СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В ОБРАЗЦАХ С ПРИМЕСЬЮ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/487 G01N35/00 G01N1/38 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и может использоваться в рутинной клинической практике специалиста клинической лабораторной диагностике при исследовании образцов синовиальной жидкости с примесью крови.

Существуют методы вычисления истинного клеточного состава спиномозговой жидкости. В публикациях (1) и (2) был представлен метод получения истинных значений клеточного состава в образцах ликвора, однако данная методика учитывает только 4 показателя - WBC и RBC для периферической крови и WBC-BF и RBC-BF для спинномозговой жидкости с использованием анализаторов с простой технологией.

Greenberg RG, Smith РВ, Cotton CM, Moody MA, Clark RH, Benjamin DK.

Traumatic lumbar punctures in neonates: test performance of the cerebrospinal fluid white blood cell count.

Pediatr Infect Dis J. 2008 Dec;27(12): 1047-51.

1. Bonadio WA.

The cerebrospinal fluid: physiologic aspects and alterations associated with bacterial meningitis.

Pediatr Infect Dis J. 1992 Jun;l l(6):423-31. Review.

2. https://patents.google.com/patent/US10401351B2/en

Сущность предлагаемого способа заключается в измерении клеточного состава в сложных образцах синовиальной жидкости с примесью крови на автоматических гематологических анализаторах с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии для получения информации об истинном клеточном составе лабораторным персоналом и врачом-клиницистом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: Синовиальную жидкость получают в асептических условиях путем пункции коленного или тазобедренного сустава у обследуемого пациента. Содержимое шприца переносится в пробирку для гематологических исследований с К3ЭДТА. После этого синовиальную жидкость повышенной вязкости, не позволяющей провести исследование, разводят каким-либо веществом или раствором в k раз, если это необходимо для повышения точности и качества измерения, k - это коэффициент разведения синовиальной жидкости, например при разведении в 10 раз, то есть 1:9, коэффицент k=10, если разведение проводилось в 20 раз, то есть 1:19, коэффициент k=20, если разведение не проводилось, коэффициент k=1.

Параллельно у этого же пациента выполняют забор периферической крови в пробирку для гематологических исследований с К3ЭДТА.

После этого пробирку с синовиальной жидкостью устанавливают на борт автоматического гематологического анализатора с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии и эритроцитов методом импедансного измерения и проводят исследование синовиальной жидкости в режиме измерения биологических жидкостей (режим BF).

Для измерения лейкоцитов в синовиальной жидкости методом флуоресцентной проточной цитометрии гематологический анализатор имеет специальную реакционную камеру 1, в которую автоматически подается биоматериал из пробирки и вступает во взаимодействие с двумя реагентами - лизирующим раствором (для лизиса эритроцитов) и флуоресцентной краской (для флуоресцентного окрашивания лейкоцитов). После этого смесь автоматически подается в проточную ячейку 1 и подвергается излучению красного лазера. Под воздействием излучения лейкоциты рассеивают свет, а флуоресцентная краска испускает свет. Рассеянный свет и свет от флуоресцентной краски собирается тремя детекторами - детектор прямого светорассеяния (FSC - forward scattering), детектор бокового светорассеяния (SSC - side scattering) и детектор боковой флуоресценции (SFL - side fluorescense). Собранные сигналы подвергаются обработке и на основе сигналов строятся скатерограммы (точечные графики). Графики представлены на фиг. 1. На фиг. 1 представлены два графика. Левый график (график WDF) построен на основе сигналов от детекторов SSC и SFL (боковое светорассеяние против боковой флуоресценции). Правый график (график WDF(EXT)) также построен на основе сигналов от детекторов SSC и SFL, только имеет расширенный динамический диапазон по оси SFL для детекции крупных патологических клеток и измерения общего количества ядросодержащих клеток (общего цитоза). Получаемые в ходе измерения параметры представлены на фиг. 1. Метод флуоресцентной проточной цитометрии позволяет оценивать общее количество ядросодержащих клеток (TC-BF - общий цитоз), общее количество лейкоцитов (WBC-BF) и измерять дополнительные субпопуляции - абсолютное и относительное количество мононуклеарных клеткок (MN%,#) и полиморфноядерных клеток (PMN%,#).

