СПОСОБ ПОДСЧЕТА КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ НА АВТОМАТИЧЕСКИХ АНАЛИЗАТОРАХ С МОДУЛЕМ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ГИАЛУРОНИДАЗОЙ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/487 G01N1/28 G01N1/38 G01N35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано в рутинной клинической практике специалиста клинической лабораторной диагностики при исследовании сложных образцов синовиальной жидкости

Существует способ ручного подсчета клеточных элементов биологических жидкостей в камере Горяева и автоматического подсчета на гематологических анализаторах с модулем исследования биологических жидкостей, при котором исследование синовиальной жидкости часто дает некорректный результат, не сопоставимый с результатом ручного подсчета, вследствие высокой вязкости синовиальной жидкости, https://megalektsii.ru/s53306t7.html

https://pandia.ru/text/77/490/71448.php

Сущность предлагаемого способа заключается в обработке сложных образцов синовиальной жидкости раствором фермента гиалуронидазы на фосфатно-солевом буфере для снижения интерференции гиалуроновой кислоты при проведении подсчета клеточного цитоза.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: Синовиальную жидкость получают в асептических условиях путем пункции коленного или тазобедренного сустава. Содержимое шприца переносят в пробирку для гематологических исследований с К3ЭДТА до метки.

Лиофилизат для приготовления раствора гиалуронидазы (64 УЕ гиалуронидазы; в нашем случае торговое название - лидаза) разводят в 5 мл фосфатно-солевого буфера. Синовиальную жидкость добавляют к раствору гиалуронидазы 1:10 (1 часть синовиальной жидкости и 9 частей раствора гиалуронидазы) и тщательно перемешивают в течение одной минуты. Производят подсчет клеточных элементов раствора синовиальной жидкости на автоматическом гематологическом анализаторе, оснащенном технологией флуоресцентной проточной цитометрии (например, как в нашем случае, Sysmex XN-L) в режиме биологических жидкостей. Валидируют полученный результат с помощью скатерограммы прибора. Полученный результат умножают на 10.

На фиг. 1 представлен принцип измерения клеток в синовиальной жидкости методом флуоресцентной проточной цитометрии.

Метод флуоресцентной проточной цитометрии позволяет оценивать не только общее количество ядросодержащих клеток, но и измерять дополнительные субпопуляции на основе сигналов прямого светорассеяния (FSC - forward scatteing), бокового светорассеяния (SSC - side scattering) и флуоресцентного сигнала (SFL - side fluorescence). Лучше всего лейкоциты разделяются с помощью графика SSC против SFL, поскольку нейтрофилы и эозинофилы имеют более сильное боковое светорассеяние из-за их высокой гранулярности, моноциты - более сильный флуоресцентный сигнал за счет большого размера и более интенсивного окрашивания. Лимфоциты имеют самый слабый сигнал, поскольку имеют низкое соотношение ядро/цитоплазма их цитоплазма не содержит гранул. На основе этого разделения мы можем дифференцировать измеряемые клетки как минимум на 4 субпопуляции лейкоцитов - лимфоциты, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы. Кроме этого за счет расширенного динамического диапазона на графике WDF(EXT) выявлятся атипичные высокофлуоресцентные клетки HF-BF, которые крупнее чем лейкоциты и поэтому имеют гораздо более высокий флуоресцентный сигнал.

На фиг. 2 представлены 2 изображения: левый образец был измерен без разведения, правый был измерен с разведением, проведенным по методике, указанной в этом патенте. Красной стрелкой на левой скатерограмме WDF показана плохая дифференциация лейкоцитов от дебриса. Прибор не распознает популяции и помечает их серым цветом. На правой скатерограмме WDF желтой стрелкой отмечена хорошая дифференциация лейкоцитов от дебриса. Прибор распознает популяции лейкоцитов и дифференцирует их.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Пациент 1. Мужчина 46 лет, обратился с жалобами на боли в правом коленном суставе. Объективно: отек и покраснение в области правого коленного сустава. При пункции правого коленного сустава получено 6 мл вязкой, светло-желтой, мутной жидкости. Образец синовиальной жидкости из пробирки с К3ЭДТА проанализирован с помощью режима измерения биологических жидкостей автоматического гематологического анализатора, оснащенного технологией флуоресцентной проточной цитометрии.

В автоматическом режиме анализатор не смог распознать клетки и не определил количество клеток и дифференциальный состав клеток в синовиальной жидкости. На фиг. 3 показан экран анализатора с серыми скатерограммами, при визуальной оценке скатерограммы прибора наблюдается интерференция, а на фиг. 4 результаты с символом «---». При ручном подсчете - 1950 клеток в 1 мкл. Добавление фермента гиалуронидазы позволяет в автоматическом режиме получать скатерограммы, которые способна обрабатывать автоматизированная система результаты, что показано на фиг. 5 и данные, сопоставимые с ручным подсчетом, что проиллюстрировано на фиг. 6.

