Способ исследования эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта Российский патент 2024 года по МПК G01N1/00 G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии и челюстно-лицевой хирургии и может быть использовано в исследовательской деятельности для оценки эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта.

Заживление ран слизистой оболочки полости рта является актуальной проблемой. Раневые дефекты данной локализации встречаются у 42% населения, особенно часто у лиц старческого и пожилого возраста, а также у людей с сопутствующими хроническими заболеваниями [Nazir M.A., 2017].

Традиционной методикой лечения данной патологии является оставление раневого дефекта открытым, однако незакрытые раны данной локализации подвержены повторному инфицированию и травматизации, вследствие чего происходит рубцевание, образование свищей и гипоплазия нижней трети лица [Singer A.J., 2021]. Поэтому в последнее время приобретает популярность подход, при котором раневой дефект перекрывается различными раневыми покрытиями, к которым относятся эпидермальные (Apligraf^®), дермальные (Alloderm^®, Matriderm^®) и композитные (Integra^®, Biobrane^®) мембраны. Также разрабатываются новые покровные биоматериалы, поэтому вопрос их апробации и оценки эффективности является актуальным.

Известен способ оценки течения и прогноза развития гнойных ран при флегмонах челюстно-лицевой области [RU2233449C1, опуб. 27.07.2004], при котором проводится визуальная оценка объема и характера экссудации, диагностические цитохимические методы исследования нейтрофильных гранулоцитов в раневом отделяемом, в том числе определение активности хроматина ДНК и активности миелопероксидазы, определяется интегральная функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов путем дополнительного изучения содержания в них катионных белков и гликогена, после чего определяется общий биологический показатель активности - тканевой индекс нейтрофильных гранулоцитов раневого экссудата, на основании которого делается прогноз относительно типа течения гнойной раны. Однако к его недостаткам относится следующее:

1. Данный метод предпочтителен для клинического этапа исследования, так как мазок-отпечаток для дальнейшего изучения достаточно тяжело взять у мелких лабораторных животных, таких как крыс, которые предпочтительно используются для формирования экспериментально модели данной патологии. Тем не менее, прежде чем материал выйдет на этап клинического исследования его необходимо апробировать на животных.

2. Исследуется только клеточный компонент слизистой оболочки полости рта в ходе течения раневого процесса. Однако, регенерация раны представляет собой сложный патоморфогенетический механизм, включающий в себя изменения в эпителии, собственной пластинке и трофическом аппарате слизистой оболочки полости рта. Поэтому данный метод не позволяет комплексно оценить все аспекты регенерации раны.

3. Анализ клеточного компонента включает в себя только оценку функциональной активности нейтрофилов. Однако, они имеют значимую роль при регенерации раны только на первых этапах данного патологического процесса. В дальнейшем главенствующая роль в межклеточном взаимодействии переходит макрофагам, фибробластам и тучным клеткам. Данная методика не включает оценку их функционального состояния.

Известен также способ прогнозирования направленности развития процесса заживления гнойных и инфицированных ран лица у детей [RU2624352C1, опуб. 03.07.2017], в ходе которого с помощью резонансного ближнепольного СВЧ зондирования измеряют диэлектрическую проницаемость в области раны или инфильтрата и на коже симметричных участков здоровой стороны. На основании полученных данных прогнозируют благоприятную или неблагоприятную направленность развития патологического процесса. Способ позволяет повысить достоверность прогноза, что достигается за счет использования резонансного ближнепольного СВЧ зондирования и измерения диэлектрической проницаемости ткани. К недостаткам способа можно отнести сложность проведения манипуляции на мелких лабораторных животных в виду наличия крупных датчиков для измерения, а также отсутствие комплексной оценки морфологических измерений в тканях слизистой оболочки полости рта, позволяющих судить об эффективности регенерации раневого дефекта еще на доклиническом этапе исследования.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ оценки течения раневого процесса и эффективности лечения кожных ран различного генеза [RU2478963C1, опуб. 10.04.2013]. При помощи данного способа оценивается течение раневого процесса и эффективность лечения кожны. Берутся соскобы с поверхности раны, выделяется ДНК с помощью реагента ДНК-ЭКСПРЕСС с красителем для электрофоретической детекции, полученный супернатант подвергаются горизонтальному электрофорезу в течение 15 минут. На полученных электрофореграммах измеряют длину полученных треков, которая отражает стадию течения раневого процесса. Описанный способ принят за прототип изобретения. Недостатками прототипа является тот факт, что при помощи данной методики делается вывод о стадии течения раневого процесса, однако его разделение на фазы воспаления, регенерации и реорганизации является достаточно условным – одна фаза сменяет другую параллельно, при этом на клеточном уровне наблюдаются признаки как воспаления, так и регенерации одномоментно. Также данный метод не позволяет проанализировать все аспекты патоморфогенеза в зависимости от выбора биоматериалов для закрытия раневых дефектов, что не дает полной картины для оценки эффективности исследуемых раневых покрытий. При этом, если их технологической особенностью является модификация ионами металлов или лекарственными средствами, становится необходимым оценить, как подобные изменения влияют на изменение морфофункциональной характеристики компонентов ткани, характеризующей воспаление, регенерацию и реорганизацию.

