СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ТКАНИ Российский патент 2024 года по МПК C07K1/12 C07K1/16 C12P21/06 A61K35/50 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к выделению эндогенных антимикробных пептидов из плацентарной ткани.

В настоящее время повсеместное распространение антибиотикорезистентности требует поиска и разработки новых противомикробных препаратов. С этой точки зрения дефензины представляют большой интерес. Дефензины обладают выраженной антимикробной активностью в отношении широкого спектра возбудителей [1]. Кроме того, дефензины позволяют усилить эффективность антибиотиков, уже используемых в медицинской практике Особый интерес для клиницистов представляют такие антимикробные пептиды (АМП), как β-дефензины, которые интенсивно экспрессируются в слизистых тканях, непрерывно контактируя с биопленками, содержащими сообщества микроорганизмов, в том числе антибиотикорезистентных. β-дефензины образуют первую линии защиты [2,3]. За последние годы появилось много публикаций о роли этих антимикробных пептидов (АМП) в патогенезе различных заболеваний пародонта, и о влиянии микробного сообщества на экспрессию бета-дефензинов. Более детальное изучение роли β-дефензинов в развитии воспалительных заболеваний позволит ответить на вопросы, почему и как прорывается естественный защитный барьер десны и возможно ли использовать β-дефензины в качестве альтернативы антибактериальным препаратам, к которым за последние годы выработалась устойчивость у бактерий [4]. Однако препятствием для широкого применения антимикробных пептидов является их дороговизна. Их нельзя пока что получать в больших масштабах как антибиотики. Стоимость лечения рекомбинантными антимикробными пептидами будет составлять примерно 6-7 тысяч рублей в день. В этой связи экономичные инновационные технологии получения эндогенных АМП из плацентарной ткани животного происхождения, являются наиболее востребованными в последнее время.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ выделения природных антимикробных пептидов из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови (Патент РФ №2729016 от 04.08.2020).

В данном способе проводят ферментативный гидролиз лейкоцитарно-эртроцитарно-тромбоцитарной массы с использованием 10 мл раствора трипсина на 100 мл гидролизуемой смеси в течение 1 часа в растворе «Версена». К полученному гидролизату добавляют 30 г сефадекса G-25, оставляют на 10 мин, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочный раствор удаляют, набухший гель эллюируют раствором «Версена», и заливают в разделительную колонку. Отбирают пробу с максимальным содержанием альфа-дефензина. Для определения концентрации альфа-дефензина в полученных образцах проб используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для построения калибровочной кривой используют стандарт рекомбинантных альфа-дефензинов из наборов Cloud-Clone Corp (США). Полученную фракцию стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. После вымывания раствором «Хэнкса» из разделительной колонки с Сефадексом G-25, из 100 мл гидролизата получают 200 мл фракции, содержащей альфа-дефензин с концентрацией 0, 3 мкг/мл.

Однако в данном способе выделения эндогенных антимикробных пептидов используется лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарная масса, в которой преимущественно содержатся альфа-дефензины и содержится недостаточное количество бета-дефензинов.

Поставлена задача оптимизации выделения более полной фракции эндогенных низкомолекулярных пептидов, содержащих альфа-дефензины, бета-дефензины, широкий комплекс антимикробных пептидов с повышенной биологической ценностью, снижение себестоимости получения комплекса антимикробных пептидов для дальнейшего создания фармацевтических композиций.

Поставленная задача достигается использованием измельченной гомогенизированной ткани плаценты животного происхождения, проведением трипсинизации и выделением АМП методом жидкостной хроматографии на разделительной колонке с использованием Сефадекса G-25. При этом низкомолекулярные пептиды проникают внутрь частиц Сефадекса G-25, а высокомолекулярные пептиды проходят мимо, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем различна для пептидов с разной молекулярной массой. Так, высокомолекулярные пептиды фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются в колонке и выходят в составе последней фракции гидролизата, содержащей бета-дефензины.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в дополнительном выделении эндогенного бета-дефензина, достигаемый использованием ферментативного гидролиза плацентарной ткани, центрифугированием его с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используют ткань плаценты, которую предварительно измельчают и гомогенизируют, проводят вирусинактивацию уксусной кислотой при уровне рН 5,0-5,5. Гидролизат плаценты получают ферментативным гидролизом с 2% раствором пепсина от исходного объема в течение 1 ч и с коррекцией среды раствором «Версена», осветляют гидролизат плаценты раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм. На гидролизованный гомогенат воздействуют ультразвуком. Выделение пептидов проводят методом жидкостной хроматографии на разделительной колонке с использованием Сефадекса G-25. При этом низкомолекулярные пептиды проникают внутрь частиц Сефадекса G-25, а высокомолекулярные пептиды проходят мимо, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем различна для пептидов с разной молекулярной массой. Так, высокомолекулярные пептиды фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются в колонке и выходят в составе последней фракции гидролизата, содержащей бета-дефензины.

