Способ и набор для идентификации Vaccinium myrtillus Российский патент 2024 года по МПК C12N15/82 

Настоящее изобретение относится к способу идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической композиции, который основан на обнаружении специфических геномных фрагментов с использованием ПЦР-амплификации. Кроме того, изобретение относится к набору, специально предназначенному для выполнения способа изобретения.

Предшествующий уровень техники

Экстракты растений широко используются в медицинской, нутрицевтической, косметической и пищевой промышленности. Одной из главных проблем, возникающих при работе с растительными экстрактами, является определение не только их химического состава, но и определение их ботанического происхождения, для того, чтобы исключить риск подделки.

Генетические методы определения ботанического происхождения растительных материалов известны в данной области (Parker, J., et al., Field-based species identification of closely-related plants using real-time nanopore sequencing. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 8345; Group, C.V.W.,ADNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(31): p. 12794-7; Fazekas, A.J., et al., DNA barcoding methods for land plants. Methods Mol Biol. 2012. 858: p. 223). Такие методы основаны на сравнении ДНК, присутствующей в растительном материале, с известными последовательностями ДНК, присутствующими в общедоступных базах данных. Например, WO 2006/020147 (The Regents of the University of California) раскрывает способ идентификации отдельных биологических генетических компонентов, присутствующих в ботанической смеси, указанный способ основан на анализе конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов (SSCP) и анализа последовательности. Считают, что метод может предоставить информацию о биологических компонентах композиции без предшествующих знаний о том, какие ботанические средства присутствуют, а также может обнаруживать и выявлять неизвестные биологические компоненты, которые могут присутствовать в смеси.

Способы генетической идентификации растений из ботанических образцов также раскрыты в CN102146477, CN106119394, CN1372005, CN107142329, CN107653330, CN105624291, CN105603107, ES2176066, CN104673930, CN102222969, CN102732513, CN105063203, JP2007282626. В некоторых случаях способы идентификации ботанических видов основаны на обнаружении определенных последовательностей посредством ПЦР амплификации, расположенных в пределах ядерного рибосомального РНК кодирующего локуса, содержащего области ITS-1 и/или ITS-2 внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS). В некоторых случаях (CN1052429, CN105603107, ES2176066), способы направлены на идентификацию примесей в коммерческих продуктах, содержащих растительные материалы.

Jaakola L et al., Food Chemistry vol. 123, no. 2 (2010) pp.494-500, раскрывает идентификацию коммерчески важных видов ягод посредством комплексного подхода, включающего баркодирование ДНК и анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM), с использованием разработанных пар праймеров, которые позволяют идентифицировать определенные виды диких ягод. Vaccinium myrtillus идентифицируют посредством HRM-анализа ампликона, расположенного в области ITS (внутреннего транскрибируемого спейсера), полученной с помощью праймеров ITSVm2f и ITSVm2r.

CN108642207 раскрывает конструкцию аллельной карты растения черники и способ идентификации сортов черники и связанных видов с использованием праймер-специфической ПЦР амплификации.

Marieschi М. et al, Food Chemistry vol. 202 (2016) pp. 438-444 раскрывает способ, основанный на характеристике последовательностей амплифицированных областей (SCARs) для выявления присутствия V. myrtillus и видов-примесей, полезный для анализа многочисленных групп.

Koskima Ki JJ et al., European Journal of Plant Pathology, Kluwer Academic Publishers - vol. 125 no. 4 (2009) pp. 629-640 раскрывает относительную экспрессию генов черники, количественно определенную посредством ПЦР в режиме реального времени с красителем SYBR-green в качестве флуоресцентного репортера.

При обработке растительных материалов и, в частности, в случае использования процедур экстракции, ДНК разрушается, производя к появлению фрагментов различного размера и в количестве, зависимом от способа экстракции, при этом эти фрагменты нельзя непосредственно сравнить с известными последовательностями ДНК, тем самым, затрудняя, даже делая практически невозможным, применение к экстрактам методов идентификации генома, которые можно применять к исходным материалам.