В основу настоящего изобретения положена задача создания нового более точного и оптимизированного способа оценки эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта на доклиническом этапе, позволяющего проанализировать все аспекты восстановления тканей на месте раневого дефекта при использовании данных покровных мембран в сравнении с аналогами или традиционной методикой, когда раневой дефект остается открытым.

Поставленная задача решается следующим способом, включающим постановку экспериментальной модели раневого дефекта с дальнейшим его перекрытием исследуемым биоматериалом и созданием группы контроля (открытый раневой дефект или перекрытие раны аналогом биоматериала), забор биоматериала на 3-и, 7-е и 12-е сутки исследования для дальнейшего комплексного морфометрического исследования.

Разделяют крыс линии Wistar на две группы – экспериментальную 1 и экспериментальную 2. Количество животных определяют из соображений, что на одну контрольную точку на одну экспериментальную группу должно приходиться пять крыс, в таком случае выборка поддается статистическому анализу при помощи непараметрических критериев Уилкоксона и Краскала-Уоллиса. Животным обеих групп формируют раневой дефект в области щеки в пределах слизистой оболочки. Животным 1-ой группы раневой дефект перекрывают исследуемым биоматериалов, животным второй – аналогом или оставляют открытым согласно традиционной методике лечения.

Производят забор гистологического материала на 3-и, 7-е и 12-е сутки исследования, что соответствует общепринятым представлениям о фазах течения раневого процесса (воспаление, регенерация, реорганизация соответственно). Изготавливают гистологические препараты для световой и электронной микроскопии исследования по стандартным методикам. Препараты для световой микроскопии окрашивают гематоксилином и эозином и по методике Ван Гизона, полутонкие срезы для подсчета клеточных элементов окрашивают азуром 2. Для имуногистохимического исследования используют антитела к VEGF (фактору роста эндотелия сосудов) и CD34 (маркер созревания сосудов).

При помощи светового микроскопа оценивают удельную площадь воспалительной инфильтрации, грануляционной ткани, рыхлой волокнистой соединительной ткани, плотной волокнистой соединительной ткани, толщину эпителиального пласта, подсчитывают индекс Керногана, индекс перикапиллярной диффузии, артериоло-венулярное взаимоотношение, численную плотность нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, тучных клеток. При помощи электронного микроскопа оценивают ультраструктурные изменений эндотелиоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, фибробластов, нейтрофилов, тучных клеток и наличие прорастающих периферических нервных волокон. При помощи иммуногистохимического исследования определяют показатель H-score для VEGF и CD34.

Проводят статистическое исследование. При сравнении независимых выборок используют критерий Краскала-Уоллиса с медианным тестом, для парных сравнений - критерий Уилкоксона.

Сущность изобретения поясняется рисунками, где представлены:

фиг 1 - оперативное вмешательство с иссечением участка слизистой оболочки полости рта и перекрытием раневого дефекта исследуемым биоматериалом;

фиг 2 - значения исследуемых показателей в интактной слизистой оболочке;

фиг 3 - схема патоморфогенеза заживления раневого дефекта слизистой оболочки полости рта.

Сущность заявляемого способа заключается в моделирование раневого дефекта и его перекрытие по заданной методике; изготовление гистологических препаратов для комплексного морфометрического анализа и иммуногистохимического исследования проведение количественного подсчета заданных показателей, максимально точно и емко отражающих процесс регенерации раневого дефекта; сравнение с полученными табличными значениями для интактной слизистой оболочки полости рта, полученными в ходе ранее проведенного исследования; и проведение статистический анализ с использованием непараметрических критериев Уилкоксона и Краскала-Уоллиса.

