Ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак Российский патент 2024 года по МПК A61K39/12 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, разработке ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак.

Основной целью улучшения качества жизни собак, а также использования их как в хозяйственных целях, так и в качестве компаньонов для человека, является специфическая профилактика. Экономически выгоднее профилактировать болезнь, чем лечить ее. Наиболее распространенными, контагиозными и опасными для жизни собак являются такие вирусные болезни, как: чума плотоядных, парвовирусный энтерит, коронавирусный энтерит, аденовирусные инфекции (инфекционный ларинготрахеит, инфекционный гепатит) и бешенство.

В настоящее время спектр вакцин против данных болезней достаточно разнообразен и представлен преимущественно препаратами, импортируемыми в РФ. Разработаны моно- и поливалентные, а также ассоциированные и смешанные (против вирусных и бактериальных инфекций) вакцины, содержащие живые и инактивированные вирусы.

При разработке вакцин особое внимание уделяют безопасности готовой продукции и напряженности иммунитета. Для формирования более напряженного и продолжительного иммунитета у вакцинированных животных в качестве неспецифических стимуляторов иммуногенеза используют широкий спектр адъювантов, в частности, гель гидроокиси алюминия (ГОА) - при изготовлении сорбированных вакцин, масляные адъюванты - при производстве эмульсионных препаратов [1, 2, 3]. Для собак наиболее распространены сорбированные вакцины; вакцины с использованием масляных адъювантов не применяются по причине их высокой реактогенности.

По данным Центра Ветеринарии, за 2021-2022 гг. эпизоотическая ситуация по вирусным болезням собак на территории РФ выглядит следующим образом: лидирующее место занимает парвовирусный энтерит - его регистрировали в 30% случаях, на втором месте аденовирусная инфекция 2 серотипа - 23%, на третьем месте чума плотоядных - 16%, коронавирусный энтерит - 12% и бешенство - 11%, аденовирусная инфекция 1 серотипа - 8%.

Вышеуказанные вирусные болезни не имеют породной и возрастной предрасположенности, но летальность от данных инфекций выше у молодняка (до 100%). Сезонность выражена неярко: например, пик заболевания парвовирусным энтеритом собак приходится на весну и осень. Также на период гона приходится пик аденовирусных инфекций из-за увеличения числа контактов домашних животных и распространения бессимптомного носительства у диких животных, например лис. Большая часть болезней являются высококонтагиозными [4, 5].

Парвовирусный энтерит, если не оказать немедленную помощь собаке, может привести к летальному исходу в 91% случаев у щенков и мелких декоративных пород собак. Чума плотоядных характеризуется длительным инкубационным периодом, для которого характерно вирусовыделение, и, вследствие этого, вирус может широко распространяться среди поголовья собак. Инфекционный ларинготрахеит, вызываемый аденовирусом 2-го серотипа, поражает собак любого возраста и может вызывать тяжелые поражения респираторного тракта, в отсутствие лечения приводящие к гибели животного. Коронавирусный энтерит наиболее опасен для собак в первые месяцы жизни [6, 7, 8, 9]. Бешенство является неизлечимой болезнью, животные подлежат обязательной вакцинации согласно Приказу Министерства сельского хозяйства от 25.11.2020 г. №705 «Об утверждении Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства».

Применение ассоциированных вакцин позволяет снизить стрессовые ситуации у вакцинируемых животных, создать напряженный иммунитет в сжатые сроки и уменьшить трудозатраты [2]. Применение инактивированных вакцин исключает вирусовыделение, которое характерно при применении вакцин, содержащих живые аттенуированные вирусы. Доказано, что вирус парвовирусного энтерита собак в течение длительного времени выделяется из организма животного и может послужить причиной заболевания не иммунных собак.

Чума плотоядных (canine distemper virus, CDV, собачий морбилливирус) - чрезвычайно заразное заболевание, вызываемое вирусом чумы плотоядных животных, поражающее виды животных отряда плотоядных (псовые, енотовые и др., в т.ч. панды, а также некоторых представителей семейства кошачьих. Политропен, приводит к системной инфекции, поражающей практически все системы организма. Возбудителем является РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae, род Morbillivirus, вид Canine morbillivirus. Вирионы плеоморфные, преимущественно округлые, шарообразные, размером около 150 нм, представлены несегментированной одноцепочечной отрицательной РНК. Внутренняя часть вириона представляет собой спиральный рибонуклеопротеид, окруженный шарообразной оболочкой с шипообразными гемагглютинином и фосфопротеином. Иммунобиологически CDV однороден [10, 11].

CDV устойчив к факторам внешней среды: в диапазоне УФ-лучей солнца активен 10-14 ч, в органах трупов при t -20°С активен до 6 мес, в крови - до 3 мес. Естественные истечения, выделяемые животными-носителями вируса при температуре 4°С представляют опасность для других животных в течение 7-11 дней. При 100°С инактивируется за 1-2 секунды [12].

Исследования показывают, что штаммы CDV достаточно однородны, но имеют различную патогенность для видов животных. Выявлено множество клинических форм течения болезни, возникающие вследствие политропности вируса. Это создает дополнительные сложности при диагностике чумы плотоядных, замедляя процесс постановки диагноза и оказания ветеринарной помощи [11].

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса чумы плотоядных, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «Onderstepoort» [13];

- штамм «Snyder Hill» [14];

- штамм «ВА5» [15];

- штамм «№37» [16];

- штамм «CDVU39»[17];

- штамм «ЭПММ» [18];

- штамм «ВНИИВВиМ-88» [19];

- штамм «Владимир 18-ДЕП» [20];

- штамм «ЭПМ» [21];

- штамм «ГКВ №2313» [22];

- штамм «Рокборн» [23, 56].

Штамм «№37» входит в вакцины серии «Мультикан», производитель ООО «Ветбиохим», Россия. Штаммы «Onderstepoort», «Snyder Hill», «ВА5» и «CDVU 39» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость и труднодоступны на данный момент. Штаммы «ЭГТММ», «ВНИИВВиМ-88», «Владимир 18-ДЕП», «ЭПМ» и «ГКВ №2313» включены в патенты, но на данный момент не входят в состав вакцин, доступных к приобретению. Штамм «Рокборн» использовался при изготовлении сухой моновалентной вакцины «Вакчум» и вакцины «Дипентавак».

Парвовирусный энтерит собак (canine parvovirus-2, CPV-2) - основная причина летальности собак среди вирусных болезней, чрезвычайно заразен. Вирус обладает тропизмом к клеточным криптам и органам лимфатической системы. Клинические признаки в основном представлены острым гастроэнтеритом, отслоением слизистой оболочки толстого кишечника (вследствие этого - яркое проявление геморрагического воспаления кишечника на всем протяжении), геморрагической диареей, эксикозом, лейкопенией и нейтропенией. Вирус семейства Parvoviridae, рода Protoparvovirus, вида Protoparvovirus carnivoran 1. Размер вириона около 25 нм, состав - сферический капсид из 3 белков и линейной одноцепочечной ДНК. Ранее считалось, что CPV-2 и CnMV (вирус минутной болезни собак) генетически родственны, в настоящее время доказано, что они не связаны друг с другом. Парвовирус собак включен в вид вируса панлейкопении кошек наряду с вирусом энтерита норок и парвовирусом енотов. Возбудитель CPV-2 обладает высокой устойчивостью к факторам в внешней среды: рН, температуры, обработке трипсином и большинству дезинфицирующих средств. Могут быть инактивированы формалином, бета-пропиолактоном и УФ-облучением при длительном воздействии [11].

В настоящее время парвовирусный энтерит собак входит в группу пяти наиболее распространенных в России и мире инфекционных болезней собак [24].

Необходимо отметить, что гастроэнтериты вирусной природы у собак может вызывать не только CPV-2, но и другие факторы: вирус коронавирусного энтерита собак, морбилливирус плотоядных, вирус аденовирусной инфекции собак 1 серотипа, бактериальные инфекции и др. [10, 39].

В разной степени подтверждена антигенная общность всех вирусов семейства Parvoviridae: вирусов, поражающих животных семейств псовых и кошачьих, а также свиных, мышиных, куньих и человека. Вследствие данной антигенной общности носительство и заболевание парвовирусами животных несет опасность для человека [11, 25, 26].

CPV-2 не вызывает ЦПД в культурах клеток, обладает способностью агглютинировать эритроциты свиньи. В организме провоцирует возникновение комплементсвязывающих, вируснейтрализующих и антигемагглютинирующих антител, выявляемых через 5-7-й день после заражения и формирующие слабый иммунитет к данному вирусу в течение 1-2 лет [26].

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса парвовирусного энтерита собак, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «NL-35-D» [14];

- штамм «С154» [13];

- штамм «CAG» [15];

- штамм «№23» [16];

- штамм «CPV OP - 1/81» [17];

- штамм «№ R-72 ВНИИЗЖ» [27];

- штамм «Геркулес 28» [28];

- штамм «Риэль» [29];

- штамм «R-72» [30];

- штамм «D-1» [56];

- штамм «ГКВ №2312» [22];

Штамм «№23» входит в вакцины серии «Мультикан», производитель ООО «Ветбиохим», Россия. Штаммы «NL-35-D», «154», «CAG» и «CPV OP - 1/81» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость и труднодоступны на данный момент. Штаммы «№ R-72 ВНИИЗЖ», «Геркулес 28», «Риэль», «R-72» и «ГКВ №2312» включены в патенты, но на данный момент не входят в состав вакцин, доступных к приобретению.

Коронавирусный энтерит собак (canine coronavirus, CCoV) - достаточно контагиозная болезнь собак, случаи заболевания регистрируются на территории России и во всем мире. В РФ был впервые выделен и охарактеризован в 1997 г. Ольшанской А.А. и др. [6, 8]. Видоспецифичен, т.е. представляет опасность для семейства псовых. У заболевания отсутствует возрастная и породная предрасположенность. Наиболее яркие проявления и высокий риск заражения регистрируются у собак до 5 мес., особенно в питомниках.

Клиническая картина парвовирусного и коронавирусного энтеритов собак сходна. Преимущественно коронавирусный энтерит собак не проявляется какими-либо клиническими признаками при отсутствии осложняющих факторов. При одновременном заражении организма вирусами CPV-2 и CCoV течение болезни осложняется. К факторам, ухудшающим прогноз для собак вплоть до неблагоприятного, относятся сопутствующие заболевания как бактериальной, так и незаразной природы, а также наличие паразитарных инфекций.

Вирус относится к семейству Coronaviridae, роду Alphacoronavirus, виду Alphacoronavirus 1. Антигенно родственен вирусам семейства кошачьих и свиных. При попадании в организм возбудителя представителей данных семейств клинических признаков не наблюдается, но встречается вирусоносительство [31].

Поскольку коронавирусный энтерит собак является весьма заразной инфекцией, лучшей профилактикой является своевременная вакцинация. Антиген CCoV включен не во все доступные вакцины.

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса коронавирусного энтерита собак, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данной болезни:

- штамм «NL-18» [18];

- штамм «TN 449» [14];

- штамм «Карат» [17];

- штамм «49» [16];

- штамм «ГКВ №2314» [22].

Штаммы «NL-18» и «TN 449» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость. Штамм «Карат» для производства вакцины репродуцируется в первично-трипсинизированной культуре клеток почки щенка, что влечет за собой постоянную потребность в органах животных для изготовления вакцины. Штамм «ГКВ №2314» описан в патенте, но на данный момент не входит в состав вакцин, доступных к приобретению.

Инфекционный ларинготрахеит - болезнь, возникающая вследствие заражения организма животного аденовирусом собак серотипа 2 (canine adenovirus serotype 2, CAV-2) вызывает транзиторную и бессимптомную или легкую форму респираторного заболевания и остается ограниченным верхними дыхательными путями, вызывая ларинготрахеит, в присутствии других патогенов или у животных с ослабленным иммунитетом может вызвать тяжелый некротизирующий бронхит и интерстициальную пневмонию [25, 32]; CAV-2 также связан с летальными случаями диареи [33] и проявлением симптомов, характерных для поражения ЦНС, у собак [11]. ДНК-содержащий вирус относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine mastadenovirus А, серотипу 2.

Штаммы, выделенные на территории РФ, антигенно родственны. Антигенного родства вируса CAV-2 с аденовирусом человека не обнаружено. Штаммы вируса, выделенные от песцов и лисиц, идентичны штаммам вируса CAV-2 по антигенным свойствам. Вирус содержит преципитирующий, гемагглютинирующий и комплементсвязывающий антигены и индуцирует образование соответствующих антител. Большинство эпизоотических штаммов вируса CAV-2 агглютинируют эритроциты цыплят, человека (О-типа) и белых крыс, но не агглютинируют эритроциты мышей, гусей, голубей, уток, крупного рогатого скота, овец, свиней и т.д. [34].

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «Mahattan LPV 3» [13];

- штамм «V 197» [14];

- штамм «DK 13» [15];

- штамм «№46» [16];

- штамм «CAV-2» [17];

- штамм «ГКВ №2311» [22];

- штамм «LT» [56];

- штамм «Ада» [35].

Штамм «№46» входит в вакцины серии «Мультикан», производитель ООО «Ветбиохим», штамм «LT» аденовируса 2 серотипа используется при производстве вакцины «Дипентавак» - ЗАО Фирма НПВиЗЦ «Ветзвероцентр», Россия. Штаммы «Mahattan LPV 3», «V 197 серотип 2», «DK 13» и «CAV-2» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость и труднодоступны на данный момент. Штаммы «ГКВ №2311» и «Ада» включены в патенты, но на данный момент не входят в состав вакцин, доступных к приобретению.

Бешенство - широко распространенное вирусное заболевание теплокровных животных и человека, протекающее с тяжелым поражением нервной системы и, как правило, заканчивающееся летальным исходом [36, 37]. Лечение данной болезни не разработано. Классический вирус бешенства, RabV, является РНК-вирус с отрицательной цепью рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae [38, 39]. Вирионы рабдовируса, как и другие вирусы с отрицательной РНК, состоят из высокостабильного и организованного комплекса геномной РНК и нуклеопротеина, содержащихся в липидной оболочке, полученной из мембраны клетки-хозяина [40, 41, 42]. RabV - самый известный представитель рода Lyssavirus, имеющий глобальное распространение и долгую историю изучения.

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса бешенства, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «Пастер-РИВ» [13];

- штамм «СЕ 52» [43];

- штамм «Vnukovo-32» [17, 56];

- штамм «ERA-CB-20M» [16];

- штамм «G52» [15];

- штамм «Щелково-51» [45];

- штамм «овечий» ВГНКИ [46];

- штамм «ТС-80» [47];

- штамм «Ера» [22];

- штамм «РВ-97» [48];

Штамм «ERA-CB-20M» входит в вакцины серии «Мультикан», производитель ООО «Ветбиохим», штамм «Внуково-32» вируса бешенства используется при производстве вакцины «Дипентавак» - ЗАО Фирма НГТВиЗЦ «Ветзвероцентр», Россия. Штаммы «Пастер-РИВ», «СЕ 52», «Vnukovo-32» и «G52» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость и труднодоступны на данный момент. Штаммы «Щёлково-51», «овечий» ВГНКИ, «ТС-80», «Ера» и «РВ-97» включены в патенты, но на данный момент не входят в состав вакцин для собак, доступных к приобретению.

К настоящему времени известно множество ассоциированных вакцин российского и зарубежного производства различной валентности против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции собак 2 серотипа и бешенства собак. На данный момент многие вакцины недоступны к приобретению.

Из российских моно- или поливалентных вакцин на рынке предлагается: Серия «Биовак», производитель Общество с ограниченной ответственностью «Биоцентр».

• «Биовак D» - компонент против чумы плотоядных.

• «Биовак РА» - комплекс компонентов против парвовирусного энтерита, гепатита, аденовирусной инфекции.

• «Биовак DPA» - содержит комплекс компонентов против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, гепатита, аденовирусной инфекции.

• «Биовак DPAL» - комплекс против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, гепатита, аденовирусной инфекции и лептоспироза.

Серия «Мультикан», производитель «Нарвак»:

• «Мультикан-1» - вакцина против чумы плотоядных.

• «Мультикан-2» - вакцина против парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций собак.

