ОПТИМИЗАЦИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ БЕТА-ДЕФЕНЗИНОВ Российский патент 2024 года по МПК C07K1/14 C07K1/16 C07K1/36 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к выделению эндогенных бета-дефензинов из плацентарной ткани.

Организм человека непрерывно контактирует с целым рядом непатогенных и патогенных микроорганизмов. В процессе эволюции сформировались механизмы защиты, позволяющие, сначала идентифицировать патоген, а затем, при необходимости, осуществлять адекватный контроль его дальнейшего проникновения и распространения. Выполнение данных задач реализуется посредством системы врожденного иммунитета, представителями которого являются эндогенные антимикробные пептиды человека, способные немедленно распознавать и уничтожать инфекционные агенты различной природы. Наиболее изученными являются дефензины, представляющие собой небольшие пептиды молекулярной массой ~4-6 кДа, имеющие положительный заряд и обладающие выраженной антимикробной активностью в отношении широкого спектра возбудителей [Базиков И.А. и соавт., 2022].

Для клиницистов важную роль играют бета-дефензины, которые интенсивно экспрессируются в тканях, контактируя с биопленками, содержащими антибиотико-резистентные микроорганизмы. Бета-дефензины находятся на первой линии защиты [Лебедева О.П. и соавт., 2015; Kamli M. et. al., 2022], что перспективно для их использования в качестве альтернативы антибиотикам, к которым за последние годы выработалась мультирезистентность у микроорганизмов [Inthanachai T. et al., 2021; Vylkova S. et al., 2007]. Стоимость лечения рекомбинантными антимикробными пептидами очень высокая, в этой связи, экономичные инновационные технологии получения бета-дефензинов из плацентарной ткани животного происхождения, являются перспективными.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является положительное решение на патент «Cпособ выделения эндогенных антимикробных пептидов из плацентарной ткани» (заявка № 2022108368 от 29.03.2022 г.).

В качестве сырья в этой методике используют ткань плаценты, которую предварительно измельчают, осветляют раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6% и гомогенизацией тремя этапами. На первом этапе проводят механическое измельчение с помощью диспергатора IKA T-25 и гомогенизатора US-4102 (Германия) до гомогенной массы. На втором этапе измельчают ткань с помощью ультразвукового гомогенизатора POLYTRON® PT 45-80 GT швейцарской компании «DONAU LAB ZURICH» путем уменьшения диаметра используемой насадки до 10 мм и увеличения скорости вращения до 2000 об/мин и времени до 30 минут при температуре 4°С. Это способствует лучшему разрушению ткани и клеток. На третьем этапе используют биологический гидролиз клеток ткани плаценты 2% раствором трипсина (ООО «Биолот» Сант-Петербург, Россия) на магнитной мешалке в течение 3 часов при температуре 18-20°С с коррекцией среды раствором «Версена». Затем осаждают неразрушенные ткани и клетки методом центрифугирования при 10000 g. Выделение пептидов проводят на разделительной колонке с использованием Сефадекса G-25. При этом низкомолекулярные пептиды проникают внутрь частиц Сефадекса G-25, а высокомолекулярные пептиды проходят мимо, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем различна для пептидов с разной молекулярной массой. Так, высокомолекулярные пептиды фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются в колонке и выходят в составе последней фракции гидролизата, содержащей альфа- и бета-дефензины. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм. Проводят вирусинактивацию уксусной кислотой при уровне pH 5,0-5,5.

Однако в данном способе выделения эндогенных антимикробных пептидов содержатся альфа- и бета-дефензины, в то время, как для клиницистов важную роль играют бета-дефензины, которые интенсивно экспрессируются в тканях, контактируя с биопленками, содержащими антибиотико-резистентные микроорганизмы.

Поставлена задача оптимизации выделения фракции эндогенных бета-дефензинов с повышенной биологической ценностью для дальнейшего создания фармацевтических композиций.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, достигается модификацией метода, основанном на предварительной ионизации Сефадекса G-25, что приводит к увеличению концентрации и чистоты выделяемой фракции бета-дефензинов.