Способ осуществляется следующим образом:

Эксперимент выполняют на 30-ти крысах-самцах линии Вистар. Животных разделяют на две группы: экспериментальную №1 (n=15), которым раневой дефект оставляют открытым согласно стандартному ведению раневого процесса или перекрывают имеющимся аналогом, экспериментальную №2 (n=15), которым раневой дефект перекрывают исследуемым материалом.

С целью моделирования раневого дефекта слизистой оболочки полости рта животных вводят в состояние наркоза в ходе внутривенной инъекции препаратом "Золетил". В течении оперативного вмешательства крысам после антисептической обработки операционного поля 2% раствором хлоргексидина иссекают лоскут слизистой оболочки в области щеки размером 7*4 мм. После остановки крови гемостатической губкой область раневого дефекта повторно обрабатывают 2% раствором хлоргексидина. Далее животным экспериментальных групп по краям раны атравматичной иглой простыми узловыми швами фиксируют исследуемый материал и материал сравнения (при необходимости) как на фигуре 1.

Выведение животных из эксперимента производят на 3-и, 7-е и 12-е сутки исследования путем введения в состояние гипоксии в СО2-камере. После повторно иссекают слизистую оболочку щеки на месте раневого дефекта с захватом тканей с периферии (отступ 0,5 см).

Приготовление гистологических препаратов осуществляют по общепринятой методике. Просматривают препараты на световом микроскопе Karl Zeuss Observer D1 (Германия) с использованием камеры для световой микроскопии Zeiss AxioCam ICc5 (Германия). Для этого окрашивают парафиновые препараты гематоксилином-эозином и по методу Ван Гизона пирофуксином и гематоксилином, полутонкие толуидиловым синим по стандартным методикам.

Иммуногистохимическое исследование.

Для иммуногистохимического окрашивания используют кроличьи поликлональные антитела VEGF и CD-34, которые наносятся на ранее подготовленные гистологические срезы. Докрашивание ядер производитсягематоксилином.

Система подсчета включала в себя характеристику интенсивности иммуногистохимической окраски исследуемых клеток, оцениваемую по 4 - бальной шкале: 0 - нет окрашивания, 1 - слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - сильное, 4 - очень сильное окрашивание.

Формула подсчета: Histochemical scores =∑ P(i) х i,

где i - интенсивност окрашивания, выраженная в баллах от 0-4,

P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Электронная микроскопия.

Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливают на ультратоме LKB-5, BROMMA (Швеция) из материала, подготовленного по стандартной методике и окрашенного уранилацетатом и цитратом свинца. Полутонкие срезы толщиной 1мкм окрашивают толуидиловым синим и просматривают в световом микроскопе Karl Zeuss Observer D1 (Германия), ультратонкие срезы толщиной 0,1мкм контрастируют уранил ацетатом и цитратом свинца и изучают с помощью электронного микроскопа JEOL JEM -1400 CX (Япония).

Морфометрический анализ.

В основе морфометрического анализа лежат классические методы стереометрии [Автандилов Г.Г., 1990]. На срезах толщиной 4-5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона пирофуксином и гематоксилином, подсчитывают показатели удельной площади воспалительной инфильтрации, грануляционной ткани, рыхлой волокнистой соединительной ткани, плотной волокнистой соединительной ткани, толщину эпителиального пласта, индекс Керногана, индекс перикапиллярной диффузии, артериоло-венулярное взаимоотношение, численную плотность нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, тучных клеток. При помощи электронного микроскопа оценивают ультраструктурные изменений эндотелиоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, фибробластов, нейтрофилов, тучных клеток и наличие прорастающих периферических нервных волокон.

При работе с изображениями используют программа обработки графических изображений Axio Vision, CarlZeiss (Германия) и Image, версия 1.52u (США).

Статистический анализ.

Статистическую обработку проводят в программе Statistica 10.0, IBM (CША). Проверку статистических гипотез на характер распределения признака проводят при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. При обработке полученных результатов используют методы описательной и непараметрической статистики. Исследуемые параметры описывают как медиану и квартили, М (Q1;Q3). При сравнении независимых выборок используют критерий Краскала-Уоллиса с медианным тестом, для парных сравнений использовали критерий Вилкоксона. Различия считают статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

Сравнивают полученные значения с интактной слизистой оболочкой (фиг.2). Делают вывод о стадии течения раневого процесса в зависимости от выбора биоматериала для перекрытия раневого дефекта, сравнивают со схемой патоморфогенеза (фиг.3).