• «Мультикан-4» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного и коронавирусного энтеритов собак.

• «Мультикан-6» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусной инфекции, парвовирусного и коронавирусного энтеритов и лептоспироза.

• «Мультикан-7» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусной инфекции типа 2, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, лептоспироза и дерматофитозов (трихофитии и микроспории).

• «Мультикан-8» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусной инфекции типа 2, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, лептоспироза (3 штамма лептоспир) и бешенства.

Производитель ООО «Ветбиохим» выпускает серию вакцин:

• «Астерион PHPPiLR» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного энтерита, парагриппа, лептоспироза и бешенства собак.

• «Астерион PHPPiL» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного энтерита, парагриппа и лептоспироза собак.

• «Астерион PHPPiR» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного энтерита, парагриппа и бешенства собак.

• «Астерион DDHPPi» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного энтерита, парагриппа собак.

• «Астерион DP» - вакцина против чумы плотоядных и парвовирусного энтерита.

Производитель ФКП Щелковский биокомбинат:

• Моновалентная вакцина антирабическая инактивированная сухая культуральная из штамма «Щелково-51» для собак и кошек (Рабикан).

Наиболее близкими по составу антигенов вирусов инфекционных болезней являются следующие вакцины российского производства:

• Вакцина «Мультикан-8» - против чумы плотоядных, аденовируса 2-го серотипа, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, инактивированных производственных штаммов вируса бешенства и лептоспир серогрупп Icterohaemorrhagiae, Canicola и Gryppotyphosa. Вакцина состоит из лиофилизированного и жидкого компонентов:

- лиофилизированный компонент (живая вакцина) изготовлен из аттенуированных производственных штаммов вируса чумы собак, аденовируса собак типа 2, парвовируса и коронавируса собак;

- жидкий компонент (инактивированная вакцина) - изготовлен из производственных инактивированных штаммов лептоспир серогрупп Icterohaemorrhagiae, Canicola, Grippotyphosa, инактивированного штамма вируса бешенства с адъювантом. Жидкий компонент является растворителем лиофилизированного компонента вакцины.

• «Астерион PHPPiR» - вакцина против чумы плотоядных, аденовирусных инфекций, парвовирусного энтерита, парагриппа и бешенства собак.

Вакцина состоит из двух компонентов: лиофилизированного (сухая однородная мелкопористая масса желто-розового цвета), изготовленного из аттенуированных штаммов вируса чумы собак, аденовируса собак типа 2, парвовируса и парагриппа собак; жидкого (гомогенная суспензия розового цвета с осадком), изготовленного из инактивированного штамма вируса бешенства и адъюванта. Жидкий компонент является растворителем лиофилизированного.

• Вакцина «Дипентавак» против против бешенства, чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита, аденовироза и лептоспироза собак (организация-разработчик: ЗАО Фирма НПВиЗЦ «Ветзвероцентр», г. Москва). Лекарственная форма представлена сухим компонентом «Дивак» - лиофилизированная масса и жидким компонентом «Пентавак» - суспензия для инъекций (растворитель для сухого компонента) [56].

Сухой компонент - «Дивак» изготовлен из живого аттенуированного вируса чумы плотоядных, штамм «Рокборн», и инактивированного УФ-лучами вируса бешенства, штамм «Внуково-32», лиофилизированных с добавлением в качестве стабилизатора смеси желатина и сахарозы 4% от общего объема.

Жидкий компонент - «Пентавак» изготовлен из парвовируса собак, штамм «D-1», аденовируса собак второго серотипа штамм «LT» и лептоспир серогрупп Icterohaemorrhagiae (штамм «ВГНКИ-2») и Canicola (штамм «ВГНКИ-3»), инактивированных формалином (в концентрации 0,3%) с добавлением в качестве адъюванта 3% геля гидроокиси алюминия (в концентрации 10%). Ингибирующее действие остаточного формальдегида на живой вирус чумы отсутствует.

Недостатком данных вакцин является увеличенный объем вводимого препарата - 2 см³, что создает дополнительные трудности: крупным собакам вводят полную дозу внутримышечно, а мелким собакам вводят дозы, что вызывает вопросы о количестве вводимого антигена и впоследствии уровня антител у собак. Также объем 2 см³ потенциально может провоцировать дополнительную реактогенность в месте введения. В вакцине «Астерион PHPPiR» отсутствует компонент CCoV.

Серия «Nobivac» / «Нобивак» (производитель Интервет Интернешнл Б.А., Нидерланды):

• Вакцина против чумы плотоядных, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита («Nobivac DHP»).

• Вакцина против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, парвовирусного энтерита и парагриппа («Nobivac DHPPi»).

• Вакцина для щенков с 4-6-недельного возраста, «Nobivac Parvo-С» (против парвовирусного энтерита) или «Nobivac Puppy DP» (против чумы плотоядных и парвовирусного энтерита).

• Вакцина против бешенства и лептоспироза «Nobivac RL» / «Нобивак RL».

• Вакцина против бешенства «Nobivac R» / «Нобивак R».

Серия вакцин Vanguard / «Вангард» (производитель США, ZOETIS Inc.):

• «Vanguard 5/L» / «Вангард 5/Л» - вакцина против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции, парагриппа и лептоспироза.

• «Vanguard 7» / «Вангард 7» - вакцина против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, аденовирусной инфекции, парагриппа, парвовирусного энтерита; лептоспироза.

• По данным производителя, указанные вакцины допустимо применять с моновалентной вакциной «Рабизин» производителя Boehringer Ingelheim Promeco S.A. de C.V., Франция [44].

Серия вакцин, выпускаемая фирмой Мериаль, Франция:

• «Eurican DHPPI2-L» / «Эурикан DHPPI2-L» - вакцина против аденовирусной инфекции, лептоспироза, парагриппа, парвовирусного энтерита, чумы плотоядных.

• «Eurican DHPPI2-RL» / «Эурикан DHPPI2-RL» - вакцина против аденовирусной инфекции, лептоспироза, парагриппа, парвовирусного энтерита, чумы плотоядных, бешенства.

Серия вакцин, выпускаемых фирмой «Биовета», Чехия:

• Биокан DHPPI+LR - вакцина против чумы плотоядных, аденовироза, инфекционного гепатита, парвовирусного энтерита, парагриппа, лептоспироза и бешенства.

Сведений о входящих в состав штаммов вирусов в импортных вакцинах в литературе нет.

Для профилактики чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, инфекционного ларинготрахеита (аденовирусной инфекции 2 серотипа) и бешенства собак используют как живые, так и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины, полученные как на основе первичных, так и перевиваемых культур клеток.

Из иностранных вакцин наиболее близкими по составу вирусов являются «Эурикан DHPPI2-LR» и «Биокан DHPPi+LR».

В состав вакцины «Эурикан DHPPI2-LR» входят штаммы вирусов аденовирусной инфекции, лептоспироза, парагриппа, парвовирусного энтерита, чумы плотоядных, бешенства.

В состав вакцины «Биокан DHPPi+LR» входят штаммы вирусов аденовирусной инфекции, лептоспироза, парагриппа, парвовирусного энтерита, чумы плотоядных, бешенства.

В состав вакцины «Нобивак DHPPi» входят штаммы вирусов инфекционного гепатита, парагриппа, парвовирусного энтерита, чумы плотоядных. Производитель предлагает отдельно приобретать компонент «Нобивак LR» против бешенства и лептоспироза или «Нобивак R» против бешенства, что влечет за собой дополнительные экономические затраты и дополнительные затруднения по приобретению компонентов.

Существенным недостатком упомянутых вакцин зарубежного производства является то, что они не создают иммунитета против коронавирусного энтерита собак ввиду отсутствия в составе данного антигена, что требует дополнительного применения моновакцин.

В настоящий момент вакцины, доступные к приобретению, как отечественного, так и зарубежного производства являются комбинированными ассоциированными. Антигены, входящие в их состав, представлены живыми аттенуированными и/или инактивированными. Вследствие того, что на территории РФ не проводится рутинный мониторинг циркулирующих штаммов вирусов собак, возникает вопрос об актуальности используемых в вакцинах штаммов. Различия в антигенном составе штаммов вирусов, применяемых для изготовления вакцин и циркулирующих на территории РФ и других стран могут стать причиной недостаточной противоэпизоотической эффективности вакцин.

В связи с этим задачей изобретения является создание безопасной и высокоиммуногенной вакцины против основных инфекционных болезней собак, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные антигены, обеспечивающих формирование устойчивого иммунитета по отношению к вирусу чумы плотоядных (CDV), аденовирусу (CAV-2) инфекционному ларинготрахеиту, парвовирусному (CPV-2) и коронавирусному энтеритам собак (CCoV) и бешенству (RabV).

В предлагаемой вакцине «Карникан-5К» предлагается комбинация антигенов, актуальных в настоящий момент в РФ, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета к CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2, RabV.

Ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «KapHHKaH-5R» в РФ не зарегистрировано, несмотря на то, что данные болезни являются для собак высококонтагиозными, приводящими к гибели.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, в частности, компонентов, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала ассоциированных вакцин против основных возбудителей инфекционных болезней собак, в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности вакцины, а также в усилении напряженности иммунитета у вакцинированных животных за счет получения компонентов вакцины с полным спектром антигенов.

Технический результат изобретения достигается путем использования в составе вакцины новых производственных штаммов вируса коронавирусной инфекции собак и аденовируса собак 2 серотипа (инфекционного ларинготрахеита), известных штаммов парвовирусного энтерита собак, вируса чумы плотоядных, вируса бешенства с высокой антигенной и иммуногенной активностью, и образования синергетической композиции поливалентной ассоциированной вакцины при объединении антигенов вирусов новых производственных штаммов с известными вакцинными штаммами.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-51Ъ>, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Сущность изобретения заключается в следующем: предлагаемая ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-511» содержит в качестве активного вещества смесь из аттенуированного антигенного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных; инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Грей» парвовирусного энтерита собак; инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Рич» коронавирусного энтерита собак; инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Юнити» аденовирусной инфекции (инфекционного ларинготрахеита) 2 серотипа собак; инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства, взятых в эффективных количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме собаки после введения ей целевого препарата. В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит в качестве адъюванта гидроокись алюминия (производство «ВНИИЗЖ») и стабилизирующую среду.

В предлагаемой вакцине активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении: для жидкого компонента, об.%: 90,0÷10,0. Для лиофилизированного компонента - активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении, об.%: 80,0÷20,0. Жидкий компонент и лиофилизированный компонент смешиваются в соотношении 1:1 и не должны использоваться отдельно друг от друга.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина ассоциированная против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5Я».

2. Активное вещество в виде смеси из:

a. лиофильно высушенного живого аттенуированного антигенного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных, вида Canine morbillivirus, депозитарий Всероссийская государственная коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №28 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;

b. инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак, вида Carnivore protoparvovirus 1, депозитор ФГБУ «Всероссийский центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером: №27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;

c. инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, вида Alphacoronavirus 1, депозитарий Всероссийская государственная коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №376 - деп / 22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;

d. инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Юнити» 2 серотипа вируса аденовирусной инфекции (инфекционного ларинготрахеита) собак вида Canine mastadenovirus А, серотип 2, депозитарий Всероссийская государственная коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №456 - деп / 23-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;

e. инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» фиксированного вируса бешенства вида Lyssavirus rabies, депозитарий Всероссийская государственная коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: «ВНИИЗЖ»-ДЕП фиксированного вируса бешенства.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь из инактивированных очищенных антигенных материалов из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита, штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита и штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2-го серотипа, штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства, и аттенуированного лиофилизированного вирусного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (CDV), полученный в перевиваемой культуре клеток Vero, в эффективном количестве.

2. Антигенный материал из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (CDV), полученный в перевиваемой культуре клеток Vero, представляющий собой аттенуированную лиофилизированную вирусную суспензию с инфекционной активностью 3,67±0,14 lg ТЦД₅₀/см³ в количестве 80,0 об.%.

3. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, в эффективном количестве.

4. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с гемагглютинирующей активностью 9,0±0,0 log₂ HA, количестве 22,5 об.%.

5. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак (CCoV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в эффективном количестве.

6. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак (CCoV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 3,43±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

7. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2-го серотипа (CAV-2), полученный в перевиваемой культуре клеток MDCK, в эффективном количестве.

8. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2-го серотипа (CAV-2), полученный в перевиваемой культуре клеток MDCK, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 3,57±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

9. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства (RabV), полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в эффективном количестве.

10. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства (RabV), полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 7,0 lg ККИД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

11. Из целевых добавок вакцина содержит гидроокись алюминия.

12. 3%-ный гель гидроокиси алюминия.

13. Вакцина содержит 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 10,0 об.%.

14. Дополнительно из целевых добавок вакцина содержит стабилизирующую среду.

15. Стабилизирующая среда состоит из: гидролизата лактальбумина (ГЛА) - 9,0%, сахарозы - 9,0%, желатозы - 2,0%.

16. Вакцина содержит стабилизирующую среду: гидролизат лактальбумина (ГЛА) - 9,0%, сахароза - 9,0%, желатоза - 2,0%, в количестве 20,0 об.%.

17. Смесь из инактивированных и очищенных антигенных материалов из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак, из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции 2-го серотипа, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства; лиофилизированного аттенуированного антигенного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных и целевые добавки: стабилизирующую среду и адъювант гидроокись алюминия в количестве, об.%:

Лиофилизированный (аттенуированный) компонент:

- Лиофилизированный антигенный материал из аттенуированного штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных 80,0 - Стабилизирующая среда 20,0

Жидкий (инактивированный) компонент:

- Антигенный материал из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак 22,5 - Антигенный материал из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак 22,5 - Антигенный материал из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции 2-го серотипа 22,5 - Антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства 22,5 - Адъювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия 10,0

Адъювант в составе вакцины усиливает воздействие фармацевтической субстанции (антигенов) на иммунную систему вакцинируемых животных, инициируя каскад иммунных реакций и обеспечивая выработку напряженного иммунитета.

Активным веществом в лиофилизированном компоненте вакцины является аттенуированный штамм «Рокборн» вируса чумы плотоядных. Для сохранения поддержания жизнеспособности и сохранения иммунобиологических свойств штамма в лиофилизированный компонент включена стабилизирующая среда, состоящая из гидролизата лактальбумина, сахарозы и желатозы, которая обеспечивает стабильность препарата на протяжении срока годности.

В результате проведенных исследований авторы определили важнейшие технологические показатели, позволившие создать препарат, в котором отсутствует конкуренция между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, а его иммуногенные свойства были сравнимы с таковыми после применения монопрепаратов. Высокий иммунологический эффект в отношении специфических антигенов, входящих в состав вакцины, был достигнут путем получения вирусных компонентов в составе вакцины, обладающих безвредностью, иммуногенностью и антигенной активностью, а также подобран вариант оптимального их соотношения в составе вакцины, обеспечивающих выработку защитного уровня антител, т.е. создание напряженного иммунитета к вирусным болезням у собак.

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вирусов чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции 2-го серотипа и бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вируссодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов, а также доступно на территории РФ на данный момент.

Дополнительный технический результат предлагаемого изобретения достигается за счет того, что в состав ассоциированной вакцины входят новые производственные штаммы «Рич» вируса коронавирусной инфекции собак и «Юнити» вируса аденовирусной инфекции 2 серотипа.

Сущность изобретения отражена на графических материалах:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов CDV «Рокборн» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса чумы плотоядных. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях Н-гена.

Фиг. 2 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов CPV-2 «Грей» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса парвовирусного энтерита собак. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях гена, кодирующего белок VP₂.

Фиг. 3 - Филогенетическое древо для CCoV штамма «Рич». Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак.

Фиг. 4 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов CAV-2 «Юнити» собак с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса аденовирусной инфекции собак 2-го серотипа. Дендрограмма основана на сравнительном анализе нуклеотидных последовательностях fiber gene аденовируса собак, в том числе I и II серотипов.

Фиг. 5 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов RabV «ВНИИЗЖ» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса бешенства. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностях G-гена кДНК вируса бешенства.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:l - Последовательность нуклеотидов Н-гена штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (Canine morbillivirus) генотипа Rockborn-like.

