Способ снижения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1 (ОАТР1В1) Российский патент 2024 года по МПК C12N5/22 C12N5/09 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для ингибирования полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (OATP1B1).

Полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 (organic anion transporting polypeptide, OATP1B1) - это трансмембранный инфлюксный белок-переносчик, обеспечивающий проникновение эндо- и экзобиотиков в клетку.

В настоящее время активно изучается модуляция активности белка-транспортера OАТР1В1. Доказано, что соединения кларитромицин, эритромицин, циклоспорин, валсартан, абамектин, азиатикозид и др. обладают ингибирующей способностью [Lane T.R., Urbina F., Zhang X., Fye M., Gerlach J., Wright S.H., Ekins S. Machine Learning Models Identify New Inhibitors for Human OATP1B1. Mol Pharm. 2022;19(11):4320-4332. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.2c00662.]

Желчные кислоты, конъюгаты стероидных гормонов, простагландины и тиреоидные гормоны являются типичными субстратами OATP1В1 [Liu T, Li Q. Organic anion-transporting polypeptides: a novel approach for cancer therapy. J Drug Target. 2014;22(1):14-22. doi: 10.3109/1061186X.2013.832767.].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и экономичного способа снижения количества OATP1B1 в эксперименте in vitro.

С данной целью было выполнено исследование на линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°С и 5%-содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C («World Science», Корея) в модифицированной среде Игла Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, CША), с добавлением L-глутамина (4мМ)(Sigma-Aldrich), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich) соответственно.

Клетки культивировали до образования клеточного монослоя (5 суток), после чего для инактивации OATP1B1 в культуральную среду добавляли прогестерон («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации 1, 10 и 100 мкМ и инкубировали 24 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли этанол (растворитель прогестерона) в конечной концентрации 0,01%.

После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США). В супернатанте определяли относительного количество OATP1B1 с помощью метода вестерн-блот. Хемилюминесценцию фиксировали с помощью ChemiDocXRS+ («Bio-Rad», США). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab («Bio-Rad», США).

Молекулярная масса OATP1B1 была подтверждена путем сравнения с маркерами молекулярной массы (Precision plus protein standards Dual Color, «Bio-Rad», США). Содержание OATP1B1 оценивали относительно уровня GAPDH.

Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Результаты представлены в виде M ± SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью теста Даннетта. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Воздействие прогестерона в концентрации 1 мкМ на клетки линии HepG2 в течение 24 ч не влияло на количество OATP1B1, данный показатель достоверно не отличался от значений контроля (р>0,05). Увеличение концентрации прогестерона до 10 и 100 мкМ приводило к повышению количества белка OATP1B1. Так, воздействие прогестерона в течение 24 ч в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ вызывало снижение количества OATP1B1 на 24,9% (р=0,003) и 27,2% (р=0,002) соответственно.

Фиг. 1. Относительное количество OATP1B1 в клетках линии HepG2 при воздействии прогестерона в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ в течение 24 ч (M ± SD, n = 3). Примечание: ** р < 0,01 статистически значимые отличия по сравнению с контролем

Таким образом, для снижения количества OATP1B1 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла прогестерона до достижения его концентрации в среде 10 мкМ и 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ - субстратов OATP1B1 в трех экспериментах.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу снижения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОATP1B1), in vitro. Указанный способ включает культивирование линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в течение 5 суток, и добавление в среду прогестерона до достижения его концентрации в среде, выбранной из 10 и 100 мкМ, с последующей инкубацией в течение 24 ч. Настоящее изобретение обеспечивает доступный и экономичный способ снижения количества OATP1B1 в эксперименте in vitro. 1 ил.

Способ снижения количества полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОATP1B1), in vitro, включающий культивирование линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в течение 5 суток, и добавление в среду прогестерона до достижения его концентрации в среде, выбранной из 10 и 100 мкМ, с последующей инкубацией в течение 24 часов.