СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИ НЕЙРОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК В СФОРМИРОВАННУЮ НЕЙРОННУЮ СЕТЬ С НАПРАВЛЕННОЙ СВЯЗЬЮ IN VITRO Российский патент 2024 года по МПК C12M3/00 C12N5/02 C12N5/07 C12N5/71 C12N5/79 

Уровень техники

Клеточная и тканевая биоинженерия одно из наиболее перспективных направлений медицины. Замещение поврежденных или не функционирующих клеток может стать методом лечения болезней, на сегодняшний день считающихся неизлечимыми. В целом клеточную терапию можно разделить на несколько направлений: трансплантация клеток-предшественников, взрослых стволовых клеток, трансплантация дифференцированных клеток, готовых к выполнению своих функций, и трансплантация генетически модифицированных клеток с исправленными дефектами.

При лечении заболеваний вызванных клеточными дефектами или генетическими отклонениями всегда необходимо учитывать ряд важных факторов:

• Во-первых, введение чужеродного клеточного материала вызывает иммунологическое отторжение. И даже при использовании «совместимого» материала реципиенты вынуждены принимать иммунодепрессанты в течение всей жизни.

• Во-вторых, возможность получить клетки донора физически ограничена - доступны лишь некоторые клеточные типы - например, клетки костного мозга, но доступное количество даже этих клеток может быть недостаточным для лечения. Если же говорить про нейроны, гепатоциты и другие специализированные клетки, то их практически невозможно получить.

• В-третьих, дифференцированные клетки взрослого организма чаще всего уже неспособны к делению, находятся в своей клеточной нише и непригодны для пересадки.

Заболевания нервной системы, связанные с нарушением функционирования и гибелью нейронов, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, в настоящее время не поддаются лечению. Рассеянный склероз - болезнь, связанная с демиелинизацией аксонов в центральной и периферической нервной системе, также неизлечима. В то же время известно, что, например, признаком болезни Паркинсона является гибель дофаминергических нейронов в черной субстанции среднего мозга, а при рассеянном склерозе выработку миелина прекращают олигодендроциты. Клеточная терапия и трансплантация функциональных нейральных клеток являются перспективным подходом для лечения таких заболеваний.

Аналог

Известен патент на изобретение №2729814, дата приоритета: 27.12.2019 г. «УСТРОЙСТВО ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЕННОЙ СВЯЗИ МЕЖДУ ПОПУЛЯЦИЯМИ НЕЙРОНАЛЬНЬГХ КЛЕТОК», представляющий собой устройство для создания направленной связи между популяциями нейрональных клеток. Устройство включает связанных между собой микроканалами камеру-источник и камеру-приемник. Микроканал выполнен из нескольких секций треугольной формы, причем вершины треугольников предыдущих секций соединены с центрами оснований последующих секций, основания направлены в сторону камеры-источника, а вершины треугольников направлены в сторону камеры-приемника. Изобретение обеспечивает высокое качество направленной функциональной связи между популяциями нейрональных клеток, низкую вероятность передачи биоэлектрических импульсных сигналов в противоположном заданному направлении, возможность определения приблизительного расположения синаптических контактов между двумя соединенных заданной направленной связью популяциями клеток мозга in vitro и воздействия на отдельные группы аксонов электрическими стимулами. Недостатком данного изобретения является то, что чип включает две камеры для культивирования клеток, и микроканалы высотой 2-4 мкм между камерами, в которые прорастают отростки нейронов, но не попадают тела нейронов. Длина микроканалов более 200 мкм позволяет прорасти через них только аксонам, но не дендритам нейронов.

Задачей предлагаемого изобретения является моделирование восстановления ткани мозга со сложной структурой связей в результате интеграции диссоциированнных нейрональных клеток.

Технический результат достигается за счет культивирования диссоциированных нейрональных клеток в трех изолированных камерах микрофлюидного чипа, связанных микроканалами.

Предлагаемое изобретение, позволяет интегрировать диссоциированныенейрональные клетки в сформированную нейронную сеть с направленной связью invitro, может быть использовано в биологических лабораториях для моделирования восстановления ткани мозга со сложной структурой связей в результате интеграции диссоциированнных нейрональных клеток.

Предлагаемое изобретение основано на использовании платформы на основе микрофлюидных чипов, совмещеных с микроэлектродными матрицами (МЕА). Устройство предполагает направление растущих клеточных отростков в микроканалах (1) от одной популяции нейрональных клеток (популяция источник) (2) к другой (популяция приемник) (4) через среднюю камеру (камера для интеграции клеток) (3) и предотвращение роста аксонов в противоположном направлении, что позволяет создать нейронную сеть, состоящую из отдельных клеточных популяций, связанных слабой однонаправленной связью, и позволяет интегрировать клетки точно в область слабой связи между двумя популяциями.