SEQ ID NO:2 - Последовательность аминокислот белка, который кодируется Н-геном, штамма «Рокборн» генотипа Rockborn-like вируса чумы плотоядных (Canine morbillivirus).

SEQ ID NO:3 - Последовательность нуклеотидов VP2-reHa штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (Canine parvovirus) генотипа CPV-2b.

SEQ ID NO:4 - Последовательность аминокислот белка, который кодируется УР2-геном, штамма Грей генотипа CPV-2b вируса парвовирусного энтерита собак (Canineparvovirus).

SEQ ID NO: 5 - Последовательность нуклеотидов М-гена к ДНК вируса коронавирусного энтерита собак (Canine coronavirus) штамма «Рич»;

SEQ ID NO:6 - Последовательность аминокислот М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак (Canine coronavirus) штамма «Рич».

SEQ ID NO:7 - Последовательность нуклеотидов fiber gene и группы генов Е3 аденовируса собак штамма «Юнити» генотипа вируса аденовируса собак 2 серотипа (Canine adenovirus 2).

SEQ ID NO:8 - Последовательность аминокислот белка, который кодируется fiber gene и группы генов Е3, штамма «Юнити» генотипа CAV-2 вируса аденовируса собак 2 серотипа (Canine adenovirus 2).

SEQ ID NO:9 - Последовательность нуклеотидов G-гена вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ» генотипа RabV (Rabies Virus).

SEQ ID NO:10 - Последовательность аминокислот гликопротеина, который кодируется G-геном вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ» генотипа RabV (Rabies Virus).

Исходный вирус для получения штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (CDV, Canine Distemper Virus) получен из ФГБУ «ВГНКИ» в 1995 г. Методом предельных разведений был адаптирован к репродукции в перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (КК Vero).

Штамм «Рокборн» CDV депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №28 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм «Рокборн» CDV характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Вирионы полиморфны - встречаются от сферической до нитевидной формы, размером 100-700 нм. РНК-содержащий вирус, имеющий на своей поверхности два белка-антигена Н и F и относящийся к роду морбилливирусов.

Антигенные свойства

Антигенная структура вируса изучена слабо. Вирус чумы в иммунобиологическом отношении однороден.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Вирион внутри содержит нуклеокапсид со спиральной структурой. В его состав входит РНК и 3 вирусных белка из 6 структурных: NP с молекулярной массой 58 кД, Р с молекулярной массой 66 кД и L - 200 кД, причем два последних обладают полимеразной активностью. В состав геномной РНК входит 10-15 тыс.нуклеотидов, организованных в шесть транскрипционных единиц. Геномная однонитевая РНК не является информационной для синтеза белка. Эту функцию выполняет РНК, комплементарная геномной, которая образуется в инфицированной клетке. Нуклеокапсид окружен липопротеидной оболочкой с М-белком с внутренней стороны и Н- и F-белками с наружной. М-мембранный белок гликазилирован. Н- и F-белки вируса чумы плотоядных, как поверхностные, наиболее интересны в патогенетическом и иммуногенном отношениях. Белок Н (hemagglutinin) - молекулярная масса 76 кД, имеет в своем составе 604 аминокислоты. Функционально ответствен за прикрепление (адсорбцию) вируса к клетке-мишени. В его структуре отмечают значительную вариабельность. С этим фактом некоторые авторы связывают тропизм вируса к различным тканям, что впоследствии определяет клинические проявления в виде кожных, респираторных или кишечных патологий. Белок F (fusion-слияние) -молекулярная масса 62 кД, состоит из двух компонентов, связанных между собой дисульфидной связью.

Методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера определена первичная структура Н-гена (1824 н.о.) (гемагглютинин) штамма «Рокборн» CDV и определено положение данного штамма на филогенетическом древе вируса.

Представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей Н-гена штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных с другими штаммами, в том числе генетических линий Europe-1/South America-1, South America-2, South America-3, European wildlike, Rockborn-like (RL), America-1, America-2, Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Arctic, Africa-1, Africa-2 (Фиг. 1).

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA7 и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 24 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность Н-гена штамма «Рокборн» CDV. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 1824 позиции нуклеотидов и 608 аминокислотных остатков. Эволюционный анализ проводился в MEGA7.

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей Н-гена штамма «Рокборн» и других штаммов CDV определено положение используемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм «Рокборн» CDV относится к генотипу Rockborn-like (RL), что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Штамм «Рокборн» проявляет генетическую стабильность.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Рокборн» CDV репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (КК Vero). Репродукция вируса в культуре клеток Vero сопровождается специфическим цитопатическим действием, вызывающим два типа клеточной дегенерации. Первый тип дегенерации проявляется появлением зернистых клеток, увеличением их рефрактильности и округлением, с последующим отделением от монослоя. Второй тип дегенерации характеризуется образованием многоядерных клеток и симпластов.

При адаптации вируса к перевиваемым клеточным культурам его патогенность постепенно утрачивается, а при пассажах в первичных культурах клеток она восстанавливается.

Устойчивость к внешним факторам

Во внешней среде в выделениях больных животных (кал, слизь) вирус сохраняется 7-11 дней, в крови при 4°С до 14 дней, в селезенке до 2 месяцев, в органах павших животных при минус 2°0С до 6 месяцев, в носовой слизи до 1 -2 месяцев. При минус 10°С вирус сохраняется в течение нескольких месяцев, при минус 76°С - неограниченное время, в лиофилизированном состоянии - более года. При 60°С вирус чумы плотоядных инактивируется за 30 минут, при 100°С - мгновенно. Чувствителен к эфиру, хлороформу, инактивируется 0,05%-ным раствором формалина при 37°С в течение 4 ч. Сравнительно устойчив при рН 4,5 и выше, частично инактивируется при рН 9,0, оптимальным является рН 7,0.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - не патогенен для собак любой породы и возраста.

Вирулентность - авирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном заражении, механическим путем через контаминированные предметы ухода, кормушки, инвентарь, подстилку и помещения, где содержались больные животные, а также при помощи человека и транспортных средств.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в течение 5 пассажей (срок наблюдения) в перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (КК Vero).

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно перевиваемую культуру клеток почки африканской зеленой мартышки (КК Vero), выращенную в виде монослоя. Из культуральных флаконов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду, далее в разные точки монослоя вносят рабочее разведение вирусного материала и распределяют покачивающими движениями по монослою клеток, после чего выдерживают 1-1,5 ч при температуре (37,0±0,5)°С. После экспозиции в матрасы с инфицированной культурой вносят поддерживающую среду и вновь помещают в термостат для культивирования вируса. При использовании культуральных флаконов с вентилируемыми крышечками необходимо поддержание в термостате концентрации СО2 5%.

Инфицированную КК Vero ежедневно просматривают под микроскопом. Через 24-48 ч в инфицированной культуре клеток наблюдают признаки цитопатического эффекта, обусловленного CDV. При охвате инфекционным процессом 70-80% площади клеточного монослоя культивирование прекращают, после чего инфицированную КК замораживают в низкотемпературном холодильнике при температуре минус (45,0±5,0)°С.

Стерильный инфицированный монослой дезагрегируют с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при комнатной температуре и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляют с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирают в общую емкость. Из собранного материала отбирают пробу для контроля контаминации бактериями (в т.ч. микоплазмами) и грибами в соответствии с ГОСТ 28085 [49].

Суспензию клеточного детрита вируса чумы плотоядных достают из низкотемпературного холодильника в количестве, необходимом для получения серии вакцины, и размораживают. Таяние материала должно происходить при температуре не выше 25°С. В жидком состоянии антиген должен храниться при температуре не выше 8°С и не более 12 ч. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным способом.

Объем вируссодержащего материала в полуфабрикате должен составлять 80%. От вирусного сырья перед смешиванием отбирают пробу для контроля стерильности, которую высевают на МПА, МПБ и агар Сабуро.

Далее в бутыль, соблюдая условия стерильности, добавляют компоненты протектора (стабилизирующая среда) в следующей пропорции (от конечного объема):

- 20%-ный раствор гидролизата лактальбумина - 9%;

- 50%-ный раствор сахарозы - 9%;

- 10%-ный раствор желатозы - 2%.

Также полученный полуфабрикат для аттенуированного компонента вакцины проверяют на стерильность. Фасовку антигена производят в стерильные стеклянные флаконы соответствующей вместимости по 1,0 см³.

Перед постановкой лотков с флаконами вакцины в холодильную камеру, устанавливают температурные датчики для контроля температуры в процессе замораживания и лиофилизации. Началом замораживания считают момент установки лотков в холодильную камеру. Замораживают при динамике минимум 12 ч при температуре минус 30°С и сублимационно высушивают в течение 35 ч при режимах глубокого вакуума, лиофилизация без подогрева первые 2 ч, режим с нагревом 30 ч; далее температуру полок постепенно увеличивают до 0°С, после этого в течение 7 ч, перейдя на положительный диапазон, температуру полок доводят до +25-27°С. В завершении проводится вторичная сушка (досушивание) в течение 5 ч при давлении в камере не более 80 мкм рт.ст., после чего процесс сушки считают законченным.

Лотки с флаконами лиофилизированного антигена выгружают из камеры сублимационной установки на тележку мобильную с ламинарным потоком и транспортируют в ламинар или в ламинарный поток, где на флакон надевается алюминиевый колпачок, который затем обкатывается закаточной машинкой. После завершения процесса обкатки определяют соответствие внешнего вида флаконов с вакциной, а именно отсутствие трещин и сколов, качество закатки колпачков. На флаконы с лиофилизированным компонентом вакцины наклеивают этикетку.

Контроль инфекционной активности штамма «Рокборн» CDV проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию вируса чумы плотоядных микрометодом» [50]. Контроль инфекционной активности проводили в перевиваемой культуре клеток Vero путем определения титра биологической активности штамма «Рокборн». Сущность титрования основана на определении цитопатогенного действия (1ДТГД) вируса, которое проявлялось в культуре клеток Vero через 96-120 ч. Титром вируса считали последнее его разведение, вызывающее 50% эффект, который рассчитывали по формуле Кербера.

Для изготовления предлагаемой вакцины используют лиофилизированный живой аттенуированный материал из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (CDV), полученный в культуре клеток Vero с инфекционной активностью 3,67±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве не менее 80,0 об.%.

Исходный вирус для получения штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2, Canine parvovirus 2) получен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2005 г. из патологического материала от собаки. Методом предельных разведений был адаптирован к репродукции в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK) и селезенки кошки (КК FS).

Штамм «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2) депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2) относится к семейству Parvoviridae, роду Protoparvovirus, виду Carnivore protoparvovirus 1. Вирионы безоболочечные кубического типа симметрии, лишены внешней липидной оболочки.

Антигенные свойства

Антигенная активность возбудителя вируса парвовирусного энтерита собак проявляется индуцированием синтеза комплементсвязывающих, вируснейтрализующих и антигемагглютинирующих антител, которые обнаруживаются на 5-7-й день после заражения и сохраняются в организме в течение двух лет.

Штамм «Грей» CPV-2 гемагглютинирует эритроциты свиньи и кошки при (21±3)°С и рН 5,8-8,2.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Диаметр вирионов 18-26 нм. Молекулярная масса колеблется в пределах 5,5х10⁶-6,2х10⁶ Кд. Икосаэдрический белковый капсид окружает геномную одноцепочечную ДНК, состоящую приблизительно из 5000 оснований, кодирующих 3 или 4 вирусных белка. Зрелые вирионы CPV-2 образованы тремя капсидными белками VP₁, VP₂, VP₃. Капсид состоит из 32 капсомеров диаметром 3-4 нм. Геном представлен односпиральной линейной молекулой ДНК. На концах такая ДНК имеет двуспиральные участки («шпильки»). Значительная часть вирионов содержит минус- и плюс-нить ДНК. Репликация вирусной ДНК и сборка вирионов происходят в ядре клетки с участием полимераз клетки. В вирионах содержатся четыре белка (А, В, С, D). Дополнительно к структурным белками геном вируса кодирует неструктурные белки: NS-1 и, вероятно, NS-2.

При изучении первичной структуры вариабельного фрагмента гена, кодирующего белок VP2 (414 н.о.) штамма «Грей» CPV-2 методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера определено положение данного штамма на филогенетическом древе вируса (Фиг. 2). Метод основан на определении наиболее вариабельной первичной структуры гена, кодирующего белок VP2 испытуемого штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами вируса парвовирусного энтерита.

На фиг. 2 представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего белок VP2, штамма «Грей» CPV-2 с другими штаммами, в том числе генотипов CPV-1, CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA7 и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 13 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность VP2-гена штамма «Грей» CPV-2. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 414 позиции нуклеотидов и 138 аминокислотных остатков. Эволюционный анализ проводился в MEGA7.

По результатам всего анализа был сделан вывод, что исследуемый штамм «Грей» относится к генотипу CPV-2b, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Штамм «Грей» проявляет генетическую стабильность.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак адаптирован к репродукции в перевиваемой культуре клеток «FS», также к перевиваемой культуре клеток «CrFK». Установлено, что CPV-2 размножается во всех культурах клеток кошек, активно репродуцируются в линиях клеток собак. Вирус не вызывает цитопатогенного действия. Обладает гемагглютинирующим действием по отношению к эритроцитам свиньи и кошки.

Устойчивость к внешним факторам

Возбудитель устойчив к физико-химическому воздействию. Хорошо переносит высушивание, выдерживает прогревание при 60°С в течение 60 минут и при 80°С - 30 минут, не разрушается при воздействии эфира, хлороформа, спирта и желчи, устойчив в средах с рН 3,0-9,0. Инактивируется ультрафиолетовыми лучами, формалином, йодоформом, едким натрием и калием, хлорной известью, гидрохлоридом и хлоридом натрия, производными этиленимина, β-пропиолактоном.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном заражении, передается механическим путем через контаминированные предметы ухода, кормушки, инвентарь и подстилку, помещения, где содержались больные животные, а также при помощи человека и транспортных средств.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в течение 5 пассажей (срок наблюдения) в перевиваемой культуре клеток почек почки кошки (КК CrFK).

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «Грей» CPV-2 в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток почки кошки (КК CrFK), выращенную в виде монослоя.

Замороженный рабочий посевной материал размораживают, разбавляют физиологическим раствором, получая рабочего разведения антигена с гемагглютинирующим титром не ниже 8,0±1,0 log₂ НА. Перед заражением проводят микроскопию клеточного монослоя, оценивая его состояние и выбраковывая культуру с признаками дегенерации.

Все операции по заражению проводят в асептических условиях. Из культуральных флаконов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. Соблюдая условия асептики, при помощи стерильной пипетки в разные точки монослоя вносят рабочее разведение вирусного материала и распределяют покачивающими движениями по монослою клеток, после чего флаконы выдерживают 1-1,5 ч при температуре (37,0±0,5)°С. После экспозиции в культуральные флаконы с инфицированной КК CrFK вносят поддерживающую среду и инкубируют при температуре (37,5±0,5)°С. При использовании культуральных флаконов с вентилируемой крышечкой необходимо поддержание концентрации в термостате СО₂ 5%.

По истечении 5 суток матрасы замораживают в низкотемпературном холодильнике при температуре минус (45,0±5,0)°С.

Стерильный инфицированный монослой дезагрегируют с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20,0±2,0)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляют с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирают в общую емкость. Из собранного материала отбирают пробу в объеме 1,0 см³ с соблюдением условий асептики и антисептики для контроля стерильности и определения гемагглютинирующего титра. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным способом.

Для инактивации штамма «Грей» CPV-2 использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании инактивации полученный материал помещают в холодильник при температуре (2-8)°С.

По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до температуры (2-8)°С и отбирали пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в вирусную суспензию антигенного материала добавляли тиосульфат натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полноту инактивации определяют методом трехкратных последовательных пассажей полученного антигена в перевиваемых культурах клеток. Отсутствие гемагглютинирующего титра свидетельствует об утрате инфекционных свойств CPV-2.

