Способ повышения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1 (ОАТР1В1) Российский патент 2024 года по МПК C12N5/07 C12N5/09 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (OATP1B1).

Полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 (organic anion transporting polypeptide, OATP1B1) - это трансмембранный инфлюксный белок-переносчик, обеспечивающий проникновение эндо- и экзобиотиков в клетку.

В настоящее время активно изучается модуляция активности белка-транспортера OАТР1В1. Доказано, что соединения кларитромицин, эритромицин, циклоспорин, валсартан, абамектин, азиатикозид и др. обладают ингибирующей способностью [Lane T.R., Urbina F., Zhang X., Fye M., Gerlach J., Wright S.H., Ekins S. Machine Learning Models Identify New Inhibitors for Human OATP1B1. Mol Pharm. 2022;19(11):4320-4332. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.2c00662].

Желчные кислоты, конъюгаты стероидных гормонов, простагландины и тиреоидные гормоны являются типичными субстратами OATP1В1 [Liu T, Li Q. Organic anion-transporting polypeptides: a novel approach for cancer therapy. J Drug Target. 2014;22(1):14-22. doi: 10.3109/1061186X.2013.832767].

Отдельными авторами была обнаружена тесная корреляция между значениями накопления эстрон-3-сульфата и уровнями экспрессии мРНК OATP1B1 (R2 = 0,64) [De Bruyn T., Ye Z.W., Peeters A., et al. Determination of OATP-, NTCP- and OCT-mediated substrate uptake activities in individual and pooled batches of cryopreserved human hepatocytes. Eur J Pharm Sci 2011;43:297-307].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и экономичного способа повышения количества OATP1B1 в эксперименте in vitro.

С данной целью было выполнено исследование на линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°С и 5%-содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C («World Science», Корея) в модифицированной среде Игла Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, CША), с добавлением L-глутамина (4мМ)(Sigma-Aldrich), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich) соответственно.

Клетки культивировали до образования клеточного монослоя (5 суток), после чего для активации OATP1B1 в культуральную среду добавляли S-нитрозоглутатион (GSNO) («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации 1, 10, 50, 100 и 500 мкМ и инкубировали 3 и 72 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.

После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США). В супернатанте определяли относительное количество OATP1B1 с помощью метода вестерн-блот. Хемилюминесценцию фиксировали с помощью ChemiDocXRS+ («Bio-Rad», США). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab («Bio-Rad», США).

Молекулярная масса OATP1B1 была подтверждена путем сравнения с маркерами молекулярной массы (Precision plus protein standards Dual Color, «Bio-Rad», США). Содержание OATP1B1 оценивали относительно уровня GAPDH.

Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Результаты представлены в виде M ± SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью теста Даннетта. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Воздействие S-нитрозоглутатиона на клетки линии HepG2 в течение 3 ч не влияло на количество OATP1B1, данный показатель достоверно не отличался от значений контроля. Увеличение длительности экспозиции с S-нитрозоглутатионом до 72 ч вызывало повышение количества OATP1B1 при концентрации GSNO 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 500 мкМ на 37,6% (р=0,01), 45,8% (р=0,004), 137,4% (р<0,0001) и 105,5% (р<0,0001) соответственно по сравнению со значениями контрольной группы. При экспозиции с GSNO в концентрации 1 мкМ наблюдалась тенденция к увеличению количества белка-транспортера на 17,4%, изменения не имели статистически значимых различий по сравнению с контролем (р>0,05).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Относительное количество OATP1B1 в клетках линии HepG2 при индукции синтеза оксида азота (II) S-нитрозоглутатионом в концентрациях 1-500 мкМ в течение 3 и 72 ч (M ± SD, n = 3). Примечание: * - p < 0,05; ** р ≤0,01; ****р < 0,0001 по сравнению с контролем.

Таким образом, для повышения количества OATP1B1 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ - субстратов OATP1B1 в трех экспериментах.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу повышения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (OATP1B1). Способ включает культивирование линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) и предусматривает добавление в среду S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 и 500 мкМ с инкубацией в течение 72 часов. Изобретение эффективно в качестве доступного способа повышения количества OATP1B1 в эксперименте in vitro. 1 ил.

Способ повышения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОATP1B1), включающий культивирование линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 5 суток, отличающийся последующим добавлением в среду S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 и 500 мкМ с инкубацией в течение 72 часов.