Формирование популяций нейрональных клеток осуществляется за счет культивирования диссоциированных нейрональных клеток в трех изолированных камерах микрофлюидного чипа, связанных микроканалами (1). Малая высота микроканалов (5-7 мкм) позволяет отделить тела клеток от отростков и обеспечивает взаимосвязь нейрональных популяций только за счет синаптических связей, образованных отростками, растущих в микроканалах (1). Направленность связей обеспечивается асимметричной формой каналов (I). Каналы (I), соединяющие камеру источник (2) и камеру для интеграции(З), имеют длину 400 мкм и обеспечивают прорастание аксонов популяции-источника в камеру для интеграции (3) за 5 суток (более 95% микроканалов). Длина дендритов составляет менее 400 мкм, поэтому они не прорастают в камеру для интеграции (3). Связывающие камеру для интеграции (3) и камеру приемник (4) каналы (1) имеют длину 600 мкм и 4 ловушки, препятствующие росту аксонов из камеры приемника (4) в камеру для интеграции (3). Расстояние между камерой приемником (3) и камерой источником (2) не превышает 1200 мкм, что позволяет аксонам клеток из камеры источника прорастать до камеры приемника (4) и формировать синаптические связи. Посадка клеток в камеру для интеграции (3) осуществляется на 5-7 день после посадки в камеры источник (2) и приемник (4). (фиг. 1). На фиг. 2 изображены сравнительные графики, показывающие спонтанне. активность культуры клеток гиппокампа мышей в трехкамерном микрофлюидном чипе, а именно число сетевых импульсов в минуту в источнике (5), имплантате (6) и приемнике (7) соответственно. На фиг. 3 изображена спонтанная активность культуры клеток гиппокампа мышей в трехкамерном микрофлюидном чипе, а именно указано распространение сетевых импульсов в %, от источника в имплантат (8), и от имплантата в приемник (9), соответственно. На фиг. 4, изображен сравнительный график задержки распространения сетевых импульсов, мс, от источника в имплантат (10), от имплантата в приемник (11). На фиг. 5 изображены графики распространения ответов на стимулы между модулями нейронной сети в трехкамерном чипе, а именно число импульсов в интервале 2 мс в гистограмме ответов на стимулы (PSTH); ответ в имплантате на стимуляцию источника (12), ответ в имплантате на стимуляцию приемника (13). На фиг. 6 изображены графики распространения ответов на стимулы между модулями нейронной сети в трехкамерном чипе, а именно число импульсов в интервале 2 мс (PSTH); ответ в приемнике на стимуляцию источника (14), ответ в источнике на стимуляцию Приемнике (15).

Предлагаемое устройство обеспечивает высокую точность интеграции клеток в область слабой направленной связи между двумя подсетями нейрональных клеток. Устройство компактно и совместимо со стандартными коммерческими микроэлектродными матрицами, что позволяет неинвазивно оценивать электро физиологические характеристики каждого модуля.

Подсадка клеток в камеру для интеграции (3) может проводиться на 5-7 день культивирования клеток в камерах источнике и приемнике и приводит к формированию однонаправленного распространения сетевой биоэлектрической активности от популяции источника через интегрированные клетки в популяцию приемник. Такая экспериментальная платформа позволяет моделировать восстановление функциональной структуры нейронных сетей после повреждения головного мозга.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено устройство для выращивания диссоциированных нейрональных клеток на основе микрофлюидных чипов совмещенных с микроэлектродными матрицами (МЕА), позволяющее интегрировать диссоциированные нейрональные клетки в сформированную нейронную сеть, состоящую из отдельных клеточных популяций, связанных слабой однонаправленной связью. Устройство содержит три изолированных камеры микрофлюидного чипа, связанных микроканалами ассиметричной формы, при этом высота микроканалов составляет 5-7 мкм, каналы, соединяющие камеру источник и камеру для интеграции, имеют длину 400 мкм и обеспечивают прорастание аксонов популяции-источника в камеру для интеграции за 5 суток. Изобретение обеспечивает высокую точность интеграции клеток в область слабой направленной связи между двумя подсетями нейрональных клеток. Также устройство компактно и совместимо со стандартными коммерческими микроэлектродными матрицами, что позволяет неинвазивно оценивать электрофизиологические характеристики каждого модуля. 6 ил.

Устройство для выращивания диссоциированных нейрональных клеток на основе микрофлюидных чипов совмещенных с микроэлектродными матрицами (МЕА), позволяющее интегрировать диссоциированные нейрональные клетки в сформированную нейронную сеть, состоящую из отдельных клеточных популяций, связанных слабой однонаправленной связью, отличающееся тем, что содержит три изолированных камеры микрофлюидного чипа, связанных микроканалами ассиметричной формы, при этом высота микроканалов составляет 5-7 мкм, каналы соединяющие камеру источник и камеру для интеграции, имеют длину 400 мкм и обеспечивают прорастание аксонов популяции-источника в камеру для интеграции за 5 суток, при этом связывающие камеру для интеграции и камеру-приемник каналы имеют длину 600 мкм и 4 ловушки, препятствующие росту аксонов из камеры приемника в камеру для интеграции, расстояние между камерой приемником и камерой источником не превышает 1200 мкм, что позволяет аксонам клеток из камеры источника прорастать до камеры приемника и формировать синаптически связи, а длина дендритов диссоциированных нейрональных клеток составляет менее 400 мкм, посадка клеток в камеру для интеграции осуществляется на 5-7 день после посадки в камеры источник и приемник.