Контроль гемагглютинирующей активности штамма «Грей» CPV-2 проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию возбудителя парвовирусного энтерита собак микрометодом» [51]. Сущность метода заключается в способности CPV-2 гемагглютинировать эритроциты свиньи. За титр вируса принимали его наибольшее разведение, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов. Гемагглютинирующая активность вируса до инактивации составила 9,0±0,0 log₂ НА в РГА.

Для изготовления жидкой части ассоциированной вакцины «Карникан-5Я» используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак, полученного в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK), с гемагглютинирующей активностью 9,0±0 log₂ НА в количестве 22,5 об.%

Изолят коронавирусного энтерита собак (CCoV, Canine coronavirus), послуживший источником для получения штамма «Рич», был выделен из патологического материала, полученного от погибшего беспородного щенка, содержавшегося в ВООО Центра животных «Валента» на территории города Владимир в 2021 году, путем пассирования выделенного вируса в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK) методом предельных разведений.

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №376 - деп / 22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

Штамм «Рич» CCoV характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак (CCoV) относится к семейству Coronaviridae, подсемейству Orthocoronavirinae, роду Alphacoronavirus, виду Alphacoronavirus 1 и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей коронавирусов: вирионы сферической формы, нуклеокапсид окружен белковой мембраной и липосодержащей внешней оболочкой, от которой отходят шиповидные отростки.

Антигенные свойства

В антигеном отношении CCoV родственен вирусам трансмиссивного гастроэнтерита свиней и коронавирусу кошек. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции нейтрализации (РН). Стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РН в культуре клеток CrFK.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак является РНК-содержащим вирусом и размером около 29,4 kb. Около 2/3 геномной РНК вируса занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF), ORFla и ORFlb, которые кодируют два полипротеина (репликазные белки), приводящих к образованию вирусной репликазы. ORF 1а и lab, кодирующими 16 неструктурных белков, которые генерируют репликазный комплекс. С 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н.о.) состоит из других ORF, кодирующих структурные и неструктурные белки. Структурные белки включают белки S, Е, М и N, кодируемые ORF2, ORF4, ORF5 и ORF6 соответственно.

Пять основных генов кодируют следующие белки: шипообразный белок (S-белок), мембранный гликопротеин (М-белок), нуклеокапсид (N-белок), белок оболочки (Е-белок) и ORFlab (большой полипротеин, известный как репликаза / протеаза). М-белок - мембранный белок с тройным охватом, который является наиболее распространенным белком в вирионе. Он играет центральную роль в сборке и морфогенезе вирионов, а также определяет форму вирусной оболочки. Данный белок рассматривается как центральный организатор сборки вирусной частицы, взаимодействующий со всеми другими основными структурными белками коронавируса. Взаимодействия между М-белками являются основной движущей силой формирования оболочки вириона. Кроме того, для полного формирования вириона ему необходимо взаимодействовать с другими структурными белками коронавируса. Взаимодействие спайкового S-белка с М-белком не требуется для процесса сборки. Однако связывание М-протеина с N-белком стабилизирует нуклеокапсид (комплекс N-белок-РНК), а также внутреннее ядро вирионов и, таким образом, способствует завершению сборки вируса.

При генетической идентификации полученного вируса и сравнительного анализа последовательности кДНК использовали обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляли секвенирование (анализировали нуклеотидную последовательность из 141 и.о., аминокислотную последовательность, соответствующую ей с длиной 95 а.о.).

Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3-параметрической классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт.Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак. Штамм «Рич» имеет близкое родство со штаммами «Карат» и №49 (Фиг. 3).

Биотехнологические характеристики.

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK) и в перевиваемой культуре клеток селезенки кошки (FS), а также в первично-трипсинизированной культуре клеток селезенки котенка (СК). Репродукция вируса в культуре клеток FS и СК не сопровождается специфическим цитопатическим действием. Репродукция вируса в культуре клеток CrFK сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к образованию симпластов и деструкции монослоя через 48-72 ч культивирования.

Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток CrFK и на естественно восприимчивых животных - 2-4 месячных щенках собак. При культивировании CCoV штамма «Рич» на перевиваемой культуре клеток CrFK вирус накапливается в титре не менее 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Вирус не устойчив во внешней среде. На поверхностях при температуре (24±2)°С погибает в течение 48 ч. В кале собак сохраняется не более 2 суток. Относительно стабилен в кислой среде при рН 6,0-6,5. Чувствителен к формальдегиду, глутаровому альдегиду, 70% раствору этилового спирта, четвертичным аммонийным соединениям. Переносит двукратное размораживание и оттаивание.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - низкопатогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - слабо вирулентен для естественно-восприимчивых животных при внутрибрюшинном заражении.

Безвреден для кроликов и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток CrFK.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Рич» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «Рич» CCoV используют преимущественно перевиваемую культуру клеток почки кошки (КК CrFK).

Первое проявление ГДПД в культуре клеток CrFK наблюдается через 48 ч культивирования. Через 72 ч культивирования большая часть клеток отслаивается от субстрата, собирается в агрегаты разного размера, часть клеток деградирует до детрита. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным способом.

Для инактивации штамма «Рич» CCoV используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до температуры (2-8)°С и отбирали пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в вирусную суспензию антигенного материала добавляли тиосульфат натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полноту инактивации определяют методом трехкратных последовательных пассажей антигена в перевиваемых культурах клеток. Отсутствие ЦПД свидетельствует об утрате инфекционных свойств CCoV.

Контроль инфекционной активности штамма «Рич» CCoV проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию вируса коронавирусного энтерита собак микрометодом» [52]. Контроль инфекционной активности проводили в перевиваемой культуре клеток CrFK путем определения титра биологической активности штамма «Рич». Сущность титрования основана на определении цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, которое проявлялось в культуре клеток CrFK через 48-72 ч. Титром вируса считают последнее его разведение, вызывающее 50% эффект, который рассчитывают по формуле Кербера. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 3,61±0,28 1g ТЦД₅₀/см³.

Для изготовления сорбированной - жидкой части ассоциированной вакцины используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, репродуцируемого в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK), с инфекционной активностью 3,43±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

Изолят вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (СА V-2, Canine mastadenovirus А, 2 serotype), послуживший источником для получения штамма «Юнити», был выделен из патологического материала, полученного от беспородной собаки, находящейся в частном владении в г. Владимир, в 2022 г., путем пассирования выделенного вируса в перевиваемой культуре клеток почки собаки (КК MDCK) методом предельных разведений.

Штамм «Юнити» 2 серотипа вируса аденовирусной инфекции собак (CAV-2) депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №456 - деп 23/6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

Штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Юнити» CAV-2 относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine mastadenovirus А, 2 серотипу.

Вирус безоболочечный, имеет икосаэдрическую форму, реплицируется в ядре. Диаметр составляет 70-90 нм. Капсид состоит из 252 зерен оболочки, из которых 240 являются гексонами, которые составляют поверхность икосаэдра.

Антигенная структура

С помощью хроматографии и электрофореза выделены три различных растворимых антигена, отличающихся по иммунологическим свойствам и связанных с различными морфологическими субъединицами вируса.

1. А-антиген, гексон - групповой, общий для всех группы аденовирусов млекопитающих антиген, локализованный в 240 капсомерах капсида, каждый из которых граничит с шестью соседними капсомерами, что определило название антигена (hexon). Антитела против очищенного гексонного антигена нейтрализуют инфекционные свойства только гомологичного серотипа. В то же время эта сыворотка реагирует в реакции связывания комплемента с любыми гетерологичными серотипами, так как в составе гексонного антигена имеются две реактивные группы, одна из которых стимулирует образование группоспецифических, а другая - типоспецифических антител. Гексон несет антиген реакции связывания комплемента, а основание пентона представляет собой полностью растворимый гемагглютинин.

2. В-антиген, пентон - токсический антиген, вызывающий округление и скучивание (агрегация) чувствительных клеток однослойной культуры и отделение клеток с поверхности стекла. Локализован в капсомерах, расположенных на вершине двенадцати угловых участков вириона, каждый из которых граничит с пятью соседними капсомерами (pepton). Чувствителен к действию трипсина. Ингибирует активность интерферона и повышает тяжесть ассоциированных инфекций.

3. С-антиген - нитевой (fiber) антиген, имеет морфологически форму нити с узловым утолщением, прикрепленной к пентонному антигену. Представляет собой типоспецифический антиген, устойчив к действию трипсина, способствует адсорбции аденовирусов на эритроцитах цыплят, человека (О-типа) и белых крыс, но не может агглютинировать эритроциты мышей, гусей, голубей, уток, крупного рогатого скота, овец, свиней.

Выделенные в разных странах штаммы CAV-2 идентичны по антигенному составу. Штаммы возбудителя могут значительно различаться по степени вирулентности.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «Юнити» CAV-2 является линейным двухцепочечным ДНК-содержащим вирусом размером 26-45 т.п.н.

Сиаловая кислота имеет сайт связывания в верхней части выпуклости. Линейные двухцепочечные молекулы ДНК имеют размер 26-45 т.п.н. Геном характеризуется инвертированным концевым повтором размером от 36 до более 200 п. н., а 5'-концы связаны с концевым белком (TP). Капсид отвечает за тканевой тропизм, модифицирован для изменения тканевого тропизма (от собак к человеку) по сравнению с аденовирусом человека HAdV-5 [33]. Гексон несет антиген реакции связывания комплемента, общий для группы аденовирусов млекопитающих, а основание пентона представляет собой полностью растворимый гемагглютинин.

Геном штамма «Юнити» CAV-2 состоит из центрального блока, ориентированного вправо поздних генов от 52К до волокна, прерываемых на той же цепи блоком ранних генов в области ЕЗ, а на противоположной цепи - генами Е2 в форме ДНК-связывающего белка (DBP) в область Е2А и претерминального белка (рТР) и ДНК-полимеразы (pol) в области Е2В. Правая концевая область занята генами Е4, а левая концевая область ранними генами Е1А и Е2В плюс два промежуточных гена (IX и IVa2).

Также у штамма «Юнити» CAV-2 обнаружен гемагглютинирующий антиген, характерный для всех выделенных эпизоотических штаммов. Он связан с инфекционным компонентом вируса, его удаление методом адсорбции ведет к снижению инфекционности вируса. Гемагглютинин устойчив к нагреванию: при 56°С разрушается за 30 мин, при 70°С - за 3-5 мин. Формалин, щелочь, фенол, лизол быстро разрушают вирусный гемагглютинин.

Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей Е3-гена кДНК CAV-2 (285 н.о.) и определено положение данного штамма на филогенетическом древе вируса (Фиг. 4). Метод основан на определении первичной структуры fiber gene испытуемого штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами аденовируса собак 2 серотипа.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA7 и алгоритма Neighbor-Joining. Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3-параметрической классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X.

В окончательном наборе данных было всего 285 позиции нуклеотидов и 95 аминокислотных остатков. Эволюционный анализ проводился в MEGA7.

При сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена ЕЗ штамма «Юнити» и других штаммов CAV-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 4).

По результатам всего анализа был сделан вывод, что исследуемый штамм «Юнити» относится к генотипу CAV-2, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Биотехнологические характеристики.

Штамм адаптирован к репродукции в перевиваемой КК почки собаки Мадина-Дерби «MDCK».

Штамм «Юнити» 2 серотипа вируса аденовирусной инфекции собак репродуцируется в перевиваемой КК MDCK, а также в первично- трипсинизированных КК селезенки щенка и почки щенка. Не чувствителен к первичным или перевиваемым клеткам других животных (кошки, обезьяны, свиньи).

Репродукция вируса в культуре клеток MDCK сопровождается специфическим цитопатическим действием, которое начинает проявляться через 24 часа и достигает пика через 36-48 часов. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток MDCK и на естественно восприимчивых животных - 2-4 месячных щенках собак. При культивировании CAV-2 штамма «Юнити» накапливается в титре не менее 3,57±0,14 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Устойчив во внешней среде. При температуре 17°С инактивируется за 22-30 дней, при температуре 0-2°С - за 168-184 дня и при 1-8°С - за 246-263 дня. При замораживании, высушивании и консервировании в 50%-ном растворе глицерина не теряет своих свойств 3-5 лет. При 55°С вирус теряет вирулентность за 40-50 минут, при 100°С - за 1 минуту. 1-3%-ные растворы формалина, щелочи, лизола, фенола инактивируют вирус в течение 30 минут. Резистентен к действию УФ-излучения, эфира, хлороформа, кислот. Инактивируется в течение 3 минут при 60°С. Чувствителен к фенолу, йодидам, гидроксиду натрия.

Для получения антигенного материала из штамма «Юнити» CAV-2 в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно перевиваемую культуру клеток почки собаки (КК MDCK), выращенную в виде монослоя.

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса к следующим культурам клеток: перевиваемая MDCK, первично-трипсинизированные почка щенка и селезенка щенка. Для выделения вируса вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой перевиваемой культуры клеток MDCK и экспонировали в течение 60 мин. при температуре (37,0±0,5)°С. Затем вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 5% фетальной сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³). Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 72 ч, затем замораживали при минус (45,0±5,0)°С, после размораживания центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 36-48 ч (культура клеток MDCK) или до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, приводящим к появлению отдельных округлившихся, рефрактильных клеток, которые постепенно отторгаются от стекла. По мере развития вируса число клеток, подвергшихся дегенерации, увеличивается и образуются большие пустоты в монослое. По краям сохранившихся островков пораженные клетки концентрируются, образуя большие конгломераты, напоминающие грозди винограда. В культуре клеток через 20-30 часов после заражения образуются характерные внутриядерные включения, которые хорошо обнаруживаются при окраске препаратов или методом иммунофлюоресценции. CAV-2 тесно расположен в типичной кристаллической структуре в ядре инфицированных клеток. Первое проявление ЦПД вируса в культуре клеток MDCK наблюдается через 24 ч культивирования, в первично-трипсинизированных культурах клеток почки щенка и селезенки щенка через 16-18 ч. В культуре клеток MDCK через 72 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от субстрата, собиралась в агрегаты разного размера, часть клеток деградировала до детрита. В культурах клеток почки щенка и селезенки щенка большая часть клеток отслаивалась от субстрата и деградировала через 24 ч.

Для инактивации штамма «Юнити» CAV-2 использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании инактивации полученный материал помещают в холодильник при температуре (2-8)°С.

По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до температуры (2-8)°С и отбирали пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в вирусную суспензию антигенного материала добавляли тиосульфат натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Контроль инфекционной активности штамма «Юнити» CAV-2 проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию вируса аденовироза собак микрометодом» [53]. Контроль инфекционной активности проводили в перевиваемой культуре клеток MDCK путем определения титра биологической активности штамма «Юнити». Сущность титрования основана на определении цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, которое проявлялось в культуре клеток MDCK через 48-72 ч. Титром вируса считают последнее его разведение, вызывающее 50% эффект, который рассчитывают по формуле Кербера. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 3,87±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Для изготовления сорбированной - жидкой части ассоциированной вакцины «Карникан-5Я» используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2), репродуцируемого в перевиваемой культуре клеток почки собаки Мадина-Дерби (КК MDCK), с инфекционной активностью 3,57±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

Изолят вируса бешенства (RabV, Rabies Virus), послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ», был получен путем адаптации производственного вакцинного штамма «Щелково-51» вируса бешенства к суспензионной культуре клеток ВНК-21/2-17.

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства (RabV) депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: «ВНИИЗЖ»-ДЕП фиксированного вируса бешенства.

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ» RabV относится к семейству Rhabdoviridae, подсемейству Alpharhabdovirinae, роду Lyssavirus, виду Lyssavirus rabies и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей лиссавирусов: вирионы пулевидной формы, размер 180><80 нм, нуклеокапсид окружен белково-липидной оболочкой, от которой отходят шиловидные отростки.

Антигенные свойства

Вирион RabV штамма «ВНИИЗЖ» содержит 2 основных антигена: гликопротеин (G-белок) вирусной оболочки и внутренний нуклеопротеин (N-белок) вириона. G-белок индуцирует формирование вируснейтрализующих антител и определяет развитие гуморального иммунитета у животных против RabV.