Для измерения эритроцитов в синовиальной жидкости методом импедансного измерения гематологический анализатор имеет специальную реакционную камеру 2, в которую автоматически подается биоматериал из пробирки и смешивается с реагентом - дилюентом, который разбавляет смесь и одновременно является обжимающей жидкостью. После этого смесь автоматически подается в проточную ячейку 2, в которой клетки, проходя через апертуру, измеряются методом постоянного тока (импедансным методом). Собранные сигналы подвергаются обработке и на их основе измеряется количество эритроцитов в биологической жидкости (RBC-BF). Этот параметр позволяет подсчитывать эритроциты с чувствительностью от 1000 кл/мкл. Одновременно с этим измеряется показатель RBC-BF2, который позволяет подсчитывать эритроциты с повышенной чувствительностью от 100 кл/мкл.

После измерения синовиальной жидкости на борт автоматического гематологического анализатора с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии и эритроцитов методом импедансного измерения устанавливается пробирка с периферической кровью того же пациента для измерения периферической крови в режиме цельной крови (WB).

Для измерения лейкоцитов в периферической крови методом флуоресцентной проточной цитометрии гематологический анализатор имеет специальную реакционную камеру 1, в которую автоматически подается биоматериал из пробирки и вступает во взаимодействие с двумя реагентами - лизирующим раствором (для лизиса эритроцитов) и флуоресцентной краской (для флуоресцентного окрашивания лейкоцитов). После этого смесь автоматически подается в проточную ячейку 1 и подвергается излучению красного лазера. Под воздействием излучения лейкоциты рассеивают свет, а флуоресцентная краска испускает свет. Рассеянный свет и свет от флуоресцентной краски собирается тремя детекторами - детектор прямого светорассеяния (FSC - forward scattering), детектор бокового светорассеяния (SSC - side scattering) и детектор боковой флуоресценции (SFL - side fluorescense). Собранные сигналы подвергаются обработке и на основе сигналов строятся скатерограммы(точечные графики). График представлен на фиг. 2. На фиг. 2 показано расположение измеряемых субпопуляций лейкоцитов в периферической крови. График WDF построен на основе сигналов от детекторов SSC и SFL (боковое светорассеяние против боковой флуоресценции). Метод флуоресцентной проточной цитометрии позволяет оценивать общее количество лейкоцитов (WBC) и измерять их субпопуляции - абсолютное и относительное количество лимфоцитов (LYMPH%,#), моноцитов (MONO%,#), нейтрофилов (NEUT%,#), эозинофилов (ЕО%,#) и базофилов(ВА80%,#).

Для измерения эритроцитов в периферической крови методом импедансного измерения гематологический анализатор имеет специальную реакционную камеру 2, в которую автоматически подается биоматериал из пробирки и смешивается с реагентом - дилюентом, который разбавляет смесь и одновременно является обжимающей жидкостью. После этого смесь автоматически подается в проточную ячейку 2, в которой клетки, проходя через апертуру, измеряются методом постоянного тока (импедансным методом). Собранные сигналы подвергаются обработке и на их основе измеряется количество эритроцитов (RBC) и тромбоцитов (PLT) в периферической крови.

Способ измерения клеточного состава синовиальной жидкости в образцах с примесью крови заключается в обработке и расчете полученных результатов двух измерений двух образцов от одного и того же пациента на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов -синовиальной жидкости в режиме измерения биологических жидкостей (BF) и периферической крови в режиме измерения цельной крови (WB).

После выполнения измерения получают таблицу с исходными данными (таб. 1).

Итоговые данные после проведения вычислений показаны в таб. 2. Всем новым полученным значениям добавляют индекс к. Этот индекс обозначает значение с итоговым результатом, которым может пользоваться лабораторный персонал и врач-клиницист.