Способ осуществляется следующим образом.

Ткань плаценты предварительно измельчается, осветляется раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6% и гомогенизацией тремя этапами. На первом этапе проводятся механическое измельчение с помощью диспергатора IKA T-25 и гомогенизатора US-4102 (Германия) до гомогенной массы. На втором этапе измельчается ткань с помощью ультразвукового гомогенизатора POLYTRON® PT 45-80 GT швейцарской компании «DONAU LAB ZURICH» путем уменьшения диаметра используемой насадки до 10 мм и увеличения скорости вращения до 2000 об/мин и времени до 30 минут при температуре 40° С. Это способствует лучшему разрушению ткани и клеток. На третьем этапе используется биологический гидролиз клеток ткани плаценты 2% раствором трипсина (ООО «Биолот» Сант-Петербург, Россия) на магнитной мешалке в течение 3 часов при температуре 18-20° С, с коррекцией среды раствором «Версена». Затем осаждают неразрушенные ткани и клетки методом центрифугирования при 10 000 g. Выделение пептидов проводится на разделительной колонке с использованием Сефадекса G-25. Гидролизат плаценты пропускается через разделительную колонку с краном и фильтром, изготовленном из стекла Симакс ЧСН ИСО 3585. Зная, что дефензины представляют собой катионные и богатые цистеином пептиды для увеличения их чистоты и количества в отбираемых фракциях, проводится предварительная ионизация Сефадекса G-25. Для этого на верхнем и нижнем слое Сефадекса G-25 помещаются пластины. К пластинам подводится постоянный электрический ток с помощью гальванизатора «Поток-1» (ЭМА, Россия) силой 5 мА на период прохождения гидролизата через слой. На поверхность фильтра наносится 5 г Сефадекса G-25. При этом низкомолекулярные пептиды проникают внутрь частиц Сефадекса G-25. В это время большие частицы и высокомолекулярные пептиды проходят мимо частиц Сефадекса G-25. Вследствие этого, скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем будет различной для пептидов, разной молекулярной массой. Так высокомолекулярные пептиды фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются в колонке и выходят в последней фракции гидролизата. Фракцию содержащую высокомолекулярные пептиды сливают. Низкомолекулярные пептиды, к которым относятся дефензины вымывают из частиц Сефадекса G-25 раствором Хэнкса. Это позволяет оптимизировать технологию выделения наиболее полной фракции, содержащих бета-дефензины.

Модификация метода и режимов выделения, основанная на предварительной ионизации Сефадекса G-25 приводит, к увеличению концентрации и чистоты выделяемой фракции бета дефензинов с 0,08 (мкг/мл) в прототипе до 0,625 (мкг/мл) в предлагаемой модифицированной методике, что продемонстрировано на хроматограмме (рисунок 1, таблица 1). Кроме того, пик выделенной фракции демонстрирует улучшение чистоты получаемых бета дефензинов.

В таблице 1 представлены расчеты концентраций бета-дефензинов по результатам хроматограммы в полученной фракции.

На рисунке 1 представлены отчёты по хроматограмме бета-дефензинов, где по оси абсцисс - время измерения, в мин.; по оси ординат - оптическая плотность, (mAU).

Таблица 1

Таблица пиков

Пик Время
(мин) Компонент Конц.
(мкг/мл) Высота Площадь Полуши-
рина 1 3.14 Бета- дефензины 0,625 195.251 3159.279 14.026

Использование выделенной фракции эндогенных бета-дефензинов в составе антимикробных препаратов способствует эффективному лечению ран, ожогов и язв, инфицированных антибиотико-резистентной микрофлорой в лечебно-профилактических учреждениях.