Штамм «ВНИИЗЖ» и большинство других штаммов и полевых изолятов RabV, выделенных на различных континентах, содержат общий нуклеопротеиновый антиген, который обнаруживается с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ), или методом флуоресцирующих антител (МФА), а также в реакции диффузной преципитации (РДП). Нуклеопротеиновый антиген обладает способностью стимулировать перекрестные реакции между изолятами вируса бешенства. N-белок играет важную роль в формировании клеточного иммунитета, в частности, взаимодействует с Т-хелперами, активирует CD4+ и CD8+- клетки. Нуклеопротеин способен стимулировать иммунную систему без осуществления внутриклеточного процессинга и сплайсинга, при этом формируется потенциально протективный иммунный ответ на высококонсервативные эпитопы N-белка (позиции 404-418).

Антигенное родство штамма «ВНИИЗЖ» с производственными штаммами «RV-97», «SAD В19», «Щелково-51» вируса бешенства, а также с полевыми изолятами из разных географических групп на территории РФ: RV 257 Omsk, 24/2010 Tuva, 1634/2008 Saratov (Европейская группа), 1352/2008 Krasnodar, RV 308 Georgia, 18/2005 Krasnodar (Кавказская группа), 33/2005 Bryansk, 552/2010 Kaliningrad (Северо-Европейская группа), 211/2010 Vladimir, 110/2009 NNovgorod, 705/2009 Moscow (Центральная группа), 304c Chita, SG 21 Yakutia, 1410/2008 Komi (Арктическая группа) изучено в реакции нейтрализации. В качестве контрольного штамма при постановке реакции нейтрализации использовали референтный штамм «CVS-27», адаптированный к культуре клеток (ANSES, Nancy, France). Референтной сывороткой служила сыворотка против штамма «ВНИИЗЖ» RabV с титром 2,5 МЕ/см³ (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Изучение антигенного родства (матчинг) в реакции нейтрализации выполняли в соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE). Значение коэффициента антигенного родства (r₁) вычисляли по формуле:

При значении r₁>0,30 исследуемые штаммы являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,30 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не обеспечит защиту от полевого изолята.

Коэффициент r₁ для штамма «CVS-27» составил 0,41; «RV-97» - 0,65; «SAD В19» - 0,42; «Щелково-51» - 0,71; RV 257 Omsk - 0,40; 24/2010 Tuva - 0,45; 1634/2008 Saratov - 0,51; 1352/2008 Krasnodar - 0,48; RV 308 Georgia - 0,58; 18/2005 Krasnodar - 0,51; 33/2005 Bryansk - 0,39; 552/2010 Kaliningrad - 0,46; 211/2010 Vladimir - 0,65; 110/2009 NNovgorod - 0,62; 705/2009 Moscow - 0,53; 304c Chita - 0,61; SG 21 Yakutia - 0,64; 1410/2008 Komi - 0,62. Таким образом, представленный штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства показывает перекрестные серологические реакции с представителями первой филогенетической линии генетической группы вируса бешенства и позволяет обеспечить защиту от заражения изолятами вируса бешенства данной группы. Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства является РНК-содержащим несегментированным одноцепочечным спирально негативным вирусом длиной около 12000 н.о. В последовательности закодированы следующие белки: G, N, NS, М, L.

Белок G имеет наибольшую молекулярную массу 65-70 кД, представлен гликопротеином. Обладает способностью индуцировать образование вируснейтрализующих антител, антигемагглютининов и создает иммунитет к заражению вирусом бешенства.

Белок N имеет молекулярную массу 57 кД - групповой антиген практически для всех представителей лиссавирусов. Вступает в перекрестные реакции между различными родственными ему вирусами, выявляется при помощи МФА, РСК и РДП N.

NS и L белки являются компонентами транскриптазы, обеспечивают транскрипцию и репликацию. NS также выполняет конформационную роль.

М белок находится вплотную к нуклеокапсиду и является негликолизированным белком вирусной оболочки.

Белки вириона распределены следующим образом: G - 47%, M₁ - 8,5%, М₂ - 10,5%), рибонуклеопротеид - 34%. «Ядро» вириона представлено 12,5% G-белка, 59,4% белка нуклеокапсида, 12,5% M₁ и 15,6% М₂.

При генетической идентификации полученного вируса и сравнительного анализа последовательности кДНК использовали обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляли секвенирование.

Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3-параметрической классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей G-гена кДНК вируса бешенства (исследовали последовательность кДНК с длиной 612 н.о. и аминокислотную последовательность, которая ей соответствует размером 204 а.о.) (Фиг. 5).

Биотехнологические характеристики.

Культивируется штамм «ВНИИЗЖ» RabV в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21.

Устойчивость к внешним факторам

При низких температурах вирус несколько месяцев сохраняется в замороженном мозге, в гниющем материале остается жизнеспособным в течение 2-3 недель. При температуре +50°С инактивируется через 1 час, при +60°С через 5-10 мин, +70°С - мгновенно. Солнечный свет при 5-6°С обезвреживает его за 5-7 дней. УФ-лучи - 5-10 мин, глицерин при +4°С консервирует до 900 дней. Вирус быстро инактивируется при воздействии дезинфицирующих растворов: формалин (1-5%) - 5 мин, сулема (0,1%) - 2-3 ч, фенол (1%) - 2-3 недели, соляная кислота (3-5%) - 5 мин, эфир - 80-120 ч.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - низкопатогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - слабо вирулентен для естественно-восприимчивых животных при внутрибрюшинном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток ВНК-21.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «ВНИИЗЖ» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» RabV используют перевиваемую культуру клеток почки сирийского хомячка (КК ВНК-21).

Для инактивации штамма «ВНИИЗЖ» RabV используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до температуры (2-8)°С и отбирали пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в вирусную суспензию антигенного материала добавляли тиосульфат натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полноту инактивации вируса бешенства определяют методом интрацеребрального введения антигена мышам. Остаточную инфекционность штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства определяют титрованием инактивированной суспензии вируса на белых мышах [7, 49].

Контроль инфекционной активности штамма «ВНИИЗЖ» RabV проводили в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Титром инфекционности вируса считали вычисленное наибольшее его разведение, вызывающее инфицирование 50% всех лунок с зараженным монослоем. Титр рассчитывали методом Спермана и Кербера и выражали в десятичных логарифмах ККИД₅₀/см³. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 7,25 lg ТЦД₅₀/см³.

Для изготовления сорбированной - жидкой части ассоциированной вакцины используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства, репродуцируемого в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка (КК ВНК-21), с инфекционной активностью не менее 7,0 lg ККиД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%

Получена ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак - «Карникан-5Я».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Приготовление предлагаемой вакцины

Для приготовления ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5Я» использовали следующие штаммы вирусов: штамм «Рокборн», штамм «Грей», штамм «Рич», штамм «Юнити», штамм «ВНИИЗЖ».

Технологический процесс состоит из следующих этапов:

• получение вирусных суспензий штамма «Рокборн», штамма «Грей», штамма «Рич», штамма «Юнити» и штамма «ВНИИЗЖ»;

• определение активности каждой суспензии;

• лиофилизация вирусного материала из аттенуированного штамма «Рокборн» отдельно;

• инактивация вируссодержащих жидкостей штаммов «Грей», «Рич», «Юнити» и «ВНИИЗЖ» отдельно;

• объединение полученных инактивированных суспензий вирусов;

• добавление адъюванта к смеси инактивированных вирусов;

• расфасовка готового продукта - лиофилизированный аттенуированный антиген штамма «Рокборн» отдельно от смешанных объединенных инактивированных сорбированных компонентов.

Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получали в перевиваемых культурах клеток.

Для изготовления вакцины «Карникан-5Я» ассоциированной против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак использовали культуральный аттенуированный вирус штамма «Рокборн»; культуральный вирус штамма «Грей»; культуральный вирус штамма «Рич», культуральный вирус штамма «Юнити», выращенные на монослое клеток в 1,5 дм³ культуральных флаконах, культуральный вирус штамма «ВНИИЗЖ», выращенный в культиваторе клеток ВНК-21.

Предлагаемая вакцина «Карникан-5К» имеет оптимальный компонентный состав, об.%:

- Лиофилизированный компонент:

1. Антигенный материал из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных (CDV), репродуцированный в перевиваемой культуре клеток КК Vero, с инфекционной активностью 3,67±0,14 lg ТЦД₅₀/см³ в количестве 80,0 об.%.

2. Стабилизирующая среда, в количестве 20,0 об.%.

- Жидкий компонент:

3. Антигенный материал из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2), репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки КК CrFK, с гемагглютинирующей активностью 9,0±0,0 log2 НА, в количестве 22,5 об.%.

4. Антигенный материал из штамма «Рич» вируса коронавирусной инфекции собак (CCoV), репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки КК CrFK, с инфекционной активностью 3,43±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

5. Антигенный материал из штамма «Юнити» 2 серотипа вируса аденовирусной инфекции собак (CAV-2), репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки собаки КК MDCK, с инфекционной активностью 3,57±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 22,5 об.%.

6. Антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства (RabV), репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21, с инфекционной активностью 7,0 lg ККИД₅₀/СМ³, в количестве 22,5 об.%.

7. Адъювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 10,0 об.%.

Содержимое антигенных материалов в предлагаемой вакцине «Карникан-5R» в указанных выше концентрациях является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.

Полученная вакцина «Карникан-5R» представляет собой:

- 1 компонент - лиофилизированная однородная пористая масса оттенка бежевого цвета;

- 2 компонент - жидкость оттенка розового или светло-розового цвета с осадком. При встряхивании осадок легко разбивается в гомогенную взвесь.

Сосуды, в которых отмечали ЦПД вируса чумы плотоядных с поражением 70-80% клеточного монослоя, исследовали на стерильность. Отобранные сосуды (V=l,5 дм³) с культурой клеток Vero, содержащей вирус штамма «Рокборн», прошедшие контроль на отсутствие контаминации, однократно замораживали и оттаивали при комнатной температуре, при этом клетки вируссодержащей суспензии дезагрегировали, и далее встряхивали суспензию подтаявшего монослоя. По окончании интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляли с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирали в общую емкость. Из собранного материала пробу высевали на бактериальные среды для исключения контаминации микробами, грибами и микоплазмами [38, 54], после чего отбирали пробы для определения инфекционной активности.

Суспензию клеточного детрита вируса чумы плотоядных доставали из низкотемпературного холодильника в количестве, необходимом для получения серии вакцины и размораживали. Таяние материала проходило при температуре не выше 25°С. В жидком состоянии антиген хранился при температуре не выше 8°С и не более 12 ч.

Объем вируссодержащего материала в полуфабрикате составил 80%. От вирусного сырья перед смешиванием отбирали пробу для контроля стерильности, которую высевали на МПА и агар Сабуро.

Далее в бутыль, соблюдая условия стерильности, добавляли компоненты стабилизирующей среды в следующей пропорции (от конечного объема):

- 20%-ный раствор гидролизата лактальбумина - 9%;

- 50%-ный раствор сахарозы - 9%;

- 10%-ный раствор желатозы - 2%.

Смешивание компонентов осуществляли с соблюдением условий асептики. От полученного полуфабриката аттенуированного компонента вакцины производили отбор проб на стерильность. Фасовку антигена со стабилизирующей средой проводили по 1,0 см³ во флакон. Перед постановкой лотков с флаконами вакцины в холодильную камеру, устанавливали температурные датчики для контроля температуры в процессе замораживания и лиофилизации. Началом замораживания считали момент установки лотков в холодильную камеру. Замораживали при динамике минимум 12 ч при температуре минус 30°С и сублимационно высушивали в течение 35 ч при режимах глубокого вакуума, лиофилизация без подогрева первые 2 ч, режим с нагревом 30 ч; далее температуру полок постепенно увеличивали до 0°С, после этого в течение 7 ч, перейдя на положительный диапазон, температуру полок доводили до (+25-27)°С. В завершении проводили вторичную сушку (досушивание) в течение 5 ч при давлении в камере не более 80 мкм рт.ст., после чего процесс лиофилизации считали законченным.

Далее в условиях асептики на флаконы надевали алюминиевые колпачки и закатывали при помощи автомата закатки алюминиевых колпачков. Наклеивали этикетку при помощи установки для этикетирования флаконов.

Полученный антигенный материал штамма «Грей», штамма «Рич», штамма «Юнити», штамма «ВНИИЗЖ» использовали для изготовления сорбированной формы вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R». Для этого инактивированный антигенный материал тщательно смешивали с 3%-ным гелем гидроокиси алюминия в количественном соотношении 22,5:22,5: 22,5:22,5:10,0 соответственно.

Содержимое сосудов с инактивированным очищенным антигенным материалом из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак (CPV-2), из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак (CCoV), штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции (CAV-2) и штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства (RabV) сливали в отдельные емкости и охлаждали при температуре (2-8)°С, освобождали от клеточного детрита при помощи низкоскоростного центрифугирования. Освобожденная от детрита суспензия имела вид полупрозрачной жидкости розового цвета.

Затем из емкостей отбирали пробы для контроля вирусного сырья.

Серия вируса штамма «Рокборн» чумы плотоядных должна иметь инфекционную активность не менее 3,67±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Серия штамма «Грей» CPV-2 должна иметь гемагглютинирующую активность не менее 9,0±0,0 log₂ HA;

Серия штамма «Рич» CCoV должна иметь инфекционную активность не менее 3,43±0,14 lg ТЦД₅₀/см³

Серия штамма «Юнити» CAV-2 должна иметь инфекционную активность не менее 3,57±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Серия штамма «ВНИИЗЖ» RabV должна иметь инфекционную активность не менее 7,0 lg ККИД₅₀/см³.

Вакцину контролировали на стабильность, стерильность и антигенную активность.

Стерильность вакцины определяли в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Методы биологического контроля стерильности» [49]. Сущность метода заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибной микрофлоры в посевах из образцов вакцины на питательные среды. Проверку на отсутствие контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV том 2, ОФС 1.7.2.0031.15 [55].

Контроль лиофилизированной части проводили на остаточную влажность после лиофилизации, контроль биологической активности в культуре клеток, отсутствие контаминации штамма другими вирусами общепринятыми методами, растворимость. Содержимое флаконов в виде восстановленной суспензии высевали на следующие среды: МПА (мясопептонный агар), МПБ (мясопептонный бульон), МППБ (мясопептонный печеночный бульон), агар Сабуро (жидкий) и тиогликолевую среду. Для исключения контаминации микоплазмами делали высевы на среду Каган жидкую с 0,3% агара и среду Каган полутвердую с 1,3% агара, проводили 3 пересева с интервалом 4-7 дней. В посевах не наблюдали роста бактериальной, грибной микрофлоры и микоплазм в установленные периоды наблюдений.

Для определения остаточной влажности проводили в соответствии с ГОСТ 24061-89 «Препараты биологические сухие. Метод определения влажности». Для проведения испытания использовали 3 флакона со штаммом «Рокборн» вируса чумы плотоядных. Пробу биопрепарата, растолченную до порошкообразного состояния, ровным слоем вносили в предварительно взвешенную бюксу. Бюксы с пробами и крышками взвешивали и помещали в открытом состоянии в сушильный шкаф. Началом досушивания считали время достижения температуры 105°С, которое продолжалось 1 ч. После окончания досушивания бюксы накрывали крышками и переносили в эксикатор для достижения комнатной температуры, после чего взвешивали с точностью до четвертого знака после запятой. Вычисление влажности каждой из проб проводили с точностью до второго десятичного знака. За окончательный результат принимали значение среднего арифметического трех параллельных определений. Массовая доля влаги во флаконе с лиофилизированной вирусной суспензией штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных составила 2,3%, что соответствует требованиям НД (табл. 1).

Титр биологической/инфекционной активности штамма «Рокборн» CDV после лиофилизации составил 3,67±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Лиофильно высушенную часть вакцины (лиофилизированный компонент), содержащей аттенуированный вирус штамма «Рокборн» CDV, контролировали на безвредность и авирулентность на естественно восприимчивых животных (хорьках, белых мышах и щенках) по ГОСТ 31926-2013 «Межгосударственный стандарт. Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности», которым вводили в повышенной дозе образец штамма.