Экстракты Vaccinium myrtillus в значительной степени используются в фармацевтических, косметических, нутрицевтических и диетических продуктах из-за свойственных им известных оздоровительных свойств. Клиническая польза V. myrtillus в качестве, как пищевой добавки, так и терапевтического средства может быть связана с наличием избыточного количества флавоноидов и антоцианов. Для способа экстракции важным является, чтобы экстракты V. myrtillus имели требуемые характеристики с точки зрения химических компонентов и заявленного чистого ботанического происхождения. Следовательно, желательным является создание способа, который позволяет идентифицировать V. myrtillus в ботанической композиции, например, в растительном экстракте, обеспечивая высокие уровни точности и специфичности видов, особенно, когда V. myrtillus находится в смеси с близкородственными загрязняющими видами.

Описание изобретения

Эти цели достигаются настоящим изобретением, который обеспечивает способ специфической и точной идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической композиции посредством определения фрагмента нуклеиновой кислоты, который содержится в остаточной ДНК экстрактов V. myrtillus.

В частности, способ изобретения включает выявление в образце ботанической композиции V. myrtillus-специфического фрагмента нуклеиновой кислоты гена 5,8S рибосомной РНК в пределах внутреннего транскрибируемого спейсера 1 и внутреннего транскрибируемого спейсера 2, где указанный фрагмент нуклеиновой кислоты состоит из SEQ ID NO: 1 или последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1, которая выбрана из группы SEQ ID NOs: 2, 3 и 4.

В предпочтительном воплощении праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, выбраны из следующих пар:

(1) SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;

(2) SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8;

(3) SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10;

(4) SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.

В особенно предпочтительном воплощении ПЦР представляет собой ПЦР в режиме реального времени (rtPCR) и способ по изобретению включает следующие стадии:

(а) выделение нуклеиновых кислот из образца ботанической композиции;

(б) проведение rt-PCR (rt-ПЦР) на выделенной нуклеиновой кислоте с использованием:

- пары праймеров, выбранных из группы, состоящей из:

(1) SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;

(2) SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8;

(3) SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10;

(4) SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; и

- отжиг зонда в области нуклеиновой кислоты, амплифицированной с использованием праймеров, указанный зонд имеет последовательность SEQ ID NO: 13;

(в) определение присутствия амплифицированного продукта,

при этом обнаружение продукта амплификации указывает на присутствие Vaccinium myrtillus в ботанической композиции.

Согласно изобретению ботаническая композиция представляет собой смесь растений или их частей, например, листьев, плодов, коры, корней, включая растительные экстракты и особенно плодовые экстракты, которые предназначены для потребления в пищу или терапевтического использования. В предпочтительном воплощении ботаническая композиция представляет собой продукт, содержащий экстракт плодов Vaccinium myrtillus, один или в комбинации с родственными видами, такими как Empetrum nigrum, Sambucus nigra, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium corymbosum и Vaccinium macrocarpon.

Выделение нуклеиновых кислот включает их разделение и очистку от других компонентов смеси растений или экстракта, и оно может проводиться с помощью обычных методов с использованием коммерчески доступных наборов. В частности, геномная ДНК может быть выделена с использованием протоколов экстракции-преципитации, способов, основанных на кремнеземной мембране или анионообменном подходе.

Технология ПЦР в режиме реального времени известна в данной области, и она комбинирует химию полимеразной цепной реакции с применением молекул флуоресцентного репортера для того, чтобы контролировать производство продуктов амплификации во время каждого цикла реакции ПЦР. Амплификацию целевой ДНК получают посредством многократных циклов денатурации с последующим отжигом праймера и зонда, и катализируемым ДНК-полимеразой удлинением праймера. Амплификацию ДНК контролируют при каждом цикле ПЦР путем измерения флуоресцентного сигнала, который производится, например, неспецифическими флуоресцентными красителями, которые взаимодействуют с двунитевой ДНК, или посредством ДНК специфических зондов, состоящих из олигонуклеотидов, меченных флуоресцентным репортером, который обеспечивает выявление результата гибридизации зонда с его комплементарной целевой ДНК. Подходящие интеркалирующие красители включают SYBR® (Green I, Green II, Gold), LCGreen®, SYTO-(9, 13, 16, 60, 62, 64, 82), BOBO-3, LCGreen®, POPO-3, BEBO, TO-PR03, PicoGreen®, SYTOX Orange и аналогичные коммерчески доступные флуоресцентные красители (флуорофоры).

