СПОСОБ ПОДСЧЕТА РЕАКТИВНЫХ НЕЙТРОФИЛОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НА АВТОМАТИЧЕСКОМ АНАЛИЗАТОРЕ С ТЕХНОЛОГИЕЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N35/08 G01N15/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и может использоваться в рутинной клинической практике специалиста клинической лабораторной диагностике при исследовании образцов цельной или разведенной крови

Сущность предлагаемого способа заключается в полностью автоматизированном измерении абсолютного и относительного количества реактивных нейтрофилов, величины индекса ядерного сдвига, общего количества всех незрелых нейтрофилов и количества сегментоядерных нейтрофилов в образцах цельной крови для получения быстрой и клинически значимой информации лабораторным персоналом и врачом-клиницистом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

У пациента выполняют сбор периферической крови. Собранный биоматериал собирают в пробирку для гематологических исследований с КЗЭДТА.

После этого данную пробирку устанавливают на борт автоматического гематологического анализатора с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии для измерения периферической крови в режиме цельной крови (WB).

Для измерения лейкоцитов в периферической крови методом флуоресцентной проточной цитометрии гематологический анализатор имеет специальную реакционную камеру 1, в которую автоматически подается биоматериал из пробирки и вступает во взаимодействие с двумя реагентами - лизирующим раствором (для лизиса эритроцитов) и флуоресцентной краской (для флуоресцентного окрашивания лейкоцитов). После этого смесь автоматически подается в проточную ячейку 1 и подвергается излучению красного лазера. Под воздействием излучения лейкоциты рассеивают свет, а флуоресцентная краска испускает свет. Рассеянный свет и свет от флуоресцентной краски собирается тремя детекторами - детектор прямого светорассеяния (FSC - forward scattering), детектор бокового светорассеяния (SSC - side scattering) и детектор боковой флуоресценции (SFL - side fluorescense). Собранные сигналы подвергаются обработке и на основе сигналов строятся скатерограммы(точечные графики). График представлен на фиг. 1. На фиг. 1 показано расположение измеряемых субпопуляций лейкоцитов в периферической крови. График WDF построен на основе сигналов от детекторов SSC и SFL (боковое светорассеяние против боковой флуоресценции). Метод флуоресцентной проточной цитометрии позволяет оценивать общее количество лейкоцитов (WBC) и измерять их субпопуляции - абсолютное и относительное количество лимфоцитов (LYMPH%,#), моноцитов (MONO%,#), нейтрофилов (NEUT%,#), эозинофилов (ЕО%,#), базофилов(ВА80%,#), незрелых гранулоцитов (Ю%,#) и показатели NEUT#& и NEUT%&, где NEUT#&=NEUT# - IG# и NEUT%&=NEUT% - IG%, Дополнительно измеряются показатель реактивной интенсивности нейтрофилов (NE-SFL) и коэффициент осцилляции нейтрофилов по оси Y (NE-WY). На основе показателей NE-SFL и NE-WY рассчитывается показатель NE-width-Y. NE-SFL показывает расстояние от оси абсцисс (SSC) до центроида популяции нейтрофилов, a NE-width-Y показывает размах популяции нейтрофилов по оси Y, а именно разницу между максимальной и минимальной точками популяции нейтрофилов вдоль оси ординат (SFL). Схема измерения показателей NE-SFL и NE-width-Y показана на фиг. 2.

Способ подсчета реактивных нейтрофилов в периферической крови на автоматическом анализаторе с помощью технологии флуоресцентной проточной цитометрии заключается в обработке полученных результатов измерения образца цельной крови на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов в режиме измерения цельной крови (WB) и получения результата на основе этих данных.

После выполнения измерения получают таблицу с исходными данными (таб. 1).

Способ подсчета реактивных нейтрофилов в периферической крови на автоматическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии:

в процессе вычислений рассчитывают размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y, индекс ядерного сдвига ИЯС, относительное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT%, абсолютное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT#, относительное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG%, абсолютное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG#, относительное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG%, абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG# в периферической крови, сначала находят размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y в периферической крови:

далее рассчитывают индекс ядерного сдвига нейтрофилов в периферической крови (ИЯС):

при этом значение ИЯС по итогам вычисления (2) принимает 2 возможных варианта:

если ИЯС≤0, то ему присваивают значение 0, так как ИЯС не может быть отрицательным и тогда остальным величинам присваивают следующие значения: RE-NEUT%=0, RE-NEUT#=0, TOTAL IG%=IG%, TOTAL IG#=IG#, SEG%=NEUT%& и SEG#=NEUT%#,