Для этого использовали хорьков 6-7 месячного возраста в количестве 9 голов, белых мышей массой 18-20 г в количестве 9 голов, беспородных щенков 2-3 месячного возраста в количестве 6 голов. Каждый вид животных разделили на 3 группы. Группа №3 - контрольная.

Группе №1 вводили лиофилизированный компонент вакцины в 10-кратной дозе - лиофильно высушенный штамм «Рокборн». Содержимое 10 флаконов растворяли в физиологическом растворе до первоначального объема перед лиофилизацией и объединяли. Препарат вводили внутримышечно в область бедра: хорькам и щенкам 10 кратную дозу в прививном объеме 1,0 см³, мышам в прививном объеме 0,2 см³. Период наблюдения за животными составил 21 день. У хорьков, щенков и мышей группы №1 какого-либо угнетенного состояния, а также снижения аппетита или отказа от корма не было отмечено. Лиофилизированный препарат из штамма «Рокборн» CDV является безвредным, т.к. в течение срока наблюдения все животные остались живыми и клинически здоровыми.

Жидкую часть вакцины контролировали на полноту инактивации (авирулентность), безвредность и фасовали в стерильные флаконы. Жидкий компонент вакцины должен быть стерильным, авирулентным и безвредным.

Полноту инактивации препарата определяли общеизвестным способом, аналогично определению безвредности.

Безвредность и реактогенность сорбированной жидкой части вакцины изучали на группе №2 хорьков, щенков и мышей, которым вводили двукратный прививной объем жидкого компонента вакцины. Период наблюдения за животными составил 10 суток. В группе №2 угнетенного состояния, снижения аппетита или отказа от корма не наблюдалось. Лишь у одной мыши на 3 день наблюдалось образование незначительной припухлости диаметром до 0,2 см на месте инъекции, которое исчезло на 5 сутки.

По результатам проверки безвредности животные оставались живыми в течение всего срока наблюдения. Известно, что местные и общие реакции, зависящие от токсического действия вакцины, наиболее выражены после первого введения препарата, в то время как аллергические свойства проявляются при повторной вакцинации. Реактогенность на аллергические свойства сорбированной жидкой части вакцины изучали на группе №2, после введения второй дозы вакцины, через 21 день после первой иммунизации. Наблюдение за животными в течение 10 дней не выявило каких-либо отклонений со стороны общего состояния организма животных, что говорит о безвредности и ареактогенности жидкой части вакцины.

Безвредность и ареактогенность ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5К» проверяли на 10 хорьках (2 группы по 5 голов), 10 белых мышах (2 группы по 5 голов) и 6 щенках (2 группы по 3 головы).

Для этого брали 10 флаконов лиофилизированного препарата и готовили на физиологическом растворе 10-кратную дозу в прививном объеме 1,0 см³ для хорьков и для щенков, и в прививном объеме 0,2 см³ для мышей. Приготовленный препарат вводили животным внутримышечно в область бедра. Период наблюдений за животными составлял 10 суток. Вакцину считали безвредной и ареактогенной, если в течение срока наблюдения все животные оставались живы и клинически здоровыми. В месте внутримышечного введения вакцины локальные изменения должны отсутствовать. У хорьков и щенков в течении 5 суток проводили ежедневную термометрию.

Группе №2 хорьков, группе №2 щенков и группе №2 мышей для оценки безвредности и ареактогенности вводили двукратный прививной объем жидкого компонента вакцины. Жидкий компонент вакцины считали безвредным и ареактогенным, если в течение срока наблюдения (10 суток) все животные оставались живы и были клинически здоровыми.

При этом на месте введения инъекции допускали небольшое покраснение или уплотнение, которое должно было исчезнуть к концу срока наблюдений.

В течение всего времени наблюдения за животными не было зарегистрировано признаков ответной местной тканевой реакции на введение как лиофилизированного, так и жидкого компонентов вакцины, заболевания и/или гибели животных. Температура тела животных оставалась в пределах физиологической нормы.

Пример 2. Антигенная активность и стабильность ассоциированной вакцины «Карникан-5R»

Антигенную активность вакцины оценивали по результатам вакцинации мышей белых, кроликов и беспородных щенков образцами, при определенных интервалах хранения вакцинного препарата (3 мес., 6 мес., 9 мес. и 12 мес.). Для каждого интервала хранения образца вакцины создавали группы животных, использовали кроликов 45-дневного возраста с массой тела 1,5-3,0 кг в количестве 14 голов (3 опытные группы по 4 головы в каждой и контрольная группа 2 головы), мышей белых массой 18-20 г в количестве 20 голов, беспородных щенков в возрасте 3-4 мес. в количестве 5 голов. Не вакцинированные 2 кролика составляли группу отрицательного контроля.

Каждые 3 месяца формировали новые группы животных с характеристиками, указанными выше (кролики 14 голов, мыши белые 20 голов, беспородные щенки 5 голов) и каждой вновь создаваемой группе вводили вакцину с соответствующим сроком хранения в объеме 1,0 см³ внутримышечно однократно. У всех животных отбирали пробы крови до иммунизации, через 21 день после иммунизации для выявления в РТГА антител к вирусу CPV-2, в РМН антител к вирусам CDV, CCoV, CAV-2, в РН методом FAVN к RabV (табл. 3). Вакцина, введенная однократно внутримышечно, должна вызывать у животных не менее чем 2-кратный прирост антител к вирусу чумы плотоядных, аденовирусу 2 серотипа, вирусу парвовирусного энтерита, вирусу коронавирусного энтерита и бешенству собак по отношению к титрам антител до вакцинации. У контрольной группы антител не должно быть.

Стабильность вакцины исследовали на протяжении 12 месяцев хранения при температуре от 2°С до 8°С с периодичностью осмотра и проведения исследований каждые 3 месяца (табл. 2). Наличие вакуума во флаконах с вакциной проводили по ГОСТ 28083-2012 «Средства лекарственные биологические лиофилизированные для ветеринарного применения. Метод контроля вакуума в ампулах и флаконах» при помощи аппарата Д'Арсонваль. Все подготовленные пробы обоих компонентов вакцины исследовали на стерильность и отсутствие контаминации микоплазмами.

Как представлено в таблицах 1,2 и 3, на всех зачетных интервалах времени при хранении вакцины при температуре от 2°С до 8°С не обнаружили изменений показателей качества препарата: внешний вид, наличие посторонних примеси, наличие вакуума, массовой доли влаги, растворимость, инфекционная активность вируса чумы плотоядных для лиофилизированного компонента; стерильность; полнота инактивации; безвредность и реактогенность; антигенная активность.

Средний титр антител к вирусу чумы плотоядных, аденовирусу и коронавирусу собак должен быть не ниже 1:4 в РН. Вакцина должна вызывать у животных не менее чем 2-кратный прирост антител к вирусу парвовирусного энтерита собак по сравнению с контрольной не вакцинированной группой в РТГА. У 80% собак (4 голов из 5) титр антител к вирусу бешенства в сыворотке крови должен быть равен или выше 0,5 МЕ/см³; или средний титр антител равен или выше титра, полученного в результате тестирования референс-вакцины на мышах.

Инфекционная активность вируса чумы плотоядных в лиофилизированном компоненте вакцины не ниже 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ и составила 3,67±0,14 ТЦД₅₀/см³

Все животные, вакцинированные образцами вакцины, как на момент закладки на хранение, так и образцами после 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения при температуре от 2°С до 8°С, через указанный период были иммунны. Титр антител у животных превышал 2-х кратный прирост антител к вирусам чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции 2 серотипа, бешенства собак, что указывает на стабильность вакцины в течение 12 месяцев.

Пример 3. Применение предлагаемой ассоциированной вакцины «KapHUKan-5R» для иммунизации собак.

Предлагаемая вакцина состоит из 2 компонентов: лиофилизированный компонент (живая вакцина) - лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций; жидкий компонент (инактивированная вакцина) - растворитель для лиофилизированного компонента для приготовления суспензии для инъекций.

Лиофилизированный компонент (живая вакцина) изготовлен из культуральной суспензии перевиваемой линии клеток Vero, инфицированной аттенуированным штаммом «Рокборн» вируса чумы плотоядных (80%), с добавлением стабилизирующих компонентов (% по сухому веществу): гидролизата лактальбумина (9%), сахарозы (9%) и желатозы (2%).

Жидкий компонент (инактивированная вакцина) изготовлен из культуральной суспензии перевиваемых линий клеток CrFK, MDCK и ВНК-21, инфицированных вирусами парвовирусного энтерита собак штамм «Грей», коронавирусного энтерита собак штамм «Рич», аденовирусной инфекции 2 серотипа штамм «Юнити», вируса бешенства штамм «ВНИИЗЖ» - смесь антигенов (90%), инактивированных аминоэтилэтиленимином, с добавлением адъюванта гидроокиси алюминия (10%).

По внешнему виду лиофилизированный компонент вакцины представляет собой сухую однородную пористую массу оттенка бежевого цвета, полностью растворяющуюся в жидком компоненте в течение 2 минут без образования хлопьев и осадка. Жидкий компонент вакцины представляет собой однородную суспензию оттенка розового цвета, при хранении которой допускается выпадение рыхлого осадка, однородность суспензии восстанавливается при взбалтывании (табл.1).

Срок годности вакцины 12 месяцев от даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования. После вскрытия флаконов вакцина может находиться при температуре (20±2)°С и ее необходимо использовать в течение 2 часов. По истечении срока годности вакцина к применению не пригодна.

Во флакон с лиофилизированным компонентом вакцины, содержащий 1 прививную дозу вакцины по CDV, соблюдая правила асептики, при помощи шприца вносили 1,0 см³ жидкого компонента, содержащего 1 прививную дозу вакцины по CPV-2, CCoV, CAV-2 и RabV и тщательно встряхивали.

Вакцину вводили щенкам двукратно с интервалом в 21 сутки внутримышечно в дозе 1,0 см³ в область средней трети бедра с соблюдением правил асептики.

Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у собак к вирусам чумы плотоядных, парвовирусного энтерита и коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции 2 серотипа и бешенства через 14 сутки после двукратного введения, с продолжительностью иммунитета против вирусов чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции 2 серотипа и бешенства собак не менее 12 месяцев.

Пример 4. Эффективность вакцинации предлагаемой вакциной

Эффективность вакцины ассоциированной против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R», изготовленной так, как описано в примере 1, представлена в таблицах 4-6.

Испытание иммуногенной активности полученного препарата проводили на 15 щенках 2-3 месячного возраста, не вакцинированных от чумы плотоядных (CDV), парвовирусного (CPV-2) и коронавирусного энтеритов (CCoV), аденовирусной инфекции (CAV-2), бешенства (RabV), а 3 щенков оставили не вакцинированными в качестве контроля.

Всех 15 щенков разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. На каждой группе испытывали различные схемы применения предлагаемого изобретения.

Щенков группы №1 вакцинировали дважды. Вакцину (предлагаемое изобретение) вводили внутримышечно двукратно с интервалом в 21 сутки в объеме 1,0 см³.

Щенков группы №2 вакцинировали дважды с интервалом в 21 сутки. В 12 месячном возрасте щенкам провели ревакцинацию. Каждый раз вакцину (предлагаемое изобретение) вводили внутримышечно в объеме 1,0 см³.

Щенкам группы №3 вакцину вводили внутримышечно однократно в объеме 1,0 см³.

Схемы отбора проб крови от животных для серологических исследований и результаты исследований титров антител по каждому компоненту вакцины представлены в таблицах 4-6. Сыворотки крови животных исследовали в РТГА на присутствие антител к вирусу CPV-2, в РМН на присутствие антител к вирусам CDV, CCoV, CAV-2, в РН методом FAVN на присутствие антител к RabV. Величину титра антител считали оценкой напряженности поствакцинального иммунитета против данных вирусов. РМН, РТГА и РН методом FAVN ставили по общепринятым методикам.

После вакцинации вакциной против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусных инфекций и бешенства собак «KapHHKaH-5R» на антигены, входящие в состав препарата, иммунная система животных активно реагировала. У животных всех групп наблюдали напряженный иммунный ответ на CDV, CCoV, CPV-2, CAV-2 и RabV на протяжении всего срока наблюдения. Однако у щенков группы №3 (табл. 6) наблюдалось снижение уровня антител к вирусам CDV через 8 месяцев, CPV-2 через 12 месяцев, CCoV через 7 месяцев, CAV-2 через 8 месяцев и RabV через 11 месяцев.

При этом пробы сыворотки, отобранные до вакцинации, показали, что специфические антитела в отношении CDV, CCoV, CAV-2 были <1,0 log₂ в РМН, в отношении CPV-2 находились в диапазоне от 4,00±0,70 до 4,40±0,54, в среднем 4,20±0,56 log₂ в РТГА, в отношении RabV были <0,5 log₂. Данные отображены в таблицах №4-6.

Как показано в таблице 4, двукратная вакцинация щенков (группа №1) позволила получить защитный уровень антител ко всем представленным антигенным компонентам. В течение 12 месяцев уровень вируснейтрализующих антител варьировал к CDV от 7,75±0,25 до 9,15±0,22 log2, к CCoV от 5,08±0,64 с увеличением до 6,10±0,28 log2, к CAV-2 от 4,30±0,89 до 6,35±0,48 log2no данным РМН, к CPV-2 от 7,20±0,44 до 10,40±0,54 log₂ в РТГА и к RabV от 2,60±0,82 до 3,69±0,54 log₂ в РН методом FAVN.

Исходя из данных, представленных в таблице 5 по группе №2, можно наблюдать вариацию уровня вируснейтрализующих антител к CDV от 6,45±0,69 до 9,05±0,59 log₂ в течение года и максимальное значение 9,45±0,44 log₂ после ревакцинации щенков в возрасте 12 месяцев. К CCoV вариация составила от 3,20±0,48 до 6,05±0,48 log₂ и максимальное значение 6,20±0,37 log₂ после ревакцинации щенков в возрасте 12 месяцев. Уровень вируснейтрализующих антител оценивался в РМН к CAV-2 и вариация составила от 4,50±0,91 до 6,20±0,48 log₂ и максимальное значение 6,95±0,45 log₂ после ревакцинации щенков в возрасте 12 месяцев. В РТГА уровень антител к CPV-2 варьировал от 7,80±0,83 до 10,40±0,54 log₂ и максимальное значение 11,20±0,84 log₂ после ревакцинации щенков в возрасте 12 месяцев. Уровень антител в РН методом FAVN к RabV - от 2,15±0,70 до 3,54±0,54 log₂, с максимальным значением после ревакцинации 3,54±0,76 log₂.

Как показано в таблице 6 при использовании третьей схемы вакцинации -группа 3, однократное введение вакцины, позволило защитить щенков от CDV, все животные в течение 12 месяцев имели уровень вируснейтрализующих антител к CDV не ниже 6,45±0,69 log₂. Титр вируснейтрализующих антител в РМН к CCoV составил от 2,35±0,33 log2. Титр вируснейтрализующих антител к CAV-2 был от 2,90±0,20 log2. Уровень специфических антител к CPV-2, выявляемый в РТГА повысился от 7,20±0,44 до 8,60±0,54 log₂. Средний геометрический титр вируснейтрализующих антител к RabV составил от 2,16±0,80 до 3,44±0,91 log₂.

После ревакцинации животных вакциной «Карникан-5К» группы №2 в возрасте 12 месяцев был установлен прирост антител к вирусам CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2, RabV. При тестировании образцов сывороток крови, отобранных от вакцинированных щенков, все пробы были положительными, данные величины статистически тождественны (р=0,05).

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что титры антител против CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2, RabV после ревакцинации значительно увеличились по сравнению с исходными показателями, превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины, и сохранялись на высоком уровне к 21 суткам наблюдения. Титры антител ко всем антигенным компонентам в контрольной группе оставались примерно на одном уровне в течение всего срока наблюдения.

Величина защитного титра антител в работах различных авторов в связи с использованием разных методов оценки отличается и колеблется в пределах: 1:4-1:16 для вируса CDV (РН), 1:2-1:8 для вируса CAV-2 (РН), 0,5 ME и выше для вируса RabV (РН методом FAVN), 1:10-1:40 для вируса CPV-2 (РТГА). При защите от возбудителя CCoV ведущая роль принадлежит секреторным иммуноглобулинам слизистых. Наличие гуморальных антител к вирусу не всегда коррелирует с защитой при контрольном заражении, однако, сероконверсия после вакцинации свидетельствует о системном иммунном ответе на вакцинацию, что, в свою очередь, позволит избежать клинических признаков заболевания коронавирусным энтеритом собак и значительно сократит время выделения вируса CCoV с фекалиями у таких животных.

