ заключается в их экстрагировании при следующих условиях: экстрагент - спирт этиловый 70%; соотношение сырье : экстрагент - 1:150; степень измельчения - 0,5 мм; кратность экстракции - однократная; время экстракции - 45 мин. В связи с тем, что облепиха крушиновидная является источником получения облепихового масла, предложено выбрать рекомендуемый срок заготовки листьев, совпадающий со сбором плодов, так как листья на данном этапе роста и развития еще содержат достаточное количество флавоноидов (до 0,8%).

Недостатком описанного способа является длительность процесса, неполное истощение сырья, высокий расход ценного экстрагента (спирта этилового), низкий выход готового продукта.

Общим и существенным недостатком описанных способов [CN10536231 OA, CN1900098A, CN101439124A, CN102579516A, CN105456311A] является отсутствие применимости методик к экстракции флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной, а также удаление листьев (как примеси) при подготовке сырья к извлечению целевой группы БАВ.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа извлечения флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной с высокой степенью чистоты целевого продукта, в отсутствии использования опасных и токсичных веществ при сокращении времени извлечения, низких затратах экстрагента, а также использование той фенологической фазы вегетации растения - I фазы завязывания плодов, при которой выход целевого продукта максимален.

Поставленная задача в изобретении решена тем, что в способе получения флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной извлечение биологически активных веществ из сырья проводится четырехкратно 70% раствором спирта этилового в ультразвуковой ванне, что позволяет значительно ускорить процесс экстракции, а также увеличить выход флавоноидов из сырья; после чего проводят отделение растительного материала путем фильтрации через бумажный фильтр и отгон спирта этилового в выпарном аппарате при небольшом разряжении 10-30 мм рт.ст., высушивание осадка суммы флавоноидов при температуре 55±5°С.

Технический результат изобретения заключается в извлечении суммы флавоноидов со степенью чистоты 98,0±0,8% из культивируемого растительного сырья, а именно из листьев облепихи крушиновидной в фенологической фазе вегетации растения - завязывание плодов, при сокращении времени извлечения и при увеличении выхода целевого продукта до 1,8% флавоноидов в пересчете на лютеолин в абсолютно сухом сырье, значительном сокращении объемов расхода экстрагента (спирта этилового) в пересчете на единицу массы сырья, в отсутствии использования опасных и токсичных веществ, а также специфических ферментных препаратов.

Технический результат достигается тем, что в способе получения суммы флавоноидов из культивируемого растительного сырья, включающем измельчение до линейного размера 0,5 мм растительного сырья - листьев облепихи крушиновидной, высушенных воздушно-теневым способом до остаточной влажности не более 10%, заготовленных в фенологической фазе вегетации растения - завязывание плодов; экстрагирование суммы флавоноидов водным раствором этанола при концентрации этанола 70%об. из растительного сырья; отделение растительного материала фильтрованием; сушку, согласно изобретению, экстракцию ведут при соотношении сырье : 1 порция экстрагента, равном 1 г : 15 мл путем выдерживания колбы с сырьем и экстрагентом в ультразвуковой ванне при частоте ультразвука 30 кГц в течение 10 минут при температуре 80°С, после чего растительный материал отделяют фильтрованием осадка через предварительно высушенный беззольный бумажный фильтр под вакуумом при остаточном давлении 0,6-0,8 атм, фильтр с осадком высушивают при температуре от 55±5°С до постоянной массы, после чего экстрагирование и фильтрование с той же порцией сырья при последовательном использовании трех новых порций по 15 мл водного раствора спирта этилового с концентрацией этанола 70% об. повторяют трижды, а высушивание фильтра с осадком - дважды, четыре порции полученного экстракта объединяют, растворитель удаляют методом вакуумной отгонки в выпарном аппарате при разряжении 10-30 мм рт.ст., а затем осадок полученной суммы флавоноидов после отгонки растворителя высушивают при температуре 55±5°С до постоянной массы.

Определение суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин осуществляли методом спектрофотометрии при длине волны 402±2 нм. Выход суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в абсолютно сухом сырье - до 1,83%.

На фиг.1 представлены результаты выделения флавоноидов в пересчете на лютеолин (%) из листьев облепихи крушиновидной при варьировании соотношением сырья и экстрагента (фаза вегетации - I, степень измельчения -1,0 мм при трехкратной экстракции по 10 минут при частоте ультразвука 35 кГц с температурой ультразвуковой бани 80°С).

На фиг.2 представлены результаты выделения флавоноидов в пересчете на лютеолин (%) из листьев облепихи крушиновидной при варьировании степенью измельчения сырья (фаза вегетации -1, при трехкратной экстракции по 10 минут и частоте ультразвука 35 кГц с температурой бани 80°С и соотношением сырья и экстрагента 1 г на 15 мл).

На фиг.3 представлены результаты выделения флавоноидов в пересчете на лютеолин (%) из листьев облепихи крушиновидной при варьировании временем экстракции и частотой ультразвука (фаза вегетации - I, при трехкратной экстракции сырья измельченностью 0,5 мм с температурой бани 80°С и соотношением сырья и экстрагента 1 г на 15 мл).

На фиг.4 представлены результаты выделения флавоноидов в пересчете на лютеолин (%) из листьев облепихи крушиновидной при варьировании кратностью экстракции (фаза вегетации -1, при экстракции сырья по 10 минут, измельченностью 0,5 мм и частоте ультразвука 30 кГц с температурой бани 80°С и соотношением сырья и экстрагента 1 г на 15 мл).