При расчетах учитывают следующие факторы:

1) Образец содержит ядросодержащие эритроциты(эритробласты). В таком случае при серьезной контаминации биологической жидкости с кровью, содержащей высокую концентрацию эритробластов получение информации об истинном цитозе, лейкоцитозе и субпопуляциях лейкоцитов невозможно.

2) Образец крови или биологической жидкости содержит бластные клетки. В этом случае возможен подсчет TC-BFk и WBC-BFk, но при оценке субпопуляций MN#k, PMN#k, MN%k и PMN%k учитывают, что какая-то из двух групп клеток (мононуклеарные или полиморфноядерные или обе) содержат бластные клетки.

Общие выводы по использованию изобретения и его преимущества перед аналогами.

Предлагаемый способ исследования синовиальной жидкости с примесью крови позволяет решить проблему интерференции кровью исследуемого клеточного состава синовиальной жидкости с примесью периферической крови на автоматических гематологических анализаторах. При этом в течение двух минут получают не только количество клеток, но и их дифференциальный состав, в том числе абсолютное и относительное количество мононуклеарных и полиморфноядерных клеток, в образцах с разведением и без.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Пациент 1. При пункции сустава получено 5 мл синовиальной жидкости с примесью крови. Образец синовиальной жидкости из пробирки с К3ЭДТА был предварительно разведен гиалуронидазой для подавления интерференции гиалуроновой кислоты в соотношении (1:9) (k=10) и был проанализирован в режиме измерения биологических жидкостей (BF) автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов с целью получения клеточного состава синовиальной жидкости. Для получения истинных значений клеточного состава исследуемой синовиальной жидкости у пациента была взята венозная кровь в пробирку с К3ЭДТА и проанализирована в режиме цельной крови (WB) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов. После проведенных измерений была сформирована таблица исходных данных:

После проведения вычислений были полученные истинные значения (табл.4):

Пример 2.

Пациент 1. При пункции сустава получено 6 мл синовиальной жидкости с примесью крови. Образец синовиальной жидкости из пробирки с К3ЭДТА был предварительно разведен гиалуронидазой для подавления интерференции гиалуроновой кислоты в соотношении (1:9) (k=10) и был проанализирован в режиме измерения биологических жидкостей (BF) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов. Для получения истинных значений клеточного состава исследуемой синовиальной жидкости у пациента была взята венозная кровь в пробирку с К3ЭДТА и проанализирована в режиме цельной крови (WB) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов. После проведенных измерений была сформирована таблица исходных данных:

После проведения вычислений были получение истинные значения (табл.6):

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для измерения клеточного состава синовиальной жидкости в образцах с примесью крови. Проводят измерение образцов синовиальной жидкости и периферической крови на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов в синовиальной жидкости в режиме измерения биологических жидкостей (BF) и периферической крови в режиме измерения цельной крови (WB). В ходе измерения образца синовиальной жидкости в режиме BF получают данные по абсолютному количеству ядросодержащих клеток, лейкоцитов и эритроцитов с повышенной чувствительностью, относительному количеству мононуклеарных клеток. В ходе измерения образца периферической крови в режиме WB получают данные по абсолютному количеству лейкоцитов и эритроцитов, относительному количеству лимфоцитов и моноцитов. Производят одновременную оценку клеточного состава синовиальной жидкости, а также исследование периферической крови обследуемого пациента на одном и том же автоматическом гематологическом анализаторе, с последующим вычислением по заявленным формулам истинного количества и клеточного состава синовиальной жидкости. Способ обеспечивает возможность повышения скорости и точности оценки клеточного состава синовиальной жидкости в образцах, загрязненных периферической кровью, за счет решения проблемы интерференции кровью исследуемого клеточного состава синовиальной жидкости с примесью периферической крови на автоматических гематологических анализаторах. 2 ил., 6 табл., 2 пр.