Как представлено в таблицах 4-6, даже при однократном введении вакцины в прививной дозе уровень антител к CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2 находится в пределах не менее, чем 2-кратного прироста по сравнению с не иммунными животными, к RabV уровень антител превышает уровень защитного титра антител (выше 0,5 МЕ/см³).

На основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R» (предлагаемое изобретение) формирует у иммунизированных животных стойкий иммунный ответ против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции 2 серотипа и бешенства собак продолжительностью не менее 12 месяцев при введении препарата двукратно с интервалом 21 день и ревакцинацией животных в 12 месячном возрасте.

Данные свидетельствуют о том, что полученная вакцина обладает высокой антигенной активностью и вызывает у вакцинированных щенков формирование высоких титров антител к вирусу чумы плотоядных штамма «Рокборн», причем прирост титров антител был постоянным в течение всего срока наблюдений и достигал максимального значения 9,45±0,44 log2 через 21 день после ревакцинации в возрасте 12 мес.

Данные свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина индуцирует у вакцинированных щенков образование высоких уровней антител к вирусу коронавирусного энтерита штамма «Рич». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 сутки после ревакцинации составил 6,20±0,37 log₂.

Данные свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина индуцирует у вакцинированных щенков образование высоких уровней антител к вирусу аденовирусной инфекции 2 серотипа (инфекционному ларинготрахеиту) штамма «Юнити». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 сутки после ревакцинации составил 6,95±0,45 log₂.

Данные свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина индуцирует у вакцинированных щенков образование высоких уровней антител к вирусу парвовирусного энтерита штамма «Грей». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 день после ревакцинации в возрасте 12 мес составил 11,2±0,84 log₂.

Данные свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина индуцирует у привитых щенков образование высоких уровней антител к вирусу бешенства штамма «ВНИИЗЖ». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 сутки после ревакцинации составил 3,54±0,76 log₂.

Пример 5. Определение антигенной активности вируса чумы плотоядных (CDV).

Готовили вакцину против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак путем смешивания лиофилизированного и жидкого компонентов, в соотношении 1:1. Вводили трем хорькам по 1,0 см³ (одна прививная доза) внутримышечно в область бедра. Контрольную группу из трех хорьков оставляли не вакцинированными и содержали отдельно. За животными вели клиническое наблюдение в течение 21 суток, после чего отбирали индивидуальные пробы крови для определения титров сывороточных антител в РМН к вирусу CDV. Пробы сывороток от вакцинированных и не иммунных (контрольных) групп хорьков исследовали методом РМН. Реакцию микронейтрализации ставили по общепринятой методики на микропланшетах в культуре клеток Vero.

Вакцину считали антигенно активной, если через 21 сутки после вакцинации титр антител составляет не ниже 7,17-7,33 logo, средний геометрический 7,39±0,25 log₂ в РМН.

Пример 6. Определение антигенной активности вируса парвовирусного энтерита собак.

Готовили вакцину против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак путем смешивания лиофилизированного и жидкого компонентов, в соотношении 1:1. Вводили трем хорькам по 1,0 см³ (одна прививная доза) внутримышечно в область бедра. Контрольную группу из трех хорьков оставляли не вакцинированными и содержали отдельно. За животными вели клиническое наблюдение в течение 21 суток, после чего отбирали индивидуальные пробы крови для определения титров сывороточных антител в РТГА к вирусу CPV-2. Пробы сывороток от вакцинированных и не иммунных (контрольных) групп хорьков исследовали методом РТГА. Реакцию торможения гемагглютинации ставили по общепринятой методике на микропланшетах с 0,8% суспензией эритроцитов свиньи.

Вакцина считается антигенно активной, если через 21 сутки после вакцинации уровень специфических антител к CPV-2, выявляемый в РТГА повышался до 7-10 log₂ (1:128-1:1024).

Пример 7. Определение антигенной активности вируса коронавирусного энтерита собак

Готовили вакцину против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак путем смешивания лиофилизированного и жидкого компонентов, в соотношении 1:1. Вводили трем хорькам по 1,0 см³ (одна прививная доза) внутримышечно в область бедра. Контрольную группу из трех хорьков оставляли не вакцинированными и содержали отдельно. За животными вели клиническое наблюдение в течение 21 суток, после чего отбирали индивидуальные пробы крови для определения титров сывороточных антител в РМН к CCoV. Пробы сывороток от вакцинированных и не иммунных (контрольных) групп хорьков исследовали методом РМН. Реакцию микронейтрализации ставили по общепринятой методики на микропланшетах в культуре клеток CrFK.

Вакцину считаются антигенно активной, если через 21 сутки после вакцинации титр антител составляет не ниже 3-5 log₂ (1:8-1:32), средний геометрический 4,5±0,90 log₂ в РМН.

Пример 8. Определение антигенной активности вируса аденовирусной инфекции (инфекционного ларинготрахеита) 2 серотипа собак.

Готовили вакцину против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак путем смешивания лиофилизированного и жидкого компонентов, в соотношении 1:1. Вводили трем хорькам по 1,0 см³ (одна прививная доза) внутримышечно в область бедра. Контрольную группу из трех хорьков оставляли не вакцинированными и содержали отдельно. За животными вели клиническое наблюдение в течение 21 суток, после чего отбирали индивидуальные пробы крови для определения титров сывороточных антител в РМН к CAV-2. Пробы сывороток от вакцинированных и не иммунных (контрольных) групп хорьков исследовали методом РМН. Реакцию микронейтрализации ставили по общепринятой методики на микропланшетах в культуре клеток MDCK.

Вакцину считают антигенно активной, если через 21 сутки после вакцинации титр антител составляет не ниже 3-5 log2 (1:8-1:32), средний геометрический 4,67±0,63 log₂ в РМН.

Пример 9. Контроль иммуногенности предлагаемой вакцины по компоненту CAV-2.

Проводили на беспородных щенках 2-3 месячного возраста в количестве 8 голов, не иммунных к вирусам чумы плотоядных (CDV), парвовирусного энтерита (CPV-2) и коронавирусного энтерита (CCoV), аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2) и бешенства (RabV).

Щенков содержали в отдельных изоляторах. Животные псевдослучайным образом были разделены на 2 группы по 4 головы. Группе №1 препарат вводили внутримышечно однократно в область бедра в прививной дозе (1 см³). Для этого, непосредственно перед инъекцией, лиофилизированный компонент вакцины смешивали с жидким компонентом, в соотношении 1:1. Контрольная группа, состоящая из 4 голов, содержалась изолированно и оставалась интактной.

Перед вакцинацией и после 21 суток от всех животных производили отбор проб крови для получения сывороток для исследования в РМН и РТГА по общим принятым методикам на наличие специфических антител к вирусам чумы плотоядных CDV, парвовирусного энтерита CPV-2 и коронавирусного энтерита CCoV, аденовирусной инфекции собак 2 серотипа CAV-2 и бешенства RabV (табл. 7).

Средний титр антител после вакцинации к CDV CAV-2, CCoV и RabV должен быть не ниже 1:4 в РН. Вакцина должна вызывать у животных не менее чем 2-кратный прирост антител к CPV-2 по сравнению с контрольной не вакцинированной группой в РТГА.

Как представлено в таблице 7, после иммунизации предлагаемой вакциной иммунная система животных активно реагировала на антигены, входящие в состав препарата. Через 21 сутки после введения вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5Я» у животных опытной группы №1 наблюдали напряженный гуморальный иммунный ответ на CDV, CCoV, CPV-2, CAV-2 и RabV. Среднегрупповые оценки титров антител к CDV были 7,16±0,52 log₂, к CCoV - 4,56±0,12 log₂, к CAV-2 - 4,66±0,12 log2 (по данным РМН), к CPV-2 - 7,50±0,57 log2 (по данным РТГА), к RabV 2,15±0,70 МЕ/см³ (по данным РН методом FAVN). При этом пробы сывороток, отобранные до вакцинации показали, что специфические антитела в отношении CDV, CCoV и CAV-2 были <1,0 log₂ в РМН, в отношении CPV-2 не превышали 3,25±0,5 log₂ в РТГА, в отношении RabV были <1,0 log₂ в РН методом FAVN.

По результатам можно сделать вывод, что лиофилизированный и жидкий компоненты вакцины не препятствуют формированию иммунного ответа на возбудителей чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак. После введения вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «KapHHKaH-5R» (предлагаемое изобретение) вырабатывается напряженный иммунитет, способный обеспечить надежную защиту против указанных возбудителей. На этом основании считаем, что компоненты вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак совместимы между собой.

Таким образом, ассоциированная вакцина против CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2 и RabV обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью в отношении всех 5 антигенных компонентов и безвредна для собак.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Ассоциированная вакцина против чумы, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «KapHHKaH-5R»:

1. McElhinney, L.M. Diagnostic tools for the detection of rabies virus - L.M. McElhiney, A.R. Fooks, A.D. Radford // EJCAP - 2008. - V. 18. - №3. - P. 224-231.

2. Мороз Н.В. Разработка и усовершенствование контроля ассоциированных вакцин против болезней плотоядных / Н.В. Мороз // Актуальные проблемы науки в АПК: Мат. научно-практ. конф. - Кострома, 2003. С. 102-103.

3. ТУ - 10-09-98-91 - https://www.tenderguru.ru/standart/tu-10-09-98-91?ysclid=18x0pokhe8385403360

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина// Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

5. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и собак: Руководство для практикующих ветеринарных врачей под редакцией Т.И. Алипера. Москва, 2017; 207-212.

6. Биологические свойства и диагностика коронавирусного энтерита собак. Ольшанская А.А. Автореферат диссертации. 1997.

7. Alves CDBT, Granados OFO, Budaszewski RDF, Streck AF, Weber MN, Cibulski SP, Pinto LD, Ikuta N, Canal CW. Identification of enteric viruses circulating in a dog population with low vaccine coverage. Braz J Microbiol. 2018 Oct-Dec;49(4):790-794. Doi: 10.1016/j.bjm.2018.02.006. Epub 2018 Mar 15. PMID: 29588198; PMCID: PMC6175709.

8. Ветеринарная патология / Ольшанская A. A. // «Диагностика и профилактика коронавирусного энтерита собак». - 1997 г.

9. Greene СЕ. et al. Canine viral enteritis // In: Infectious diseases of the dog and cat, 4th ed., Elsevier, 2012; p.67-80.

10. Белоусова P.B., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. Москва, 2006.

11. Сулимов, А.А. Вирусные болезни собак / А.А. Сулимов, В.И. Уласов. • М.: КолосС, 2006. - 110 с.

12. Gillespie, «А Study of Inactivated Distemper Virus in the Dog', pp.3-8, Veterinary Virus Research Institute, 1964.

13. Инструкция по применению вакцины Nobivac DHPPi // https://www.vetlek.ru/shop/?gid-188&id=498.

14. Инструкция по применению вакцины «Вангард 7» // https://www.vetlek.ru/shop/?gid-188&id=l 169.

15. Инструкция по применению вакцины Эурикан DHPPI2-L // https://vetsnab.info/vetpreparaty/eurikan-dhppi2-l.

16. Антигенная активность усовершенствованной вакцины против чумы, аденовирусных инфекций, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, лептоспироза и бешенства собак «Мультикан-8» [Электронный ресурс] // Ветбиохим: https://vetbio.ru/public/articles/statya-antigennaya-aktivnost-usovershen stvovannoy-vaktsiny-multikan-8/

17. Инструкция по применению вакцины Биокан DHPPi+LR для профилактики чумы, аденовироза, инфекционного гепатита, парвовироза, парагриппа, лептоспироза и бешенства собак (организация-разработчик: АО Биовета, Чешская республика).

18. Патент №2150295С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01). Вакцина «Бионор» против чумы, вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза норок, вакцинный штамм вируса чумы плотоядных ЭПММ и вакцинный штамм парвовируса плотоядных «Геркулес»: (№98117280/13: заявл. 18.09.1998 г.: опубл. 10.06.2000 г. / Сулимов А.А., Колышкин В.М., Уласов В.И. и др.; заявитель ТОО «Биоцентр» - 5 с. - Текст: непосредственный.

19. Патент №2154496 С2 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01), А61К 39/175 (2006.01), А61К 39/23 (2006.01.), А61К 39/245 (2006.01), C12N 7/00 (2006.01), C12R 1/93 (2006.01). Вакцина против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных: (№97121184/13: заявл. 04.12.1997 г.: опубл. 20.08.2000 г. / Балышев В.М., Вишняков И.Ф., Федорищев И.В. и др.; заявитель ВНИИ ВВиМ - 9 с. - Текст: непосредственный.

20. Патент №2147441 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01), А61К 39/175 (2006.01), А61К 39/23 (2006.01.), А61К 39/235 (2006.01), А61К 39/29 (2006.01), C12N 7/00 (2006.01). Штамм вируса Virus distemper canis «Владимир» для изготовления вакцины против чумы плотоядных и вакцины «Владивак» против вирусных болезней плотоядных на его основе: (№98108718/13: заявл. 12.05.1998 г.: опубл. 20.04.2000 г. / Элизбарашвили Э.И., Уласов В.И., Рахманина М.М. и др.; заявитель Сазонкин В.Н. - 8 с. - Текст: непосредственный.

21. Патент №2030917С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01). Вакцина для профилактики чумы, инфекционного гепатита, аденовирусных инфекции и парвовирусного энтерита у собак и способ профилактики чумы, инфекционного гепатита, аденовирусных инфекции и парвовирусного энтерита у собак: (№4953741/13: заявл. 28.06.1991 г.: опубл. 20.03.1995 г. / Уласов В.И., Селиванов А.В., Сулимов А.А. и др.; заявитель ВГНИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов -10 с. - Текст: непосредственный.

22. Патент №2546247 С2 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01), А61Р 31/12 (2006.01). Вакцина против чумы, аденовирусных инфекций, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, лептоспироза и бешенства собак: (№2013126074/10: заявл. 06.06.2013 г.: опубл. 10.04.2015 г. / Непоклонов Е.А., Алипер Т.Н., Мусиенко М.И. и др.; заявитель АНО «НИИ ДПБ» - 22 с. - Текст: непосредственный.

23. Патент №SU 527072 A1 СССР, МПК С12К 5/00 (1990.01). Способ получения вакцины против чумы плотоядных «Вакчум»: (№2019238: заявл. 25.04.1974 г.: опубл. 25.10.1977 г. / Чумаков М.П., Прохорова И.А., Грачев В.П. и др.; - Текст: непосредственный.

24. Болезни собак / Практическое руководство для ветеринарных врачей // Ниманд Х.Г., Сутер П.Ф. - М.: Аквариум. - 1998.

25. Львов Д.К. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Медицинское информационное агентство. Москва, 2013.

26. Иммунобиологические свойства возбудителей парвовирусного энтерита и чумы плотоядных, используемых для изготовления биопрепаратов. Автореферат диссертации, Галкина Т.С., 2008 г.

27. Патент №2242994С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/23 (2006.01.), C12N 7/00 (2006.01). Штамм №R-72 ВНИИЗЖ парвовируса собак для изготовления диагностических и вакцинных препаратов: (№2003124490/13: заявл. 05.08.2003 г.: опубл. 27.12.2004 г. / Старов С.К., Герасимова Н.И., Фомина Т.А. и др.; заявитель ФГУ ВНИИЗЖ - 10 с. - Текст: непосредственный.

28. Патент №93031257А Российская Федерация, МПК А61К 39/23 (1995.01), C12N 7/00 (1995.01). Штамм Parvovirus canin для контроля и приготовления иммунологических препаратов: (№93031257/13: заявл. 31.05.1993 г.: опубл. 10.06.1996 г. / Сулимов А.А., Уласов В.И.; заявитель ТОО «Биоцентр» - Текст: непосредственный.