если ИЯС>0, то значение ИЯС оставляют без изменений и далее рассчитывают RE-NEUT%, RE-NEUT#, TOTAL IG%, TOTAL IG#, SEG% и SEG#, далее определяют относительное количество реактивных нейтрофилов:

при этом значение RE-NEUT% по итогам вычисления (3) принимает 2 возможных варианта:

если RE-NEUT%≤0, то ему присваивается значение 0, так как RE-NEUT% не может быть отрицательным и тогда RE-NEUT%=0, RE-NEUT#=0, TOTAL IG%=IG%, TOTAL IG#=IG#, SEG%=NEUT%& и SEG#=NEUT%#,

если RE-NEUT%>0, то значение RE-NEUT% оставляют без изменений и далее рассчитывают RE-NEUT#, TOTAL IG%, TOTAL IG#, SEG%h SEG#:

Итоговые данные после проведения вычислений показаны в таб.2. Этими значениями могут пользоваться лабораторный персонал и врач-клиницист.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

5126 образцов пациентов были проанализированы в режиме цельной крови (WB) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов. После проведения исследования на гематологическом анализаторе проводился ручной подсчет лейкоцитарной формулы в мазках крови для получения информации о концентрации палочкоядерных нейтрофилов (п/я%). После обработки данных для каждого диапазона п/я% строились коробчатые графики для показателя RE-NEUT%. Итоговые данные отображены на фиг. 3. Каждый столбец на фиг. 3-это разброс значений RE-NEUT% для конкретного диапазона п/я%. Значения RE-NEUT% постепенно повышались с ростом п/я%. В табл. 3 приведены средние значения и медианы для п/я% и RE-NEUT% для каждого диапазона п/я%.

Пример 2

У пациента 65 лет с развивающимся сепсисом в течение двух суток 7 раз выполняли забор периферической крови в пробирки с антикоагулянтом КЗЭДТА. После этого кровь была проанализирована в режиме цельной крови (WB) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов. После проведения исследования на гематологическом анализаторе проводился ручной подсчет лейкоцитарной формулы в мазках крови. После проведенных измерений была сформирована таблица исходных данных(табл. 4):

После проведения вычислений были получены данные по количеству реактивных нейтрофилов и всех незрелых нейтрофилов, которые сранивались с количеством палочкоядерных нейтрофилов (п/я), определенных с помощью микроскопического анализа (табл. 5):

Из табл.4 наблюдалось нарастание концентрации реактивных нейтрофилов (RE-NEUT%) в течение двух суток, которое коррелировало с нарастанием палочкоядерных нейтрофилов и развитием сепсиса. Показатель NE-SFL (табл. 3) в измерениях 1-6 находился в диапазоне 43.8-47.2 и показал значимое повышение только в измерении 7.

Пример 3

У пациента 53 лет с развивающимся сепсисом в течение четырех суток 3 раза выполняли забор периферической крови в пробирки с антикоагулянтом КЗЭДТА. После этого кровь была проанализирована в режиме цельной крови (WB) на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов. После проведения исследования на гематологическом анализаторе проводился ручной подсчет лейкоцитарной формулы в мазках крови. На фиг. 4 показаны результаты трех измерений. Наблюдается постепенное увеличение показателей NE-SFL, NE-width-Y, RE-NEUT% и TOTAL IG%. Параметр RE-NEUT% коррелировал с нарастанием палочкоядерных нейтрофилов (п/я, %).

Общие выводы по использованию изобретения и его преимущества.

Представленный способ позволяет подробно оценить количество реактивных нейтрофилов и всех незрелых нейтрофилов полностью в автоматическом режиме без необходимости дополнительных измерений и микроскопического анализа

Автоматизированное измерение реактивных нейтрофилов позволяет решить проблему со стандартизацией оценки левого сдвига и оценки реактивности нейтрофилов на автоматических анализаторах с технологией флуоресцентной проточной цитометрии для анализа лейкоцитов, в том числе решая проблему оценки нейтрофильного сдвига влево на основе показателя NE-SFL у пациентов разных возрастов и на разных измерительных модулях. При этом в течение одной минуты проводят подробный анализ и диагностику клеток нейтрофильного ряда. Данная информация является быстрой и клинически значимой для использования лабораторным персоналом и врачом-клиницистом.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для подсчета реактивных нейтрофилов в периферической крови на автоматическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии. Проводят измерение образцов периферической крови на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии для измерения в режиме цельной крови (WB). В ходе измерения лейкоцитов в образце периферической крови в режиме WB получают данные:

WBC – общее количество лейкоцитов, 10⁹ кл/л;

NEUT# - абсолютное количество нейтрофилов, 10⁹ кл/л;

NEUT% - относительное количество нейтрофилов, в %;

IG# - абсолютное количество незрелых гранулоцитов, 10⁹ кл/л;

IG% - относительное количество незрелых гранулоцитов, в %.