На фиг.5 представлены результаты выделения флавоноидов в пересчете на лютеолин (%) из листьев облепихи крушиновидной при варьировании фазой вегетации листьев (при трехкратной экстракции сырья измельченностью 0,5 мм по 10 минут и частоте ультразвука 30 кГц с температурой бани 80°С и соотношением сырья и экстрагента 1 г на 15 мл).

Пример 1. Для получения суммы флавоноидов аналитическую пробу сырья (фаза I - завязывания плодов) - листья облепихи крушиновидной измельчают до частиц размера 0,5 мм. Около 1 г (точная навеска) высушенного воздушно-теневым способом до остаточной влажности не более 10% и измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 15 мл водного раствора спирта этилового с концентрацией этанола 70% об., помещают в ультразвуковую ванну с частотой 30 кГц при температуре 80°С, экстрагируют 10 минут. Растительный материал отделяют фильтрованием осадка под вакуумом при остаточном давлении 0,6-0,8 атм через предварительно высушенный беззольный бумажный фильтр, вложенный в стеклянную воронку диаметром 5 см, а затем фильтр с осадком высушивают при температуре от 55±5°С до постоянной массы. После чего экстракцию и фильтрование с той же порцией сырья при последовательном использовании трех новых порций по 15 мл водного раствора спирта этилового с концентрацией этанола 70% об. повторяют трижды. Стадию высушивания фильтра с осадком повторяют дважды, высушивание сырья после четвертого экстрагирования и фильтрования не требуется. Четыре полученные порции экстракта объединяют.Удаление растворителя осуществляют методом вакуумной отгонки в выпарном аппарате при небольшом разряжении 10-30 мм рт.ст. и высушиванием осадка суммы флавоноидов после отгонки растворителя при температуре 55±5°С. Определение суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин осуществляет методом спектрофотометрии при длине волны 402±2 нм.

Предлагаемый способ позволяет получить сумму флавоноидов из листьев облепихи крушиновидной со степенью чистоты 98,0±0,8% при выходе целевого продукта до 1,83% (в пересчете на лютеолин) в пересчете на абсолютно сухое сырье. Максимальный выход отмечен при выделении суммы флавоноидов из листьев, собранных в фазу завязывания плодов (фаза I).

Способ получения суммы флавоноидов из культивируемого растительного сырья, при котором используют растительное сырье в фенологической фазе вегетации растения - завязывании плодов, растительное сырье измельчают до линейного размера 0,5 мм, экстрагирование по 10 минут осуществляют спиртом этиловым 70% при соотношении сырье: 1 порция этилового спирта 1 г: 15 мл, при этом экстрагирование ведут путем выдерживания колбы с сырьем и экстрагентом в ультразвуковой ванне при частоте ультразвука 30 кГц при температуре 80°С; растительный материал отделяют фильтрованием осадка, фильтр с осадком высушивают при температуре 55±5°С до постоянной массы, после чего экстрагирование и фильтрование повторяют трижды, а высушивание фильтра с осадком - дважды, четыре порции полученного экстракта объединяют, растворитель удаляют методом вакуумной отгонки в выпарном аппарате при разряжении 10-30 мм рт.ст., а затем осадок полученной суммы флавоноидов после отгонки растворителя высушивают при температуре 55±5°С до постоянной массы. Технический результат изобретения заключается в извлечении суммы флавоноидов со степенью чистоты 98,0±0,8% из культивируемого растительного сырья в фенологической фазе вегетации растения - завязывании плодов, а именно из листьев облепихи крушиновидной, при сокращении времени извлечения и при увеличении выхода целевого продукта до 1,8% флавоноидов в пересчете на лютеолин в абсолютно сухом сырье, значительном сокращении объемов расхода экстрагента (спирта этилового) в пересчете на единицу массы сырья, в отсутствии использования опасных и токсичных веществ, а также специфических ферментных препаратов. 5 ил., 1 пр.

Способ получения суммы флавоноидов из культивируемого растительного сырья, включающий измельчение до линейного размера 0,5 мм растительного сырья - листьев облепихи крушиновидной, высушенных воздушно-теневым способом до остаточной влажности не более 10%, заготовленных в фенологической фазе вегетации растения - завязывание плодов; экстрагирование суммы флавоноидов водным раствором этанола при концентрации этанола 70%об. из растительного сырья; отделение растительного материала фильтрованием; сушку, отличающийся тем, что экстракцию ведут при соотношении сырье : 1 порция экстрагента, равном 1 г : 15 мл, путем выдерживания колбы с сырьем и экстрагентом в ультразвуковой ванне при частоте ультразвука 30 кГц в течение 10 минут при температуре 80°С, после чего растительный материал отделяют фильтрованием осадка через предварительно высушенный беззольный бумажный фильтр под вакуумом при остаточном давлении 0,6-0,8 атм, фильтр с осадком высушивают при температуре от 55±5°С до постоянной массы, после чего экстрагирование и фильтрование с той же порцией сырья при последовательном использовании трех новых порций по 15 мл водного раствора спирта этилового с концентрацией этанола 70% об. повторяют трижды, а высушивание фильтра с осадком - дважды, четыре порции полученного экстракта объединяют, растворитель удаляют методом вакуумной отгонки в выпарном аппарате при разряжении 10-30 мм рт.ст., а затем осадок полученной суммы флавоноидов после отгонки растворителя высушивают при температуре 55±5°С до постоянной массы.