Штамм @ @ ,используемый для тестирования мутагенных агентов Советский патент 1986 года по МПК C12Q1/02 C12N15/00 C12Q1/02 C12R1/42 

|)

о

QD СП

СА9 Изобретение относится к области Микробиологии, в частности, к генетике микроорганизмов, и может быть использовано для отбора мутагенных агентов, Целью изобретения является создание нового штамма, позволяющего в от сутствие R-плазмид эффе.ктивно выявлять мутагенные агенты, Ц1 дуцирую1цие мутации различного рода возникающие в результате замены пар оснований и/или сдвига рамки считывания. Salmonella typhimurium штамм AG 262 (№ 59) получен на основе штамма Эймса ТА 1535. Штамм AG 262 получен в результате мобилизации с помощью плазмиды Ridrd 16 фрагмента хромосомы E.coli, содер жащего umu С -ген, В геном этого штамма в результате обработки YCR-191 введена мутация в аргининовый ген, возникшая вследст вие сдвига рамки считывания. Arg-мутация картирована на 88 мин.генетической карты сальмонелл, Штамм Salmonella typhimurium хранится в Музее микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в лиофилизированном виде под номером 59 и характеризует следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы разме ром 2-4 X 0,5 мк, подвижные граммот рицательные. Культуральные свойства. Ауксотроф: зависит от гистидина и аргинина. Не утилизирует лактозу. На минш альной синтетической сре де А с добавками гистидина и аргини на (по 30 мкг/мл) и глюкозы (0,4%) через 48 ч роста при образует колонии, имеющие диаметр 1,5-2 мм с ровными краями. На L-arape через 24 ч роста дает мелкие блестящие колонии до 2 мм в диаметре, В L-бульоне растет в виде равномерного помутнения, На питательном агаре Дифко через 24 ч роста при образует очень мелкие (до 0,5 мм) колонии с гладкой поверхностью. Генетическая характеристика. Штамм № 59 представляет собой ги РИД, образовавшийся в результате ре комбинации фрагментов хромосомы Ё.с 11, несущих гены trp, umuC , gal, bio, с хромосомой S. typbitnurium, ;Штамм AG 262 сохранил ряд существен 32 ных для его использования мутаций исходного штамма ТА 1535: мутацию по эксцизионной репарации - uvr В, мутацию, изменяющую проницаемость клеточной стенки, - rfa, мутацию hisG 46, возникшую в результате замены пар оснований. Новая мутация в arg-гене в штамме № 59 является мутацией сдвига рамки считывания. Штамм АС 262 не несет, маркера канамицинрезистентности, свойственного плазмиде, исполь зованной для получения гибрида. Фон спонтанных реверсий к гистидиннезависимости 2-6/10 , к аргининнезависимости 1-3/10. Пример 1, Мутагенное действие 4 нитрохинолин-1-оксида 4(НХО), Бактерии испытуемых штаммов выращивают в L-бульоне в течение 18 ч при 37°С. Через 18 ч культуры разводят в 10 раз свежим L-бульоном и выращивают на качалке при 37С до логарифмической фазы роста. Затем культуры отмывают физиологическим раствором с помощью-центрифугирования, ресуспендируют в фосфатном буфере (рН 7) и добавляют мутаген. После инкубации в течение 60 мин при 37С культуры отмывают от мутагена центрифугированиeмj ресуспендируют в физиологическом растворе и высевают без разведения на среду, селективную для his мутагенов, возникших в результате замены пар оснований. Дпя учета выживших соответствующие разведения культур высевают на минимальную среду, содержащую полные добавки аминокислот. Рабочий раствор 4НХО готовят в этаноле и хранят при +4°С. Учет результатов производят через 48 ч инкубации при . Расчет частоты 1 утагенеза производят по формуле М -J-, где М - часU , тота индуцированных мутаций; а среднее количество мутантов на чаш- ке при данной дозе; b - среднее количество мутантов на ч.ашке в необработанной пробе; d - среднее число клеток, выживших при данной дозе мутагена. Дпя сравнения полученных результатов во всех опытах наряду с предлагаемым штаммом берут известные штаммы системы ЭйМса, 4НХО - сильнейщий канцероген, требующий для проявления мутагенного действия индукции SOS-системы репарации ДНК, вызывает почти равно выра31женный мутагенез (замена пар оснований) на сконструированном штамме 59 и содержащем R-плазмиду штамме ТА 100 и не вызывает мутагенез у бесплазмид ного штамма ТА 1535. Пример 2. Мутагенное действи этилметансульфоната (ЭМС).Определение влияния ЭМС проводят, как описано в примере 1. ЭМС-агент-, не требующий для проявления мутагенного действия индукции SOS-системы репарации ДНК, оказывает почти равно выраженный мутагенный эффект относительно всех 3 испытуемых штаммов, П р и м е р 3. Мутагенное действие диаминодиокСиодигидродиазопирена (ДИАМ). Определение влияния ДИАН проводят как описано в примере 1, Селективная среда для Arg -мутантов содержит 30 мкг/мл гистидина и 0,7 мкг/мл аргинина. 534 Мутагенная активность ДИАМ-соединения, индуцирующего мутации сдвига рамки считывания, которые в подавляющем большинстве случаев не требуют активности гена umu С , равно выражены для всех 3 испытуемых штаммов до дозы 10 мкг/мл. При более высоких дозах штамм 59 дает более выраженный мутагенез. Однако выявление мутаций сдвига рамки считывания при использовании штаммов системы Эймса требует применения других, нежели в первых двух примерах, штаммов. С аналогичными результатами были испытаны еще 5 различных агентов, относящихся к различным классам соединений: УФ-свет (как в примере 1) метилметансульфонат (ММС) и N-метилЫ-нитро-Ы-нитрозогуанидин (НГ), как в примере 2. YCR-191, 9-аминоакридин (9АА), как в примере 3.

Штамм Salmonella typhiraurium № 59 (Музей микроорганизмов Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, используемый для тестирования мутагенных агентов. (Я с