Совокупность существенных признаков изобретения позволяет получить новый технический результат, заключающийся в комплексной и объективной оценке изменений тканей слизистой оболочки полости рта происходящих на разных этапах регенерации раневого дефекта, на основе которой можно сделать вывод об эффективности использования нового биоматериала для лечения данной патологии на доклиническом этапе.

Таким образом, предложенный способ позволяет на доклиническом этапе оценить возможность использования новых разработанных биоматериалов для лечения раневых дефектов слизистой оболочки полости рта, что позволит улучшить качество лечения и сократить его сроки, а также снизить риск возникновения постоперационных осложнений.

Источники информации

1. Alim M.A. Do mast cells have a role in tendon healing and inflammation? / M.A. Alim, M. Peterson, G. Pejler. Cells. – 2020. – Vol. 5 – № 9. – P. 1134.

2. Bolbasov E.N. The investigation of the production method influences on the structure and properties of the ferroelectric nonwoven materials based on vinylidene fluoride – tetrafluoroethylene copolymer / E.N. Bolbasov, K.S. Stankevich, E.A. Sudarev, V.M. Bouznik, V.L. Kudryavtseva, L.V. Antonova, V.G. Matveeva, Y.G. Anissimov, S.I. Tverdokhlebov // Materials chemistry and physics – 2020. – Vol. 182. – P. 338–346.

3. Nazir M.A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention / M.A. Nazir // International journal of health sciences (Qassim). – 2017. – Vol. 11. – № 2. – P. 72-80.

4. Singer A.J. Healing mechanisms in cutaneous wounds: tipping the balance / A.J. Singer // Tissue engineering part B: reviews. - 2022. Mar 11. doi: 10.1089/ten.TEB.2021.0114. Epub ahead of print. PMID: 34915757.

5. Smane-Filipova L. Immunohistochemical analysis of nestin, CD34 and TGFβ3 in facial tissue of children with complete unilateral and bilateral cleft lip and palate / L. Smane – Filipova, M. Pilmane, I. Akota // Stomatologija. – 2016. – Vol. 18 - № 3. – P. 98-104.

6. Vidal MT. Density of mast cells and microvessels in minor salivary gland tumors / M.T. Vidal, I.B. de Oliveira Araújo, C.A. Gurgel, A. Pereira Fde, D.S. Vilas-Bôas, E.A. Ramos // Tumor Biology. – 2013. – Vol. 34. – №1. – P. 309-316.

7. Zhao N. Dual aptamer-functionalized in situ injectable fibrin hydrogel for promotion of angiogenesis via co-delivery of VEGF and PDGF-BB / N. Zaao, A. Suzuki, X. Zhang, P. Shi, L. Abune, J. Coyne, H. Jia, N. Xiong., G. Zhang., Y. Wang // ACS Applid material and interfaces. 2019. – Vol. 108. – P. 44–65.

Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано при исследовании эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта. Создают экспериментальную модель раневого дефекта на крысах. Забор материала осуществляется на 3-и, 7-е и 12-е сутки исследования. Проводят комплексный морфометрический анализ, включающий в себя световую и электронную микроскопию, иммуногистохимическое исследование. Сравнивают полученные значения с интактной слизистой оболочкой. Способ обеспечивает исследование эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта за счет оценки комплекса наиболее значимых показателей. 3 ил.

Способ исследования эффективности применения биосовместимых материалов для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта, включающий создание экспериментальной модели раневого дефекта в пределах слизистой оболочки на крысах с дальнейшим его перекрытием исследуемым биосовместимым материалом, отличающийся тем, что на 3, 7 и 12 сутки исследования производят забор гистологического материала слизистой оболочки и проводят комплексный морфометрический анализ, включающий световую микроскопию с оценкой удельной площади воспалительной инфильтрации, грануляционной ткани, рыхлой волокнистой соединительной ткани, плотной волокнистой соединительной ткани, толщины эпителиального пласта, подсчитывают индекс Керногана, индекс перикапиллярной диффузии, артериоло-венулярное взаимоотношение, численную плотность нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, тучных клеток; электронную микроскопию и оценивают ультраструктурные изменения эндотелиоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, фибробластов, нейтрофилов, тучных клеток и наличие прорастающих периферических нервных волокон; проводят иммуногистохимическое исследование, для окрашивания используют кроличьи поликлональные антитела VEGF и CD-34с и определяют показатель H-score для VEGF и CD34, сравнивают полученные значения с интактной слизистой оболочкой в соответствии с фигурой 2 и делают вывод об эффективности применения исследуемого материала для закрытия раневых дефектов слизистой оболочки полости рта.