В процессе вычислений рассчитывают размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y, индекс ядерного сдвига ИЯС, относительное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT%, абсолютное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT#, относительное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG%, абсолютное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG#, относительное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG%, абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG# в периферической крови. Сначала находят размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y в периферической крови по заявленной формуле (1). Далее рассчитывают индекс ядерного сдвига нейтрофилов в периферической крови (ИЯС) по заявленной формуле (2). При этом значение ИЯС по итогам вычисления (2) принимает 2 возможных варианта: если ИЯС ≤ 0 и если ИЯС > 0. Далее определяют относительное количество реактивных нейтрофилов по заявленной формуле (3). При этом значение RE-NEUT% по итогам вычисления (3) принимает 2 возможных варианта: если RE-NEUT% ≤ 0 и если RE-NEUT% > 0. Далее рассчитывают RE-NEUT#, TOTAL IG%, TOTAL IG#, SEG% и SEG# по заявленным формулам (4), (5), (6), (7), (8), соответственно. Способ обеспечивает возможность повышения скорости и точности подсчета и оценки нейтрофильного сдвига влево и активации нейтрофилов в периферической крови за счет полностью автоматизированного измерения абсолютного и относительного количества реактивных нейтрофилов, величины индекса ядерного сдвига, общего количества всех незрелых нейтрофилов и количества сегментоядерных нейтрофилов в образцах цельной крови. 4 ил., 5 табл., 3 пр.

Способ подсчета реактивных нейтрофилов в периферической крови на автоматическом анализаторе с технологией флуоресцентной проточной цитометрии, включающий измерение образцов периферической крови на автоматическом гематологическом анализаторе с технологией измерения лейкоцитов методом флуоресцентной проточной цитометрии для измерения в режиме цельной крови (WB);

в ходе измерения лейкоцитов в образце периферической крови в режиме WB получают данные:

WBC – общее количество лейкоцитов, 10⁹ кл/л;

NEUT# - абсолютное количество нейтрофилов, 10⁹ кл/л;

NEUT% - относительное количество нейтрофилов, в %;

IG# - абсолютное количество незрелых гранулоцитов, 10⁹ кл/л;

IG% - относительное количество незрелых гранулоцитов, в %;

в процессе вычислений рассчитывают размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y, индекс ядерного сдвига ИЯС, относительное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT%, абсолютное количество реактивных нейтрофилов RE-NEUT#, относительное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG%, абсолютное количество всех незрелых нейтрофилов TOTAL IG#, относительное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG%, абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов SEG# в периферической крови, сначала находят размах популяции нейтрофилов по оси Y NE-width-Y в периферической крови:

где

NE-SFL - показатель реактивной интенсивности нейтрофилов;

NE-WY - коэффициент осцилляции нейтрофилов по оси Y;

далее рассчитывают индекс ядерного сдвига нейтрофилов в периферической крови (ИЯС):

при этом значение ИЯС по итогам вычисления (2) принимает 2 возможных варианта:

если ИЯС ≤ 0, то ему присваивают значение 0, так как ИЯС не может быть отрицательным и тогда остальным величинам присваивают следующие значения: RE-NEUT% = 0, RE-NEUT# = 0, TOTAL IG% = IG%, TOTAL IG# = IG#, SEG% = NEUT%& и SEG# = NEUT#&, где

NEUT%& = NEUT% - IG%;

NEUT#& = NEUT# - IG#,

если ИЯС > 0, то значение ИЯС оставляют без изменений и далее рассчитывают RE-NEUT%, RE-NEUT#, TOTAL IG%, TOTAL IG#, SEG% и SEG#,

далее определяют относительное количество реактивных нейтрофилов:

при этом значение RE-NEUT% по итогам вычисления (3) принимает 2 возможных варианта:

если RE-NEUT% ≤ 0, то ему присваивают значение 0, так как RE-NEUT% не может быть отрицательным и тогда RE-NEUT% = 0, RE-NEUT# = 0, TOTAL IG% = IG%, TOTAL IG# = IG#, SEG% = NEUT%& и SEG# = NEUT#&,

если RE-NEUT% > 0, то значение RE-NEUT% оставляют без изменений и далее рассчитывают RE-NEUT#, TOTAL IG%, TOTAL IG#, SEG% и SEG#:

.