Способ тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1 (organic anion-transporting polypeptides 1В1, ОАТР1В1), кодируемого геном SLCO1B1.

Разработанный способ можно рекомендовать для изучения фармакокинетики лекарственных веществ и прогнозирования развития межлекарственных взаимодействий на уровне данного белка-транспортера.

Уровень техники

В качестве модели in vivo для тестирования новых лекарственных препаратов на принадлежность к субстратам, индукторам и ингибиторам ОАТР1В1 были предложены мыши с нокаутом по гену Oatp1b2, имеющим сходство по локализации, структуре и субстратной специфичности с ОАТР1В1 и ОАТР1В3. Степень гомологии с ОАТР1В1 составляет 65%, и модель хорошо себя показала при исследованиях поглощения известных субстратов ОАТР1В. Однако возможны межвидовые отличия, например, нокаут гена не влиял на соотношение концентраций церивастатина и симвастатиновой кислоты в печени и плазме животных, что может указывать на разницу в субстратной специфичности и требует дальнейшего изучения [Chen, C., Stock, J. L., Liu, X., Shi, J., Van Deusen, J. W., et al. (2008) Utility of a novel Oatplb2 knockout mouse model for evaluating the role of Oatp1b2 in the hepatic uptake of model compounds, Drug Metab Dispos, 36, 1840-5, doi: 10.1124/dmd.108.020594]. Кроме того, на уровне целого организма сложнее оценить вклад взаимодействия препарата с конкретным транспортером из-за большого числа других факторов, и, как правило, модели in vivo и in vitro дополняют друг друга.

Согласно международным рекомендациям управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (The U.S. Food and Drug Administration, FDA), Европейского агентства по лекарственным средствам (European Medicines Agency, EMA) и Международного консорциума по транспортерам (The International Transporter Consortium, ITC) тестирование лекарственных веществ на принадлежность к субстратам ОАТР1В1 проводят на первичных гепатоцитах или клеточных линиях гепатоцитарного происхождения. Однако клеточные линии гепатоцитарного происхождения обычно экспрессируют сразу несколько транспортеров, что затрудняет проведение анализа [Hirano, M., Maeda, K., Shitara, Y., Sugiyama, Y. (2004) Contribution of OATP2 (OATP1B1) and OATP8 (OATP1B3) to the Hepatic Uptake of Pitavastatin in Humans, J Pharmacol Exp Ther, 311, 139–46, doi: 10.1124/jpet.104.068056; Sudsakorn, S., Bahadduri, P., Fretland, J., Lu, C. (2020) 2020 FDA Drug-drug Interaction Guidance: A Comparison Analysis and Action Plan by Pharmaceutical Industrial Scientists, Curr Drug Metab, 6, 403-426, doi: 10.2174/1389200221666200620210522.; Drug interaction studies, 2022 https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-ich-guideline-m12-drug-interaction-studies-step-2b_en.pdf].

В ряде работ использовались клеточные линии, селективно гиперэкспрессирующие ОАТР1В1 [Zhang X, Scialis RJ, Feng B, Leach K. Detection of statin cytotoxicity is increased in cells expressing the OATP1B1 transporter. Toxicol Sci. 2013 Jul;134(1):73-82. doi: 10.1093/toxsci/kft085. Epub 2013 Apr 5. PMID: 23564645; Shitara Y, Takeuchi K, Horie T. Long-lasting inhibitory effects of saquinavir and ritonavir on OATP1B1-mediated uptake. J Pharm Sci. 2013 Sep;102(9):3427-35. doi: 10.1002/jps.23477. Epub 2013 Feb 25. PMID: 23440887; Suga T, Yamaguchi H, Sato T, Maekawa M, Goto J, Mano N. Preference of Conjugated Bile Acids over Unconjugated Bile Acids as Substrates for OATP1B1 and OATP1B3. PLoS One. 2017 Jan 6;12(1):e0169719. doi: 10.1371/journal.pone.0169719. PMID: 28060902; PMCID: PMC5218478], однако в данных исследованиях использовался ОАТР1В1, не связанный с зеленым флуоресцентным белком (GFP), что затрудняет контроль экспрессии ОАТР1В1 в клетках, а также сильно варьировали сроки инкубации и концентрации тестируемых субстратов. Также не использовался четкий критерий оценки принадлежности лекарственных веществ к субстратам ОАТР1В1, то есть во сколько раз должен усиливаться транспорт вещества под действием ОАТР1В1, если вещество является его субстратом.