Использование разделительной колонки позволяет получить фракцию с содержанием дефензина бета 1 - 77.095±6,4 (нг/мл), что увеличивает содержание дефензина бета 1 во фракции более чем в 10 раз по сравнению с прототипом. Определение содержания бета дефензина в гидролизате плаценты проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Из 10 г исходного сырья плацентарной ткани получают 500 мл фракции с концентрацией 77.095 (нг/мл).

На фигуре 1 представлен отчет по хроматограмме фракции бета-дефензинов, полученной из ткани плаценты, где по оси абсцисс - время измерения, в мин.; по оси ординат - оптическая плотность, (mAU).

В таблице №1 представлены пики фракций бета дефензинов, в таблице №2 - программа измерений фракций бета-дефензинов.

Использование выделенной фракции эндогенных дефензинов в составе антимикробных препаратов способствует эффективному лечению ран, ожогов и язв, инфицированных антибиотико-резистентной микрофлорой в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

Источники информации:

1. Wehkamp J. et al. Reduced Paneth cell alpha-defensins in ileal Crohn's disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Journal. - 2005. - Vol. 102, no. 50. - P. 18129-18134. - doi:10.1073/pnas.0505256102. -PMJ.D 16330776.

2. Craddock R.M., Huang J.T., Jackson E. et al. Increased alpha defensins as a blood marker for schizophrenia susceptibility // Mol. Cell Proteomics Journal. - 2008. - March (vol. 7). - P. 1204. - doi:10.1074/mcp.M700459-MCP200. - PMID 18349140.

3. Bolatchiev A., Baturin V., Bazikov I., Maltsev A., Kunitsina E. Effect of antimicrobial peptides HNP-1 and hBD-1 on Staphylococcus aureus strains in vitro and in vivo// Fundamental and Clinical Pharmacology. 2020; 34(1):102-108. doi: 10.1111/fcp.l2499.

4. Mtink C., Wei G., Yang O.O., Waring A.J., Wang W., Hong Т., Lehrer R.I., Landau N.R., Cole A.M. The theta-defensin, retrocyclin, inhibits HIV-1 entry // AIDS Res Hum Retroviruses. 2003; 19 (10): 875-81, PMID 14585219.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к способу выделения из плацентарной ткани фракции эндогенных бета-дефензинов. Способ выделения из плацентарной ткани фракции эндогенных бета-дефензинов, включающий измельчение, гомогенизацию, вирусинактивацию уксусной кислотой при рН 5,0-5,5, ферментативный гидролиз 2% раствором пепсина от исходного объема в течение 1 ч и с коррекцией среды раствором Версена, осветление гидролизата раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%, стерилизующую фильтрацию через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм, воздействие ультразвуком, жидкостную хроматографию с Сефадексом G-25, при этом получаемая фракция содержит дефензин бета 1 в количестве 77,095 нг/мл. Вышеуказанное изобретение позволяет извлечь фракцию эндогенных бета-дефензинов из плацентарной ткани, характеризующуюся содержанием дефензина бета 1 77,095 нг/мл. 1 ил., 2 табл.

Способ выделения из плацентарной ткани фракции эндогенных бета-дефензинов, включающий измельчение, гомогенизацию, вирусинактивацию уксусной кислотой при рН 5,0-5,5, ферментативный гидролиз 2% раствором пепсина от исходного объема в течение 1 ч и с коррекцией среды раствором Версена, осветление гидролизата раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%, стерилизующую фильтрацию через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм, воздействие ультразвуком, жидкостную хроматографию с Сефадексом G-25, при этом получаемая фракция содержит дефензин бета 1 в количестве 77,095 нг/мл.