Олигонуклеотидный зонд маркирован флуоресцентным репортером (флуорофором) на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. 5'-экзонуклеазная активность полимеразы расщепляет зонд, высвобождая молекулу репортера, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Примеры флуорофоров включают 5- или 6-карбоксифлуоресцеин (5- или 6-FAM), тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ), гексахлор-6-карбоксифлуоресцеин (HEX), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (JOE), тетраметилродамин (TAMRA), 5- карбокситетраметилродамин (TAMRASE), карбокси-Х-родамин (ROX), 4-(диметиламиноазо)бензол-4-карбоновую кислоту (DABCYL). Примеры гасителей включают семейство BHQ (Black Hole Quencher®), NFQ-MGB (не флуоресцентный гаситель и связывающийся с минорной бороздкой), QSY 7 или 21 карбоновая кислота N-сукцинимидиловый эфир.

Параметры и условия rtПЦР, такие как температура и продолжительность каждого цикла денатурации и отжига могут быть подобраны в зависимости от фрагмента нуклеиновой кислоты, подвергаемой амплификации, от набора праймеров, используемых для амплификации и от других переменных, как известно специалистам в данной области. В предпочтительном воплощении изобретения, фрагменты нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, амплифицируют с помощью праймеров (1) посредством (4) применения следующих условий:

- исходная стадия денатурации при 95°С в течение 180 сек

- 2-стадийные циклы: 15 сек при 95°С (1-ая стадия) и 15 сек при 62-68,5°С

(2-ая стадия), повторяемая от сорока (40) до пятидесяти (50) раз.

Конкретные комбинации праймеров и зонда по изобретению позволяют осуществлять конкретную идентификацию Vaccinium myrtillus в ботанических композициях, содержащих близкородственные виды, такие как Empetrum nigrum, Sambucus nigra, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium corymbosum и Vaccinium macrocarpon. Как сообщается в экспериментальном разделе, применение зонда, отличного от зонда, специфичного к Vaccinium myrtillus SEQ ID NO: 13, и аналогичный отжиг с фрагментами SEQ ID NOs: 1-4, устраняет системную способность идентифицировать Vaccinium myrtillus в смеси с Empetrum, используя те же праймеры и те же условия rt-ПЦР, раскрытые выше. Это указывает на специфичность выбранной комбинации праймеров, зонда и эффективности условий гШЦР в соответствии с изобретением.

Другой аспект изобретения относится к набору для идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической композиции. Набор по изобретению содержит по меньшей мере пару праймеров, выбранных из (1) до (4), и зонд, как указано выше. Кроме того, набор может содержать, в отдельных контейнерах, реагенты, необходимые для осуществления гШЦР, в частности, дезоксинуклеотиды и ДНК-полимеразу, а также реагенты для выделения, очистки и, возможно, количественной оценки ДНК. Набор может также содержать ДНК из Vaccinium myrtillus, в качестве положительного контроля и не содержащую нуклеазу воду или буфер, в качестве отрицательного контроля, а также инструкцию для выполнения ПЦР анализа.

В предпочтительном воплощении изобретения набор содержит:

- одну пробирку или флакон, содержащий все реагенты, необходимые для выполнения анализа (ДНК полимеразу, дезоксинуклеотиды (dNTP), буфер, реагенты для зонда, праймеры и зонд)

- одну пробирку или флакон, содержащий положительный контроль (ДНК Vaccinium myrtillus)

- одну пробирку или флакон, содержащий отрицательный контроль ДНК (воду, не содержащую нуклеазу)

Набор может быть использован со всеми коммерчески доступными системами ПЦР в режиме реального времени.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1: протокол амплификации rt-ПЦР.