Техническим результатом изобретения является разработка доступного и эффективного способа оценки принадлежности лекарственных веществ к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОАТР1В1).

Изобретение заключается в сравнении проникновения тестируемых веществ в клетки эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293 (Human embryonic kidney 293 cells, HEK293) и клетки эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, искусственно сцепленный с зеленым флуоресцентным белком (GFP), и гиперэкспрессирующие данный полипептид (HEK293-OATP1B1), в концентрации 1 мкМ и длительностью эксперимента 5 мин. Если концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 более чем в 2 раза превышает концентрацию в лизате клеток HEK293, делается вывод о том, что тестируемое вещество является субстратом ОАТР1В1.

Для этого:

- используются трансфицированные геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, клетки эмбриональной почки человека, трансформированные аденовирусом 5 типа, вариант 293 (HEK293-OATP1B1);

- полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 искусственно сцеплен с зеленым флуоресцентным белком (GFP), что позволяет постоянно контролировать его экспрессию в клетках;

- тестируемые вещества используются в концентрации 1 мкМ;

- длительность транспортного эксперимента составляет 5 мин;

- концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 должна быть выше его концентрации в лизате клеток HEK293 в 2 и более раз, тогда делается вывод о том, что тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1.

Осуществление изобретения

На первом этапе создавалась клеточная линия НЕК293-ОАТР1В1 - клетки эмбриональной почки человека, трансформированные аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1. При этом к полипептиду, транспортирующему органические анионы 1B1, к С-концу присоединялся зеленый флуоресцентный белок (GFP).

Получение плазмиды с геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, сцепленный на С-конце с зеленым флуоресцентным белком (pEGFP-SLCO1B1).

Ген SLCO1B1, кодирующий полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 (Gene ID:10599, NCBI Reference Sequence: NM_006446.5) был получен путем синтеза и клонирован в линеаризованный по сайтам XhoI и HindIII вектор pEGFP-N1 («Clontech»), путем безлигазного клонирования с T4 ДНК-полимеразой, в результате чего была получена плазмида pEGFP-SLCO1B1. Адекватность последовательности клонированного гена проверялось секвенированием. Целевой ген клонирован в вектор в одной рамке считывания с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) на С-конце. Поскольку ген GFP находится в той же рамке считывания, что и целевой ген SLCO1B1, флуоресценция в трансфицированной клетке указывает на экспрессию полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОАТР1В1).

Трансфекция клеток HEK293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293)

Клетки линии НЕК293 высевались в 96-луночный планшет в количестве 10⁴ клеток на лунку планшета. По достижении 70% конфлюентности клетки подвергались трансфекции плазмидой pEGFP-SLCO1B1 методом липофекции с использованием реагента Lipofectamine 3000 Reagent («Invitrogen», США). Все манипуляции производились в соответствии с инструкцией производителя. Через 48 часов экспрессию GFP оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus СКХ53 («Olympus», Япония). Для получения стабильных клонов HEK293-ОАТР1В1, экспрессирующих ОАТР1В1, проводили селекцию с использованием антибиотика G-418 («Promega», США) в концентрации 500 мкг/мл. Было отобрано четыре стабильных клона, которые в свою очередь подвергли клональной селекции методом предельных разведений. Через две недели культивирования клоны с сохраненной флуоресценцией перестали получать антибиотик и подверглись вторичному клонированию. Целевые клоны отбирали по интенсивности флуоресценции, размножали и использовали для дальнейшей работы.

Экспрессия гена SLCO1B1 в полученной клеточной линии HEK293-ОАТР1В1, была подтверждена методом ПЦР в реальном времени. Синтез белка ОАТР1В1 в полученной клеточной линии HEK293-SLCO1B1 был подтвержден методом вестерн-блот, (OATP2 Polyclonal Antibody, «Invitrogen», США, в разведении 1:2000; Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, «Invitrogen», США).

Если в процессе культивирования полученной клеточной линии HEK293-ОАТР1В1, клетки теряли флуоресценцию, это свидетельствовало о снижении экспрессии OATP1B1, что было подтверждено методом ПЦР и вестерн-блот.

Оценку принадлежности лекарственных веществ к субстратам ОАТР1В1 оценивали следующим образом.