Источники информации:

1. Базиков И.А., Мальцев А.Н., Ефременко А.А., Рубайло М.В., Базиков Ф.И. «Лиофилизированное антимикробное средство на основе эндогенных дефензинов»// Бактериология,- 2021, том 6, №2, с. 23-26.

2. Лебедева О.П., Ивашова О.Н., Пахомов С.П., Чурносов М.И., Калуцкий П.В., Тафинцева Г.А., Тубольцева С.Л. Роль человеческих бета-дефензинов и секреторного ингибитора лейкоцитарных протеаз в формировании микробиоценоза женского репродуктивного тракта на поздних сроках беременности // Актуальные проблемы медицины. -2015. №4 (201).

3. Kamli M.R., Sabir J.S., Malik M.A., Ahmad A. Human β defensins-1, an antimicrobial peptide, kills Candida glabrata by generating oxidative stress and arresting the cell cycle in G0/G1 phase// Biomed Pharmacother. - 2022. Oct; 154:113569. doi: 10.1016.

4. Inthanachai T., Thammahong A., Edwards S., Virakul S., Kiatsurayanon C., Chiewchengchol Di. The Inhibitory Effect of Human Beta-defensin-3 on Candida Glabrata Isolated from Patients with Candidiasis// Immunol Invest. - 2021 Jan; 50 (1):80-91. doi: 10.1080/08820139.2020.1755307.

5. Vylkova S, Nayyar N, Li W, Edgerton M. Human beta-defensins kill Candida albicans in an energy-dependent and salt-sensitive manner without causing membrane disruption.// Antimicrob Agents Chemother. - 2007 Jan;51(1):154-61. doi: 10.1128/AAC.00478-06.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к выделению эндогенных бета-дефензинов из плацентарной ткани. Раскрыт способ выделения бета-дефензинов из клеток плацентарной ткани, включающий измельчение, осветление раствором перекиси водорода, гомогенизацию тремя этапами: механическим измельчением, ультразвуковым воздействием с диаметром используемой насадки 10 мм и увеличением скорости вращения до 2000 об/мин, времени до 30 минут при температуре 4°С, ферментативным гидролизом клеток ткани плаценты 2% раствором трипсина на магнитной мешалке, коррекцией среды раствором «Версена», осаждения клеток методом центрифугирования при 10 000 g, выделение пептидов на разделительной колонке, с предварительной ионизацией Сефадекса G-25 пропусканием через пластины постоянного электрического тока силой 5 мА при прохождении гидролизата через слой Сефадекса G-25, с последующим вымыванием бета-дефензинов из частиц Сефадекса G-25 раствором холодного раствора Хэнкса, стерилизующей фильтрацией через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм и вирусинактивацией уксусной кислотой. Изобретение обеспечивает оптимизацию выделения фракции эндогенных бета-дефензинов с повышенной биологической ценностью для дальнейшего создания фармацевтических композиций. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ выделения бета-дефензинов из клеток плацентарной ткани, включающий измельчение, осветление раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%, гомогенизацию тремя этапами: механическим измельчением, ультразвуковым воздействием с диаметром используемой насадки 10 мм и увеличением скорости вращения до 2000 об/мин, времени до 30 минут при температуре 4°С, ферментативным гидролизом клеток ткани плаценты 2% раствором трипсина на магнитной мешалке в течение 3 часов при температуре 18-20°С, коррекцией среды раствором «Версена», осаждения клеток методом центрифугирования при 10 000 g, выделение пептидов на разделительной колонке, отличающийся предварительной ионизацией Сефадекса G-25 пропусканием через пластины постоянного электрического тока с помощью гальванизатора «Поток-1» (ЭМА, Россия), силой 5 мА при прохождении гидролизата через слой Сефадекса G-25, с последующим вымыванием бета-дефензинов из частиц Сефадекса G-25 раствором холодного 40°С раствора Хэнкса, стерилизующей фильтрацией через мелкопористые фильтры, с диаметром пор 0,2 мкм и вирусинактивацией уксусной кислотой при уровне pH 5,0-5,5.