Фиг. 2: результаты амплификации rt-ПЦР (а) и анализ кривой плавления (Тm)

(б) геномной ДНК, выделенной из замороженных плодов Vaccinium myrtillus.

Фиг. 3: Анализ калибровочной кривой для Vaccinium myrtillus.

Фиг. 4: Амплификация rt-ПЦР на основе зонда M-FAM, специфичного для V. Myrtillus. NTC: отрицательный контроль.

Фиг. 5: (а) Амплификация rt-ПЦР на основе зонда M-FAM, специфичного для V. myrtillus в смешанных образцах с соотношением, указанным в легенде. NTC: отрицательный контроль;

(б) Амплификация rt-ПЦР на основе зонда Е-НЕХ, специфичного для Е. nigrum в смешанных образцах с соотношением, указанным в легенде. NTC: отрицательный контроль.

Фиг. 6: Корреляция между Cq Mean (средняя) и процентом целевых видов для V. myrtillus.

Фиг. 7: Экспериментальная схема, используемая для rt-ПЦР анализа образцов сухого экстракта. rt-PCR rt-ПЦР.

Фиг. 8: Амплификация rt-ПЦР остаточных ДНК, выделенных из образцов сухого экстракта Vaccinium myrtillus. Положительный контроль представляет собой геномную ДНК, экстрагированную из замороженных плодов Vaccinium myrtillus. а) набор праймеров L; б) набор праймеров S.

Фиг. 9: Анализ rt-ПЦР ампликонов в агарозном геле.

Фиг. 10: Анализ выравнивания секвенированных ампликонов (сверху) и относительная идентификационная матрица идентичности (внизу)

Фиг. 11: rt-ПЦР 36% сухого этанольного экстракта Vaccinium myrtillus. Амплификация и кривые плавления.

Фиг. 12: rt-ПЦР 36% сухого этанольного экстракта Vaccinium myrtillus со способом на основе зонда. РТС: положительный контроль (геномная ДНК, экстрагированная из замороженных плодов V. myrtillus); NTC: отрицательный контроль.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕКЦИЯ - общие процедуры Экстракция геномной ДНК (геномная ДНК)

Экстракцию ДНК выполняли посредством использования протокола NucleoSpin® plant II, как описано поставщиком (Macherey nagel. Cat. 740770.250 - July 2014/Rev.09).

Очистка остаточной ДНК от сухого экстракта.

Первую очистку выполняли посредством использования протокола набора NucleoSpin® plant II Maxi, как описано поставщиком (Macherey nagel. Cat. 740770.250 -July 2014/Rev.09), с некоторыми модификациями, представленными ниже.

- Взвешивание 3-5 г сухого экстракта в конической 50 мл колбе

- Добавление 3 мл дистиллированной воды

- Добавление 9 мл лизирующего буфера

- Перемешивание на мешалке типа Вортекс в течение 30 секунд

- Перенос образца на фильтр NucleoSpin® Filter Maxi

- Центрифугирование в течение 5 мин при 4500 g, сбор чистого элюата и удаление фильтра NucleoSpin Filter Maxi

- Добавление 20 мл связывающего буфера

- Перемешивание на мешалке типа Вортекс в течение 30 секунд

- Нанесение образца на колонку NucleoSpin® Plant II Maxi

- Центрифугирование в течение 3 минут при 4500 g и удаление элюата

- Повторение нанесения для всех оставшихся образцов

- Добавление 4 мл промывочного буфера (PW1) на колонку NucleoSpin® Plant II Maxi

- Центрифугирование в течение 3 минут при 4500 g и удаление элюата

- Добавление 10 мл промывочного буфера (PW2) на колонку NucleoSpin® Plant II Maxi

- Центрифугирование в течение 3 минут при 4500 g и удаление элюата.

- Добавление 2 мл промывочного буфера (PW2) к колонке NucleoSpin® Plant II Maxi

- Центрифугирование в течение 12 минут при 4500 g и удаление элюата

- Помещение колонки NucleoSpin® Plant II Maxi в новую пробирку для сбора образцов (50 мл)

- Добавление из пипетки 1000 мкл элюирующего буфера (РЕ) (65°С) на мембрану

- Инкубирование колонки NucleoSpin® Plant II Maxi в течение 5 минут при 65°С

- Центрифугирование в течение 3 минут при 4500 g для элюирования ДНК

Вторичную очистку выполняли с использованием набора ReliaPrep™ DNA Clean-UP и протокола системы концентрирования, как описано поставщиком (Promega. Cat. А2893).

Количественная оценка ДНК

Количество ДНК определяли с помощью прибора NanoQuant Plate™. Количественную оценку выполняют с использованием УФ-метода. Поглощение при 260 нм использовали для количественного определения ДНК при условии, что 1 OD при 260 нм соответствует 50 мкг/мкл ДНК. Соотношение поглощения 260 нм/280 нм определяли для оценки чистоты ДНК.

rt-ПЦР и анализ кривой плавления

Амплификацию rt-ПЦР выполняли с использованием SYBR Green или на основе применения зонда, как описано поставщиком (SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix, BioRad Cat. N. 1725272; SsoAdvanced™ Universal Probes Supermix, BioRad Cat. N. 1725281), с 3-стадийным протоколом на основе амплификации, как указано на Фиг. 1.

ПЦР в режиме реального времени

Получение смеси, как изложено ниже, конечный объем 20 мкл:

Загрузка образца в прибор для проведения ПЦР в реальном времени (BioRad или эквивалент) и установка следующей программы:

Получение данных после второй стадии циклов.

ДНК-секвенирование

Амплифицированную ДНК очищали с помощью агарозного геля и очищенный фрагмент секвенировали посредством создания двух последовательностей для каждого образца: один получали посредством использования прямого праймера, а другой посредством использования обратного праймера. Для секвенирования смешивали очищенную ДНК и TRIS-HC1 5 мМ рН 8,0 для получения концентрации, требуемой для секвенирования (в зависимости от длины последовательности, 2-5 нг/мкл).

Последовательности анализировали с помощью программного обеспечения BioEdit или BLAST для сравнения и идентификации последовательностей.

Примеры

Пример 1 - Валидация способа

Геномную ДНК замороженных плодов Vaccinium myrtillus очищали и количественно определяли (Таблица 1), и далее представлены ее загрязняющие/родственные виды:

Создание параметров реакции rt-ПЦР относительно пика Cq (количественного определения цикла) и Тm (температуры плавления) изначально оценивались, используя геномную ДНК, выделенную из замороженных плодов Vaccinium myrtillus (Фиг. 2). Результаты rt-ПЦР показали, что разработанные праймеры позволяют амплифицировать одну область ДНК для всех наборов праймеров (Таблицы 2 и 3).

rt-ПЦР также выполняли с помощью ДНК, выделенной из V. Myrtillus, загрязняющих/родственных видов, и результаты продемонстрировали, что можно отличить различные ДНК посредством набора праймеров и, в частности, маленьких 2 праймеров (Таблица 4).

Линейность кривой амплификации также оценивали с помощью создания стандартной кривой для Vaccinium myrtillus, используя набор маленького 2 праймера (Фиг. 3). Очевидно, что линейность была обеспечена в тестированном диапазоне концентраций (почти 0,0625 8,00 нг/мкл).

Для улучшения способности метода различать Vaccinium myrtillus и загрязняющие/родственные виды, rtПЦР выполняли с помощью зонда, связывающегося с минорной бороздкой (M-FAM - SEQ ID NO: 13), специально разработанного для амплификации последовательности V. myrtillus.