Клетки линии НЕК293 и полученные рекомбинантные клетки HEK293-ОАТР1В1, обладающие интенсивной флуоресценцией за счет GFP, культивировали в Дульбекко-модифицированной среде Игла («ПанЭко», Россия) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия) и 2 мМ L-глутамина («Sigma-Aldrich», Германия) при 37 °C и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C («World Science», Южная Корея) в 24 луночных планшетах до достижения монослоя. Каждый эксперимент выполнялся в трёх повторах.

Экспрессию ОАТР1В1 в клетках HEK293-ОАТР1В1 оценивали по зеленой флуоресценции за счет наличия зеленого флуоресцентного белка (GFP).

Непосредственно перед проведением транспортного эксперимента клетки однократно промывали нагретой до 37 °C транспортной средой, представляющей собой сбалансированный солевой раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия), с содержанием буфера хепес 25 мМ с рН=7,4 («Sigma-Aldrich», Германия) и 1% диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия)). Затем к клеткам добавляли ту же транспортную среду, содержащую тестируемое вещество в конечной концентрации 1 мкМ.

Клетки инкубировали с транспортной средой, содержащей тестируемое вещество, в течение 5 минут. Реакцию останавливали удалением транспортной среды, содержащей тестируемое вещество, и немедленной промывкой клеток 500 мкл охлажденной транспортной средой. После этого клетки трижды промывали 500 мкл холодного фосфатного буфера («ПанЭко», Россия). Лизис клеток осуществляли трёхкратным циклом замораживания-размораживания (клетки замораживали при -80 °C, затем размораживали при комнатной температуре). Концентрацию общего белка в пробах анализировали по методу Бредфорд с помощью коммерческого набора Pierce Coomassie Plus Bradford Assay Kit («ThermoFisher», США).

Концентрацию тестируемого вещества в лизате клеток оценивают методом ВЭЖХ-МС/МС. Оценивают концентрацию тестируемого вещества в лизате клеток HEK293 и HEK293-ОАТР1В1.

Для подтверждения работы способа тестировались известные субстраты.

Оценивали проникновение эстрон-3-сультфата – известного субстрата ОАТР1В1 в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация эстрон-3-сультфата в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 12,01 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 5,9 пМ/мг белка. Концентрация эстрон-3-сультфата в HEK293-OATP1B1 выше концентрации HEK293 в 2 раза.

Концентрация аторвастатина – другого субстрата ОАТР1В1 в лизате клеток HEK293-OATP1B1 при добавлении к клеткам в концентрации 1 мкМ и длительности эксперимента 5 минут составила 16,19 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 7,34 пМ/мг белка. Концентрация аторвастатина в HEK293-OATP1B1 выше концентрации HEK293 в 2,2 раза.

Так же анализировали проникновение фексофенадина – не субстрата ОАТР1В1 в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация фексофенадина в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 4,45 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 4,35 пМ/мг белка.

Таким образом, концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 должна быть выше его концентрации в лизате клеток HEK293 в 2 и более раз, при этом тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1.

Пример.

Оценивали проникновение этилметилгидроксипиридина в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация этилметилгидроксипиридина в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 8,8 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 – 7,28 пМ/мг белка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что этилметилгидроксипиридин не является субстратом OATP1B1.

Изобретение относится к фармакологии. Раскрыт способ тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1, включающий использование клеточной линии эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293 и клеточной линии эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 с присоединенным зеленым флуоресцентным белком, инкубирование клеток с транспортной средой, содержащей тестируемое вещество в конечной концентрации 1 мкМ, в течение 5 мин и определение концентраций данного вещества в лизатах клеток, при этом если концентрация тестируемого вещества в лизате клеток эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 с присоединенным зеленым флуоресцентным белком выше его концентрации в лизате клеток эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, в 2 и более раза тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1. Изобретение обеспечивает доступный и эффективный способ оценки принадлежности лекарственных веществ к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1. 1 пр.

Способ тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1, включающий использование клеточной линии эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293 и клеточной линии эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 с присоединенным зеленым флуоресцентным белком, инкубирование клеток с транспортной средой, представляющей собой сбалансированный солевой раствор Хэнкса, с содержанием буфера хепес 25 мМ с рН=7,4 и 1% диметилсульфоксида, содержащей тестируемое вещество в конечной концентрации 1 мкМ, в течение 5 мин и определение концентраций данного вещества в лизатах клеток, при этом если концентрация тестируемого вещества в лизате клеток эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 с присоединенным зеленым флуоресцентным белком выше его концентрации в лизате клеток эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293 в 2 и более раза тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1.