29. Патент №21476090 Российская Федерация, МПК C12N 7/00 (2006.01), А61К 39/23 (2006.01.), А61К 39/235 (2006.01), А61К 39/29 (2006.01), А61К 39/295 (2006.01). Штамм вируса Canine parvovirus «Риэль» для изготовления вакцины против парвовирусной инфекции и вакцины «Владивак» против вирусных болезней плотоядных на его основе: (№98108729/13: заявл. 12.05.1998 г.: опубл. 20.04.2000 г. / Элизбарашвили Э.И., Уласов В.И., Рахманина М.М. и др.; заявитель Сазонкин В.Н. - 8 с. - Текст: непосредственный.

30. Патент №2003124490А Российская Федерация, МПК А61К 39/23 (2006.01), C12N 7/00 (1995.01). Штамм No R-72 ВНИИЗЖ парвовируса собак для изготовления диагностических и вакцинных препаратов: (№2003124490/13: заявл. 05.08.2003 г.: опубл. 27.01.2005 г. / Старов С.К., Герасимова Н.И., Фомина Т.А. и др.; заявитель ФГУ ВНИИЗЖ - 1 с. - Текст: непосредственный.

31. Decaro N. et al. Fecal immunoglobulin A antibodies in dogs infected or vaccinated with canine coronavirus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004; 11:102-105.

32. Шалдин H.H. Аденовирусная инфекция у собак. - URL: https://mosk-vet.ru/dis_ca/inf/art.php?ID=755, дата обращения 28.12.2022 г. ).

33. G. Koptopoulos, Cornwell H. J. C. 1981; Аденовирусы собак: обзор. Ветеринарный бюллетень 51:135-142.

34. Difference Analysis Between Canine Adenovirus Types 1 And 2 URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.854876 /full, дата обращения 12.01.2023).

35. Патент №2150296C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/295 (2006.01). Вакцина «Биовак» против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита, аденовироза и лептоспироза собак: (№98117482/13: заявл. 18.09.1998 г.: опубл. 10.06.2000 г. / Сулимов А.А., Колышкин В.М., Уласов В.И. и др.; заявитель ТОО «Биоцентр» - 5 с. - Текст: непосредственный.

36. Гаврилов А. В., Зотова А. В. Учебное пособие «Бешенство». - Благовещенск, 2020. - 38 с.

37. Мари Н.Н. Основы учения о зоонозах. Вып.2. Бешенство. СПб., 1909. 222 с.

38. Tordo, N. Structure of rabies virus / N. Tordo, O. Poch // Rabies. - Boston: Kluwer Academic Publishers, 1988. - P. 25-45.

39. Kuzmin IV, Tordo N. 2012. Genus Lyssavirus In Rhabdoviruses: Molecular Taxonomy, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control, pp.37-58. Norfolk, UK: Caister Academic Press.

40. Dietzgen RG. 2012. Morphology, Genome Organization, Transcription and Replication of Rhabdoviruses In Rhabdoviruses: Molecular Taxonomy, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control, ed. Dietzgen RG, Kuzmin IV, pp.5-12. Norfolk, UK: Caister Academic Press.

41. Самерханов И.И. Эпизоотологический анализ и контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных в республике Татарстан: дис. канд. биол. наук: 06.02.02: защищена 2018 г. / Самерханов И.И. -Казань, 2018. - 125 с. - Библиогр.: с. 17

42. Meslin, F.X. Laboratory Techniques in Rabies / F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski // Laboratory techniques in rabies. WHO. 4-th ed. - Geneva, 1996. - P. 9-27.

43. Инструкция по применению вакцины для собак против бешенства и лептоспироза // https://www.vetlek.ru/shop/?gid-188&id=6120.

44. Инструкция по применению вакцины против бешенства «Рабизин» https://www.vetlek.ru/shop/?gid-188&id=l 303

45. Патент №955577А1, МПК А61К 39/205 (2006.01). Вакцина для профилактики бешенства крупного рогатого скота: (№3254001/15: заявл. 03.03.1981 г.: опубл. 15.08.1994 г. / Кузнецов ПЛ., Иванов B.C., Панов B.C. и др.;- 5 с. - Текст: непосредственный.

46. Патент №2134590С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/205 (2006.01), C12N 7/04 (2006.01). Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных: (№97119126/13: заявл. 24.11.1997 г.: опубл. 20.08.1999 г. / Михалишин В.В., Лезова Т.Н., Улупов Н.А. и др.; заявитель ВНИИЗЖ - 10 с. - Текст: непосредственный.

47. Патент №23119240 Российская Федерация, МПК А61К 39/205 (2006.01). Вирус-вакцина против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных и способ ее изготовления: (№2005138318/13: заявл. 09.12.2005 г.: опубл. 10.12.2007 г. / Хрипунов Е.М., Евсеева С.Д., Жестерев В.И. и др.; заявитель ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии - 5 с. - Текст: непосредственный.

48. Патент №24924520 Российская Федерация, МПК G01N 21/64, А61К 39/205 (2006.01). Способ контроля полноты инактивации антирабической инактивированной вакцины: (№2012107274/10: заявл. 29.02.2012 г.: опубл. 10.09.2013 г. / Лаптева О.Г., Балышева В.И., Глухарева Е.Н.; заявитель ГНУ ВНИИВВиМ Российской академии сельскохозяйственных наук - 6 с. - Текст: непосредственный.

49. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

50. «Методические рекомендации по титрованию вируса чумы плотоядных микрометодом» /A.M. Киселев, А.А. Комарова, Т.С.Галкина, А.А. Климова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 10 с.

51. «Методические рекомендации по титрованию возбудителя парвовирусного энтерита собак микрометодом» / А.А. Климова, А.А. Комарова, A.M. Киселёв, Т.С. Галкина; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 9 с.

52. «Методические рекомендации по титрованию вируса коронавирусного энтерита собак микрометодом» /А.А. Комарова, Т.С. Галкина, A.M. Киселев, А.А. Климова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 10 с.

53. «Методические рекомендации по титрованию вируса аденовироза собак микрометодом» / А.А. Климова, А.А. Комарова, A.M. Киселев, Т.С.Галкина; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 10 с.

54. Инфекционные болезни мелких домашних животных. //А.А. Шевченко, Д.Ю. Зеркалев, Л.В. Шевченко, О.Ю. Черных, Е.А. Горпинченко//Учебное пособие: Краснодарский ЦНТИ- филиал ФГБУ «РЭА» Минэнерго России (Краснодар), 2018.

55. ГФ XIV, т.2, с. 2997-3008 Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

56. https://veterinarka.ru/vetmedicaments/dipentavac.html?ysclid=lied52trvq963881249

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine K5.

xml.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-04-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-24</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>501</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-24</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Ассоциированная вакцина против

чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов,

аденовирусной инфекции и бешенства собак

«Карникан-5R</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>10</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1824</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1824</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine

morbillivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgctctcctaccaagacaaggtgggtgccttctataaagataatgcaa

gagctaattcatccaagctgtccttagtgacagaagagcaagggggcaggagaccaccctatttgctgtt

tgtccttctcatcctactggttggaatcatggccttacttgctatcactggagttcgatttcaccaagta

tcaactagcaatatggaatttagcagattgctgaaagaggatatggagaaatcagaggccgtacatcacc

aagtcatagatgtcttgacaccgctcttcaaaattattggagatgagattgggttacggttgccacaaaa

actaaacgagatcaaacaatttatccttcaaaagacaaacttcttcaatccgaacagggaattcgacttc

cgcgatctccactggtgcattaacccacctagtaagatcaaggtgaatttaactaattactgcgatacaa

ttgggctcagaaaatctattgcatcggcagcaaatcccatccttttatcagcactctccagaggcagagg

tgacatattcccaccatacagatgcagtggagctactacttcagtaggcagatttttccccctatcagta

tcattgtccatgtctttgatctcaagaacatcagagataatcaatatgctaaccgctatctcagacggag

tgtatggtaaaacttatttgctagtgcctgattatattgaaggggagttcgacacgcaaaagattcgagt

ctttgagatagggttcatcaaacggtggctgaatgacatgccattactccagacaaccaactatatggtc

ctcccggagaattccaaagccaaggtatgtactatagcagtgggcgagttgacactggcttccttgtgtg

tagatgagagcaccgtattgttatatcatgacagcaatggttcacaagatggtattctagtagtgacgct

gggaatatttggggcaacacctatggatcaagttgaagaggtgatacctgtcgctcacccatcagtagaa

aaaatacatataacaaatcaccgtgggttcataaaagattcaatagcaacctggatggtgcctgcattgg

tctctgagaaacaagaggaacaaaaaaattgtctggagtcggcttgtcaaagaaaatcctaccctatgtg

caaccaaacgtcatgggaaccctttggaggaggacagttgccatcttatgggcggttgacattacctcta

gatccaagtattgaccttcaacttaacatatcgtttacatacggtccggttatactgaatggagacggta

tggattattatgaaagcccacttttggactccggatggcttaccattcctcccaagaacggaacagtcct

tggattgataaacaaagcaagtagaggagaccagttcactgtaatcccccatgtgttgacatttgcgccc

agggaatcaagtggaaattgttatttacctattcaaacattccagattatggataaagatgtccttactg

agtccaatttagtggtgttgcctacacagaattttagatatgtcatagcaacatatgatatatcccggga

cgatcatgcgattgtttattatgtttatgacccaatccggaagatttcttttacgtacccatttagacta

actaccaagggtagacctgatttcctaaggattgaatgttttgtgtgggatgacgatttgtggtgtcacc

aattttaccgattcgaggctgacatcaccaactttacaaccagtgttgagaatttagtccgtataagatt

ctcatgtaaccgttcaaaaccttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>608</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..608</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine

morbillivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MLSYQDKVGAFYKDNARANSSKLSLVTEEQGGRRPPYLLFVLLILLVGI

MALLAITGVRFHQVSTSNMEFSRLLKEDMEKSEAVHHQVIDVLTPLFKIIGDEIGLRLPQKLNEIKQFIL

QKTNFFNPNREFDFRDLHWCINPPSKIKVNLTNYCDTIGLRKSIASAANPILLSALSRGRGDIFPPYRCS

GATTSVGRFFPLSVSLSMSLISRTSEIINMLTAISDGVYGKTYLLVPDYIEGEFDTQKIRVFEIGFIKRW

LNDMPLLQTTNYMVLPENSKAKVCTIAVGELTLASLCVDESTVLLYHDSNGSQDGILVVTLGIFGATPMD

QVEEVIPVAHPSVEKIHITNHRGFIKDSIATWMVPALVSEKQEEQKNCLESACQRKSYPMCNQTSWEPFG

GGQLPSYGRLTLPLDPSIDLQLNISFTYGPVILNGDGMDYYESPLLDSGWLTIPPKNGTVLGLINKASRG

DQFTVIPHVLTFAPRESSGNCYLPIQTFQIMDKDVLTESNLVVLPTQNFRYVIATYDISRDDHAIVYYVY

DPIRKISFTYPFRLTTKGRPDFLRIECFVWDDDLWCHQFYRFEADITNFTTSVENLVRIRFSCNRSKPA<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>414</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..414</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine parvovirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtg

taactcaaatgggaaaaacaaactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatag

tgcaccatattattcttttgaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctattgcagcaggacggggg

ggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaagatatgcatttggtagacaacatggtc

aaaaaactaccacaacaggagaaacacctgagagatttacatatatagcacatcaagatacaggaagata

tccagaaggagattggattcaaaatattaactttaaccttcctgtaacagatgataatgtattgctacca

acagatccaattgga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>138</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..138</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine parvovirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GTNFGYIGVQQDKRRGVTQMGKTNYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEAS

TQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAFGRQHGQKTTTTGETPERFTYIAHQDTGRYPEGDWIQNI

NFNLPVTDDNVLLPTDPIG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>141</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..141</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaagaacagttattattgttccagcgcaacatgcctatgatgcctataa

gaattttatgcgaattaaagcatataaccccgacgaagcactccttgtttgaactaaacaaaatgaagat

tttgttagtattagcgtgtgcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EEQLLLFQRNMPMMPIRILCELKHITPTKHSLFELNKMKILLVLACA</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>285</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..285</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine adenovirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catcatcaataatatacaggacaaagaggtgtggcttaaatttgggtgt

tgcaaggtttttggtcatgggaaaatcaggttcaggtcacgccctgtttttggtgttcccacgggaatgt

ccatgacgtcaaaggcgtggttttcggacttttggccggcgccccgtttttgggcgtttattgattttgc

ggtttacgggtggtgcttttaccactgtttgcggaagatttagttgtttatggagctggttttggtgcca

gttctccacgcctaatgtcaaagttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>95</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..95</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine adenovirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>HHQYTGQRGVAIWVLQGFWSWENQAVQVTPCFWCSHGNVHDVKGVVFGL

LAGAPAFLGVYFCGLRVVLLPLFAEDLAVVYGAGFGASSPRLMSKF</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>612</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..612</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RabV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgcttaacaacaagatcaaagaagaagcagacagtgtcatttgcagag

caaaaatgtaacacctctacaatggataccgacaagattgtattcaaagttaataatcaggtggtctctt

taaagcctgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaaaaagccctg

tataaccctagggaaagcccccgacttgaacaaagcatacaaatcagttttatcaggcatgaatgctgcc

aaacttgatcccgatgatgtatgttcctacttggcagcagcaatgcagttctttgaggggacgtgtccgg

aagactggaccagctacgggatcttgattgcacggaaaggagacaagatcaccccaaattctctagtgga

aataaagcgtactgatgtagaagggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagggaccccact

gtccctgagcatgcatctttggtcggtcttctcctgagtctgtataggttgagcaaaatatcaggacaaa

acaccggtaactataaaacaaacattgcagataggatagagcaggttttcgagacagccccttttattaa

aat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>204</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..204</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RabV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TLNNKIKEEADSVICRAAKMHLYNGYRQDCIQSSGGALFKADYRAGSIV

QVPACYQRFEKAALYNPRESARLEQSIQISFIRHAECCQATSRCMFLLGSSNAVLGDVSGRLDQLRALDC

TERRQDAHPKFSSANKAYCRELGSDRRHGTDKGAPHCPAACAIFGRSSPAESVVEAQNIRTKHARLNKHC

RDRAGFRDSPFYNAA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена Вакцина ассоциированная против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак. Вакцина содержит активное вещество и целевую добавку. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из аттенуированного очищенного антигенного материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных, вида Morbillivirus canis, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Грей» вируса парвовирусного энтерита собак, вида Carnivore protoparvovirus 1, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, вида Alphacoronavirus 1, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции 2 серотипа собак, вида Canine mastadenovirus А, серотипа 2, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства, вида Lyssavirus rabies, в качестве целевых добавок: 3%-ный гель гидроокиси алюминия и стабилизатор; взятых в эффективном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме собак после введения ему целевого препарата. Изобретение позволяет создать безопасную и высокоиммуногенную вакцину против основных инфекционных болезней собак, содержащую сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные антигены, обеспечивающую формирование устойчивого иммунитета по отношению к вирусу чумы плотоядных (CDV), аденовирусу (CAV-2) инфекционному ларинготрахеиту, парвовирусному (CPV-2) и коронавирусному энтеритам собак (CCoV), и бешенству (RabV). 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 табл., 8 пр.

Вакцина ассоциированная против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит два компонента: жидкий компонент - смесь из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Грей» парвовирусного энтерита собак, вида Carnivore protoparvovirus 1, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Рич» коронавирусного энтерита собак, вида Alphacoronavirus 1, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №376 - деп/22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Юнити» аденовирусной инфекции (инфекционного ларинготрахеита) собак вида Canine mastadenovirus А, серотипа 2, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №456 - деп/23-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства вида Lyssavirus rabies, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: «ВНИИЗЖ»-ДЕП фиксированного вируса бешенства и лиофилизированный компонент - лиофилизированный аттенуированный очищенный антигенный материала из штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных вида Morbillivirus canis, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №28 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; и целевые добавки: 3%-ный гель гидроокиси алюминия и стабилизирующая среда, взятые в объемном соотношении 22,5:22,5:22,5:22,5:10,0 и 80,0:20,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммуногенную активность каждого антигена в организме собак после введения им целевого препарата.