В сравнительном эксперименте rtПЦР выполняли с одновременным использованием зондов, связывающихся с минорной бороздкой SEQ ID NO: 13 (М-FAM) и SEQ ID NO: 14 (E-HEX).

Для проверки способа на основе зонда были проведены различные способы экспериментов, обобщенные в таблице ниже.

Результаты амплификации были пропорциональны содержанию целевых видов (Фиг. 6)

Пример 2 - Идентификация остаточной ДНК в сухом экстракте Vaccinium myrtillus

Для каждого образца были выполнены два независимых выделения остаточной ДНК (биологические репликаты), и для каждой выделенной ДНК были протестированы три технических репликата, Фиг. 7.

Вся процедура была первоначально выполнена на четырех образцах: 32549/Н76, 32549/Н80, 32549/Н83, 32549/Н84. После выделения и количественной оценки остаточной ДНК (Таблица 6), в этих образцах анализировали их характеристики rt-ПЦР амплификации (Cq и Тm) по сравнению с таковыми характеристиками для положительного контроля (Фиг. 8 и Таблица 7).

Результаты амплификации rt-ПЦР со всеми образцами показали, что:

ДНК была амплифицирована как для положительного контроля, так и для всех тестируемых образцов;

отрицательный контроль (без ДНК) не продемонстрировал сигнала амплификации;

положительный контроль и образцы продемонстрировали равные значения для пиков температуры плавления (Тm).

Этот результат указывает на то, что ампликоны имеют такие же характеристики с точки зрения длины и/или состава нуклеотидных оснований.

Кроме того, результаты Cq коррелируют с тестируемым количеством ДНК, что означает, что амплификация специфична для выбранной мишени.

Чтобы проверить, что образованные ампликоны имеют такую же последовательность положительного контроля, все амплифицированные последовательности очищали на агарозном геле (Фиг. 9) и очищенные фрагменты секвенировали (Фиг. 10).

Анализ агарозного геля подтвердил различие длины ампликонов: фрагмент, образованный с помощью набора праймера S, показал длину, составляющую примерно 130 п. о., в то время, как фрагмент, образованный с помощью набора праймера L, показал длину, составляющую примерно 270 п. о.. Кроме того, в ходе анализа агарозного геля можно обнаружить также присутствие неспецифических продуктов rt-ПЦР, как на Фиг. 9, на дорожке 4 для образца 32549/Н83_1, где видны две полосы в хорошем соответствии с результатами пика Тm (Фиг. 8, b).

Все полученные последовательности были выровнены при рассмотрении только части, используя параметры высококачественного секвенирования. Результаты секвенирования (Фиг. 10) показали, что все последовательности ампликонов (маленькие и большие) идентичны стандартному образцу последовательности Vaccinium myrtillus.

Пример 3 - Идентификация Vaccinium myrtillus по 36% сухому этанольному экстракту (Е. ЕТ.) остаточной ДНК

Анализ остаточной ДНК также выполняли на образцах с кодом компании mdena 9042202, MIRTILLO (V. MYRTILLUS) Е. ЕТ. 36% после фазы смешивания сухого порошка, 32788/М1, 32786/М2, 32788/М2. Предыдущие образцы 32549/Н76, 32549/Н80 и 32549/Н83 были снова протестированы в качестве контрольных образцов.

Чтобы оптимизировать процедуру очистки, после первого этапа очистки ДНК изолированную остаточную ДНК обрабатывали с помощью набора ReliaPrep™ (Promega). Результаты с точки зрения количества ДНК (нг/мкл) и качества (отношение 260/280) при двухстадийной очистке (Таблица 8) выявили, что концентрация, а также очистка, лучше при введении второй стадии.

Анализ rt-ПЦР выполняли, используя SYBR green (Фиг. 11) и способы на основе зондов (Фиг. 12), согласно протоколам, описанным выше. Результаты показывают, что:

(а) все тестируемые образцы имеют тот же пик Тm положительного контроля (Фиг. 11 и Таблица 9) при анализе методом SYBR green:

Таблица 9 - Обобщающие результаты rt-ПЦР, метод SYBR green - Е. ЕТ. 36%

(б) все тестируемые образцы анализировали с помощью зонда, специфичного для последовательности V. myrtillus (Фиг. 12 и Таблица 10) при использовании способа на основе зонда.

Пример 4 - Набор для анализа

Набор состоит из:

Одной 1,5 мл пробирки, содержащей все реагенты, необходимые для выполнения анализа (ДНК полимераза, dNTPs, буфер, реагенты для зонда, праймеры и зонд)

Одной 1,5 мл пробирки, содержащей положительный контроль (ДНК Vaccinium myrtillus)

Одной 1,5 мл пробирки, содержащей отрицательный контроль ДНК (вода без нуклеазы)

Набор можно использовать со всеми коммерчески доступными системами ПЦР в режиме реального времени (в частности, BioRad CFX96™, BioRad CFX96 ™, bCube®, Roche LightCycler® 480, и т.д.)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической смеси посредством ПЦР-амплификации. Определяют в образце смеси фрагмент нуклеиновой кислоты V. myrtillus, находящийся в пределах внутреннего транскрибируемого спейсера 1, области гена 5,8S рибосомной РНК и внутреннего транскрибируемого спейсера 2. Для этого выделяют нуклеиновые кислоты из указанного образца. Выполняют ПЦР в режиме реального времени на выделенной нуклеиновой кислоте с использованием набора праймеров, выбранных из группы: SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12. Отжигают зонд в области нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью праймеров, где указанный зонд состоит из последовательности SEQ ID NO:13. Определяют наличие продукта амплификации. Обнаружение продукта амплификации указывает на наличие Vaccinium myrtillus в ботанической композиции. Изобретение расширяет арсенал средств идентификации Vaccinium myrtillus. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 ил., 10 табл., 4 пр.

1. Способ идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической смеси посредством ПЦР-амплификации, включающий определение в образце этой смеси фрагмента нуклеиновой кислоты V. myrtillus, находящегося в пределах внутреннего транскрибируемого спейсера 1, области гена 5,8S рибосомной РНК и внутреннего транскрибируемого спейсера 2, где указанный способ включает следующие стадии:

(а) выделение нуклеиновых кислот из указанного образца;

(б) выполнение ПЦР в режиме реального времени на выделенной нуклеиновой кислоте с использованием:

- набора праймеров, выбранных из группы, состоящей из:

(1) SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6;

(2) SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8;

(3) SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10;

(4) SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12;

и

- отжиг зонда в области нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью праймеров, где указанный зонд состоит из последовательности SEQ ID NO:13;

(в) определение наличия продукта амплификации, при этом обнаружение продукта амплификации указывает на наличие Vaccinium myrtillus в ботанической композиции.

2. Способ по п. 1, где набор праймеров (1) используют на стадии (б).

3. Способ по п. 1 или 2, где указанную ПЦР в режиме реального времени выполняют в следующих условиях:

- начальная стадия денатурации при 95°C в течение 180 с;

- 2-стадийные циклы, где 1-я стадия представляет собой 15 с при 95°C, и 2-я стадия представляет собой 15 с при 62-68,5°C, повторяют от 40 до 50 раз.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где ботаническая смесь представляет собой растительный экстракт.

5. Набор для идентификации Vaccinium myrtillus в ботанической смеси, содержащий набор праймеров, выбранных из группы, состоящей из:

(1) SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6;

(2) SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8;

(3) SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10;

(4) SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12;

и зонд, состоящий из последовательности SEQ ID NO:13.

6. Набор по п. 5, дополнительно содержащий ДНК-полимеразу, смесь дезоксинуклеотидов, буферные растворы.

7. Набор по п. 5 или 6, дополнительно содержащий в отдельных контейнерах образец нуклеиновой кислоты Vaccinium myrtillus для использования в качестве положительного контроля и воду или буферный раствор, не содержащие нуклеазу, в качестве отрицательного контроля.