Пациентка 2, женщина 67 лет, обратилась с жалобами на боли в левом тазобедренном суставе. В анамнезе эндопротезирование левого тазобедренного сустава. Объективно: отек и покраснение в области тазобедренного сустава. При пункции левого тазобедренного сустава получено 5 мл вязкой, светло-желтой, мутной жидкости. Образец синовиальной жидкости из пробирки с КЗЭДТА проанализирован с помощью режима измерения биологических жидкостей автоматического гематологического анализатора, оснащенного технологией флуоресцентной проточной цитометрии.

В результате в автоматическом режиме количество клеток синовиальной жидкости составило 51347 в 1 мкл (показано на фиг. 8). При ручном подсчете - 64700 клеток в 1 мкл. При визуальной оценке скатерограммы прибора наблюдается интерференция (показано на фиг. 7). Добавление фермента гиалуронидазы позволяет в автоматическом режиме получать скатерограммы, которые способна обрабатывать автоматизированная система результаты, что показано на фиг. 9 и данные, сопоставимые с ручным подсчетом, что проиллюстрировано на фиг. 10.

Пациент 3, мужчина 71 года, обратился с жалобами на боли в левом коленном суставе. В анамнезе эндопротезирование левого коленного сустава. Объективно: отек и покраснение в области левого коленного сустава. При пункции левого коленного сустава получено 9 мл вязкой, светло-желтой, мутной жидкости. Образец синовиальной жидкости из пробирки с К3ЭДТА проанализирован с помощью режима измерения биологических жидкостей автоматического гематологического анализатора, оснащенного технологией флуоресцентной проточной цитометрии.

В результате в автоматическом режиме количество клеток синовиальной жидкости составило 3 408 в 1 мкл. (показано на фиг. 12) При ручном подсчете-2 700 клеток в 1 мкл. При визуальной оценке скатерограммы прибора наблюдается интерференция, (показано на фиг. 11) Добавление фермента гиалуронидазы позволяет в автоматическом режиме получать скатерограммы, которые способна обрабатывать автоматизированная система результаты, что показано на фиг. 13 и данные, сопоставимые с ручным подсчетом, что проиллюстрировано на фиг. 14.

Добавление гиалуронидазы в синовиальную жидкость позволяет решить проблему интерференции гиалуроновой кислоты при подсчете клеточных элементов на автоматических гематологических анализаторах. При этом мы в течение двух минут получаем не только количество клеток, но и их дифференциальный состав. Предлагаемый способ можно рекомендовать для использования в рутинной клинической практике.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для подсчета клеточного состава синовиальной жидкости на автоматических анализаторах с модулем биологических жидкостей после обработки гиалуронидазой. Лиофилизат для приготовления раствора гиалуронидазы - 64 УЕ гиалуронидазы - лидазы разводят в 5 мл фосфатно-солевого буфера. Суставной аспират из пробирки с К3ЭДТА добавляют к раствору фермента 1:10 - 1 часть синовиальной жидкости, 9 частей раствора гиалуронидазы, тщательно перемешивают в течение одной минуты. Производят подсчет клеточных элементов на модуле биологических жидкостей автоматического гематологического анализатора. Валидируют результат с помощью скатерограммы прибора, результат умножают на 10. Способ обеспечивает возможность повышения скорости и точности оценки количества клеточных элементов синовиальной жидкости за счет обработки сложных образцов синовиальной жидкости раствором фермента гиалуронидазы на фосфатно-солевом буфере для снижения интерференции гиалуроновой кислоты при проведении подсчета клеточного цитоза. 14 ил., 3 пр.

Способ подсчета клеточного состава синовиальной жидкости на автоматических анализаторах с модулем биологических жидкостей после обработки гиалуронидазой, заключающийся в том, что лиофилизат для приготовления раствора гиалуронидазы - 64 УЕ гиалуронидазы - лидазы разводят в 5 мл фосфатно-солевого буфера, суставной аспират из пробирки с К3ЭДТА добавляют к раствору фермента 1:10 - 1 часть синовиальной жидкости, 9 частей раствора гиалуронидазы, тщательно перемешивают в течение одной минуты, производят подсчет клеточных элементов на модуле биологических жидкостей автоматического гематологического анализатора, валидируют результат с помощью скатерограммы прибора, результат умножают на 10.