Способ измерения клеточного состава синовиальной жидкости в образцах с примесью крови, включающий измерение образцов синовиальной жидкости и периферической крови на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов и технологией импедансного измерения для анализа эритроцитов в синовиальной жидкости в режиме измерения биологических жидкостей (BF) и периферической крови в режиме измерения цельной крови (WB);

в ходе измерения образца синовиальной жидкости в режиме BF получают данные:

TC-BF, в кл/мкл – абсолютное количество ядросодержащих клеток;

WBC-BF, в кл/мкл – абсолютное количество лейкоцитов;

MN%, в % - относительное количество мононуклеарных клеток;

RBC-BF2, 10¹² кл/л – абсолютное количество эритроцитов с повышенной чувствительностью;

в ходе измерения образца периферической крови в режиме WB получают данные:

WBC, 10⁹ кл/л – абсолютное количество лейкоцитов;

RBC, 10¹² кл/л – абсолютное количество эритроцитов;

LYMPH%, в % - относительное количество лимфоцитов;

MONO%, в % - относительное количество моноцитов;

в процессе вычислений рассчитывают скорректированное количество ядросодержащих клеток, т.е. общий цитоз (TC-BFk), скорректированное абсолютное количество лейкоцитов (WBC-BFk), скорректированное абсолютное количество мононуклеарных клеток (MN#k), скорректированное абсолютное количество полиморфноядерных клеток (PMN#k), скорректированное относительное количество мононуклеарных клеток (MN%k) и скорректированное относительное количество полиморфноядерных клеток (PMN%k) в синовиальной жидкости,

сначала находят скорректированное количество ядросодержащих клеток, т.е. общий цитоз (TC-BFk) в синовиальной жидкости:

где k – коэффициент разведения синовиальной жидкости;

при этом значение TC-BFk по итогам вычисления (1) принимает 2 возможных варианта:

если TC-BFk ≤ 0, то ему присваивают значение 0, так как TC-BFk не может быть отрицательным, и тогда остальным величинам присваивают следующие значения: TC-BFk = 0, WBC-BFk = 0, MN#k = 0, PMN#k = 0, MN%k = 0%, PMN%k = 0%,

если TC-BFk > 0, то значение TC-BFk оставляют без изменений и далее рассчитывают WBC-BFk, MN#k, PMN#k, MN%k и PMN%k,

далее рассчитывают скорректированное абсолютное количество лейкоцитов в биологической жидкости (WBC-BFk):

при этом значение WBC-BFk по итогам вычисления (2) принимает 2 возможных варианта:

если WBC-BFk ≤ 0, то ему присваивают значение 0, так как WBC-BFk не может быть отрицательным, и тогда остальным величинам присваивают следующие значения: WBC-BFk = 0, MN#k = 0, PMN#k = 0, MN%k = 0%, PMN%k = 0%,

если WBC-BFk > 0, то значение TC-BFk оставляют без изменений и далее рассчитывают MN#k, PMN#k, MN%k и PMN%k,

далее определяют скорректированное абсолютное количество мононуклеарных клеток в биологической жидкости:

при этом значение MN#k по итогам вычисления (3) принимает 3 возможных варианта:

если MN#k < 0, то ему присваивают значение 0, так как MN#k не может быть отрицательным, и тогда MN#k = 0, PMN#k = WBC-BFk, MN%k = 0%, PMN%k = 100%,

если MN#k > WBC-BFk, то ему присваивают значение, равное WBC-BFk, так как скорректированное абсолютное количество лейкоцитов является суммой скорректированного абсолютного количества мононуклеарных клеток MN#k и скорректированного абсолютного количества полиморфноядерных клеток PMN#k и значение MN#k не может быть больше WBC-BFk, и тогда MN#k = WBC-BFk, PMN#k = 0, MN%k = 100%, PMN%k = 0%,

если 0 ≤ MN#k ≤ WBC-BFk, то значение MN#k оставляют без изменений и далее рассчитывают PMN#k, MN%k и PMN%k: