CXCL8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/115 A61K31/7088 C12Q1/6834 A61P29/00 

Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной связываться с CXCL8; к молекуле нуклеиновой кислоты для ее применения в способе лечения и/или профилактики заболевания; к молекуле нуклеиновой кислоты для применения в способе детектирования CXCL8; к молекуле нуклеиновой кислоты для получения детектирующего средства или биосенсора; к фармацевтической композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты; к применению молекулы нуклеиновой кислоты для получения лекарственного средства; к применению молекулы нуклеиновой кислоты для получения диагностического агента, диагностического средства или биосенсора; к применению молекулы нуклеиновой кислоты для детектирования CXCL8; к набору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты; к способу для детектирования CXCL8 с использованием молекулы нуклеиновой кислоты; к комплексу, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты; к способу скрининга антагониста активности, опосредованной CXCL8, с использованием молекулы нуклеиновой кислоты; и к способу детектирования молекулы нуклеиновой кислоты.

CXCL8 (UniProtKB/Swiss-Prot PI 0145, IL8_HUMAN; SEQ ID NO: 2), также известный как интерлейкин 8 (сокращенно IL-8), нейтрофил-активирующий белок 1 (сокращенно NAP-1), моноцитарный фактор хемотаксиса нейтрофилов (сокращенно MDNCF) или белок хемотаксиса гранулоцитов (сокращенно GCP-1) представляет собой небольшой основный белок, который принадлежит к подсемейству хемокинов CXC с провоспалительными и проангиогенными свойствами, характеризующимися наличием мотива глутамат-лейцин-аргинин (сокращенно ELR) у N-конца. ELR-позитивные хемокины CXCL1 (также известные как рост-регулирующий альфа-белок, Gro-альфа, белок с активностью, стимулирующей рост меланомы, MGSA, или NAP-3), CXCL2 (также известный как Gro-бета или макрофагальный воспалительный белок 2-альфа, MIP2-альфа), CXCL3 (также известный как Gro-гамма или MIP2-бета), CXCL5 (также известный как эпителиальный нейтрофил-активирующий белок 78, ENA-78 или слабоиндуцибельный цитокин В5), CXCL6 (также известный как хемокин альфа-3, CKA-3, белок 2 хемотаксиса гранулоцитов, GCP-2, или слабоиндуцибельный цитокин В6), CXCL7 (также известный как тромбоцитарный основный белок, PBP, лейкоцитарный фактор роста, LDGF, макрофагальный фактор роста, MDGF, или слабоиндуцибельный цитокин В7) и CXCL8 представляют собой агонисты рецептора CXCR2 (также известного как IL8RB, IL8R типа 2, CD182, CDwl28b или рецептор GRO/MGSA). CXCL6, CXCL7 и CXCL8 представляют собой агонисты рецептора CXCR1 (также известного как IL8RA, IL8R типа 1, CD181 или CDwl28a). CXCL8 связывается с рецепторами CXCR1 и CXCR2 c аналогичными аффинностями в концентрации приблизительно 4 нМ. Связывание CXCL8 с CXCR1/2 запускает Gαi-зависимые сигнальные пути и, например, индуцирует миграцию нейтрофилов, дегрануляцию и окислительную вспышку. Чувствительность к рецептору можно регулировать посредством фосфорилирования, рекрутинга бета-аррестина и интернализации рецептора (Ha, Theranostics 2017). CXCL7 имеет самую высокую гомологию с CXCL8 c 33 идентичными аминокислотами. CXCL8 приматов, не являющихся человеком (macaca mulata, собакоподобных обезьян), на 95% идентичны (73 аминокислоты из 77 аминокислот являются идентичными) человеческому CXCL8. У мышей и крыс ортолог CXCL8 отсутствует.

CXCL8 секретируется клетками различных типов, включая моноциты, макрофаги, фибробласты, эндотелиальные и эпителиальные клетки в ответ, например, на молекулы, имеющие ассоциированный с патогеном молекулярный паттерн (сокращенно PAMP) (например, LPS), провоспалительные медиаторы (например, IL-1, IL-6 и TNF-α), гипоксию, активный кислород или факторы стресса окружающей среды (например, сигаретный дым) (Ha, Theranostics 2017). CXCL8 действует как хемотаксический и активирующий цитокин для нейтрофилов и моноцитов и играет важную физиологическую роль в защите хозяина.

CXCL8 используется в качестве биомаркера для диагностики, оценки статуса заболевания, прогноза и терапевтической эффективности при инфекционных заболеваниях с повышенными уровнями CXCL8, которые наблюдаются при вирусных инфекциях (например, при инфицировании респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом простого герпеса, вирусом гепатита В и С, человеческим цитомегаловирусом), при бактериальных инфекциях (например, Streptococcus Pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis) и при грибковых инфекциях (например, Candida albicans и Aspergillus fumigatus). При инфицировании детей респираторно-синцитиальным вирусом (сокращенно RSV), уровни CXCL8 в плазме коррелируют с тяжестью заболевания. Таким образом, CXCL8 может служить в качестве биомаркера для оценки тяжести RSV-инфекции и разработки схемы лечения. Комбинация с другими иммунологическими биомаркерами, а именно, с количеством лимфоцитов и уровнями ССL5 в плазме, повышает точность оценки (Brand, Pediatr Res. 2013). Дополнительными примерами инфекционных заболеваний, при которых CXCL8 может быть использован в качестве биомаркера, являются неонатальный сепсис (Zhou, PLoS One 2015), бактериальный менингит (Yao, Int J Clin Exp Med 2015), пневмония (Morris, Thorax 2009) и нейросифилис (Wang, Sci Rep 2016). CXCL8 может быть также использован в качестве биомаркера при воспалительных заболеваниях, включая хронический простатит, острый пиелонефрит, кистозный фиброз и различные аутоиммунные заболевания (Shahzad, Int Arch Med 2010). У пациентов с раком, уровни CXCL8 коррелируют с опухолевой нагрузкой и неблагоприятным исходом лечения (Sanmamed, Clin Cancer Res. 2014). Так, например, CXCL8 коррелирует с более низкой выживаемостью при раке молочной железы (Fang, Anticancer Res. 2017), раке поджелудочной железы (Chen, World J. Gastroenterol 2012) и при саркоме у детей (Highfill, Sci Transl Med 2014). При меланоме, повышенные базовые уровни CXCL8 коррелируют с невосприимчивостью к комбинированному лечению анти-CTLA 4 антителом/химиотерапии и неблагоприятным исходом лечения пациента (Jamal, J Immunother Cancer 2017).

CXCL8 и его рецепторы участвуют в патогенезе некоторых воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания дыхательных путей (например, хроническую обструктивную болезнь легких, острый респираторный дистресс-синдром, астму, муковисцидоз, фиброз легких), воспалительные заболевания кожи (например, нейтрофильные дерматозы, псориаз, буллезный пемфигоид), аутоиммунные заболевания (например, воспалительные заболевания кишечника, язвенный колит, рассеянный склероз, ревматоидный артрит), воспалительные нервные болезни (например, нервное заболевание Свита, болезнь Альцгеймера), ишемические заболевания (например, инсульт, инфаркт миокарда, ишемию и инфаркт головного мозга) и другие воспалительные заболевания (например, атеросклероз) (Ha, Theranostics 2017; Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014). Эффективность ингибирования CXCL8 при лечении таких воспалительных заболеваний подтверждается на животных с моделями заболевания. Так, например, у кроликов, введение анти-CXCL8 антитела способствует устранению LPS-индуцируемого дерматита, LPS-индуцированного плеврита, LPS/IL-1-индуцированного артрита, гломерулонефрита IC-типа, острого повреждения легкого и реперфузионноого повреждения легкого (Bao, Int Immunopharmacol 2010; Harada, J Leukoc Biol 1994). Блокада CXCR1/2 уменьшает ишемическое повреждение головного мозга у крысиной модели (Garau, Cytokine 2005).

CXCL8 участвует в развитии, прогрессировании и вырабатывании резистентности к лечению рака у человека, включая рак легких, рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника и меланому, и способствует росту и метастазированию опухоли (Brat, neurooncol 2005; Ha, Theranotics 2017; Koch, Science 1992; Li, Angiogenesis 2005; Liu, Cytokine Growth Factor Rev 2016; Xu, Oncol Res 2000). Механизмы стимуляции рака посредством CXCL8 включают стимуляцию ангиогенеза, самообновление раковых стволовых клеток, преобразование эпителиальных клеток в мезенхимальные и образование иммуносупрессорного микроокружения опухоли (Ginestier, J Clin Invest 2010; Visvader, Nat Rev Cancer 2008; David, Vaccines 2016). Эффективность ингибирования CXCL8 при лечении рака у человека подтверждается на животных с моделями заболевания. Так, например, нокдаун CXCL8 снижает рост раковых клеток яичника, резистентных к химиотерапии (Merritt, J Natl Сancer Inst 2008). Ингибирование CXCL8 усиливает антиангиогенные ответы, вырабатываемые доцетакселом у моделей с раком яичника и предстательной железы (Campbell, Pharmaceuticals 2013). Сверхэкспрессия CXCL8 в опухолях с недостаточными уровнями фосфатазы и гомолога тензина (PTEN) приводит к повышению жизнеспособности раковых клеток и вносит свой вклад в развитие резистентных к лечению опухолей (Campbell, Pharmaceuticals 2013; Maxwell, Eur Urol 2013; Maxwell, Oncotarget 2014). Ингибирование передачи сигнала CXCL8 приводит к сенсибилизации PTEN-дефицитных, а также р53-мутантных раковых клеток в ответ на стратегию нацеливания на ДНК-разрушающие агенты, на антиметаболиты или на рецептор андрогена (Campbell, Pharmaceuticals 2013). Блокада CXCR2 повышает эффективность анти-PD-1 антитела как ингибитора иммунной контрольной точки у мышей с моделями рабдомиосаркомы и аденокарциномы панкреатических протоков (Highfill, Sci Transl Med 2014; Steele, Cancer Cell 2016).

Некоторые соединения, нацеленные на CXCL8 или один или оба соответствующих рецептора CXCR1 и CXCR2, известны специалистам и были успешно протестированы на моделях in vivo. Некоторые из них были также протестированы в клинических испытаниях. Антагонисты CXCR1 и/или CXCR2, а именно, репариксин, ладариксин, данириксин, навариксин, SX-682 и AZD-5069 были протестированы в клинических испытаниях на трансплантацию панкреатических островков, трансплантацию органов, диабет типа 1, ХОБЛ, астму, бронхиэктаз, псориаз, буллезный пемфигоид и рак. Антагонист CXCR1/2, а именно, репариксин, прошел дополнительные клинические испытания у пациентов с метастазирующим раком молочной железы, негативным по трем симптомам. Антагонист CXCR2 AZD-5069 тестировали в комбинации с анти-PD-11 антителом, а именно дурвалумабом, или химиотерапией при солидных раковых опухолях.

Хотя рецепторы CXCR1 и CXCR2 имеют общие свойства, однако, ELR-позитивные хемокины имеют различные паттерны экспрессии, а именно, распределение in vivo (свойства связывания с внеклеточным матриксом) и механизмы взаимодействия с рецепторами (Feniger-Barish, Cytokine 1999; Sawant, Sci Rep. 2016). Соответствующие физиологические функции различных ELR-позитивных членов семейства хемокинов пока еще плохо изучены. Таким образом, селективное ингибирование CXCL8, вызывающего заболевание, потенциально может быть более эффективным для лечения заболевания и снижения риска побочных эффектов по сравнению с широкой блокадой CXCR1/CXCR2. Так, например, для поддержания раковых стволовых клеток необходим CXCL8, но не CXCL1 (Liotti F Et al. Stem Cells 2017; 35: 135-146). При инфицировании, хемокины обладают перекрывающимися активностями. Следовательно, ингибирование ELR-позитивных хемокинов широкого ряда (например, одновременное ингибирование CXCL8 и CXCL1) может ассоциироваться с повышенным риском инфекции (Yung SC and Murphy PM; frontiers in Immunology, September 2012, vol. 3, Art. 276). Лиганды CXCR1/2 имеют общий N-концевой мотив ELR, который может служить в качестве связывающего эпитопа (описанного в патенте США No. 9783605). Присутствие этого общего структурного признака в лигандах CXCR1/2 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 и CXCL8 представляет определенные проблемы при попытке идентифицировать соединение, которое будет селективно связываться с CXCL8 и ингибировать его, не оказывая при этом негативного влияния на другие ELR-позитивные хемокины.

Были идентифицированы антитела, связывающиеся с CXCL8, но не с ELR-позитивными хемокинами CXCL1 (также известными как рост-регулирующий белок альфа, GRO-альфа) и CXCL2 (также известным как рост-регулирующий белок бета, GRO-бета) (Skov, J Immunol 2008). CXCL8-специфические моноклональные антитела до сих пор не давали какую-либо эффективность в клинических испытаниях, которая может быть ассоциирована с фармакологическими свойствами вещества этого класса, включая фармакокинетический профиль, биораспределение и элиминацию. Так, например, высокие уровни продуцирования хемокинов могут приводить к быстрому насыщению терапевтическими антителами и к недостаточной эффективности с использованием обычно применяемых длительных интервалов дозирования. Кроме того, антитела могут не оказывать негативного влияния на связывание хемокинов с гликозаминогликанами, что будет приводить к отсутствию деструкции градиента хемокина и к недостаточному ингибированию миграции лейкоцитов и экстравазации. Нуклеиновые кислоты преимущественно связываются с сайтами белков, связывающимися с гликозаминогликаном (Oberthur, Nat Commun 2015). Таким образом, вещества других классов, подобные нуклеиновым кислотам, могут быть даже лучше для терапевтического нацеливания на CXCL8.

Нуклеиновые кислоты чувствительны к разложению под действием ферментов (нуклеаз), присутствующих в физиологических жидкостях. Такое отсутствие биостабильности затрудняет приготовление лекарственных средств на основе нуклеиновой кислоты для лечения человека, а также изготовление диагностических агентов на основе нуклеиновой кислоты для диагностики и/или лечения заболевания. Химические модификации могут повышать стабильность нуклеиновых кислот, но они могут быть недостаточными для обеспечения стабильности, достаточной для их применения в качестве лекарственного средства. Так, например, нуклеиновая кислота с 2'-фтор-модифицированными пиримидинами имеет время полужизни в плазме, сравнимое с временем полужизни всех нуклеиновых кислот на основе ДНК, а 2'-O-метильные модификации необходимы для достижения длительных периодов полужизни (Kratschmer, Nucleic Acid Ther 2017). Макуген, первый аптамер, одобренный для терапевтического применения, был стабилизирован комбинацией 2'-фторпиримидинов, 2'-О-метилпуринов и 3'-кэпа. Кроме того, химические модификации могут повышать риск побочных эффектов при их использовании в целях приготовления лекарственного средства. И наоборот, нуклеиновые кислоты с неприродной L-конфигурацией являются в высокой степени стабильными и, как было показано, являются безопасными, хорошо переносятся пациентами и являются эффективными в клинических испытаниях (Ludwig, Leukemia 2017; Menne, Nephrol Dial Transplant 2016).

2'-Фторпиримидиновые РНК-аптамеры, связывающиеся с CXCL8, были описаны ранее (Sung, Biomaterials 2014). Однако, в функциональных анализах, высокая аффинность связывания одного из описанных аптамеров, а именно, аптамера 8A-35, не приводила к улучшению функциональных свойств, таких как ингибирование миграции нейтрофилов, индуцированной CXCL8, с IC₅₀ >125 нМ. Полуколичественный анализ показал отсутствие связывания или низкое связывание аптамера-предшественника с ELR-позитивными хемокинами CXCL1 (также известными как GRO-альфа) и CXCL2 (также известными как GRO-бета).

Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в создании молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно L-нуклеиновой кислоты, которая специфически взаимодействует с CXCL8, а предпочтительно, специфически не взаимодействует с другими ELR-позитивными хемокинами, а более предпочтительно, не связывается с ELR-позитивными хемокинами, которые связываются с рецепторами CXCR1 и/или CXCR2.

Другая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в получении молекулы нуклеиновой кислоты, а предпочтительно молекулы L-нуклеиновой кислоты, которая связывается с CXCL8 с высокой аффинностью, и тем самым, позволяет эффективно ингибировать CXCL8-стимулированный хемотаксис, предпочтительно с константой ингибирования в одноразрядном наномолярном диапазоне, а более предпочтительно в пикомолярном диапазоне.

Дополнительная проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в получении молекулы нуклеиновой кислоты, а предпочтительно, молекулы L-нуклеиновой кислоты, в целях приготовления лекарственного средства для лечения заболевания человека и/или животных, где такое заболевание характеризуется наличием CXCL8, который прямо или опосредованно участвует в патогенезе этого заболевания, а предпочтительно, лекарственного средства, которое подавляло бы или ингибировало CXCL8 до такой степени, чтобы это давало терапевтический эффект.

Еще одна проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в получении молекулы нуклеиновой кислоты, а предпочтительно, молекулы L-нуклеиновой кислоты, в целях получения диагностического агента для идентификации, диагностики и/или лечения заболевания, где такое заболевание характеризуется наличием CXCL8, который прямо или опосредованно участвует в патогенезе этого заболевания.

Эти и другие проблемы, лежащие в основе настоящего изобретения, могут быть решены с использованием рассматриваемого предмета изобретения, заявленного в прилагаемых независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления изобретения могут быть взяты из зависимых пунктов формулы изобретения.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем первом аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты, способной связываться с человеческим CXCL8, где молекула L-нуклеиновой кислоты включает центральный нуклеотидный фрагмент, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность

5'-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(X_U)RAGUGUGUCCCG-3' [SEQ ID. NO: 27], где X_U представляет собой U или отсутствует.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем втором аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты первого аспекта, включая любой его вариант, для использования в способе лечения и/или профилактики заболевания.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем третьем аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты первого аспекта, включая любой его вариант, для использования в способе детектирования CXCL8.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем четвертом аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты первого аспекта, включая любой его вариант, для получения детектирующего средства или биосенсора.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем пятом аспекте с использованием фармацевтической композиции, содержащей молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, и необязательно дополнительный компонент, где дополнительный компонент выбран из группы, включающей фармацевтически приемлемый наполнитель, фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически активный агент.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем шестом аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, для получения лекарственного средства.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем седьмом аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, для получения диагностического агента, диагностического средства или биосенсора.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем восьмом аспекте с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, для детектирования CXCL8, а предпочтительно человеческого CXCL8.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем девятом аспекте с использованием набора для детектирования CXCL8, где набор содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант и по меньшей мере вкладыш с инструкцией или реакционный сосуд.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем десятом аспекте с применением способа детектирования CXCL8 с использованием L-нуклеиновой кислоты, определенной согласно первому аспекту, включая любой его вариант, в образце, где указанный способ включает стадии:

а) получения образца с неизвестной концентрацией CXCL8;

b) контактирования образца или его разведения с диагностическим агентом, диагностическим средством или биосенсором, определенными в седьмом аспекте, включая любой его вариант;

c) измерения сигнала с использованием диагностического агента, диагностического средства или биосенсора, определенных в седьмом аспекте, включая любой его вариант;

d) сравнения, но необязательно, сигнала с эталоном,

где, необязательно, концентрацию CXCL8 в образце с неизвестной концентрацией CXCL8 определяют путем сравнения с сигналами, полученными по меньшей мере из одного образца с известной концентрацией CXCL8, а предпочтительно по меньшей мере один образец с известной концентрацией CXCL8 подвергают стадиям b)-c).

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем одиннадцатом аспекте с использованием комплекса, содержащего молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант и CXCL8, где, предпочтительно, комплекс является кристаллическим комплексом.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем двенадцатом аспекте с применением способа скрининга антагониста активности, опосредуемой CXCL8, где указанный способ включает следующие стадии:

- получения кандидата-антагониста активности, опосредуемой CXCL8,

- получения молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант,

- создания тест-системы, которая будет передавать сигнал в присутствии антагониста активности, опосредуемой CXCL8, и

- подтверждения, что кандидат-антагонист активности, опосредуемой CXCL8, является антагонистом активности, опосредуемой CXCL8.

Более конкретно, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена в своем 13-ом аспекте с применением способа детектирования молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, в образце, где указанный способ включает стадии:

а) получения зонда для захвата, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, и зонда для детектирования, где зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, или, альтернативно, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, а зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант;

b) добавления зонда для захвата и зонда для детектирования, отдельно или в комбинации, к образцу, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант или, предположительно, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант;

c) обеспечения взаимодействия зонда для захвата и зонда для детектирования либо одновременно, либо последовательно в любом порядке с молекулой L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант;

d) необязательно, определения того, гибридизуется ли зонд для захвата с молекулой L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, как описано в стадии a); и

e) детектирования комплекса, образованного в стадии c) и состоящего из молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, включая любой его вариант, зонда для захвата и зонда для детектирования.

Более конкретно, настоящее изобретение также может быть осуществлено в соответствии с нижеследующими вариантами 1-103, где вариант 1 соответствует первому аспекту, вариант 47 соответствует второму аспекту, вариант 49 соответствует третьему аспекту, вариант 50 соответствует четвертому аспекту, вариант 51 соответствует пятому аспекту, вариант 53 соответствует шестому аспекту, вариант 56 соответствует седьмому аспекту, вариант 79 соответствует восьмому аспекту, вариант 96 соответствует девятому аспекту, вариант 97 соответствует десятому аспекту, вариант 98 соответствует одиннадцатому аспекту, вариант 99 соответствует двенадцатому аспекту, а вариант 100 соответствует 13-му аспекту:

Вариант 1: Молекула L-нуклеиновой кислоты, способная связываться с человеческим CXCL8, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит центральный нуклеотидный фрагмент, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность:

5'-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(X_U)RAGUGUGUCCCG-3' [SEQ ID. NO: 27], где X_U представляет собой U или отсутствует.

Вариант 2: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 1, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы:

a) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 28],

b) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 29] и

c) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 30].

Вариант 3: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 2, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность:

5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 30] или 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 28], а предпочтительно, 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' [SEQ. ID. NO: 30].

Вариант 4: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-3, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит, в направлении 5'→3', первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент, где:

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит от трех до шести нуклеотидов и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит от трех до шести нуклеотидов,

где предпочтительно:

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит от пяти до шести нуклеотидов и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит от пяти до шести нуклеотидов,

где более предпочтительно:

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит пять нуклеотидов, и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит пять нуклеотидов.

Вариант 5: Молекула L-нуклеиновой кислоты варианта 4, где первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-Z₁Z₂Z₃Z₄Z₅C-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GZ₆Z₇Z₈Z₉Z₁₀-3', где

Z₁ представляет собой G или отсутствует, Z₂ представляет собой S или отсутствует; Z₃ представляет собой K или отсутствует, Z₄ представляет собой S;, Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M или отсутствует; Z₉ представляет собой S или отсутствует, а Z₁₀ представляет собой C или отсутствует;

где предпочтительно:

a) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

b) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, а Z₁₀ отсутствует; или

c) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

d) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

e) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, а Z₁₀ представляет собой C; или

f) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

g) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

h) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

i) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

j) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

k) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

l) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

m) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

n) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

o) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

p) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой М; Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует.

Вариант 6: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 4-5, где:

а) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3';

b) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAGC-3'; или

c) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAGC-3';

d) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3';

е) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность из 5'-UGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCA-3';

f) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCC-3';

g) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGC-3';

h) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GGUC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GACC-3';

i) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-UGGC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCCA-3';

j) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUC-3';

где предпочтительно:

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3'; или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAGC-3' или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3';

где более предпочтительно:

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3';

или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3'.

Вариант 7: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-6, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит от 40 до 45 нуклеотидов, предпочтительно от 42 до 45 нуклеотидов, а более предпочтительно 42 нуклеотида.

Вариант 8: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-7, где молекула L-нуклеиновой кислоты состоит из рибонуклеотидов.

Вариант 9: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-8, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 14-26 и 39-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75% идентична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ NO: 14-26 и 39-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая гомологична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ. ID NO: 14-26 и 39-44, где такая гомология составляет по меньшей мере 75%.

Вариант 10: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 9, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75% идентична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая гомологична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ 41-44%, где гомология составляет по меньшей мере 75%.

Вариант 11: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-10, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает способностью связываться с CXCL8, где предпочтительно CXCL8 представляет собой человеческий CXCL8, обезьяний CXCL8, кроличий CXCL8, свиной CXCL8, собачий CXCL8, овечий CXCL8 или CXCL8 морской свинки.

Вариант 12: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-11, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает способностью специфически связываться с CXCL8, предпочтительно с человеческим CXCL8, обезьяньим CXCL8, кроличьим CXCL8, свиным CXCL8, собачьим CXCL8, овечьим CXCL8 или CXCL8 морской свинки, а более предпочтительно с человеческим CXCL8.

Вариант 13: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-12, где молекула L-нуклеиновой кислоты не связывается или не обладает способностью связываться с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные хемокины CXC, отличающиеся от CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 и CXCL7.

Вариант 14: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 13, где молекула L-нуклеиновой кислоты не связывается или не обладает способностью связываться с ELR-позитивными человеческими хемокинами CXC, отличающимися от человеческого CXCL8, где ELR-позитивные человеческие хемокины CXC, отличающиеся от человеческого CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из человеческого CXCL1, человеческого CXCL2, человеческого CXCL3, человеческого CXCL5, человеческого CXCL6 и человеческого CXCL7.

Вариант 15: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-14, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как KD, и составляющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

Вариант 16: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-15, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как IC₅₀, и составляющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

Вариант 17: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-16, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как KD и составляющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, а более предпочтительно 1000 нМ или более.

Вариант 18: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-17, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составляющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, а более предпочтительно 1000 нМ или более.

Вариант 19: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-18, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как KD и составлющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как KD и составлющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, и более предпочтительно 1000 нМ или более, и/или

молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составлющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составлющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, и более предпочтительно 1000 нМ или более.

Вариант 20: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 15-19, где аффинность связывания определяют при комнатной температуре, предпочтительно при 25°С.

Вариант 21: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 15-19, где аффинность связывания определяют при 37°C.

Вариант 22: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-21, где молекула L-нуклеиновой кислоты является антагонистом активности, опосредуемой CXCL8, а предпочтительно человеческим CXCL8, обезьяньим CXCL8, кроличьим CXCL8, свиным CXCL8, собачьим CXCL8, овечьим CXCL8 или CXCL8 морской свинки, а более предпочтительно человеческим CXCL8.

Вариант 23: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 22, где молекула L-нуклеиновой кислоты не является антагонистом ELR-позитивных человеческих хемокинов CXC, отличающихся от человеческого CXCL8, или не способна подавлять активность, опосредуемую ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные хемокины CXC, отличающиеся от CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 и CXCL7.

Вариант 24: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 23, где молекула L-нуклеиновой кислоты не является антагонистом ELR-позитивных человеческих хемокинов CXC, отличающихся от человеческого CXCL8, или не способна подавлять активность, опосредуемую ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные человеческие хемокины CXC, отличающиеся от человеческого CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из человеческого CXCL1, человеческого CXCL2, человеческого CXCL3, человеческого CXCL5, человеческого CXCL6 и человеческого СXCL7.

Вариант 25: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 22-24, где антагонистическая активность молекулы L-нуклеиновой кислоты по отношению к активности, опосредуемой человеческими CXCR1 и/или CXCR2, и выраженной как IC₅₀, составляет 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

Вариант 26: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 22-25, где антагонистическую активность молекулы L-нуклеиновой кислоты по отношению к активности, опосредуемой человеческим CXCL8, определяют при 37°C.

Вариант 27: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-26, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит модифицирующую группу.

Вариант 28: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 27, где модифицирующая группа присоединена к 5'-концевому нуклеотиду и/или 3'-концевому нуклеотиду молекулы L-нуклеиновой кислоты и/или к нуклеотиду молекулы L-нуклеиновой кислоты между 5'-концевым нуклеотидом молекулы L-нуклеиновой кислоты и 3'-концевым нуклеотидом молекулы L-нуклеиновой кислоты.

Вариант 29: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27 и 28, где модифицирующая группа присоединена к молекуле L-нуклеиновой кислоты посредством линкера.

Вариант 30: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 29, где линкер представляет собой гидрофильный линкер, где гидрофильный линкер предпочтительно содержит одно или более звеньев этиленгликоля, а более предпочтительно гидрофильный линкер содержит триэтиленгликоль, гексаэтиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Вариант 31: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 29, где линкер представляет собой биоразлагаемый линкер.

Вариант 32: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27-31, где скорость экскреции молекулы L-нуклеиновой кислоты, содержащей модифицирующую группу, из организма, снижается по сравнению со скоростью экскреции L-нуклеиновой кислоты, не содержащей модифицирующую группу.

Вариант 33: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27-31, где молекула L-нуклеиновой кислоты, содержащая модифицирующую группу, имеет более продолжительное время удерживания в организме по сравнению с временем удерживания молекулы L-нуклеиновой кислоты, не содержащей модифицирующую группу.

Вариант 34: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 32-33, где организм представляет собой организм человека или животного, а предпочтительно организм человека.

Вариант 35: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27 и 34, где модифицирующая группа выбрана из группы, включающей биоразлагаемую модификацию и не-биоразлагаемую модификацию, и где модифицирующая группа предпочтительно выбрана из группы, включающей полиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль с прямой цепью, разветвленный полиэтиленгликоль, гидроксиэтилированный крахмал, пептид, белок, полисахарид, стирол, полиоксипропилен, полиоксиамидат и поли(2-гидроксиэтил)-L-глутамин.

Вариант 36: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 35, где модифицирующая группа представляет собой полиэтиленгликоль, предпочтительно полиэтиленгликоль с прямой цепью, или разветвленный полиэтиленгликоль, где молекулярная масса полиэтиленгликоля предпочтительно составляет приблизительно от 20000 до приблизительно 120000 Да, более предпочтительно, приблизительно от 30000 до приблизительно 80000 Да, а наиболее предпочтительно, приблизительно 40000 Да.

Вариант 37: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 36, где молекулярная масса полиэтиленгликоля составляет приблизительно от 20000 до приблизительно 120000 Да, предпочтительно приблизительно от 30000 до приблизительно 80000 Да, а наиболее предпочтительно, приблизительно 40000 Да.

Вариант 38: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 35, где модифицирующая группа представляет собой гидроксиэтилированный крахмал, где молекулярная масса гидроксиэтилированного крахмала предпочтительно составляет приблизительно от 50 до приблизительно 1000 кДа, более предпочтительно, приблизительно от 100 до приблизительно 700 кДа, а наиболее предпочтительно, от 200 до 500 кДа.

Вариант 39: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27-31, где модифицирующая группа предназначена для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты.

Вариант 40: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 39, где иммобилизация включает ковалентное связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты с поверхностью, где предпочтительной поверхностью является поверхность реакционного сосуда, поверхность устройства в реакционном сосуде или поверхность биосенсора.

Вариант 41: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 39, где иммобилизация включает нековалентное связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты с поверхностью, где предпочтительной поверхностью является поверхность реакционного сосуда, поверхность устройства в реакционном сосуде или поверхность биосенсора.

Вариант 42: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 39-41, где модифицирующая группа выбрана из группы, включающей карбоксил, гидроксил, фосфатидил, сложный эфир сульфоновой кислоты, амин, тиол, эпоксид, алкин, стерический циклоалкин, малеимид, азид, гидразид, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) и азадибензоциклооктин (ADIBO).

Вариант 43: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 42, где модифицирующая группа представляет собой стерический циклоалкин, а предпочтительно дибензоциклооктил (DBCO).

Вариант 44: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 41, где модифицирующая группа представляет собой биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин или олигонуклеотид, а предпочтительно модифицирующая группа представляет собой биотин.

Вариант 45: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 27-31, где модифицирующая группа позволяет детектировать молекулу L-нуклеиновой кислоты, а предпочтительно модифицирующая группа представляет собой метку.

Вариант 46: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно варианту 45, где метка выбрана из группы, включающей биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин, олигонуклеотид, флуоресцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, УФ-метку, коллоидное золото, наночастицу и метку в виде молекулы, образующей хелатный комплекс.

Вариант 47: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-46 для применения в способе лечения и/или профилактики заболевания.

Вариант 48: Молекула L-нуклеиновой кислоты для применения согласно варианту 47, где заболевание ассоциировано с CXCL8-опосредуемым патогенным механизмом и/или выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание и рак, где воспалительное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание дыхательных путей, воспалительное заболевание кожи, аутоиммунное заболевание, воспалительное нервное заболевание, ишемическое заболевание, атеросклероз, отторжение трансплантата панкреатических островков, отторжение трансплантата органов, замедленную функцию органов, повреждение спинного мозга или цистит.

Вариант 49: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-47 для ее использования в способе детектирования CXCL8.

Вариант 50: Молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-47 для получения детектирующего средства или биосенсора.

Вариант 51: Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу L-нуклеиновой кислоты, определенную в любом из вариантов 1-50, и необязательно дополнительный компонент, где дополнительный компонент выбран из группы, включающей фармацевтически приемлемый наполнитель, фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически активный агент.

Вариант 52: Фармацевтическая композиция согласно варианту 51, где фармацевтическая композиция содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, определенную в любом из вариантов 1-50, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант 53: Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 для получения лекарственного средства.

Вариант 54: Применение согласно варианту 53, где лекарственное средство предназначено для применения в медицине или в ветеринарии.

Вариант 55: Применение согласно варианту 54, где лекарственное средство предназначено для лечения и/или профилактики заболевания, которое ассоциируется с CXCL8-опосредуемым патогенным механизмом и/или выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание и рак, где воспалительное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание дыхательных путей, воспалительное заболевание кожи, аутоиммунное заболевание, воспалительное нервное заболевание, ишемическое заболевание, атеросклероз, отторжение трансплантата панкреатических островков, отторжение трансплантата органов, замедленную функцию органов, повреждение спинного мозга или цистит.

Вариант 56: Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 для получения диагностического агента, диагностического средства или биосенсора.

Вариант 57: Применение согласно варианту 56, где диагностический агент или диагностическое средство имеет поверхность на реакционном сосуде или поверхность на устройстве в реакционном сосуде.

Вариант 58: Применение согласно варианту 56, где биосенсор имеет поверхность.

Вариант 59: Применение согласно любому из вариантов 56-58, где диагностический агент, диагностическое средство или биосенсор являются подходящими для детектирования, либо непосредственно, либо опосредованно, CXCL8, а предпочтительно человеческого CXCL8.

Вариант 60: Применение согласно любому из вариантов 56-57, где CXCL8 детектируют посредством прямого связывания, в «сэндвич»-анализе на связывание или в анализе на конкурентное связывание.

Вариант 61: Применение согласно варианту 60, где прямое связывание включает способ детектирования, в котором используется только молекула L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50, и в котором не используется или который не включает использование второй молекулы, отличающейся от молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50, которая взаимодействует с CXCL8.

Вариант 62: Применение согласно варианту 60, где сэндвич-анализ представляет собой сэндвич-анализ на гибридизацию, в котором молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 иммобилизуют на поверхности, и комплекс молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 и CXCL8 детектируют с помощью детектирующего средства, которое связывается с эпитопом (эпитопами) CXCL8, который(е) отличается(ются) от эпитопа(ов), связанного(ых) с молекулой L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50.

Вариант 63: Применение согласно варианту 60, где сэндвич-анализ представляет собой сэндвич-анализ на гибридизацию, где средство, которое связывается с эпитопом (эпитопами) CXCL8, который(е) отличается(ются) от эпитопа(ов), связанного(ых) с молекулой L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50, иммобилизуют на поверхности, и комплекс таких средств и CXCL8 детектируют с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50.

Вариант 64: Применение согласно варианту 60, где в анализе на конкурентное связывание, молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 иммобилизуют на поверхности, и связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 с CXCL8 конкурирует с олигонуклеотидными зондами, по меньшей мере частично комплементарными молекуле L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 или с CXCL8, где комплементарность предпочтительно представляет собой комплементарность оснований, а более предпочтительно основана на спаривании оснований Уотсона-Крика.

Вариант 65: Применение согласно варианту 60, где в анализе на конкурентное связывание, молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 не иммобилизуют на поверхности, и связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 с CXCL8 конкурирует с олигонуклеотидными зондами, комплементарными молекуле L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 или CXCL8, где предпочтительно, олигонуклеотидные зонды, комплементарные молекуле L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 или CXCL8, иммобилизуют на поверхности, где комплементарность предпочтительно представляет собой комплементарность оснований, а более предпочтительно, такая комплементарность основана на спаривании оснований Уотсона-Крика.

Вариант 66: Применение согласно любому из вариантов 62-65, где для иммобилизации на поверхности используют молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 39-44.

Вариант 67: Применение согласно любому из вариантов 57-66, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора, выбрана из группы, состоящей из золота, серебра, титана, циркония, ванадия, хрома, марганца, кобальта, вольфрама, молибдена, платины, алюминия, железа, стали, меди, никеля, кремния, германия, фосфида индия, арсенида галлия и оксида, нитрида или их сплавов или смесей, оксида индия-олова, стеклообразного углерода, сапфира, силикатного стекла и боратного стекла.

Вариант 68: Применение согласно любому из вариантов 57-67, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора, модифицирована полилизином; аминосиланом; эпоксисиланом; нитроцеллюлозой; карбоксидекстраном; углеродной наномембраной; оксидом графена; углеродной поверхностью, такой как черная сажа, углеродное волокно, углеродная пластина, углеродная ткань, активированный углерод, стекловидный углерод, уголь, активированный уголь, графитовый порошок, графитовое волокно, углеродная нанотрубка; фуллереном; карбоксильной группой; азидной группой; тиоловой группой; гидроксигруппой; эпоксидом; малеимидом; алкином; стерическим алкином или любой их комбинацией.

Вариант 69: Применение согласно варианту 68, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 39-44, поверхность функционализируют первичным амином, тиоловой группой, азидом, алкином, алкеном, тетразином, тетразолом или стерическим циклоалкином, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) или азадибензоциклооктин (ADIBO).

Вариант 70: Применение согласно варианту 69, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 42-43 проводят реакцию циклоприсоединения азида-алкина, стимулируемую стерическим алкином.

Вариант 71: Применение согласно любому из вариантов 56-70, где молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 44-46 используют для детектирования.

Вариант 72: Применение согласно любому из вариантов 56-71, где детектирующая система биосенсора основана на оптическом считывании, изменении массы, показателе преломления, заряде, поверхностном натяжении и микроскопии на основе межатомных сил.

Вариант 73: Применение согласно варианту 72, где детектирующая система биосенсора, основанная на оптическом считывании, представляет собой флуоресценцию, абсорбцию или люминесценцию.

Вариант 74: Применение согласно варианту 72, где детектирующая система биосенсора, основанная на изменении массы, представляет собой систему микробаланса на основе кварцевых кристаллов или микроэлектромеханические системы.

Вариант 75: Применение согласно варианту 72, где детектирующая система биосенсора, основанная на показателе преломления, представляет собой поверхностный плазмонный резонанс, круговой резонатор или эллипсометрию.

Вариант 76: Применение согласно варианту 72, где детектирующая система биосенсора, основанная на заряде, представляет собой электрохимическое сопротивление, вольтамперометрию, амперометрию, потенциометрию, проводимость или полевой транзистор.

Вариант 77: Применение согласно варианту 72, где детектирующая система биосенсора, основанная на поверхностном натяжении, представляет собой консольный биосенсор.

Вариант 78: Применение согласно любому из вариантов 56-59, где CXCL8 детектируют с помощью устройства для анализа на гомогенность.

Вариант 79: Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 для детектирования CXCL8, а предпочтительно, человеческого CXCL8.

Вариант 80: Применение согласно варианту 79, где CXCL8 детектируют с помощью устройства для «сэндвич»-анализа на связывание, устройства для анализа на гомогенность или устройства для анализа на конкурентное связывание.

Вариант 81: Применение согласно варианту 80, где устройство для «сэндвич»-анализа на связывание, устройство для анализа на гомогенность или устройство для анализа на конкурентное связывание являются подходящими для прямого или опосредуемого детектирования CXCL8.

Вариант 82: Применение согласно любому из вариантов 78-81, где молекула L-нуклеиновой кислоты ковалентно иммобилизована на поверхности реакционного сосуда с диагностическим средством, на поверхности устройства в реакционном сосуде с диагностическим средством или на поверхности биосенсора.

Вариант 83: Применение согласно варианту 82, где для иммобилизации используют молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 39-44.

Вариант 84: Применение согласно любому из вариантов 82-83, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора выбрана из группы, состоящей из золота, серебра, титана, циркония, ванадия, хрома, марганца, кобальта, вольфрама, молибдена, платины, алюминия, железа, стали, меди, никеля, кремния, германия, фосфида индия, арсенида галлия и оксида, нитрида или их сплавов или смесей, оксида индия-олова, стеклообразного углерода, сапфира, силикатного стекла и боратного стекла.

Вариант 85: Применение согласно любому из вариантов 82-84, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора модифицирована полилизином; аминосиланом; эпоксисиланом; нитроцеллюлозой; карбоксидекстраном; углеродной наномембраной; оксидом графена; углеродной поверхностью, такой как черная сажа, углеродное волокно, углеродная пластина, углеродная ткань, активированный углерод, стекловидный углерод, уголь, активированный уголь, графитовый порошок, графитовое волокно, углеродная нанотрубка; фуллереном; карбоксильной группой; азидной группой; тиоловой группой; гидроксигруппой; эпоксидом; малеимидом; алкином; стерическим алкином или любой их комбинацией.

Вариант 86: Применение согласно варианту 85, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 38-44, поверхность функционализируют активированным первичным амином, тиоловой группой, азидом или стерическим циклоалкином, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) или азадибензоциклооктин (ADIBO).

Вариант 87: Применение согласно варианту 86, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 42-43 проводят реакцию циклоприсоединения азида-алкина, стимулируемую стерическим алкином.

Вариант 88: Применение согласно любому из вариантов 82-87, где детектирующая система биосенсора основана на оптическом считывании, изменении массы, показателе преломления, заряде, поверхностном натяжении и микроскопии на основе межатомных сил.

Вариант 89: Применение согласно варианту 88, где детектирующая система биосенсора, основанная на оптическом считывании, представляет собой флуоресценцию, абсорбцию или люминесценцию.

Вариант 90: Применение согласно варианту 85, где детектирующая система биосенсора, основанная на изменении массы, представляет собой систему микробаланса на основе кварцевых кристаллов или микроэлектромеханические системы.

Вариант 91: Применение согласно варианту 88, где детектирующая система биосенсора, основанная на показателе преломления, представляет собой поверхностный плазмонный резонанс, круговой резонатор или эллипсометрию.

Вариант 92: Применение согласно варианту 88, где детектирующая система биосенсора, основанная на заряде, представляет собой электрохимическое сопротивление, вольтамперометрию, амперометрию, потенциометрию, проводимость или полевой транзистор.

Вариант 93: Применение согласно варианту 88, где детектирующая система биосенсора, основанная на поверхностном натяжении, представляет собой консольный биосенсор.

Вариант 94: Применение согласно любому из вариантов 79-81, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит модифицирующую группу, которая позволяет детектировать молекулу L-нуклеиновой кислоты, а предпочтительно, модифицирующая группа представляет собой метку.

Вариант 95: Применение согласно варианту 94, где метка выбрана из группы, включающей биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин, олигонуклеотид, флуоресцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, УФ-метку, коллоидное золото, наночастицу и метку в виде молекулы, образующей хелатный комплекс.

Вариант 96: Набор для детектирования CXCL8, где набор содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 и по меньшей мере вкладыш с инструкцией или реакционный сосуд.

Вариант 97: Способ детектирования CXCL8 с использованием L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50 в образце, где указанный способ включает стадии:

а) получения образца с неизвестной концентрацией CXCL8;

b) контактирования образца или его разведения с диагностическим агентом, диагностическим средством или биосенсором, определенными в любом из вариантов 56-78;

c) измерения сигнала с использованием диагностического агента, диагностического средства или биосенсора, определенных в любом из вариантов 56-78;

d) сравнения, но необязательно, сигнала с эталоном;

где, необязательно, концентрацию CXCL8 в образце с неизвестной концентрацией CXCL8 определяют путем сравнения с сигналами, полученными по меньшей мере от одного образца с известной концентрацией CXCL8, а предпочтительно по меньшей мере один образец с известной концентрацией CXCL8 подвергают стадиям b)-c).

Вариант 98: Комплекс, содержащий молекулу L-нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов 1-50 и CXCL8, где комплекс предпочтительно представляет собой кристаллический комплекс.

Вариант 99: Способ скрининга антагониста активности, опосредуемой CXCL8, где указанный способ включает следующие стадии:

- получения кандидата-антагониста активности, опосредуемой CXCL8,

- получения молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50;

- создания тест-системы, которая будет передавать сигнал в присутствии антагониста активности, опосредуемой CXCL8, и

- подтверждения, что кандидат-антагонист активности, опосредуемой CXCL8, является антагонистом активности, опосредуемой CXCL8.

Вариант 100: Способ детектирования L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, в образце, где указанный способ включает стадии:

а) получения зонда для захвата, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты определенной в любом из вариантов 1-50, и зонда для детектирования, где зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50; или, альтернативно, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, а зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50;

b) добавления зонда для захвата и зонда для детектирования, отдельно или в комбинации, к образцу, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты, определенную в любом из вариантов 1-50, или, предположительно, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты, определенную в любом из вариантов 1-50;

c) обеспечения взаимодействия зонда для захвата и зонда для детектирования либо одновременно, либо последовательно в любом порядке с молекулой L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, или ее части;

d) необязательно, определения того, гибридизуется ли зонд для захвата с молекулой L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, как описано в стадии a); и

e) детектирования комплекса, полученного в стадии c) и состоящего из молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, зонда для захвата и зонда для детектирования.

Вариант 101: Способ согласно варианту 100, где зонд для детектирования содержит детектирующее средство, и/или где зонд для захвата иммобилизован на носителе, а предпочтительно, на твердом носителе.

Вариант 102: Способ согласно варианту 100 или 101, где любой зонд для детектирования, который не является частью комплекса, полученного в стадии с), удаляют из реакционной смеси, так, чтобы в стадии е) детектировался только детектирующий зонд, который является частью комплекса.

Вариант 103: Способ согласно любому из вариантов 100-102, где стадия е) включает стадию сравнения сигнала, генерируемого детектирующим средством, если зонд для захвата и зонд для детектирования гибридизуются в присутствии молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50, или ее части, и в отсутствии указанной молекулы L-нуклеиновой кислоты, определенной в любом из вариантов 1-50.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что ими было неожиданно обнаружено, что биостабильная молекула L-нуклеиновой кислоты согласно изобретению связывается специфически и с высокой аффинностью с человеческим CXCL8, и тем самы эффективно ингибирует связывание CXCL8 с его рецепторами. Авторами была неожиданно идентифицирована молекула нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с CXCL8 и ингибирует CXCL8, но не связывается с родственными хемокинами CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 и CXCL7, и, соответственно, не ингибирует эти хемокины, хотя эти белки имеют такие же структурные свойства как и CXCL8, например, мотив ELR. Указанная аффинность в пикомолярном диапазоне и высокая селективность связывания нуклеиновой кислоты с CXCL8 не могли быть предсказаны.

В частности, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению является подходящей для блокирования взаимодействия CXCL8 с его рецепторами и ингибирует CXCL8-индуцированный хемотаксис с константой ингибирования в пикомолярном диапазоне. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может также рассматриваться как антагонист действия CXCL8, а в частности действия CXCL8 на его рецепторы CXCR1 и/или CXCR2. Предпочтительно используемый здесь антагонист CXCL8 представляет собой молекулу, которая связывается с CXCL8, такую как как молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и ингибирует функцию CXCL8, предпочтительно в анализе in vitro, как описано в примерах, или у модели in vivo.

В соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту. Что касается терминов «нуклеиновая кислота» и «молекула нуклеиновой кислоты», то они используются здесь как синонимы, если это не оговорено особо. Кроме того, такая(ие) нуклеиновая(ые) кислота(ы) предпочтительно также называется(ются) здесь молекулой(ами) нуклеиновой кислоты согласно (настоящему) изобретению, нуклеиновой(ыми) кислотой(ами) согласно настоящему изобретению, нуклеиновой(ыми) кислотой(ами) согласно изобретению, или молекулой(ами) нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Описанные здесь признаки нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть реализованы в любом аспекте настоящего изобретения, включая любой его вариант, где используется нуклеиновая кислота, либо отдельно, либо в любой комбинации. Следует отметить, что любой вариант аспекта настоящего изобретения также представляет собой вариант каждого и любого другого аспекта настоящего изобретения. Более конкретно, любой вариант осуществления первого аспекта настоящего изобретения также представляет собой вариант каждого и любого из второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого и 13-го аспектов.

Что касается различных заболеваний, состояний и расстройств, которые могут быть подвергнуты лечению или профилактике с использованием молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и композиций, а предпочтительно фармацевтических композиций, содержащих эти молекулы, то следует отметить, что такие заболевания, состояния и расстройства предпочтительно представляют собой заболевания, состояния и расстройства, описанные в настоящей заявке, включая, в частности, заболевания, состояния и расстройства, описанные и представленные во вступительной части настоящей заявки. Кроме того, соответствующие разделы в описании и во вступительной части описания составляют основную часть описания, в которой рассматривается возможное применение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению для профилактики и лечения, соответственно, указанных заболеваний, состояний и расстройств. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению является предпочтительной, если физиологическое действие рецептора CXCL8-CXCR1 и системы рецепторов CXCL8-CXCR2 ассоциируется с более высокими уровнями CXCL8 в плазме.

Используемый здесь термин CXCL8, предпочтительно, означает любой CXCL8, включая, но не ограничиваясь ими, CXCL8 млекопитающих. Предпочтительно, CXCL8 млекопитающих выбран из группы, включающей CXCL8 человека, обезьян, кроликов, свиней, собак, овец, рыбы-зебры и морских свинок. Более предпочтительно, CXCL8 представляет собой человеческий CXCL8, предпочтительно имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No 2.

Как более подробно описано в формуле изобретения и в Примере 1, авторами настоящего изобретения неожиданно был идентифицирован ряд различных молекул нуклеиновой кислоты, способных связываться с человеческим CXCL8.

Как более подробно описано в настоящей заявке, авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд различных молекул нуклеиновой кислоты CXCL8, способных связываться с человеческим CXCL8, где молекулы нуклеиновой кислоты могут быть охарактеризованы как нуклеотидные фрагменты, которые также раскрываются в настоящем описании (см. Пример 1).

Каждая из молекул нуклеиновой кислоты различных типов, связывающихся с CXCL8 согласно изобретению, которые связываются с CXCL8, содержит три различных нуклеотидных фрагмента: первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент. В общих чертах, молекула нуклеиновой кислоты, связывающаяся с CXCL8 согласно изобретению, содержит на своем 5'-конце и 3'-конце каждый из концевых нуклеотидных фрагментов, то есть, первый концевой нуклеотидный фрагмент и/или второй концевой нуклеотидный фрагмент (также называемые 5'-концевым нуклеотидным фрагментом и 3'-концевым нуклеотидным фрагментом, соответственно). Первый концевой нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент могут, в принципе, благодаря комплементарности своих оснований, гибридизоваться друг с другом, в результате чего, при такой гибридизации будет образовываться двухцепочечная структура. Однако, такая гибридизация необязательно реализуется в молекуле в физиологических и/или не-физиологических условиях. Три нуклеотидных фрагмента молекул нуклеиновой кислоты, связывающихся с CXCCL8, а именно, первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент расположены по отношению друг к другу в направлении 5'→3': первый концевой нуклеотидный фрагмент - центральный нуклеотидный фрагмент - второй концевой нуклеотидный фрагмент. Альтернативно, второй концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и первый концевой нуклеотидный фрагмент расположены по отношению друг к другу в направлении 5'→3'.

Длина центральных нуклеотидных фрагментов нуклеиновых кислот согласно изобретению предпочтительно составляет 32 или 33 нуклеотида.

Длина первых концевых нуклеотидных фрагментов нуклеиновых кислот согласно изобретению составляет от трех до шести нуклеотидов, предпочтительно от пяти до шести нуклеотидов, а более предпочтительно пять нуклеотидов.

Длина вторых концевых нуклеотидных фрагментов нуклеиновых кислот согласно изобретению составляет от трех до шести нуклеотидов, предпочтительно от пяти до шести нуклеотидов, а более предпочтительно пять нуклеотидов.

Используемые здесь термины «фрагмент» и «нуклеотидный фрагмент» являются синонимами, если это не оговорено особо.

Различия в последовательностях определенных фрагментов между различными молекулами нуклеиновых кислот, связывающимися с CXCL8, могут влиять на аффинность связывания с CXCL8. Исходя из анализа на связывание различных молекул нуклеиновой кислоты, связывающихся с CXCL8 согласно изобретению, центральный фрагмент и нуклеотиды, образующие этот фрагмент, по отдельности, а более предпочтительно во всей их общей длине, играют важную роль в связывании CXCL8-связывающейся молекулы нуклеиновой кислоты с CXCL8.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой одну молекулу нуклеиновой кислоты. В дополнительном варианте осуществления изобретения, одна молекула нуклеиновой кислоты присутствует в виде множества одиночных молекул нуклеиновой кислоты или в виде множества отдельных молекул нуклеиновой кислоты различных видов.

Специалистам в данной области будет очевидно, что молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, предпочтительно, состоит из нуклеотидов, ковалентно связанных друг с другом, предпочтительно, посредством фосфодиэфирных связей или линкеров.

В соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит два или более фрагментв или их частей, которые, в принципе, могут гибридизироваться друг с другом. После такой гибридизации образуется двухцепочечная структура. Специалистам в данной области будет очевидно, что такая гибридизация может происходить, а может не происходить, в частности, в условиях in vitro и/или in vivo. Кроме того, в случае гибридизации, такая гибридизация, но необязательно, происходит по всей длине двух фрагментов, где по меньшей мере исходя из правил спаривания оснований, в принципе, может происходить такая гибридизация и тем самым образование двухцепочечной структуры. Предпочтительно используемая здесь двухцепочечная структура является частью молекулы нуклеиновой кислоты или структурой, образованной двумя или более отдельными цепями или двумя пространственно разделенными фрагментами одной цепи молекулы нуклеиновой кислоты, где по меньшей мере, одна, а предпочтительно две или более пар оснований представляют собой пары оснований, а предпочтительно, оснований, спаривающихся в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика. Специалистам в данной области также будет очевидно, что может происходить и другое спаривание оснований, такое как спаривание оснований Хугстена, либо, при таком спаривании может образовываться двухцепочечная структура. Следует также отметить, что такая особенность гибридизации двух фрагментов предпочтительно указывает на то, что такая гибридизация, как предполагается, происходит из-за комплементарности оснований двух фрагментв независимо от того, происходит ли такая гибридизация in vivo и/или in vitro. В соответствии с настоящим изобретением, такие фрагменты представляют собой первые концевые нуклеотидные фрагменты и вторые концевые нуклеотидные фрагменты, которые, в одном варианте изобретения, могут гибридизоваться, как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, используемый здесь термин «расположение» означает порядок или последовательность описанных здесь структурных или функциональных признаков или элементов, относящихся к раскрытой(ым) здесь молекуле(ам) нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению также содержит нуклеиновые кислоты, которые по существу гомологичны конкретным раскрытым здесь последовательностям. Термин «по существу гомологичный» означает, что гомология составляет по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% а наиболее предпочтительно более 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Фактический процент гомологичных нуклеотидов, присутствующих в молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению, будет зависеть от общего количества нуклеотидов, присутствующих в молекуле нуклеиновой кислоты. Процентное изменение может быть основано на общем количестве нуклеотидов, присутствующих в молекуле нуклеиновой кислоты.

Гомология между двумя молекулами нуклеиновых кислот может быть определена методом, известным специалистам. Более конкретно, алгоритм сравнения последовательностей может быть использован для вычисления процента гомологии тестируемой(ых) последовательности(ей) по отношению к эталонной последовательности на основе указанных параметров программы. Тестируемая последовательность предпочтительно представляет собой последовательность или молекулу нуклеиновой кислоты, которая считается гомологичной, либо она может быть протестирована на ее гомологию и степень гомологии с другой молекулой нуклеиновой кислоты, и такая другая молекула нуклеиновой кислоты также называется эталонной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения, эталонная последовательность представляет собой описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты, а предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность в соответствии с любой из SEQ NО: 14-26 и 39-44, а предпочтительно SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Смиту и Уотерману (Smith & Waterman, 1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологичных последовательностей Нидлмана и Вюнша (Needleman & Wunsch, 1970), с применением метода поиска сходства по Пирсону и Липману (Pearson & Lipman, 1988), с помощью компьютеризованных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, Wis.) или путем визуального наблюдения.

Одним из примеров алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей, является алгоритм, используемый в базовом пакете программ поиска локальных выравниваний (далее называемого «BLAST»), см. например, Altschul Et Al. (Altschul et al. 1990 и Altschul et al. 1997). Компьютерная программа для проведения анализов BLAST является общедоступной на сайте Национального Центра Биотехнологической информации (далее называемая «NCBI»). Параметры по умолчанию, используемые для определения идентичности последовательностей с помощью компьютерной программы, имеющейся в NCBI, например, BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) и BLASTP (для аминокислотных последовательностей), описаны McGinnis et al. (McGinnis et al. 2004).

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению также содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет определенную степень идентичности нуклеиновым кислотам, раскрытым и описанным в настоящей заявке и определяется их нуклеотидной последовательностью. Более предпочтительно, настоящее изобретение также включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, а наиболее предпочтительно, более, чем на 95%, 96%, 97% 98% или 99% идентична молекуле нуклеиновой кислоты, раскрытой и описанной в настоящей заявке и определяемой ее нуклеотидной последовательностью или ее частью.

Термин «нуклеиновая кислота согласно изобретению» или молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению также включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую раскрытые или описанные здесь последовательности нуклеиновой кислоты или их часть, предпочтительно в той степени, в которой молекула нуклеиновой кислоты или указанные части участвуют в связывании с человеческим CXCL8. В одном варианте осуществления изобретения, такая нуклеиновая кислота представляет собой одну из описанных или раскрытых здесь молекул нуклеиновой кислоты, или их производных и/или метаболитов, где такое производное и/или метаболит предпочтительно представляют собой усеченную молекулу нуклеиновой кислоты по сравнению с молекулами нуклеиновой кислоты, описанными или раскрытыми в настоящей заявке. Усечение может быть осуществлено по любому концу или по обоим концам молекул нуклеиновой кислоты, раскрытых или описанных в настоящей заявке. Кроме того, усечение может быть осуществлено во внутренней нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, то есть, оно может быть осуществлено между 5'- и 3'-концевыми нуклеотидами, соответственно. Кроме того, усечение может включать делецию по меньшей мере одного нуклеотида в последовательности описанных здесь нуклеиновых кислот. Усечение может быть также осуществлено в более, чем одном фрагменте нуклеиновой(ых) кислоты (кислот), описанной(ых) или раскрытой(ых) в данном описании, где такой фрагмент может иметь длину как минимум в один нуклеотид. Связывание молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть определено специалистом в данной области с помощью рутинных экспериментов или с использованием или применением способа, описанного в настоящей заявке, а предпочтительно, описанного в настоящей заявке в разделе «Примеры».

Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может представлять собой либо молекулу D-нуклеиновой кислоты, либо молекулу L-нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой молекулу L-нуклеиновой кислоты.

Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения, каждая и любая из описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты, во всей своей полноте входит в объем термина «последовательность(и)» нуклеиновой кислоты, но не ограничивается конкретно указанной(ыми) нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями). Другими словами, термины «содержащий» или «содержит(ат)» должны интерпретироваться в таком варианте как «включающий» или «состоящий из».

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой часть более длинной молекулы нуклеиновой кислоты, где такая более длинная нуклеиновая кислота содержит несколько частей, где по меньшей мере одна такая часть представляет собой нуклеиновую кислоту согласно изобретению или ее часть. Другая(ие) часть(и) такой более длинной молекулы нуклеиновой кислоты может (могут) представлять собой одну или несколько молекул D-нуклеиновой кислоты или одну или несколько молекул L-нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении может быть использована любая их комбинация. Эти другие части более длинной молекулы нуклеиновой кислоты, взятые отдельно или вместе, либо полностью, либо в определенной комбинации, могут обладать функцией, которая отличается от связывания, а предпочтительно от связывания с CXCL8. Одной из возможных функций является взаимодействие с другими молекулами, а поэтому, такие другие молекулы предпочтительно отличаются от CXCL8, например, с точки зрения иммобилизации, перекрестного связывания, детектирования или амплификации. В другом варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает, в виде отдельных или комбинированных фрагментов, несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Такая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая несколько нуклеиновых кислот согласно изобретению, также входит в объем термина «более длинная нуклеиновая кислота».

Используемый здесь термин «L-нуклеиновая кислота» означает нуклеиновую кислоту или молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из L-нуклеотидов, а предпочтительно состоящую полностью из L-нуклеотидов.

Используемый здесь термин «D-нуклеиновая кислота» означает нуклеиновую кислоту или молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из D-нуклеотидов, а предпочтительно состоящую полностью из D-нуклеотидов.

Используемые здесь термины «нуклеиновая кислота и молекула нуклеиновой кислоты» являются синонимами, если это не оговорено особо.

Кроме того, если это не оговорено особо, то любая нуклеотидная последовательность представлена здесь в направлении 5'→3'.

Предпочтительно используемое здесь любое положение нуклеотида определяется или указывается по отношению к 5'- концу последовательности, фрагмента или субфрагмента, содержащего такой нуклеотид. Соответственно, второй нуклеотид представляет собой второй нуклеотид, если считать от 5'-конца последовательности, фрагмента и субфрагмента, соответственно. Кроме того, в соответствии с этим, предпоследний нуклеотид представляет собой второй нуклеотид, если считать от 3'-конца последовательности, фрагмента и субфрагмента, соответственно.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению состоит из рибонуклеотидов, где:

G представляет собой гуанозин-5'-монофосфат,

С представляет собой цитидин-5'-монофосфат,

А представляет собой аденозин-5'-монофосфат,

U представляет собой уридин-5'-монофосфат.

Для определения мотивов рибонуклеотидной последовательности используются аббревиатуры IUPAC для неоднозначных нуклеотидов:

S сильный G или C W слабый A или U(T) R пурин G или A Y пиримидин С или U (Т) K кето G или U (T) M имино A или C B не A C или U (T) или G D не C A или G или U (T) H не G A или C или U (T) V не U A или C или G N все A или G или C или U (T)

Конструирование молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве молекулы L-нуклеиновой кислоты является предпочтительным по нескольким причинам. Молекулы L-нуклеиновой кислоты представляют собой энантиомеры встречающихся в природе молекул нуклеиновой кислоты. Однако, молекулы D-нуклеиновой кислоты являются не очень стабильными в водных растворах, а в частности, в биологических системах или в биологических образцах из-за присутствия нуклеаз широкого ряда. Встречающиеся в природе нуклеазы, а в частности, нуклеазы клеток животных, не способны разлагать L-нуклеиновые кислоты. Вследствие этого, биологическое время полужизни молекулы L-нуклеиновой кислоты значительно увеличивается в такой системе, включая организм животного и человека. Из-за отсутствия расщепляемости молекул L-нуклеиновой кислоты, продукты разложения нуклеазами не образуются, а поэтому в такой системе, включая организм животного и человека, не наблюдается каких-либо побочных эффектов. Это свойство позволяет отличать молекулы L-нуклеиновой кислоты фактически от всех других соединений, которые используются в терапии заболеваний и/или расстройств, ассоциированных с наличием CXCL8. Молекула L-нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с молекулой-мишенью по механизму, отличающемуся от спаривания оснований Уотсона-Крика, или аптамер, который состоит частично или полностью из L-нуклеотидов, а в частности, часть аптамера, участвующего в связывании аптамера с молекулой-мишенью, также называются оптическим изомером. Аптамеры и оптические изомеры, как таковые, известны специалистам в данной области и, среди прочих, описаны в «Руководстве по аптамерам» (eds. Klussmann, 2006).

В соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, независимо от того, присутствует ли она в виде молекулы D-нуклеиновой кислоты, молекулы L-нуклеиновой кислоты или молекулы D, L-нуклеиновой кислоты, может присутствовать в виде одноцепочечной или двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Обычно, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, которая обладает определенной вторичной структурой благодаря своей первичной последовательности и может таким образом также образовывать третичную структуру. Однако, молекула нуклеиновой кислоты может быть также двухцепочечной в том смысле, что две цепи, которые являются комплементарными или частично комплементарными друг другу, гибридизуются друг с другом.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть модифицирована. Такая модификация может быть сделана в одном нуклеотиде молекулы нуклеиновой кислоты и хорошо известна специалистам в данной области. Примеры таких модификаций описаны, среди прочих, Venkatesan et al. (Venkatesan et al. 2003) и Kusser (Kusser, 2000). Такая модификация может представлять собой атом Н, атом F или группу О-СН₃ или NH₂ в 2'-положении одного, нескольких из всех отдельных нуклеотидов, из которых состоит молекула нуклеиновой кислоты. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать по меньшей мере один нуклеотид LNA. В одном варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению состоит из нуклеотидов LNA.

В одном из вариантов осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может представлять собой многокомпонентную молекулу нуклеиновой кислоты. Используемая здесь многокомпонентная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая состоит по меньшей мере из двух отдельных цепей нуклеиновой кислоты. Эти по меньшей мере две цепи нуклеиновой кислоты образуют функциональную единицу, где такая функциональная единица является лигандом для молекулы-мишени и, предпочтительно, антагонистом молекулы-мишени, в данном случае CXCL8. По меньшей мере две цепи нуклеиновой кислоты могут быть получены из любой молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению посредством расщепления молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению с образованием по меньшей мере двух цепей или посредством синтеза одной молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей первой части полноразмерной молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и другой молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей другой части полноразмерной молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В зависимости от количества частей, образующих полноразмерные молекулы нуклеиновой кислоты, может быть синтезирован соответствующий набор частей, имеющих требуемую нуклеотидную последовательность. Следует отметить, что способ расщепления и способ синтеза могут быть применены для получения многокомпонентной молекулы нуклеиновой кислоты, где присутствуют более двух цепей, как описано выше. Другими словами, по меньшей мере две отдельные цепи нуклеиновой кислоты обычно отличаются от двух цепей, которые являются комплементарными и гибридизуются друг с другом, хотя может существовать определенная степень комплементарности между указанными по меньшей мере двумя отдельными цепями нуклеиновой кислоты, и при этом, такая комплементарность может приводить к гибридизации указанных отдельных цепей.

И наконец, в настоящем изобретении также рассматривается получение полностью замкнутой, то есть, кольцевой структуры молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, то есть, в одном из вариантов осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению является замкнутой, предпочтительно посредством ковалентной связи, где более предпочтительно такая ковалентная связь присутствует между 5'-концом и 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, как описано в настоящей заявке, или любого их производного.

Определение констант связывания молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть осуществлен с применением способов, описанных в Примерах 3 и 4, в которых подтверждается тот факт, что молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеет подходящий диапазон значений K_D. Соответствующей мерой для выражения силы связывания между отдельной молекулой нуклеиновой кислоты и мишенью, которая, в данном случае, представляет собой CXCL8, является так называемая величина K_D, которая как таковая, а также способ ее определения известны специалистам в данной области.

Предпочтительно, величина K_D для нуклеиновых кислот согласно изобретению составляет ниже 1 мкМ. Величина K_D приблизительно 1 мкМ считается характерной для неспецифического связывания нуклеиновой кислоты с мишенью. Как будет очевидно для специалистов в данной области, величина K_D для группы соединений, таких как молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, находится в определенном диапазоне. Вышеупомянутая величина K_D приблизительно 1 мкМ является предпочтительным верхним пределом для величины K_D. Нижний предел K_D для нуклеиновых кислот, связывающихся с мишенью, может составлять по меньшей мере приблизительно 10 пикомоль или выше. В соответствии с настоящим изобретением, величины K_D для отдельных нуклеиновых кислот, связывающихся с CXCL8, предпочтительно находятся в пределах этого диапазона. Предпочтительные диапазоны могут быть определены путем выбора любого первого числа в этом диапазоне и любого второго числа в этом диапазоне. Предпочтительные верхние величины K_D составляют 250 нМ, 100 нМ и 20 нМ, предпочтительные более низкие величины K_D составляют 10 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 100 пМ или ниже и 30 пМ или ниже. Более предпочтительная верхняя величина K_D составляет 20 нМ, а более предпочтительная нижняя величина K_D составляет 30 пМ или ниже.

В дополнение к свойствам связывания молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению ингибирует функцию соответствующей молекулы-мишени, которая, в данном случае, представляет собой CXCL8. Ингибирование функции CXCL8, например, стимуляции соответствующих рецепторов, как описано ранее, достигается посредством связывания молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению с CXCL8 с образованием комплекса молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и CXCL8. Такой комплекс молекулы нуклеиновой кислоты и CXCL8 не может стимулировать рецепторы, которые обычно стимулируются CXCL8, то есть, CXCL8, который не присутствует в комплексе с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В соответствии с этим, ингибирование функции рецептора молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению не зависит от соответствующего рецептора, который может стимулироваться CXCL8, но является результатом предотвращения стимуляции рецептора CXCL8 молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Определение константы ингибирования для молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть осуществлено с применением способов, описанных в Примере 5, в котором подтверждается тот факт, что молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеет подходящую константу ингибирования, позволяющую использовать указанные нуклеиновые кислоты в терапевтической схеме лечения. Соответствующей мерой для выражения силы ингибирующего эффекта в отношении взаимодействия отдельной молекулы нуклеиновой кислоты с мишениью, в данном случае с CXCL8, и соответствующим рецептором, является так называемая полумаксимальная ингибирующая концентрация (сокращенно IC₅₀), которая как таковая и способ ее определения известны специалистам в данной области.

Предпочтительно, величина IC₅₀ для нуклеиновых кислот согласно изобретению составляет ниже 1 мкМ. Величина IC₅₀ приблизительно 1 мкМ считается характерной для неспецифического ингибирования функций мишени молекулой нуклеиновой кислоты. Как будет очевидно для специалистов в данной области, величина IC₅₀ для группы соединений, таких как молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, находится в определенном диапазоне. Вышеупомянутая величина IC₅₀ приблизительно 1 мкМ является предпочтительным верхним пределом для величины IC₅₀. Нижний предел IC₅₀ для молекулы нуклеиновой кислоты, связывающейся с мишенью, может составлять по меньшей мере приблизительно 10 пикомоль или выше. В соответствии с настоящим изобретением, величины IC₅₀ для отдельных нуклеиновых кислот, связывающихся с CXCL8, предпочтительно находятся в пределах этого диапазона. Предпочтительные диапазоны могут быть определены путем выбора любого первого числа в этом диапазоне и любого второго числа в этом диапазоне. Предпочтительные верхние величины IC₅₀ составляют 250 нМ, 100 нМ и 20 нМ, предпочтительные более низкие величины IC₅₀ составляют 10 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 500 пМ или ниже и 260 пМ или ниже. Более предпочтительная верхняя величина IC₅₀ составляет 20 нМ, а более предпочтительная нижняя величина IC₅₀ составляет 260 пМ или ниже.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может иметь любую длину, при условии, что она будет обладать способностью связываться с молекулой-мишенью. Специалисту в данной области очевидно, что молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеют предпочтительную длину. Обычно длина составляет от 15 до 120 нуклеотидов. Специалистам в данной области техники очевидно, что возможная длина молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению составляет от 15 до 120 нуклеотидов. Более предпочтительными интервалами длин молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются длины в пределах приблизительно от 20 до 100 нуклеотидов, приблизительно от 20 до 80 нуклеотидов, приблизительно от 20 до 60 нуклеотидов, приблизительно от 38 до 45 нуклеотидов и приблизительно от 40 до 45 нуклеотидов.

В соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит часть, которая предпочтительно представляет собой высокомолекулярную часть и/или которая предпочтительно позволяет изменять свойства молекулы нуклеиновой кислоты, где такими свойствами являются, среди прочих, время пребывания в организме животного, а предпочтительно, в организме человека. Особенно предпочтительным вариантом такой модификации является ПЭГилирование и введение в молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению группы гидроксиэтилированного крахмала (HES). Используемый здесь термин ПЭГ означает полиэтиленгликоль, а HES означает гидроксиэтилированный крахмал. Предпочтительно используемое здесь ПЭГилирование представляет собой модификацию молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где такая модификация состоит из молекулы ПЭГ, которая присоединена к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Предпочтительно применяемое здесь введение HES представляет собой модификацию молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где такая модификация состоит из молекулы HES, которая присоединена к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Эти модификации, а также способ модификации молекулы нуклеиновой кислоты посредством таких изменений описаны в патентных заявках EP1306382 и W02018099600A1, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки.

В случае ПЭГ, который представляет собой высокомолекулярную группу, молекулярная масса предпочтительно составляет приблизительно от 20000 до приблизительно 120000 Да, более предпочтительно, приблизительно от 30000 до приблизительно 80000 Да, а наиболее предпочтительно, приблизительно 40000 Да. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, ПЭГ представляет собой ПЭГ, описанный в Международной патентной заявке W003076490. В случае HES, представляющего собой высокомолекулярную группу, молекулярная масса предпочтительно составляет приблизительно от 50 кДа до приблизительно 1000 кДа, более предпочтительно, приблизительно от 100 кДа до приблизительно 700 кДа, а наиболее предпочтительно, от 200 кДа до 500 кДа. Молярное замещение HES составляет от 0,1 до 1,5, более предпочтительно, от 1 до 1,5, и такая степень замещения выражена как отношение C2/C6, составляющее приблизительно от 0,1 до 15, а предпочтительно, приблизительно от 3 до 10. Способ модификации HES описан, например, в заявке на патент Германии DE 142004006 249.8, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.

В принципе, модификация может быть введена в молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению в любом ее положении. Предпочтительно, такая модификация может быть введена в 5'- концевой нуклеотид, в 3'-концевой нуклеотид и/или в любой нуклеотид между 5'-нуклеотидом и 3'-нуклеотидом молекулы нуклеиновой кислоты.

Модификация, а предпочтительно, группа ПЭГ и/или HES могут быть присоединены к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению либо непосредственно, либо опосредовано, а предпочтительно посредством линкера. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит одну или более модификаций, а предпочтительно, одну или более групп ПЭГ и/или HES. В одном варианте осуществления изобретения, каждая линкерная молекула присоединяет более, чем одну группу ПЭГ или группу HES к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Линкер, используемый в настоящем изобретении, может быть прямым или разветвленным. Линкеры этого типа известны специалистам в данной области и дополнительно описаны в Международных патентных заявках WO 2005/074993 и WO 2003/035665.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, линкер является биоразлагаемым линкером. Биоразлагаемый линкер позволяет изменять свойства молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где такими свойствами являются, среди прочих, время пребывания в организме животного, а предпочтительно в организме человека, что обусловлено высвобождением модификации из молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Использование биологически разлагаемого линкера позволяет лучше регулировать время пребывания молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Предпочтительным вариантом такого биологически разлагаемого линкера является биоразлагаемый линкер, описанный в Международных патентных заявках, включая, но не ограничиваясь ими, WO 2006/052790, WO 2008/034122, WO 2004/092191 и W02005/099768.

В соответствии с настоящим изобретением, модификация или модифицирующая группа представляет собой биоразлагаемую модификацию, где такая биоразлагаемая модификация может быть присоединена к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению либо непосредственно, либо опосредовано, а предпочтительно посредством линкера. Биоразлагаемая модификация позволяет изменять свойства молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где такими свойствами являются, среди прочих, время пребывания в организме животного, а предпочтительно в организме человека, что обусловлено высвобождением или разложением модифицирующей группы из молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Использование биологически разлагаемой модификации позволяет лучше регулировать время пребывания молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Предпочтительным вариантом такой биоразлагаемой модификации является биоразлагаемая модификация, описанная в Международных патентных заявках, включая, но не ограничиваясь ими, WO 2002/065963, WO 2003/070823, WO 2004/113394 и WO 2000/41647, а предпочтительно WO 2000/41647, страница 18, строки 4-24.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, линкер имеет следующую структуру:

Соответствующий линкер, например, описан в WO 2015/062743. Исходя из вышеуказанной структуры, линвер соединяет две отдельных молекулы ПЭГ с группой ОН фосфатной части нуклеотида молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Помимо модификаций, описанных выше, для изменения свойств молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы и другие модификации, где такие другие модификации могут быть выбраны из группы белков, липидов, таких как холестерин, и сахарных цепей, таких как амилаза, декстран и т.п.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что благодаря модификации молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению высокомолекулярной группой, такой как полимер, а, более конкретно, один или несколько описанных здесь полимеров, которые предпочтительно являются физиологически приемлемыми, кинетика экскреции модифицированной таким образом молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из организма животного или человека, которому вводят модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, изменяется. Более конкретно, благодаря увеличению молекулярной массы модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и благодаря отсутствию метаболизма молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, а особенно, если она присутствует в L-Форме, то есть, в форме молекулы L-нуклеиновой кислоты, степень экскреции из организма животного, предпочтительно из организма млекопитающего, а более предпочтительно из организма человека, снижается. Поскольку экскреция обычно осуществляется через почки, то авторы настоящего изобретения предполагают, что скорость фильтрации модифицированной таким образом молекулы нуклеиновой кислоты из клубочков значительно снижается по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты, не имеющей высокомолекулярной модификации такого типа, что приводит к увеличению времени пребывания модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты в организме животного. В связи с этим, особенно примечательно то, что, несмотря на такую высокомолекулярную модификацию, специфичность молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению не дает негативного эффекта. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, помимо прочего, обладает удивительным свойством, которое обычно не наблюдается для фармацевтически активного соединения, то есть, свойством, при котором для обеспечения пролонгированного высвобождения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению необязательно использовать фармацевтическую композицию, обеспечивающую пролонгированное высвобождение. Вместо этого, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению в модифицированной форме, содержащей высокомолекулярную группу, может быть такой, которую уже можно использовать в качестве композиции с прологнгированным высвобождением, поскольку она действует благодаря своей модификации, так, как если бы она высвобождалась из композиции с прологнгированным высвобождением. В этом случае, модификация(и) молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, как описано в настоящей заявке, и модифицированная таким образом молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению и любая композиция, содержащая эти молекулы, могут обеспечивать четкую, предпочтительно регулируемую фармакокинетику и их биораспределение. Это свойство также включает время пребывания этих молекул в кровотоке организма животного и человека и их распределение в тканях такого животного и человека. Такие модификации дополнительно описаны в патентной заявке WO2003/035665.

Однако, в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению также не содержит никакой модификации, а в частности, не имеет высокомолекулярной модификации, такой как ПЭГ или HES. Такой вариант осуществления изобретения является особенно предпочтительным, если молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеет преимущественное распределение в любом органе или в ткани-мишени в организме, или если желательным является быстрый клиренс молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из организма после ее введения. Описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению с преимущественным профилем распределения в любом органе или ткани-мишени в организме позволяет установить эффективные локальные концентрации в ткани-мишени при сохранении низкой системной концентрации молекулы нуклеиновой кислоты. Это позволяет использовать низкие дозы, которые не только полезны с экономической точки зрения, но также снижают нежелательное воздействие молекулы нуклеиновой кислоты на другие ткани, и тем самым снижают потенциальный риск побочных эффектов. Быстрое выведение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из организма после ее введения может быть желательным, среди прочего, в случае визуализации in vivo или получения конкретно требуемых терапевтических доз при использовании молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению или лекарственных средств, содержащих такую молекулу.

Нуклеиновая кислота согласно изобретению, которая также называется здесь нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению или молекулой нуклеиновой кислоты согласно (настоящему) изобретению, и/или антагонисты согласно настоящему изобретению могут быть использованы для получения или приготовления лекарственного средства. Такое лекарственное средство или фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот согласно изобретению необязательно вместе с другими фармацевтически активными соединениями, где нуклеиновая кислота согласно изобретению предпочтительно действует как само фармацевтически активное соединение. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения, такие лекарственные средства содержат по меньшей мере фармацевтически приемлемый носитель. Таким носителем может быть, например, вода, буфер, PBS, раствор глюкозы, предпочтительно 5% сбалансированный раствор соли глюкозы, крахмал, сахар, желатин или любое другое приемлемое вещество-носитель. Такие носители, по существу, известны специалистам в данной области. Специалисту в данной области будет очевидно, что любые варианты, применение и аспекты или родственные аспекты, относящиеся к лекарственному средству согласно изобретению, также применимы к фармацевтической композиции согласно изобретению и к молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению для лечения и/или профилактики и/или диагностики любого описанного или раскрытого здесь заболевания, и наоборот.

Показания, заболевания и расстройства, для лечения и/или профилактики которых используются нуклеиновые кислоты, фармацевтические композиции и лекарственные средства в соответствии с настоящим изобретением или полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются результатом прямого или опосредованного участия CXCL8 в соответствующем патогенезе.

CXCL8 (UniProtKB/Swiss-Prot PI 0145, IL8 HUMAN; SEQ ID NO: 2), также известный как интерлейкин 8 (IL-8), нейтрофил-активирующий белок 1 (NAP-1), моноцитарный фактор хемотаксиса нейтрофилов (MDNCDF) или белок 1 (GCP-1) хемотаксиса гранулоцитов (GCP-1) представляет собой небольшой основный белок, который принадлежит к подсемейству хемокинов CXC, обладающих провоспалительными и проангиогенными свойствами, характеризующимися наличием мотива глутамат-лейцин-аргинин (ELR) у N-конца. ELR-позитивные хемокины CXCL1 (также известные как рост-регулирующий альфа-белок, Gro-альфа, белок, обладающий активностью, стимулирующей рост меланомы, MGSA или NAP-3), CXCL2 (также известный как Gro-бета или макрофагальный воспалительный белок 2-альфа, MIP2-альфа), CXCL3 (также известный как Gro-гамма или MIP2-бета), CXCL5 (также известный как эпителиальный нейтрофил-активирующий белок 78, ENA-78 или слабоиндуцибельный цитокин В5), CXCL6 (также известный как хемокин альфа-3, CKA-3, белок 2 хемотаксиса гранулоцитов, GCP-2, или слабоиндуцибельный цитокин В6), CXCL7 (также известный как тромбоцитарный основный белок, PBP, лейкоцитарный фактор роста, LDGF, макрофагальный фактор роста, MDGF, или слабоиндуцибельный цитокин В7), и CXCL8 представляют собой агонисты рецептора CXCR2 (также известного как IL8RB, IL8R типа 2, CD182, CDwl28b или рецептор GRO/MGSA). CXCL6, CXCL7 и CXCL8 представляют собой агонисты рецептора CXCR1 (также известного как IL8RA, IL8R типа 1, CD181 или CDwl28a). CXCL8 связывается с рецепторами CXCR1 и CXCR2 c аналогичными аффинностями в концентрации приблизительно 4 нМ. Связывание CXCL8 с CXCR1/2 запускает Gαi-зависимые сигнальные пути и, например, индуцирует миграцию нейтрофилов, дегрануляцию и окислительную вспышку. Чувствительность к рецептору можно регулировать посредством фосфорилирования, рекрутинга бета-аррестина и интернализации рецептора (Ha, Theranostics 2017). CXCL7 имеет самую высокую гомологию с CXCL8 c 33 идентичными аминокислотами. CXCL8 приматов, не являющихся человеком (Macaca Mulata, собакоподобных обезьян), на 95% идентичны (73 аминокислоты из 77 аминокислот являются идентичными) человеческому CXCL8. У мышей и крыс ортолог CXCL8 отсутствует.

Совершенно очевидно, что поскольку CXCL8-связывающаяся молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению взаимодействует или связывается с человеческим CXCL8, то специалисту в данной области будет понятно, что CXCL8-связывающаяся молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть с успехом использована для лечения, профилактики и/или диагностики любого заболевания у человека и животных, как описано в настоящей заявке. В связи с этим, следует отметить, что молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть использованы для лечения и/или профилактики любых описанных здесь заболеваний, расстройств или состояний, независимо от механизма действия, лежащего в основе такого заболевания, расстройства и состояния.

В дальнейшем, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что рациональное использование молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению для лечения различных заболеваний, расстройств и состояний обеспечивает таким образом заявленную терапевтическую, профилактическую и диагностическую применимость молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Во избежание какого-либо ненужного повторения, следует отметить, что благодаря включению системы рецепторов CXCL8-CXCL8, описанной в связи с этим, указанная система может служить мишенью для молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению так, чтобы достигался заявленный терапевтический, профилактический и диагностический эффект. Кроме того, следует отметить, что особенности заболеваний, расстройств и состояний у пациентов и любое приведенное в связи с этим подробное описание схемы лечения может служит предметом изобретения, относящимся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

CXCL8 и его рецепторы участвуют или вовлечены в патофизиологию нескольких воспалительных заболеваний, и потенциал ингибирования CXCL8 для лечения таких воспалительных заболеваний подтверждается у животных с моделями таких заболеваний. Воспалительные заболевания и/или расстройства и/или патологические состояния, для лечения и/или профилактики которых может быть использовано лекарственное средство согласно изобретению, могут включать, но не ограничиваются ими:

Воспалительные заболевания дыхательных путей:

а. Хроническая обструктивная болезнь легких

b. Острый респираторный дистресс-синдром

с. Астма и аллергическое воспаление

d. Бронхит, бронхиолит, облитерирующий бронхиолит, бронхиэктаз

е. Интерстициальные заболевания легких, включая фиброз легких

f. Муковисцидоз

g. трансплантация легких

h. Повреждения легких, вызываемые физическими повреждениями, например, сигаретным дымом, расправление легких после ателеэктаза, гипероксией

i. Повреждения легких, вызываемые бактериальной, вирусной или грибковой инфекцией (пневмонией)

Воспалительные заболевания кожи:

а. Нейтрофильные дерматозы

b. Псориаз

с. Буллезный пемфигоид

d. Буллезный эпидермолиз

е. Гнойный гидрадеиит

f. Нейродермит

g. Экзема

Аутоиммунные заболевания:

а. Воспалительные заболевания кишечника

b. Язвенный колит

с. Рассеянный склероз

d. Ревматоидный артрит

е. Диабет Типа 1

f. Анкилозирующий спондилит

Нервные заболевания:

а. Нервная болезнь Свита

b. Болезнь Альцгеймера

Ишемические реперфузионные повреждения:

а. Инсульт

b. Инфаркт миокарда

с. Ишемия и инфаркт головного мозга

Другие воспалительные заболевания:

a. Атеросклероз

б. Отторжение панкреатических островков

c. Отторжение трансплантированных органов и/или их замедленная функция

d. Повреждение спинного мозга

е. Цистит

(Обзор, представленный Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014 и Ha, Theranostics 2017).

CXCL8 сверхэкспрессируется в раковых опухолях человека, и экспериментальные модели рака подтверждают возможность ингибирования CXCL8 для лечения рака. Соответственно, заболевания и/или расстройства и/или патологические состояния, для лечения и/или профилактики которых может быть использовано лекарственное средство согласно изобретению, включают, но не ограничиваются ими:

а. рак легких

b. рак толстой кишки

с. рак прямой и ободочной кишки

d. рак предстательной железы, включая рак предстательной железы, не поддающийся лечению гормонами

е. рак поджелудочной железы

f. рак печени

g. рак молочной железы

h. рак яичника

i. рак щитовидной железы

j. меланому

k. глиобластому

l. остеосаркому

m. рак пищевода

n. рак крови (лейкозы и лимфомы)

o. опухоли, дефицитные по PTEN

p. p53-мутированные опухоли

q. Kras-мутированные опухоли

r. Не поддающийся лечению рак, включая рак, резистентный к лечению химиотерапевтическими средствами, антиангиогенными агентами, ингибиторами тирозинкиназы и ингибиторами иммунной контрольной точки.

В другом варианте осуществления изобретения, лекарственное средство содержит дополнительный фармацевтически активный агент для лечения рака и/или опухолей. Такими дополнительными фармацевтически активными соединениями являются, среди прочих, но не ограничиваются ими, соединения, известные как противоопухолевые активные вещества, такие как алкилирующие агенты, антиметаболиты, антиангиогенные агенты, агенты, ингибирующие митоз, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы передачи клеточных сигналов, гормоны, антитела, иммуноконъюгаты и гибридные белки.

Другими фармацевтически активными соединениями для лечения рака и/или опухолей являются иммунотерапевтические средства. Такими дополнительными фармацевтически активными соединениями являются, среди прочих, но не ограничиваются ими, ингибиторы контрольной точки, противораковые вакцины, иммуностимулирующие агенты, клеточные агенты, противораковые терапевтические средства.

Другими фармацевтически активными соединениями являются, среди прочих, но не ограничиваются ими, соединения, известные как блеомицин, ингибиторы тимидилат-синтазы, такие как ралтитрексед и пеметрексед, ферменты, такие как L-аспарагиназа, милтефозин и ангарелид, ингибиторы протеосомы, такие как бортезомиб.

В соответствии с настоящим изобретением, лекарственное средство и фармацевтическая композиция, соответственно, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению, могут быть использованы для лечения таким способом.

В дополнительном варианте осуществления изобретения, лекарственное средство содержит дополнительный фармацевтически активный агент для лечения воспалительных заболеваний. Такими дополнительными фармацевтически активными соединениями являются, среди прочих, но не ограничиваются ими, соединения, которые, как известно, подавляют иммунную систему, такие как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, кортикостероиды, ингибиторы кальцинейрина, циклоспорин А, метотрексат, азатиоприн, такролимус, рапамицин, хлорамбуцил, лефлуномид, микофенолят мофетил, бреквинар, мизорибин, талидомид, деоксиспергуалин, дапсон, гидроксихлорохин, сульфасалазин, антигистамины или противовоспалительные биологические средства, такие как антитело против фактора некроза опухоли, адалимумаб, анти-CD20 антитело ритуксимаб, истощающее В-клетки, анти-IL6R антитело тоцилизумаб, анти-IgE антитело омализумаб и иммуноглобулины для внутривенного введения.

И наконец, дополнительный фармацевтически активный агент может представлять собой модулятор активности любого другого хемокина, который может представлять собой агонист или антагонист хемокина или агонист или антагонист хемокинового рецептора. Альтернативно или дополнительно, такой дополнительный фармацевтически активный агент представляет собой дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Альтернативно, лекарственное средство содержит по меньшей мере одну или более нуклеиновых кислот, которые связываются с молекулой-мишенью, отличающейся от CXCL8, или обладает функцией, отличающейся от функции одной из нуклеиновых кислот согласно изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением, лекарственное средство альтернативно или дополнительно используют, в принципе, для профилактики любого из заболеваний, раскрытых в связи с применением лекарственного средства для лечения указанных заболеваний. Соответствующие маркеры, то есть, маркеры для выявления соответствующих заболеваний, известны специалистам в данной области. Предпочтительно, соответствующим маркером является CXCL8.

В одном варианте лекарственного средства согласно изобретению, такое лекарственное средство предназначено для его применения в комбинации с другими способами лечения любых раскрытых здесь заболеваний, а в частности, заболеваний, для которых может быть использовано лекарственное средство согласно изобретению.

«Комбинированная терапия» (или «совместная терапия») включает введение лекарственного средства согласно изобретению и по меньшей мере второго агента как часть конкретной схемы лечения для достижения благоприятного эффекта от совместного действия этих терапевтических агентов, то есть, лекарственного средства согласно изобретению и указанного второго агента. Благоприятный эффект такой комбинации включает, но не ограничивается ими, фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие, являющееся результатом введения комбинации терапевтических агентов. Введение этих терапевтических агентов в комбинации обычно осуществляют в течение определенного периода времени (обычно в течение нескольких минут, часов, дней или недель в зависимости от выбранной комбинации).

«Комбинированная терапия» может включать, но обычно не включает, введение двух или более из этих терапевтических агентов как часть отдельных схем монотерапии, которые случайно и произвольно приводят к комбинированной терапии согласно изобретению. «Комбинированная терапия» может включать последовательное введение этих терапевтических агентов, то есть, когда каждый терапевтический агент вводят в разное время, а также когда эти терапевтические агенты или по меньшей мере два из них вводят, по существу, одновременно. По существу одновременное введение может быть осуществлено, например, путем введения индивидууму одной капсулы, имеющей фиксированное отношение каждого терапевтического агента или множества отдельных капсул для каждого из терапевтических агентов.

Последовательное или по существу одновременное введение каждого терапевтического агента может быть осуществлено любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь ими, местное введение, пероральное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение и прямое всасывание через ткани слизистой оболочки. Терапевтические агенты могут быть введены одним и тем же способом или различными способами. Так, например, первый терапевтический агент комбинации может быть введен путем инъекции, в то время как другие терапевтические агенты комбинации могут быть введены местно.

Альтернативно, например, все терапевтические агенты могут быть введены местно, или все терапевтические агенты могут быть введены путем инъекции. Последовательность введения терапевтических агентов не является строго определенной, если это не оговорено особо. «Комбинированная терапия» также может охватывать введение описанных выше терапевтических агентов в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами. Если комбинированная терапия дополнительно включает не-медикаментозное лечение, то такое не-медикаментозное лечение может проводиться в любое подходящее время до тех пор, пока не будет достигнут благоприятный эффект от совместного действия комбинации терапевтических агентов и не-медикаментозного лечения. Так, например, в некоторых случаях, благоприятный эффект может быть все же достигнут, даже если не-медикаментозное лечение временно прекращается при введении терапевтических агентов, возможно в течение нескольких дней или даже недель.

Как в общих чертах описано выше, лекарственное средство согласно изобретению может быть введено, в принципе, в любой форме, известной специалистам в данной области. Предпочтительным способом введения является системное введение, а более предпочтительным является парентеральное введение, предпочтительно путем инъекции. Альтернативно, лекарственное средство может быть введено местно. Другие способы введения включают внутримышечное, внутрибрюшинное и подкожное введение, пероральное введение, интраназальное введение, интратрахеальное введение или введение в легкие, причем предпочтение следует отдать способу введения, который является наименее инвазивным, и в то же время обеспечивал бы эффективность.

Парентеральное введение обычно применяют для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Кроме того, один способ парентерального введения предусматривает имплантацию систем с замедленным высвобождением или с пролонгированным высвобождением, что будет гарантировать поддержание постоянного уровня дозы, как хорошо известно специалистам в данной области.

Кроме того, предпочтительные лекарственные средства согласно изобретению могут быть введены интраназально путем местного применения подходящих интраназальных носителей, ингаляторов, или трансдермально с использованием трансдермальных кожных пластырей в форме, хорошо известной специалистам в данной области. При введении системы для трансдермальной доставки в такой форме, введение дозы, как известно, будет непрерывным, и не будет прерываться в течение всей схемы введения доз. Другие предпочтительные препараты для местного применения включают кремы, мази, лосьоны, аэрозольные спреи и гели, в которых концентрация активного ингредиента обычно составляет в пределах от 0,01 до 15% масс./масс. или масс./об.

Лекарственное средство согласно изобретению обычно содержит эффективное количество активного(ых) компонента(ов) терапии, включая, но не ограничиваясь ими, молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, растворенную или диспергированную в фармацевтически приемлемой среде. Фармацевтически приемлемые среды или носители включают любые и все растворители, дисперсионные среды, вещества для покрытий, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно специалистам в данной области. Дополнительные активные ингредиенты могут быть также включены в лекарственное средство согласно изобретению.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции. Такая фармацевтическая композиция включает по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот согласно изобретению и предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель. Такой носитель может представлять собой любой носитель или любое связывающее вещество, используемое и/или известное специалистам в данной области. Более конкретно, такое связывающее вещество или носитель представляет собой любое связывающее вещество или носитель, как описано в разделе настоящей заявки, относящемся к приготовлению лекарственного средства. В дополнительном варианте осуществления изобретения, фармацевтическая композиция содержит дополнительный фармацевтически активный агент.

Получение лекарственного средства и фармацевтической композиции будет известно специалистам в данной области исходя из описания изобретения. Обычно, такие композиции могут быть получены в виде препаратов для инъекций в виде жидких растворов или суспензий; твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией; в виде таблеток или других твердых веществ для перорального введения; в виде капсул с замедленным высвобождением; или в любой другой форме, используемой в настоящее время, включая глазные капли, кремы, лосьоны, мази, ингаляторы и т.п. Также может быть особенно полезным применение стерильных композиций, таких как промывки на основе физиологического раствора, которые используются хирургами, врачами или медицинским персоналом для обработки конкретного участка в операционном поле. Композиции могут быть также доставлены посредством микроустройства, микрочастицы или губки.

После составления рецептуры, лекарственное средство или фармацевтическую композицию вводят способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является фармакологически эффективным. Композиции могут быть легко введены в виде различных лекарственных форм, таких как растворы для инъекций описанного выше типа, но также могут быть использованы капсулы для высвобождения лекарственных средств и т.п.

В этом контексте, количество активного ингредиента и объем вводимой композиции зависит от индивидуума или пациента, проходящего лечение. Конкретные количества активного соединения, необходимые для введения, зависят от решения, принимаемого практическим врачом, и являются индивидуальными для каждого пациента.

Обычно используют минимальный объем лекарственного средства или фармацевтической композиции, необходимой для диспергирования активных соединений. Подходящие схемы введения также отличаются друг от друга, но могут быть типичными, например, по первоначальному введению соединения и мониторингу результатов, а затем могут быть введены дополнительные регулируеме дозы через дополнительные интервалы.

Так, например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы (например, желатиновой капсулы), активный лекарственный компонент, то есть, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению и/или любой другой фармацевтически активный агент, также называемый здесь терапевтическим(и) агентом(ами) или активным(и) соединением(ями), могут быть объединены с пероральным, нетоксичным, фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Кроме того, при желании или при необходимости, в смесь могут быть также включены подходящие связующие вещества, лубриканты, дезинтегрирующие агенты и красители. Подходящими связующими веществами являются крахмал, алюмосиликат магния, крахмальная паста, желатин, метилцеллюлоза, натрий-содержащая карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, кукурузные подсластители, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, воски и т.п. Лубрикантами, используемыми в этих лекарственных формах, являются олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота, ее магниевая или кальциевая соль и/или полиэтиленгликоль и т.п. Дезинтеграторами являются, но не ограничиваются ими, крахмал, метилцеллюлоза, агар, бентонит, крахмал-содержащая ксантановая камедь, агар, альгиновая кислота или ее натриевая соль, или шипучие смеси, и т.п. Разбавителями являются, например, лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза и/или глицин.

Лекарственное средство или фармацевтическая композиция согласно изобретению могут быть также введены в таких пероральных лекарственных формах в виде таблеток или капсул с замедленным и пролонгированным высвобождением, драже, порошков, гранул, эликсиров, настоек, суспензий, сиропов и эмульсий. Суппозитории преимущественно получают из жировых эмульсий или суспензий.

Фармацевтическая композиция или лекарственное средство могут быть стерилизованными и/или могут содержать адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие или эмульгирующие агенты, стимуляторы растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать и другие терапевтически ценные вещества. Композиции получают стандартными способами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия, и они обычно содержат приблизительно от 0,1 до 75%, а предпочтительно приблизительно от 1 до 50% активного ингредиента.

Жидкие композиции, а в частности, композиции для инъекций, могут быть получены, например, путем растворения, диспергирования и т.п. Активное соединение растворяют или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким как, например, вода, физиологический раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и т.п. с образованием раствора или суспензии для инъекций. Кроме того, могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения в жидкости перед инъекцией.

Для твердых композиций, наполнителями являются фармацевтически чистые вещества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-содержащий сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, карбонат магния и т.п. Активное соединение, определенное выше, может быть также приготовлено в виде суппозиториев с использованием, например, полиалкиленгликолей, например пропиленгликоля в качестве носителя. В некоторых вариантах осуществления изобретения, суппозитории преимущественно получают из жировых эмульсий или суспензий.

Лекарственное средство, фармацевтическая композиция и молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, соответственно, могут быть также введены в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах осуществления изобретения, пленку из липидных компонентов гидратируют водным раствором лекарственного средства с образованием липидного слоя, инкапсулирующего лекарственное средство, что хорошо известно специалистам в данной области. Так, например, описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены в виде комплекса с липофильным соединением или они могут быть получены в виде неиммуногенного высокомолекулярного соединения методами, известными специалистам. Кроме того, липосомы могут нести такие молекулы нуклеиновой кислоты на своей поверхности для нацеливания и переноса цитотоксических агентов вонутрь клетки для ее цитолиза. Пример комплексов, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, представлен в патенте США No. 6011020.

Лекарственное средство, фармацевтическая композиция и молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, соответственно, могут быть также связаны с растворимыми полимерами в качестве носителей для доставки лекарственных средств. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, пирановый сополимер, полигидроксипропил-метакриламид-фенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. Кроме того, лекарственные средства и молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, соответственно, могут быть связаны с биоразлагаемыми полимерами конкретного класса, подходящими для регулируемого высвобождения лекарственного средства, например, такими как полимолочная кислота, полиэпсилонкапролактон, полигидроксимасляная кислота, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианоакрилаты и перекрестно связанные или амфипатические блоксополимеры гидрогелей.

При желании, вводимые фармацевтическая композиция и лекарственное средство, соответственно, могут также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие агенты и другие вещества, такие как, например, ацетат натрия и олеат триэтаноламина.

Схему введения доз, в которой используют молекулу нуклеиновой кислоты, лекарственное средство или фармацевтическую композицию согласно изобретению, соответственно, выбирают в зависимости от ряда факторов, включая тип, вид, возраст, массу, пол и состояние здоровья пациента; тяжесть состояния, подлежащего лечению; способ введения; функцию почек и печени пациента; и конкретный используемый аптамер или его соль. Специалист в данной области, а именно, врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество лекарственного средства, необходимое для профилактики, подавления или прекращения развития заболевания.

Эффективные уровни нуклеиновой кислоты согласно изобретению в плазме предпочтительно составляют в пределах от 500 фМ до 500 мкМ при лечении любого из заболеваний, описанных в настоящей заявке.

Молекула нуклеиновой кислоты, лекарственное средство и фармацевтическая композиция согласно изобретению, соответственно, предпочтительно могут быть введены в виде однократной суточной дозы, через каждый второй или третий день, еженедельно, через две недели, один раз в месяц или раз в три месяца.

В соответствии с настоящим изобретением, описанное здесь лекарственное средство входит в состав раскрытой здесь фармацевтической композиции.

В своем дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает введение фармацевтически активного количества по меньшей мере одной из молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном варианте осуществления изобретения, индивидуум страдает заболеванием или подвержен риску развития такого заболевания, где указанным заболеванием является любое из описанных здесь заболеваний, а в частности, любое из заболеваний, раскрытых здесь в связи с использованием любых нуклеиновых кислот согласно изобретению для получения лекарственного средства.

Следует отметить, что нуклеиновая кислота, а также антагонисты согласно изобретению могут быть использованы не только в качестве лекарственного средства или в качестве средства для приготовления лекарственного препарата, но также и для косметических целей, а в частности, для лечения воспалительных локальных повреждений кожи, вызываемых CXCL8. Поэтому, дополнительным состоянием или заболеванием, для лечения или профилактики которого используются нуклеиновая кислота, лекарственное средство и/или фармацевтическая композиция согласно изобретению, являются воспалительные локальные повреждения кожи.

Очевидно, что поскольку CXCL8-связывающая молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению взаимодействует или связывается с человеческим CXCL8, то специалисту в данной области будет, по существу, понятно, что CXCL8-связывающая молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть с успехом использована для детектирования CXCL8 и для приготовления диагностического агента или биосенсора.

Предпочтительно используемые здесь диагностическое вещество или диагностический агент или диагностическое средство или биосенсор являются подходящими для детектирования, либо непосредственно, либо опосредованно, CXCL8, а предпочтительно CXCL8, описанного в настоящей заявке, а более предпочтительно CXCL8, описанного в разделе, относящемся к различным описанным здесь расстройствам и заболеваниям. Диагностическое средство или биосенсор являются подходящими для таких целей, как, но не ограничивающихся ими, обнаружение и/или наблюдение за течением любых описанных здесь расстройств и заболеваний, соответственно. Такое обнаружение может быть осуществлено посредством связывания нуклеиновой кислоты согласно изобретению с CXCL8. Такое связывание может быть детектировано либо непосредственно, либо опосредованно, где молекула нуклеиновой кислоты может содержать модифицирующую группу, а может и не содержать модифицирующую группу. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, модифицирующая группа позволяет осуществлять иммобилизацию нуклеиновой кислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, модифицирующая группа представляет собой метку. Соответствующие способы и средства известны специалистам в данной области.

В одном из вариантов осуществления изобретения, нуклеиновая кислота согласно изобретению иммобилизована на поверхности реакционного сосуда с диагностическим средством, на поверхности устройства, содержащегося в реакционном сосуде с диагностическим средством, или на поверхности биосенсора, с применением любых средств, известных специалистам, включая нековалентное или ковалентное связывание.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, нуклеиновая кислота согласно изобретению иммобилизована на поверхности посредством ковалентного связывания. Таким образом, в настоящем изобретении, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит модифицирующую группу, которая обеспечивает иммобилизацию молекулы нуклеиновой кислоты на поверхностях. Такими модифицирующими группами для ковалентного связывания являются, но не ограничиваются ими, (активированный) карбоксил, гидроксил, фосфатидил, сложный эфир сульфоновой кислоты, амин, тиол, эпоксид, алкин, стерический циклоалкин (например, дибензоциклооктил, DBCO; бицикло[6.1.0]нон-4-ин, BCN или азадибензоциклооктин, ADIBO), малеимид, азид, гидразид.

Такие ковалентные связи могут быть образованы, например, активированными карбоксильными группами (например, посредством активации в присутствии EDC/NHS), взаимодействующими с первичными аминами; малеимидом, взаимодействующим с тиоловыми группами, посредством реакции циклоприсоединения азида-алкина, катализируемой медью (проводимой автоматизированным химическим методом), с применением автоматизированного химического метода без меди, включая, но не ограничиваясь ими, реакцию циклоприсоединения азида-стерического алкина без меди, реакцию циклоприсоединения алкена-азида [3+2], реакцию инверсии алкена-тетразина Дильса-Альдера, и автоматизированную фотореакцию присоединения алкена-тетразола, или посредством прямого связывания тиолированных зондов на золотых поверхностях. В этом варианте осуществления изобретения, такие способы не ограничиваются конкретной геометрией, и реакционноспособная группа может быть расположена на любой поверхности или на нуклеиновых кислотах.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, нуклеиновые кислоты согласно изобретению подвергают связыванию с функционализированными азидом поверхностями биосенсоров посредством реакции циклоприсоединения азида-алкина, стимулируемой стерическими связями (автоматизированным химическим методом). Для этого, поверхность функционализируют азидом, а олигонуклеотид функционализируют стерическим алкином, например, дибензоциклооктилом, DBCO; бицикло[6.1.0]нон-4-ином (BCN) и азадибензоциклооктином (ADIBO), предпочтительно у 5'- или 3'-конца. Альтернативно, может быть использована инвертированная геометрическая структура, то есть, реакция может быть проведена на биосенсорной поверхности, функционализированной стерическим алкином, и с использованием нуклеиновых кислот, модифицированных азидом.

В другом варианте осуществления изобретения, нуклеиновую кислоту согласно изобретению иммобилизуют посредством нековалентного связывания. Таким образом, в настоящем изобретении, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит модифицирующую группу, которая позволяет иммобилизовать молекулу нуклеиновой кислоты на поверхностях, где такое связывание является обратимым. Такими модифицирующими группами для нековалентного связывания являются, но не ограничиваются ими, биотин (связывающийся с авидином, стрептавидином или нейтравидином), бромдезоксиуридин (связывающийся с антителом против бромдезоксиуридина), дигоксигенин (связывающийся с антителом против дигоксигенина) и олигонуклеотиды (связывающиеся с комплементарным олигонуклеотидом). Неблокированные 3'-концы олигонуклеотидов могут служить в качестве праймеров для полимераз или в качестве акцепторов для другой нуклеиновой кислоты в лигазной реакции. В этом варианте осуществления изобретения, такие способы не ограничиваются конкретной геометрией, и реакционноспособная группа может быть расположена либо на поверхности, либо на нуклеиновых кислотах.

В настоящем изобретении, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению не является иммобилизованной, а используется в растворе и содержит модифицирующую группу, которая, предпочтительно, позволяет детектировать молекулу нуклеиновой кислоты, называемую здесь меткой. Этими метками являются, но не ограничиваются ими, биотин (связывающийся с авидином, стрептавидином или нейтравидином), бромдезоксиуридин (связывающийся с антителом против бромдезоксиуридина), дигоксигенин (связывающийся с антителом против дигоксигенина) и олигонуклеотиды (связывающиеся с комплементарным олигонуклеотидом), флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, Су-3, Су-5), электрохемилюминесцентные метки, радиоактивные метки, ферментные метки, УФ-метки, коллоидное золото, наночастицы и метки в виде молекул, образующих хелатные комплексы.

В дополнительном варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит не-нуклеозид, а предпочтительно гидрофильный линкер, такой как одиночное звено или повторяющийся этиленгликоль, например, триэтиленгликоль (ТЭГ), гексаэтиленгликоль (ГЭГ) или даже полиэтиленгликоль (ПЭГ), который может соединять нуклеиновую кислоту и модифицирующую группу.

Что касается детектирования CXCL8, то предпочтительными способами являются прямое связывание CXCL8, «сэндвич»-анализ на связывание, анализ на конкурентное связывание или метод с использованием устройства с латеральным потоком.

В одном варианте осуществления изобретения, CXCL8 детектируют посредством прямого связывания иммобилизованной нуклеиновой кислоты с CXCL8. Прямое связывание согласно изобретению представляет собой способ, в котором используют только нуклеиновую кислоту согласно изобретению, но не вторую молекулу, которая взаимодействует с CXCL8.

Одним из форматов «сэндвич»-анализа на связывание является образование иммобилизованного комплекса CXCL8 и молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащей модифицирующую группу для иммобилизации, где комплекс иммобилизуют на поверхности реакционного сосуда с диагностическим средством, на поверхности устройства, содержащегося в реакционном сосуде с диагностическим средством или на поверхности биосенсора с последующим детектированием, предпочтительно, указанного комплекса. В одном из вариантов осуществления изобретения, CXCL8 детектируют из комплекса. Соответствующее детектирующее средство, которое соответствует этому требованию, представляет собой, например, любое детектирующее средство, которое является специфичным для этой части/этих частей (эпитопов) CXCL8, не детектируемых молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и которое выбрано из группы, содержащей нуклеиновые кислоты, полипептиды, белки и антитела, получение которых известно специалистам в данной области. Методика проведения таких «сэндвич»-анализов на связывание известна специалистам в данной области.

В одном из вариантов может быть проведен «сэндвич»-анализ на связывание, в котором используется инвертированная геометрическая структура, где описанное выше детектирующее средство иммобилизуют на поверхности реакционного сосуда с диагностическим средством, на поверхности устройства, содержащегося в реакционном сосуде с диагностическим средством, или на поверхности биосенсора с образованием комплекса CXCL8 в образце, и с последующим детектированием этого комплекса молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В данном варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит метку или является немеченной. Детектирование немеченной молекулы нуклеиновой кислоты может включать использование второго детектирующего средства, которое предпочтительно также выбирают из группы, включающей нуклеиновые кислоты, полипептиды, белки и варианты, входящие в различные описанные здесь варианты. Такие детектирующме средства предпочтительно являются специфичными для нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

И наконец, в соответствии с настоящим изобретением, второе детектирующее средство детектируют с использованием третьего детектирующего средства, где предпочтительно третье детектирующее средство связано с ферментом, а более предпочтительно, обеспечивает ферментативную реакцию после детектирования второго детектирующего средства, или где третье детектирующее средство является средством для детектирования излучения, а более предпочтительно излучения, испускаемого радионуклидом. Предпочтительно, третье детектирующее средство позволяет специфически обнаруживать второе детектирующее средство и/или взаимодействовать со вторым детектирующим средством.

В дополнительном варианте осуществления изобретения, связывание молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению с CXCL8 детектируют в анализах на конкурентное связывание. В данном случае, иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, комплементарные частям молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению конкурируют за образование комплекса между нуклеиновой кислотой согласно изобретению и CXCL8, где в таком варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты не иммобилизуется на поверхности. Альтернативно, иммобилизованные CXCL8 конкурируют за образование комплекса между нуклеиновой кислотой согласно изобретению и CXCL8, где в таком варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты не иммобилизована на поверхности. В дополнительном варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению иммобилизована на поверхности, и связывание CXCL8 с иммобилизованной молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению конкурирует с олигонуклеотидными зондами, комплементарными частям молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Методика таких анализов известна специалистам в данной области.

Что касается детектирования CXCL8, то другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является применение молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению для получения биосенсора. Согласно определению, биосенсор представляет собой аналитическое устройство, используемое для детектирования аналита, такого как CXCL8, который объединяет биологический компонент, такой как нуклеиновая кислота согласно изобретению, с физико-химическим детектором. Преобразователь или детектирующий элемент, который преобразует один сигнал в другой, работает по физико-химическиму механизму, то есть, оптическому, пьезоэлектрическому, электрохимическому, электрохемилюминесцентному механизму и т.п., посредством взаимодействия CXCL8 с биологическим элементом. Биосенсор может содержать по меньшей мере один биологический элемент, ковалентно иммобилизованный на поверхности биосенсора. По меньшей мере один биологический элемент, ковалентно иммобилизованный на поверхности биосенсора, представляет собой нуклеиновую кислоту согласно изобретению, содержащую модифицирующую группу для иммобилизации, средство для специфического связывания с этим эпитопом/этими эпитопами CXCL8, которые не связаны с нуклеиновыми кислотами согласно изобретению; олигонуклеотидный зонд, комплементарный нуклеиновым кислотам согласно изобретению, или CXCL8. Если нуклеиновая кислота согласно изобретению не иммобилизирована на поверхности биосенсора, то нуклеиновая кислота согласно изобретению содержит модифицирующую группу, которая представляет собой метку, или не содержит модифицирующую группу.

Поверхность биосенсора или поверхность диагностического средства может быть выбрана из группы, состоящей из золота, серебра, титана, циркония, ванадия, хрома, марганца, кобальта, вольфрама, молибдена, платины, алюминия, железа, стали, меди, никеля, кремния, германия, фосфида индия, арсенида галлия и оксидов, нитридов или сплавов или смесей вышеупомянутых материалов, оксида индия-олова, стеклоуглерода, сапфира и силикатного или боратного стекла.

Эти поверхности могут быть дополнительно модифицированы полилизином; аминосиланом; эпоксисиланом; нитроцеллюлозой; карбоксидекстраном; углеродными наномембранами; оксидом графена; аминографеном; углеродной поверхностью, такой как черная сажа, углеродное волокно, углеродная пластина, углеродная ткань, активированный углерод, стекловидный углерод, уголь, активированный уголь, графитовый порошок, графитовое волокно, углеродная нанотрубка; фуллеренами; карбоксильными группами; азидными группами; тиоловыми группами; гидроксигруппами; эпоксидом; малеимидом; алкинами; стерическими алкинами или любой их комбинацией.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащую модифицирующую группу для иммобилизации, иммобилизуют на поверхности биосенсора для прямого детектирования CXCL8 или для детектирования CXCL8 в формате «сэндвич»-анализа или в формате анализа на конкурентное связывание. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, детектирующее средство, специфичное для этого эпитопа/этих эпитопов CXCL8, не детектируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению (описанной выше); олигонуклеотидный зонд, комплементарный нуклеиновым кислотам согласно изобретению или CXCL8, которые были иммобилизованы на поверхности биосенсора; и меченные или немеченные нуклеиновые кислоты согласно изобретению (описанные выше) используют для детектирования в формате «сэндвич»-анализа или в формате анализа на конкурентноое связывание.

Детектирующие системы в диагностических средствах и биосенсорах могут быть основаны, например, на оптическом считывании (флуоресценции, абсорбции и люминесценции), на изменении массы (например, микробаланса на основе кварцевых кристаллов и микроэлектромеханических систем), на показателе преломления (на основе поверхностного плазмонного резонанса, кругового резонатора, эллипсометрии), на заряде (на основе электрохимического сопротивления, вольтамперометрии, амперометрии, потенциометрии, проводимости или полевых транзисторах), на поверхностном натяжении (на основе консольных биосенсоров) и на атомно-силовой микроскопии.

В дополнительном варианте осуществления изобретения, молекулу нулеиновой кислоты согласно изобретению используют в «сэндвич»-анализах или в анализах на конкурентноое связывание с латеральным потоком. Методика таких анализов с латеральным потоком известна специалистам в данной области.

В дополнительном варианте осуществления изобретения, связывание молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению с CXCL8 детектируют в анализах на гомогенность с использованием нуклеиновокислотных зондов, комплементарных частям молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где в таком варианте осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты не иммобилизована на поверхности. В данном случае, гибридизация приводит к изменениям флуоресцентного сигнала двух флуорофорных групп, связанных с нуклеиновыми кислотами, а предпочтительно к изменению интенсивности, и такая гибридизация конкурирует за образование комплекса между нуклеиновой кислотой согласно изобретению и CXCL8. Две флуорофорных группы либо обе связаны с нуклеиновокислотным зондом (молекулярным маяком), либо одна из них связана с зондом, а другая связана с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В дополнительном варианте осуществления изобретения, одна или две флуорофорных группы связаны с нуклеиновой кислотой согласно изобретению, а образование комплекса с CXCL8 приводит к изменениям флуоресцентного сигнала, а предпочтительно к изменению интенсивности. Методика таких анализов известна специалистам в данной области.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть также использована в качестве исходного материала для разработки лекарственных средств. В основном, существуют два возможных подхода. Одним из таких подходов является скрининг библиотек соединений, где каждая библиотека соединений предпочтительно представляет собой библиотеку низкомолекулярных соединений. В одном варианте осуществления изобретения, скрининг представляет собой крупномасштабный скрининг. Предпочтительно, крупномасштабный скрининг представляет собой быструю, эффективную оценку проб и ошибок для соединений в анализе на основе мишени. В наилучшем случае, анализы проводят посредством колориметрической оценки. Библиотеки, используемые в таком скрининге, известны специалистам в данной области.

Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть использована для рациональной разработки лекарственных средств. Предпочтительно, рациональная разработка лекарственных средств представляет собой создание основной фармацевтической структуры. Исходя из трехмерной структуры мишени, которая обычно идентифицируется такими методами, как рентгеновская кристаллография или спектроскопия методом ядерного магнитного резонанса, для поиска в базах данных, содержащих структуры многих различных химических соединений, используют компьютерные программы. Отбор осуществляют на компьютере, и идентифицированные соединения впоследствии могут быть протестированы в лаборатории.

Рациональная разработка лекарственных средств может начинаться с любой молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и включает поиск структуры, предпочтительно трехмерной структуры, которая аналогична структуре нуклеиновых кислот согласно изобретению или идентична частям структуры нуклеиновой кислоты согласно изобретению, опосредующим связывание. В любом случае, такая структура все же будет демонстрировать такое же свойство связывания, как и нуклеиновая кислота согласно изобретению, или аналогичное свойство связывания. На следующей стадии или в качестве альтернативной стадии рациональной разработки лекарственных средств, предпочтительно, чтобы трехмерная структура этих частей нуклеиновой кислоты, связывающейся с нейромедиатором, была замаскирована химическими группами, которые отличаются от нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Посредством такой мимикрии может быть получено соединение, отличающееся от нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Такое соединение предпочтительно представляет собой небольшую молекулу или пептид.

В случае скрининга библиотек соединений, например, с помощью анализа на конкурентное связывание, известного специалисту в данной области, могут быть найдены соответствующие аналоги CXCL8, агонисты CXCL8 или антагонисты CXCL8. Такие анализы на конкурентное связывание могут быть проведены следующим образом. Нуклеиновую кислоту согласно изобретению, а предпочтительно оптический изомер, которая представляет собой мишень-связывающую L-нуклеиновую кислоту, присоединяют к твердой фазе. Для идентификации аналогов CXCL8, в анализ добавляют меченный CXCL8. Потенциальный аналог будет конкурировать с молекулами CXCL8 за связывание с оптическим изомером, что будет сопровождаться уменьшением сигнала, передаваемого соответствующей меткой. Скрининг на агонисты или антагонисты может включать применение анализа культуры клеток, известного специалистам в данной области.

Набор согласно изобретению может содержать по меньшей мере одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Кроме того, набор может содержать по меньшей мере один или несколько позитивных или негативных контролей. Позитивным контролем может быть, например, CXCL8, а в частности CXCL8, против которого проводят отбор нуклеиновой кислоты согласно изобретению или с которым она связывается предпочтительно в жидкой форме. Негативный контроль может представлять собой, например, пептид, который имеет биофизические свойства, аналогичные свойствам CXCL8, но который не распознается нуклеиновыми кислотами согласно изобретению. Кроме того, указанный набор может содержать один или несколько буферов. Различные ингредиенты могут содержаться в наборе в высушенной или в лиофилизованной форме, или они могут быть растворены в жидкости. Набор может содержать один или несколько контейнеров, которые, в свою очередь, могут содержать один или несколько ингредиентов набора. В дополнительном варианте осуществления изобретения, набор содержит инструкцию или вкладыш с инструкцией, которая предоставляет пользователю информацию о том, как использовать набор и его различные ингредиенты.

Фармацевтическое и биоаналитическое определение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой элементный анализ для оценки ее фармакокинетического и биодинамического профиля в различных физиологических жидкостях, тканях и органах организма человека и животного. Для этой цели может быть использован любой из способов детектирования, раскрытых в настоящей заявке или известных специалисту в данной области. В дополнительном аспекте настоящего изобретения используется «сэндвич»-анализ на гибридизацию для детектирования нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В детектирующем анализе используют зонд для захвата и зонд для детектирования. Зонд для захвата является комплементарным первой части, а зонд для детектирования комплементарен второй части нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Зонд для захвата и зонд для детектирования могут быть образованы ДНК-нуклеотидами, модифицированными ДНК-нуклеотидами, модифицированными РНК-нуклеотидами, РНК-нуклеотидами, LNA-нуклеотидами и/или PNA-нуклеотидами.

Таким образом, зонд для захвата содержит фрагмент последовательности, комплементарный 5'-концу молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, а зонд для детектирования содержит фрагмент последовательности, комплементарный 3'-концу молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В этом случае, зонд для захвата иммобилизуют на поверхности или матрице у своего 5'-конца, в результате чего, зонд для захвата может быть иммобилизован непосредственно у своего 5'-конца или посредством линкера, расположенного между его 5'-концом и поверхностью или матрицей. Однако, в принципе, линкер может быть связан с каждым нуклеотидом зонда для захвата. Линкер может быть образован гидрофильными линкерами, известными специалистам в данной области, или нуклеотидами D-ДНК, модифицированными нуклеотидами D-ДНК, нуклеотидами D-РНК, модифицированными нуклеотидами D-РНК, нуклеотидами D-LNA, нуклеотидами PNA, нуклеотидами L-РНК, нуклеотидами L-ДНК, модифицированными нуклеотидами L-РНК, модифицированными нуклеотидами L-ДНК и/или нуклеотидами L-LNA.

Альтернативно, зонд для захвата содержит фрагмент последовательности, комплементарный 3'-концу молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, а зонд для детектирования содержит фрагмент последовательности, комплементарный 5'-концу молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В этом случае, зонд для захвата иммобилизуют на поверхности или матрице у своего 3'-конца, в результате чего, зонд для захвата может быть иммобилизован непосредственно у своего 3'-конца или посредством линкера, расположенного между его 3'-концом и поверхностью или матрицей. Однако, в принципе, линкер может быть связан с каждым нуклеотидом фрагмента последовательности, который комплементарен нуклеиновой кислоте согласно изобретению. Линкер может быть образован гидрофильными линкерами, известными специалистам в данной области, или нуклеотидами D-ДНК, модифицированными нуклеотидами D-ДНК, нуклеотидами D-РНК, модифицированными нуклеотидами D-РНК, нуклеотидами D-LNA, нуклеотидами PNA, нуклеотидами L-РНК, нуклеотидами L-ДНК, модифицированными нуклеотидами L-РНК, модифицированными нуклеотидами L-ДНК и/или нуклеотидами L-LNA.

Количество нуклеотидов зонда для захвата и зонда для детектирования, которые могут гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, может быть вариабельным и может зависеть от числа нуклеотидов зонда для захвата и/или зонда для детектирования и/или самой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Общее число нуклеотидов зонда для захвата и зонда для детектирования, которые могут гибридизироваться с нуклеиновой кислотой согласно изобретению, должно представлять собой максимальное число нуклеотидов, которые состоят из нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Минимальное число нуклеотидов (от 2 до 10 нуклеотидов) зонда для детектирования и зонда для захвата должно обеспечивать гибридизацию с 5'-концом или 3'-концом, соответственно, нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Для обеспечения высокой специфичности и селективности между нуклеиновой кислотой согласно изобретению и другими нуклеиновыми кислотами, присутствующими в образцах, которые были проанализированы, общее число нуклеотидов зонда для захвата и зонда для детектирования должно представлять собой максимальное число нуклеотидов, которые состоят из молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Кроме того, зонд для детектирования предпочтительно несет маркерную молекулу или метку, которая может быть детектирована, как описано выше в настоящей заявке. Метка или маркерная молекула, в принципе, могут быть связаны с каждым нуклеотидом зонда для детектирования. Предпочтительно, метка или маркер расположены на 5'-конце или 3'-конце зонда для детектирования, посредством чего между нуклеотидами внутри зонда для детектирования, которые являются комплементарными молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и меткой может быть встроен линкер. Линкер может быть образован гидрофильными линкерами, известными специалистам в данной области, или нуклеотидами D-ДНК, модифицированными нуклеотидами D-ДНК, нуклеотидами D-РНК, модифицированными нуклеотидами D-РНК, нуклеотидами D-LNA, нуклеотидами PNA, нуклеотидами L-РНК, нуклеотидами L-ДНК, модифицированными Нуклеотидами L-РНК, модифицированными нуклеотидами L-ДНК и/или нуклеотидами L-LNA.

Детектирование нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть осуществлено следующим образом.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению гибридизуется у одного из своих концов с зондом для захвата, а у другого конца с зондом для детектирования. После этого, несвязанный зонд для детектирования удаляют, например, путем проведения одной или нескольких стадий промывки. Количество связанного зонда для детектирования, который предпочтительно несет метку или маркерную молекулу, может быть впоследствии оценено, например, как более подробно описано в заявке WO/2008/052774, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.

Предпочтительно используемый здесь термин «лечение» включает, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, дополнительно или альтернативно, профилактику и/или наблюдение.

Предпочтительно используемые здесь термины «заболевание» и «расстройство» являются синонимами, если это не оговорено особо.

Используемый здесь термин «включает» предпочтительно не рассматривается как ограничение предмета изобретения, за которым следует такой термин, или который описан с помощью такого термина. Однако, в альтернативном варианте осуществления изобретения, термин «включает» следует понимать как «содержит» и, таким образом, он рассматривается как ограничение предмета изобретения, за которым следует, или который описан с помощью такого термина.

Различные последовательности SEQ ID NO:, химическая природа молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению и молекулы-мишени CXCL8, используемые в настоящей заявке, их фактическая последовательность и внутренний эталонный стандарт систематизированы в нижеследующей таблице.

Таблица 1

SEQ. ID. NO: Название Последовательность (N-конец → C-конец) 1 D-аминокислоты D-CXCL8
(C-био)(также называемый здесь «биотинилированным D-CXCL8») AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCAN
TEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS-биотин 2 L- аминокислоты CXCL8, также называемый «L-CXCL8») AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHC
ANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS 3 D-РНК 315-H9-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCGGUCAGC 4 D-РНК 315-F11-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCGGUGAGC 5 D-РНК 315-F8-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAGC 6 D-РНК 315-F8-002 CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG 7 D-РНК 315-F8-003 UGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCA 8 D-РНК 315-F8-004 GACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUC 9 D-РНК 315-F8-005 GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC 10 D-РНК 315-F8-006 GGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCC 11 D-РНК 315-F8-007 GCACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUGC 12 D-РНК 315-F8-008 GGUCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGACC 13 D-РНК 315-F8-009 UGGCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGCCA 14 L-РНК 315-H9-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCGGUCAGC 15 L-РНК 315-F11-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCGGUGAGC 16 L-РНК 315-F8-001 GCUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAGC 17 L-РНК 315-F8-002 CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG 18 L-РНК 315-F8-003 UGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCA 19 L-РНК 315-F8-004 GACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUC 20 L-РНК 315-F8-005 GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC 21 L-РНК 315-F8-006 GGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCC 22 L-РНК 315-F8-007 GCACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUGC 23 L-РНК 315-F8-008 GGUCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGACC 24 L-РНК 315-F8-009 UGGCGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGCCA 25 L-РНК 315-F8-002-ПЭГ, 315-F8-002-5'-ПЭГ ПЭГ-линкер-CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG; линкер=аминогексил 26 L-РНК 315-F8-002-амино, 315-F8-002-5'-амино NH2-линкер-CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG; 27 GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG
где X_U представляет собой U или отсутствует 28 GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 29 GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 30 GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 31 Обратный 315-F8-002-амино NH2-линкер-GACUGGCCCUGUGUGAAAGCCGAAAGGUGCAUGAAGGCAGUC 32 L-аминокислоты CXCL1 ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQ
TEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN 33 L-аминокислоты CXCL2 APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTE
VIATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN 34 L-аминокислоты CXCL3 ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTE
VIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN 35 L-аминокислоты CXCL5 AGPAAAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCS
KVEVVASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN 36 L-аминокислоты CXCL6 GPVSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSK
VEVVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN 37 L-аминокислоты CXCL7 SSTKGQTKRNLAKGKEESLDSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEV
IGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD 38 L-аминокислоты CCL5 SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS 39 L-РНК 315-F8-002-3'-ПЭГ CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG-линкер-ПЭГ; линкер=аминогексил 40 L-РНК 315-F8-002-3'-амино CUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAG-линкер-амино; линкер=аминогексил 41 L-РНК 315-F8-005-5'- ПЭГ ПЭГ-линкер-GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC;
линкер=аминогексил 42 L-РНК 315-F8-005-5'- амино NH2-линкер-GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC;
линкер=аминогексил 43 L-РНК 315-F8-005-3'- ПЭГ GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC-линкер-ПЭГ; линкер=аминогексил 44 L-РНК 315-F8-005-3-амино GUGACGGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCGGUCAC- линкер-амино; линкер=аминогексил 45 D-РНК 8A-35
(Sung, Biomaterials 2014) 5'-GGGGGCUUAUCAUUCCAUUUAGUGUUAUGAUAACC-3'
C=2-фтор-C; U=2'-фтор-U ПЭГ=Полиэтиленгликоль 40 кД в Y-форме

Признаки настоящего изобретения, раскрытые в описании, в формуле изобретения, в списке последовательностей и/или на чертежах, могут как по отдельности, так и в любой их комбинации служить материалом для осуществления изобретения в различных формах.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано на чертежах, в примерах и в списке последовательностей, из которых могут быть выявлены дополнительные признаки, варианты и преимущества, где:

На фиг. 1 показано выравнивание последовательностей молекул нуклеиновой кислоты, способных связываться с человеческим CXCL8, включая величину K_D, определенную с помощью анализа на конкурентное ингибирующее связывание;

На фиг. 2 показаны усеченные производные молекулы нуклеиновой кислоты 315-F8-001, включая величину K_D, и относительную активность связывания с человеческим CXCL8, как было определено с помощью анализа на конкурентное ингибирующее связывание и/или путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса;

На фиг. 3 показана кинетическая оценка, проведенная с помощью анализа на конкурентное ингибирующее связывание молекул D-нуклеиновой кислоты 315-F8-001 и 315-F8-002 с D-CXCL8;

На фиг. 4 показано связывание молекулы нуклеиновой кислоты 315-F8-002 с CXCL8 при (А) 25°С и (В) 37°C, как было определено путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса. Была получена константа ассоциации ka и константа диссоциации kd;

На фиг. 5 показано связывание молекулы нуклеиновой кислоты 315-F8-002-ПЭГ с CXCL8 при (А) 25°С и (В) 37°C, как было определено путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса. Была получена константа ассоциации ka и константа диссоциации kd;

На фиг. 6 показана селективность связывания 315-F8-002 с CXCL8, определенная с помощью анализов на конкурентное связывание путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса;

На фиг. 7 показано ингибирование CXCL8-индуцированного хемотаксиса CXCR2-экспрессирующих клеток молекулой нуклеиновой кислоты 315-F8-002-ПЭГ;

На фиг. 8 представлена гистограмма, иллюстрирующая количественную оценку CXCL8 с использованием молекулы нуклеиновой кислоты 315-F8-002 (Фиг. 8A) и количественную оценку CCL5 с использованием молекулы нуклеиновой кислоты 315-F8-002 (фиг. 8B); и

На фиг. 9 представлена гистограмма, иллюстрирующая связывание L-аптамера 315-F8-002 (фиг. 9A) и аптамера 8A-35 (фиг. 9B) с растворимыми CXCL8 и CXCL1 в различных концентрациях.

Пример 1. Нуклеиновые кислоты, способные связываться с человеческим CXCL8

Было идентифицировано несколько нуклеиновых кислот, связывающихся с CXCL8, и их производных, нуклеотидные последовательности которых показаны на фиг. 1-2. Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8, тестировали как D-аптамеры (D-нуклеиновые кислоты) и L-аптамеры (L-нуклеиновые кислоты), в результате чего были синтезированы D-нуклеиновые кислоты и L-нуклеиновые кислоты как описано в Примере 2.

Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8, были охарактеризованы:

a) как D-аптамеры с помощью анализов на ингибирующее связывание с биотинилированным D-CXCL8 (SEQ ID NO: 1), как показано в Примере 3; и

b) как L-аптамеры путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (Пример 4) и с помощью анализа in vitro с использованием клеток, экспрессирующимх человеческий рецептор CXCR2, и в обоих этих способах использовали L-CXCL8 (SEQ ID NO: 2) (Пример 5).

Полученные таким образом нуклеиновые кислоты имеют несколько различающихся последовательностей, причем, такие последовательности могут быть систематизированы или сгруппированы в виде семейства последовательностей.

Для определения мотивов нуклеотидных последовательностей используются аббревиатуры IUPAC для неоднозначных нуклеотидов:

S сильный G или C W слабый A или U(T) R пурин G или A Y пиримидин С или U (Т) K кето G или U (T) M имино A или C B не A C или U (T) или G D не C A или G или U (T) H не G A или C или U (T) V не U A или C или G N все A или G или C или U (T)

Если это не оговорено особо, то любая последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность фрагментов, соответственно, указаны в направлении 5'→3'.

Как показано на фигурах 1-2, нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8, содержат одие центральный нуклеотидный фрагмент, определяющий потенциальный CXCL8-связывающий мотив, где на фигуре 1 показаны различные последовательности из семейства последовательностей, а на фигуре 2 показаны усеченные производные CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-001, включая CXCL8-связывающую нуклеиновую кислоту 315-F8-002-ПЭГ.

В общих чертах, молекулы нуклеиновой кислоты, связывающиеся с CXCL8, содержат у 5'-конца и 3'-конца концевые нуклеотидные фрагменты: первый концевой нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент. Первый концевой нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент могут гибридизоваться друг с другом, и после такой гибридизации образуется двухцепочечная структура. Однако, такая гибридизация не обязательно наблюдается в молекуле in vivo и in vitro.

Три нуклеотидных фрагмента молекул нуклеиновой кислоты, связывающихся с CXCCL8, а именно, первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент расположены по отношению друг к другу в направлении 5' → 3': первый концевой нуклеотидный фрагмент - центральный нуклеотидный фрагмент - второй концевой нуклеотидный фрагмент. Однако, альтернативно, первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент расположены по отношению друг к другу в направлении 5' → 3': второй концевой нуклеотидный фрагмент - центральный нуклеотидный фрагмент - первый концевой нуклеотидный фрагмент.

Последовательности определенных фрагментов могут различаться между CXCL8-связывающимися молекулами нуклеиновых кислот, что влияет на аффинность связывания с CXCL8. Исходя из анализа на связывание различных молекул нуклеиновой кислоты, связывающихся с CXCL8, было обнаружено, что центральный нуклеотидный фрагмент и их нуклеотидные последовательности, описанные ниже, отдельно, а более предпочтительно, по всей своей длине играют важную роль в связывании с CXCL8.

Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8, состоят из рибонуклеотидов (как показано на фигурах 1-2).

Как показано на фигуре 1, последовательности центрального нуклеотидного фрагмента CXCCL8-связывающихся нуклеиновых кислот 315-H9-001, 315-F11-001 и 315-F8-001 немного отличаются друг от друга:

5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3' (315-H9-001),

5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3' (315-F11-001),

5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' (315-F8-001).

Центральные нуклеотидные фрагменты CXCL8-связывающихся нуклеиновых кислот согласно изобретению содержат 32-33 нуклеотида и могут быть систематизированы в консенсусной последовательности: 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(X_U)RAGUGUGUCCCG 3', где X_U представляет собой U или отсутствует.

Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8 с наилучшей аффинностью связывания с CXCL8, то есть, CXCL8-связывающие нуклеиновые кислоты с самым высокой аффинностью связывания с CXCL8 или с самой низкой константой диссоциации Kd для CXCL8, содержат центральные нуклеотидные фрагменты с последовательностями 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' (315-F8-001) и 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3' (315-H9-001), где центральные нуклеотидные фрагменты с последовательностью 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3' (315-F8-001) сообщают наилучшую аффинность связывания CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты с CXCL8.

Как показано на фигурах 1 и 2, первый концевой нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент CXCL8-связывающих нуклеиновых кислот содержат шесть нуклеотидов, пять нуклеотидов, четыре нуклеотида или три нуклеотида, в результате чего, эти фрагменты необязательно гибридизуются друг с другом, и после такой гибридизации образуется двухцепочечная структура. Эта двухцепочечная структура может состоять из шести, пяти, четырех или трех пар оснований. Однако, такая гибридизация необязательно наблюдается в данной молекуле.

Как показано на фигуре 1, первый и второй нуклеотидные фрагменты CXCL8-связывающих нуклеиновых кислот 315-H9-001, 315-F11-001 И 315-F8-001 содержат шесть нуклеотидов, соответственно:

a) CXCL8-связывающие нуклеиновые кислоты 315-H9-001 и 315-F8-001 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GCUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAGC 3';

b) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F11-001 -первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GCUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUGAGC 3'.

Как показано на фигуре 2, первый и второй нуклеотидные фрагменты CXCL8-связывающих нуклеиновых кислот содержат пять, четыре или три нуклеотида, соответственно:

a) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-002 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'CUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAG 3';

b) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-005 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAC 3';

c) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-003 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-UGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCA 3';

d) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-006 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCC 3';

e) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-007 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GCAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUGC 3';

f) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-008 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GGUC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GACC 3';

g) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-009 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'UTGGC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GCCA 3';

h) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-004 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUC-3'.

Первый концевой нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент всех протестированных CXCL8-связывающих молекул нуклеиновой кислоты могут быть систематизированы в следующей общей формуле для первого концевого нуклеотидного фрагмента и второго концевого нуклеотидного фрагмента:

общая формула для первого концевого нуклеотидного фрагмента представляет собой 5'-Z₁Z₂Z₃Z₄Z₅C-3', а общая формула для второго концевого нуклеотидного фрагмента представляет собой 5'-GZ₆Z₇Z₈Z₉Z₁₀-3', где Z₁ представляет собой G или отсутствует, Z₂ представляет собой S или отсутствует; Z₃ представляет собой K или отсутствует, Z₄ представляет собой S;, Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M или отсутствует; Z₉ представляет собой S или отсутствует, а Z₁₀ представляет собой C или отсутствует;

где в первом предпочтительном варианте осуществления изобретения:

q) Z₁ представляет собой G, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

r) Z₁ отсутствует, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

s) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

t) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ отсутствует, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ отсутствует, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

u) Z₁ отсутствует, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

v) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

w) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ отсутствует, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ представляет собой C; или

x) Z₁ представляет собой G, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

y) Z₁ представляет собой G, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

z) Z₁ представляет собой G, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ отсутствует, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

aa) Z₁ отсутствует, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

bb) Z₁ отсутствует, Z₂ представляет собой S, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ отсутствует, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

cc) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

dd) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ отсутствует, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ представляет собой S, и Z₁₀ отсутствует; или

ee) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ представляет собой K, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ отсутствует, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует; или

ff) Z₁ отсутствует, Z₂ отсутствует, Z₃ отсутствует, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D, Z₆ представляет собой H, Z₇ представляет собой S, Z₈ представляет собой M, Z₉ отсутствует, и Z₁₀ отсутствует.

Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с CXCL8 с наилучшей аффинностью связывания с CXCL8, то есть, CXCL8-связывающие нуклеиновые кислоты с самой высокой аффинностью связывания с CXCL8 или с самой низкой константой диссоциации Kd для CXCL8, включают нижеследующие первый и второй концевые нуклеотидные фрагменты:

a) CXCL8-связывающие нуклеиновые кислоты 315-H9-001 и 315-F8-001 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAGC-3';

b) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-002 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'CUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAG 3';

c) CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-005 - первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUGAC 3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'GUCAC 3'.

Величины Kd для CXCL8-связывающих нуклеиновых кислот 315-F8-001, 315-H9-001 и 315-F11-001 (содержащих концевые фрагменты с шестью нуклеотидами) измеряли в диапазоне 1,5-12,5 нМ, как было определено в анализе на конкурентное ингибирующее связывание (фигуры 1-3). В прямом анализе на ингибирование, CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-001 имела величину Kd 0,8 нМ. При измерении методом поверхностного плазмонного резонанса, который является более чувствительным методом определения величин Kd, величина Kd для CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-001 составляла 0,22 нМ при 25°С и 0,68 нМ при 37°C (Фигура 2).

Неожиданно было обнаружено, что усечение первого концевого фрагмента от шести до пяти нуклеотидов и усечение второго концевого фрагмента от шести до пяти нуклеотидов не оказывало негативного влияния на аффинность связывания с CXCL8. Аффинность связывания CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002, измеренная с помощью анализа на конкурентное ингибирование (Kd 1,1 нМ; фигуры 2 и 3), и путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (Kd 0,22 нМ при 25°С и 0,75 нМ при 37°C; фигуры 2 и 4), составляет в пределах аффинностей связывания, определенных для CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-001 (см. выше величины Kd для 315-F8-001).

Попытки дальнейшего усечения и/или мутации концевых фрагментов CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 привели к получению CXCL8-связывающих нуклеиновых кислот 315-F8-003, 315-F8-004, 315-F8-005, 315-F8-006, 315-F8-007, 315-F8-008 и 315-F8-009 с более низкими (315-F8-003, 315-F8-004, 315-F8-006, 315-F8-007, 315-F8-008 и 315-F8-009, 315-F8-007, 315-F8-008 и 315-F8-009) или аналогичныыми (315-F8-005) аффинностями связывания с CXCL8 (фигура 2).

Для 5'-ПЭГированного варианта CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 размером 40 кДа, а именно, CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002-ПЭГ (также называемой AON-S08), Kd 0,2 нМ при 25°С и 0,8 нМ при 37°C была определена путем измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (фигуры 2 и 5).

CXCL8 является одним из нескольких ELR-позитивных человеческих хемокинов CXC. Кроме CXCL8, ELR-позитивные человеческие хемокины CXC: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 связываются с CXCL8-рецептором CXCR2, где ELR-позитивные человеческие хемокины CXC: CXCL6 и CXCL7 также связываются с CXCL8-рецептором CXCR1. Для подтверждения специфичности и селективности связывающих свойств CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002, аффинность связывания CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 с ELR-позитивными человеческими хемокинами CXC: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 тестировали с помощью ППР в анализе на конкурентное связывание (Пример 4). CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-002 не связывалась с любыми другими ELR-позитивными человеческими хемокинами CXC: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 (фигура 6).

CXCL8-связывающая нуклеиновая кислота 315-F8-002-ПЭГ ингибировала CXCL8-индуцируемый хемотаксис CXCR2-экспрессирующих клеток BA/F3 со средней константой ингибирования IC₅₀, равной 0,26 нМ (фигура 7, Пример 5).

Биосенсор с иммобилизованной CXCL8-связывающей нуклеиновой кислотой 315-F8-002 использовали для детектирования и количественного определения CXCL8. Предел детектирования (средняя базовая величина+3× стандартное отклонение от базовых величин) составлял <98 пМ для CXCL8, а нижний предел количественной оценки (средняя базовая величина+10× стандартное отклонение от базовых величин) также составлял <98 пМ для CXCL8 (Фигура 8А, Пример 6). Для того чтобы продемонстрировать специфичность иммобилизованной CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002, в качестве аналита использовали другой хемокин (ССL5). Связывание ССL5 не измеряли при концентрациях до 12,5 нМ (Фигура 8В, Пример 6).

Пример 2: Синтез D-и L-аптамеров

Твердофазный синтез в лабораторном масштабе

D-аптамеры (D-нуклеиновые кислоты) и L-аптамеры (L-нуклеиновые кислоты) получали посредством твердофазного синтеза с использованием синтезатора ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) путем проведения химической реакции присоединения 2'TBDMS-РНК-фосфорамидита (Damha и Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-, D-rA(N-Bz)-, D-rC(Ac)-, D-rG(N-ibu)-, D-rU-фосфорамидиты были закуплены у ChemGenes, Wilmington, MA. D- и L-аптамеры очищали с помощью гель-электрофореза.

Крупномасштабный твердофазный синтез

D-аптамеры получали посредством твердофазного синтеза с использованием синтезатора AktaPilotlOO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) путем проведения химической реакции присоединения 2'TBDMS-РНК и ДНК-фосфорамидита (Damha и Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu) и L-rU- были закуплены у ChemGenes, Wilmington, MA. 5'-аминомодификатор был закуплен у American International Chemicals Inc (Framingham, MA, USA). Синтез немодифицированного или 5'-амино-модифицированного L-аптамера начинали с L-рибоА, L-рибоC, L-рибоG или L-рибоU, модифицированного CPG с размером пор 1000A (Link Technology, Glasgow, UK). Для связывания РНК-фосфорамидитов (15 минут на цикл) использовали 0,3М бензилтиотетразол (CMS-Chemicals, Abingdon, UK) в ацетонитриле и 2 эквивалента соответствующего 0,2 M раствора фосфорамидита в ацетонитриле. Был проведен цикл реакций окисления-кэпирования. Для синтеза олигонуклеотидов использовали следующие стандартные растворители и реагенты, закупленные у Biosolve (Valkenswaard, NL). L-аптамер представлял собой синтезированный DMT-ON; и после снятия защиты, его очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (Wincott et al. 1995) с использованием среды Sourcel5RPC (Amersham). 5'-DMT-группу удаляли 80% уксусной кислотой (30 минут при комнатной температуре). В случае 5'-амино-модифицированных L-аптамеров, 5'-ММТ-группу удаляли 80% уксусной кислотой (90 минут при комнатной температуре). Затем добавляли водный 2М раствор NaOAc и L-аптамер обессоливали путем фильтрации в тангенциальном потоке с использованием 5К-регенерированной целлюлозной мембраны (Millipore, Bedford, MA).

ПЭГилирование L-аптамеров

Для увеличения времени пребывания L-аптамера в плазме in vivo, L-аптамер ковалентно связывали с фрагментом полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40 кДа (ПЭГ) у 5'- конца. Для ПЭГилирования (технические детали способа ПЭГилирования можно найти в Европейской патентной заявке EP1306382), очищенный 5'-амино-модифицированный L-аптамер растворяли в смеси H₂О (2,5 мл), ДМФ (5 мл) и буфера А (5 мл, полученного путем смешивания лимонной кислоты × H₂О [7 г], борной кислоты [3,54 г], фосфорной кислоты [2,26 мл] и 1 М NaOH [343 мл] и добавления воды до конечного объема 1 л; рН=8,4 корректировали путем добавления 1 М HСl).

рН раствора L-аптамера доводили до 8,4 с помощью 1М NaOH. Затем добавляли 40 кДа-ПЭГ-NHS-эфир (Jenkem Technology, Allen, TX, США) при 37°C через каждые 30 минут шестью частями по 0,25 эквивалента до достижения максимального выхода 75-85%. рН реакционной смеси поддерживали на уровне 8-8,5 с помощью 1М NaOH во время добавления ПЭГ-NHS-эфира.

Реакционную смесь смешивали с 4 мл раствора мочевины (8 М) и 4 мл буфера В (0,1 М ацетата триэтиламмония в H₂О) и нагревали до 95°С в течение 15 минут. Затем ПЭГилированный L-аптамер очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ в среде Source 15 RPC (Amersham), в градиенте ацетонитрила (буфер В; буфер С: 0,1М ацетат триэтиламмония в ацетонитриле). Избыток ПЭГ элюировали при 5% буфера С, а ПЭГилированный L-аптамер элюировали при 10-15% буфера С. Фракции продукта с чистотой >95% (как было определено с помощью ВЭЖХ) объединяли и смешивали с 40 мл 3М NaOAc. ПЭГилированный L-аптамер обессоливали путем фильтрации в тангенциальном потоке (с использованием 5К-регенерированной целлюлозной мембраны, Millipore, Bedford, MA).

Пример 3: Анализы на ингибирующее связывание

Прямой анализ на ингибирование для определения констант связывания D-аптамеров

Для определения аффинности связывания D-аптамеров с D-CXCL8(C-bio) (SEQ ID NO: 1) проводили прямые анализы на ингибирование (SEQ ID NO: 1). Для этой цели, D-аптамеры радиоактивно метили полинуклеотидкиназой Т4 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) с использованием [γ-³²P]-ATФ (Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany). Удельная радиоактивность меченных D-аптамеров составляла 110000-300000 импульсов в минуту/пмоль. Меченые D-аптамеры инкубировали при концентрации 0,2 нМ в буфере для отбора (20 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KСl, 1 мМ MgСl₂, 1 мМ CaCl₂, 0,1% Твин 20, 100 мкг/мл незаменимых жирных кислот без альбумина бычьей сыворотки, 200 мг/мл дрожжевой РНК) вместе с различными количествами D-CXCL8(C-bio) в диапазоне от 0,0192 до 300 нМ в течение 1,5-2 часов при 37°C. Комплексы D-CXCL8(C-bio)/D-аптамер иммобилизовали на сферах с NAag⁺ (на агарозе с нейтравидином плюс от Pierce Biotechnology, Rockford, USA), предварительно уравновешенных в буфере для отбора. После удаления супернатанта и соответствующей промывки измеряли связанную со сферами радиоактивность в сцинтилляционном счетчике (LS6500; Beckman Coulter, Fullton, USA). Количество иммобилизованного меченного D-аптамера (% от исходного количества) откладывали на графике зависимости от концентрации D-CXCL8(C-Bio), и константы диссоциации Kd получали с использованием программных алгоритмов (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey UK) с предполагаемой стехиометрией 1:1.

Для CXCL8-связывающих аптамеров 315-H9-001 И 315-F8-001, величины Kd 1,7 нМ и 0,8 нМ определяли с помощью прямого анализа на ингибирование, соответственно.

Анализ на конкурентное ингибирование для ранжирования и определения констант связывания D-аптамеров.

Анализы на конкурентное ингибирование проводили для сравнения аффинностей различных D-CXCL8(C-bio)-связывающих D-аптамеров. Для этой цели, эталонный D-аптамер радиоактивно метили (как описано выше) и инкубировали при 37°C с D-CXCL8(C-bio) в буфере для отбора в условиях, которые способствуют передаче ненасыщенного сигнала связывания после иммобилизации на NAag⁺ и промывки (например, 3 нМ D-CXCL8(C-Bio), 0,15 нМ меченного D-аптамера). Добавление избытка немеченного D-аптамера, конкурирующего с меченым D-аптамером за связывание с D-CXCL8(C-Bio), приводит к уменьшению количества связанной со сферами радиоактивности после иммобилизации и промывки. Степень снижения сигнала зависит от количества и аффинности немеченного D-аптамера. Анализы на конкурентное ингибирование проводили в экспериментах по ранжированию и для определения констант диссоциации (Kd) выбранных D-аптамеров. Константы диссоциации Kd определяли путем построения графика зависимости части (в %) меченного D-аптамера, связанного с D-CXCL8(C-bio), от концентрации немеченного конкурирующего D-аптамера. Анализы данных проводили с использованием GRAFIT.

Результаты анализов на ингибирующее связывание представлены в Примере 1 и показаны на фиг. 1, 2 и 3, где в качестве меченного D-аптамера использовали CXCL8-связывающую нуклеиновую кислоту 315-F8-001.

Пример 4: Анализы на связывание методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР)

Измерения методом поверхностного плазмонного резонанса проводили на приборе Biacore 2000 (GE Healthcare), установленном на постоянную температуру 25°С или 37°C. Белки иммобилизовали на сенсорных чипах CM4 (GE Healthcare) посредством реакции присоединения амина. Поверхность сенсорного чипа активировали путем впрыска смеси 1:1 0,4М EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида; GE) и 0,1M NHS (N-гидроксисукцинимида; GE). Максимальный наблюдаемый отклик для ковалентно иммобилизованного пептида или белка составлял приблизительно 500 RU. Проточные кюветы блокировали 1М гидрохлоридом этаноламина (GE, BR-1000-50). Нековалентно связанный пептид или белок также удаляли с помощью такой процедуры. Проточную кювету с поверхностью, не обработанной декстраном, и проточную кювету с поверхностью, блокированной этаноламином, использовали в качестве контроля. Перед измерением, сенсорный чип дважды обрабатывали дегазированным физиологическим рабочим буфером (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KСl, 1 мМ MgСl₂ и 1 мМ СaCl₂) и проводили по меньшей мере три цикла впрыска и регенерации (5М NaCl).

Аффинности связывания L-аптамеров измеряли путем впрыска серий концентраций 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95, 0,98, 0,49, 0,24, 0,12, 0,06 нМ и регистрации фазы ассоциации и диссоциации событий связывания. Полученные кривые связывания строили в соответствии с Лангмюровской моделью стехиометрического связывания 1:1 для определения констант кинетики связывания (константы ассоциации ka; константы диссоциации kd), которые используют для вычисления константы диссоциации (Kd=kd/ka). Анализ данных проводили с использованием компьютерной программы BIAevaleation 3.1.1 (BIACORE AB, Uppsala, Sweden) с постоянным показателем преломления (RI) и начальным коэффициентом переноса массы Kt, равным 1 × 10⁷ (RU × M^-1s^-1).

Селективность связывания L-аптамера оценивали с помощью анализов на конкурентное связывание. Для этой цели, человеческие хемокины CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 и CXCL8 (закупленные у RnD Systems, PeproTech или ProSpecTech) отдельно впрыскивали при 40 нМ вместе с L-аптамером CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 (0,25 нМ) для оценки конкурентного связывания L-аптамера с иммобилизованным CXCL8. В качестве контроля, хемокины впрыскивали в отсутствии L-аптамера для мониторинга связывания с декстрановой матрицей сенсорного чмпа и/или с иммобилизованным CXCL8. Связывание 315-F8-002 с иммобилизованным CXCL8 регистрировали в предварительно определенный момент времени через 240 секунд после окончания впрыска. Выбранные хемокины иммобилизовали, и аффинности связывания L-аптамера CXCCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 определяли как описано выше.

Результаты анализов на связывание методом ППР указаны в Примере 1 и показаны на Фигурах 2, 4, 5 и 6.

Пример 5: Фармакология in vitro - Анализ на хемотаксис

Мышиная про-В-клеточная линия BA/F3 была стабильно трансфецирована с использованием плазмиды, кодирующей человеческий CXCR2. Для анализов на хемотаксис, рекомбинантный CXCL8 (0,5 нМ) предварительно инкубировали с L-аптамером CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002-ПЭГ в указанных концентрациях в буфере HBH (сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) + 1 мг/мл BSA+20 мМ HEPES) в нижних отделениях 96-луночного планшета Сorning Transwell с 5 мкм-порами (Costar Corning, NY) при 37°C в течение 20-30 минут. CXCR2⁺-клетки в буфере HBH добавляли в верхние отделения, и эти клетки могли мигрировать при 37°C в течение 3 часов. После удаления верхних отделений, в нижние отделения добавляли 50 мкМ ресазурина (Sigma-Aldrich) в PBS и инкубировали при 37°C в течение 2,5 часа. Флуоресценцию измеряли на 590 нм (длина волны возбуждения 544 нм). Скорректированные по фону и нормализованные значения флуоресценции наносили на график зависимости от концентрации L-аптамера. Величины констант ингибирования IC₅₀ (концентрации L-аптамера, требуемые для полумаксимального ингибирования) определяли по уравнению нелинейной регрессии (4-параметрическая подгонка) с использованием компьютерной программы Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Результаты анализов на хемотаксис приводятся в Примере 1 и показаны на фигуре 7.

Пример 6: Биосенсор CXCL8

Были приготовлены ППР-сенсорные чипы, покрытые карбо-наномембраной, терминированной азидом, и CXCL8-связывающий L-аптамер 315-F8-002-DBCO (DBCO-модифицированный вариант 315-F8-002-амино) был иммобилизован из 20 мкМ раствора в 2М NaCl на проточной кювете коммерчески доступной системы Biacore (приблизительно до 1000 RU). В качестве эталона, нефункциональный L-аптамер (DBCO-модифицированный обратный 315-F8-002-амино) иммобилизовали до аналогичного количества на другой проточной кювете. Поверхности пассировали путем иммобилизации DBCO-модифицированного метокси-терминированного полиэтиленгликоля с прямой цепью (Молекулярная масса: 5 кДа). Введение серии концентраций аналита CXCL8, который был введен путем впрыска в стандартный буфер для образцов (универсальная транспортная среда от Copan) с добавлением 0,1% (масс./об.) Твина 20, давало дозозависимое увеличение сигнала. Температура в процессе измерения составляла 25°С, скорость потока составляла 30 мкл/мин, а рабочий буфер представлял собой буфер для измерения (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KСl, 1 мМ MgСl₂ 1 мМ СaСl₂, 0,1% (масс./об.) Твин 20). Аналит оставляли для ассоциации на 10 минут, а затем на 2,5 мин. для диссоциации в буфере для измерения. Сигнал по окончании фазы диссоциации вычисляли путем вычитания сигнала, полученного на эталонной проточной кювете.

Результаты для биосенсора CXCL8 приводятся в Примере 1 и показаны на Фигуре 8.

Пример 7: ППР-анализ на связывание для сравнения связывания с растворимыми хемокинами

Ингибирующая активность аптамера зависит от его способности связываться с мишенью в растворе. В данном случае, ППР-анализ на конкурентное связывание проводили для определения связывания L-аптамера CXCL8-связывающей нуклеиновой кислоты 315-F8-002 согласно изобретению и связывания ранее опубликованного аптамера 8A-35 (Sung, Biomaterials 2014) с растворимыми CXCL8 и CXCL1. Для этой цели, ППР-измерения проводили, как описано в Примере 4, с использованием CXCL8, иммобилизованного на Cl-сенсорном чипе (GE Healthcare) путем проведения реакции присоединения амина. Связывание 315-F8-002 (3 нМ) или 8A-35 (1,6 нМ) с иммобилизованным CXCL8 приводило к реакции связывания приблизительно 20 единиц отклика. В анализах на связывание 8A-35, сенсорные чипы регенерировали с использованием 1M раствора CaСl₂. Для оценки связывания обоих аптамеров с их мишенью в растворе, растворимый CXCL8 одновременно впрыскивали в эквимолярной концентрации (в отношении 1:1) или в 5-кратном избытке (в отношении 1:5) для анализа на конкурентное связывание аптамера с иммобилизованным CXCL8. Связывание растворимого CXCL1 использовали в качестве контроля. Все измерения проводили при 37°C. Ответы на связывание с иммобилизованным CXCL8 регистрировали через 240 сек. после впрыска.

Связывание 315-F8-002 с иммобилизованным CXCL8 полностью блокировалось (>90%) эквимолярной концентрацией растворимого CXCL8 (фигура 9А). И наоборот, связывание 8А-35 лишь частично блокировалось растворимым CXCL8 в эквимолярной концентрации (прибл. 30%) и в 5-кратном избытке (прибл. 45%) (фигура 9В). Это указывает на то, что 315-F8-002 обладает более высокой аффинностью связывания с растворимым CXCL8 по сравнению с 8A-35. Пониженная аффинность связывания с растворимым CXCL8 (по сравнению с CXCL8, иммобилизованным на поверхности) может служить объяснением плохой ингибирующей активности 8А-358, наблюдаемой в анализе на миграцию нейтрофилов, индуцированную CXCL8 (Sung, Biomaterials 2014).

Растворимый CXCL1 использовали в качестве контроля, поскольку было показано, что 315-F8-002 не обладает перекрестной реактивностью с другими ELR-позитивными хемокинами (фигура 6). В соответствии с этим, связывание 315-F8-002 не блокировалось растворимым CXCL1 (фигура 9А). Неожиданно было обнаружено, что связывание 8А-358 блокировалось растворимым CXCL1 с такой же эффективностью, как и растворимым CXCL8 (прибл. 25% в эквимолярной концентрации и прибл. 35% в концентрации с 5-кратным избытком (фигура 9В). Это указывает на то, что 8A-35, в отличие от 315-F8-002, селективно не связывается с CXCL8 и в дальнейшем не будет ингибировать CXCL8 в растворе.

Ссылки

Полные библиографические данные цитируемых здесь документов, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, перечислены ниже, если это не оговорено особо.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3):403-10.

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402.

Bao, Z., et al. (2010), Humanized monoclonal antibody against the chemokine CXCL-8 (IL-8) effectively prevents acute lung injury. Int Immunopharmacol. 10(2): 259-63.

Brand, H.K., et al. (2013), CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatr Res. 73(2): 187-93.

Brat, D.J., A.C. Bellail, and E.G. Van Meir (2005), The role of interleukin-8 and its receptors in gliomagenesis and tumoral angiogenesis. Neuro Oncol. 7(2): 122-33.

Campbell, L.M., P.J. Maxwell, and D.J. Waugh (2013), Rationale and Means to Target Pro-Inflammatory Interleukin-8 (CXCL8) Signaling in Cancer. Pharmaceuticals (Basel). 6(8): 929-59.

Chen, Y., et al. (2012), Interleukin-8, a promising predictor for prognosis of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18(10): 1123-9.

David, J.M., et al. (2016), The IL-8/IL-8R Axis: A Double Agent in Tumor Immune Resistance. Vaccines (Basel). 4(3): 22.

Fang, Q.I., et al. (2017), Increased CXCL8 Expression Is Negatively Correlated with the Overall Survival of Patients with ER-Negative Breast Cancer. Anticancer Res. 37(9): 4845-4852.

Feniger-Barish, R., et al. (1999), Differential modes of regulation of cxc chemokine-induced internalization and recycling of human CXCR1 and CXCR2. Cytokine. 11(12): 996-1009.

Garau, A., et al. (2005), Neuroprotection with the CXCL8 inhibitor repertaxin in transient brain ischemia. Cytokine. 30(3): 125-31.

Ginestier, C., et al. (2010), CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J Clin Invest. 120(2): 485-97.

Ha, H., B. Debnath, and N. Neamati (2017), Role of the CXCL8-CXCR1/2 Axis in Cancer and Inflammatory Diseases. Theranostics. 7(6): 1543-1588.

Harada, A., et al. (1994), Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. J Leukoc Biol. 56(5): 559-64.

Highfill, S.L., et al. (2014), Disruption of CXCR2-mediated MDSC tumor trafficking enhances anti-PD1 efficacy. Sci Transl Med. 6(237): 237ra67.

Jamal, R., et al. (2017), Peripheral and local predictive immune signatures identified in a phase II trial of ipilimumab with carboplatin/paclitaxel in unresectable stage III or stage IV melanoma. J Immunother Cancer. 5(1): 83.

Klussmann S. (2006). "The Aptamer Handbook - Functional Oligonucleotides and their Applications." Edited by S. Klussmann. WILEY-VCH, Weinheim, Germany, ISBN 3-527-31059-2

Koch, A.E., et al. (1992), Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science. 258(5089): 1798-801.

Kratschmer, C. and M. Levy, Effect of Chemical Modifications on Aptamer Stability in Serum. Nucleic Acid Ther, 2017. 27(6): p. 335-344.

Kusser W (2000). J Biotechnol 74:27-38

Li, A., et al. (2005), Autocrine role of interleukin-8 in induction of endothelial cell proliferation, survival, migration and MMP-2 production and angiogenesis. Angiogenesis. 8(1): 63-71.

Liu, Q., et al. (2016), The CXCL8-CXCR1/2 pathways in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 31: 61-71.

Ludwig, H., et al. (2017), Olaptesed pegol, an anti-CXCL12/SDF-1 Spiegelmer, alone and with bortezomib-dexamethasone in relapsed/refractory multiple myeloma: a Phase IIa Study. Leukemia. 31(4): 997-1000.

Maxwell, P.J., et al. (2013), Potentiation of inflammatory CXCL8 signalling sustains cell survival in PTEN-deficient prostate carcinoma. Eur Urol. 64(2): 177-88.

Maxwell, P.J., et al. (2014), Tumor-derived CXCL8 signaling augments stroma-derived CCL2-promoted proliferation and CXCL12-mediated invasion of PTEN-deficient prostate cancer cells. Oncotarget. 5(13): 4895-4908.

McGinnis S, Madden TL (2004) BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32(Web Server issue):W20-5.

Menne, J., et al. (2017), C-C motif-ligand 2 inhibition with emapticap pegol (NOX-E36) in type 2 diabetic patients with albuminuria. Nephrol Dial Transplant. 32(2): 307-315.

Merritt, W.M., et al. (2008), Effect of interleukin-8 gene silencing with liposome-encapsulated small interfering RNA on ovarian cancer cell growth. J Natl Cancer Inst. 100(5): 359-72.

Morris, A.C., et al. (2009), Diagnostic importance of pulmonary interleukin-1β and interleukin-8 in ventilator-associated pneumonia. Thorax. thx. 2009.122291.

Needleman & Wunsch (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48(3):443-53.

Oberthur, D., et al. (2015), Crystal structure of a mirror-image L-RNA aptamer (Spiegelmer) in complex with the natural L-protein target CCL2. Nat Commun. 6: 6923.

Pearson & Lipman (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444

Russo, R.C., et al. (2014), The CXCL8/IL-8 chemokine family and its receptors in inflammatory diseases. Expert Rev Clin Immunol. 10(5): 593-619.

Sanmamed, M.F., et al. (2014), Serum interleukin-8 reflects tumor burden and treatment response across malignancies of multiple tissue origins. Clin Cancer Res. 20(22): 5697-707.

Sawant, K.V., et al. (2016), Chemokine CXCL1 mediated neutrophil recruitment: Role of glycosaminoglycan interactions. Sci Rep. 6: 33123.

Shahzad, A., et al. (2010), Interleukin 8 (IL-8) - a universal biomarker? Int Arch Med. 3: p. 11.

Skov, L., et al. (2008), IL-8 as antibody therapeutic target in inflammatory diseases: reduction of clinical activity in palmoplantar pustulosis. J Immunol. 181(1): 669-79.

Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482

Steele, C.W., et al. (2016), CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29(6): 832-45.

Sung, H.J., et al., Inhibition of human neutrophil activity by an RNA aptamer bound to interleukin-8. Biomaterials, 2014. 35(1): p. 578-89.

Venkatesan N, Kim SJ, Kim BH (2003) Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides. Curr Med Chem 10(19): 1973-1991

Visvader, J.E. and G.J. Lindeman (2008), Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence and unresolved questions. Nat Rev Cancer. 8(10): 755-68.

Wang, C., et al. (2016), CXCL13, CXCL10 and CXCL8 as Potential Biomarkers for the Diagnosis of Neurosyphilis Patients. Sci Rep. 6: 33569.

Wincott F, DiRenzo A, Shaffer C, Grimm S, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S, and Usman N (1995). Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribosomes. Nucleic Acids Res. 23:2677-2684.

Xu, L. and I.J. Fidler (2000), Interleukin 8: an autocrine growth factor for human ovarian cancer. Oncol Res. 12(2): 97-106.

Yao, R., et al. (2015), Diagnostic performance of interleukin-6 and interleukin-8 for bacterial meningitis: a meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 8(5): 7059-68.

Zhou, M., et al. (2015), Interleukin-8 for diagnosis of neonatal sepsis: a meta-analysis. PLoS One. 10(5): e0127170.

Проект, положенный в основу разработки настоящей заявки, служил результатом исследования, проводимого специалистами Horizon Европейского Союза в 2020 году, в соответствии с программой инновации, реализуемой на грант No 634415.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Aptarion biotech AG

<120> CXCL8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

<130> A 10064 PCT

<150> EP 18 205 750.5

<151> 2018-11-12

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 77

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(77)

<223> D-аминокислота

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (77)..(77)

<223> присоединенный биотин

<400> 1

Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val

20 25 30

Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu

35 40 45

Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln

50 55 60

Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser

65 70 75

<210> 2

<211> 77

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(77)

<223> CXCL8

<400> 2

Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys

1 5 10 15

Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val

20 25 30

Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu

35 40 45

Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln

50 55 60

Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser

65 70 75

<210> 3

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

gcugacggaa guacguggaa agccaaugag ugugucccgg ucagc

45

<210> 4

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

gcugacggaa guacguggaa agccgaugag ugugucccgg ugagc

45

<210> 5

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

gcugacggaa guacguggaa agccgaaagu gugucccggu cagc

44

<210> 6

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 7

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

ugacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccgguca

40

<210> 8

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

gacggaagua cguggaaagc cgaaagugug ucccgguc

38

<210> 9

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 10

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

ggacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggucc

40

<210> 11

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

gcacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggugc

40

<210> 12

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

ggucggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggacc

40

<210> 13

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

uggcggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggcca

40

<210> 14

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

gcugacggaa guacguggaa agccaaugag ugugucccgg ucagc

45

<210> 15

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

gcugacggaa guacguggaa agccgaugag ugugucccgg ugagc

45

<210> 16

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

gcugacggaa guacguggaa agccgaaagu gugucccggu cagc

44

<210> 17

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 18

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

ugacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccgguca

40

<210> 19

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

gacggaagua cguggaaagc cgaaagugug ucccgguc

38

<210> 20

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 21

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

ggacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggucc

40

<210> 22

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

gcacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggugc

40

<210> 23

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

ggucggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggacc

40

<210> 24

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

uggcggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggcca

40

<210> 25

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<223> ПЭГ, связанный посредством аминогексильного линкера с

5ʹ-концом

<400> 25

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 26

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<223> аминогексильный линкер, присоединенный к 5ʹ-концу

<400> 26

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 27

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> U представляет собой U или отсутствует

<400> 27

ggaaguacgu ggaaagccra uraguguguc ccg

33

<210> 28

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

ggaaguacgu ggaaagccaa ugaguguguc ccg

33

<210> 29

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

ggaaguacgu ggaaagccga ugaguguguc ccg

33

<210> 30

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

ggaaguacgu ggaaagccga aagugugucc cg

32

<210> 31

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

gacuggcccu gugugaaagc cgaaaggugc augaaggcag uc

42

<210> 32

<211> 73

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(73)

<223> CXCL1

<400> 32

Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

65 70

<210> 33

<211> 73

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(73)

<223> CXCL2

<400> 33

Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn

65 70

<210> 34

<211> 73

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(73)

<223> CXCL3

<400> 34

Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln

1 5 10 15

Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly

20 25 30

Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys

35 40 45

Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu

50 55 60

Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn

65 70

<210> 35

<211> 78

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(78)

<223> CXCL5

<400> 35

Ala Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Cys Val Cys Leu

1 5 10 15

Gln Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser Asn Leu Gln Val

20 25 30

Phe Ala Ile Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu

35 40 45

Lys Asn Gly Lys Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys

50 55 60

Lys Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys Glu Asn

65 70 75

<210> 36

<211> 77

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(77)

<223> CXCL6

<400> 36

Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg

1 5 10 15

Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe

20 25 30

Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys

35 40 45

Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys

50 55 60

Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn

65 70 75

<210> 37

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(94)

<223> CXCL7

<400> 37

Ser Ser Thr Lys Gly Gln Thr Lys Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys Glu

1 5 10 15

Glu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile

20 25 30

Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Glu Val

35 40 45

Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn Gln Val Glu Val Ile Ala Thr Leu

50 55 60

Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys

65 70 75 80

Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala Asp

85 90

<210> 38

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(68)

<223> CCL5

<400> 38

Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly

20 25 30

Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Met Ser

65

<210> 39

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> ПЭГ, присоединенный посредством аминогексильного линкера

<400> 39

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 40

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> Присоединенный аминогексильный линкер

<400> 40

cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag

42

<210> 41

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> ПЭГ, присоединенный посредством аминогексильного линкера

<400> 41

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 42

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Присоединенный аминогексильный линкер

<400> 42

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 43

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> ПЭГ, присоединенный посредством аминогексильного линкера

<400> 43

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 44

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> Аминогексильный линкер

<400> 44

gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac

42

<210> 45

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<223> Все C представляют собой 2’-фтор-C

<220>

<221> misc_feature

<223> Все U представляют собой 2'-фтор-U

<400> 45

gggggcuuau cauuccauuu aguguuauga uaacc

35

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано медицине и диагностике. Изобретение раскрывает молекулу L-нуклеиновой кислоты, содержащую в центральном фрагменте нуклеотидную последовательность: 5’-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(Xu)RAGUGUGUCCCG-3’ [SEQ ID NО: 27], где Xu представляет собой U или отсутствует. L-нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению способна специфически связываться с человеческим CXCL8 (IL-8), при этом не взаимодействуя с другими ELR-позитивными хемокинами, а более предпочтительно не связываясь с ELR-позитивными хемокинами, которые связываются с рецепторами CXCR1 и/или CXCR2. Изобретение может быть использовано в качестве диагностического или лекарственного средства для диагностики или лечения заболевания, характеризующегося наличием CXCL8, который прямо или опосредованно участвует в патогенезе этого заболевания. 11 н. и 87 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл., 9 ил.

1. Молекула L-нуклеиновой кислоты, способная связываться с человеческим CXCL8, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит центральный нуклеотидный фрагмент и необязательно модифицирующую группу, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность:

5’-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(X_U)RAGUGUGUCCCG-3’ [SEQ ID NO: 27], где X_U представляет собой U или отсутствует.

2. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 1, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы:

a) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 28],

b) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 29] и

c) 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 30].

3. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 2, где центральный нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность:

5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 30] или 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 28], а предпочтительно 5’ GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3’ [SEQ ID NO: 30].

4. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит в направлении 5' → 3' первый концевой нуклеотидный фрагмент, центральный нуклеотидный фрагмент и второй концевой нуклеотидный фрагмент, где

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит от трех до шести нуклеотидов и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит от трех до шести нуклеотидов,

где предпочтительно

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит от пяти до шести нуклеотидов и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит от пяти до шести нуклеотидов,

где более предпочтительно

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит пять нуклеотидов и

второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит пять нуклеотидов.

5. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 4, где первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-Z₁Z₂Z₃Z₄Z₅C-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5’-GZ₆Z₇Z₈Z₉Z₁₀-3’, где

Z₁ представляет собой G или отсутствует, Z₂ представляет собой S или отсутствует; Z₃ представляет собой K или отсутствует, Z₄ представляет собой S, Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M или отсутствует; Z₉ представляет собой S или отсутствует, а Z₁₀ представляет собой C или отсутствует;

где предпочтительно

a) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ представляет собой C; или

b) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, а Z₁₀ отсутствует; или

c) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

d) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

e) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S, а Z₁₀ представляет собой C; или

f) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ представляет собой C; или

g) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ представляет собой C; или

h) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ отсутствует; или

i) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

j) Z₁ представляет собой G; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

k) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

l) Z₁ отсутствует; Z₂ представляет собой S; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

m) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ отсутствует; или

n) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ представляет собой S и Z₁₀ отсутствует; или

o) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ представляет собой K; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ отсутствует; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует; или

p) Z₁ отсутствует; Z₂ отсутствует; Z₃ отсутствует; Z₄ представляет собой S; Z₅ представляет собой D; Z₆ представляет собой H; Z₇ представляет собой S; Z₈ представляет собой M; Z₉ отсутствует и Z₁₀ отсутствует.

6. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4, 5, где:

а) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3';

b) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAGC-3'; или

c) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAGC-3';

d) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3';

е) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность из 5'-UGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCA-3';

f) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCC-3';

g) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGC-3';

h) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GGUC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GACC-3';

i) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-UGGC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCCA-3';

j) первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUC-3';

где предпочтительно

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3', или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GCUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAGC-3', или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3';

где более предпочтительно

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-CUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAG-3' или

первый концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUGAC-3', а второй концевой нуклеотидный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUCAC-3'.

7. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит от 40 до 45 нуклеотидов, предпочтительно от 42 до 45 нуклеотидов, а более предпочтительно 42 нуклеотида.

8. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7, где молекула L-нуклеиновой кислоты состоит из рибонуклеотидов.

9. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 14-26 и 39-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75% идентична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 14-26 и 39-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая гомологична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 14-26 и 39-44, где такая гомология составляет по меньшей мере 75%.

10. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 9, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75% идентична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44, или молекула L-нуклеиновой кислоты содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты, которая гомологична молекуле L-нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41-44, где гомология составляет по меньшей мере 75%.

11. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает способностью связываться с CXCL8, где предпочтительно CXCL8 представляет собой человеческий CXCL8, обезьяний CXCL8, кроличий CXCL8, свиной CXCL8, собачий CXCL8, овечий CXCL8 или CXCL8 морской свинки.

12. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает способностью специфически связываться с CXCL8, предпочтительно с человеческим CXCL8, обезьяньим CXCL8, кроличьим CXCL8, свиным CXCL8, собачьим CXCL8, овечьим CXCL8 или CXCL8 морской свинки, а более предпочтительно с человеческим CXCL8.

13. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, где молекула L-нуклеиновой кислоты не связывается или не обладает способностью связываться с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные хемокины CXC, отличающиеся от CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 и CXCL7.

14. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 13, где молекула L-нуклеиновой кислоты не связывается или не обладает способностью связываться с ELR-позитивными человеческими хемокинами CXC, отличающимися от человеческого CXCL8, где ELR-позитивные человеческие хемокины CXC, отличающиеся от человеческого CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из человеческого CXCL1, человеческого CXCL2, человеческого CXCL3, человеческого CXCL5, человеческого CXCL6 и человеческого CXCL7.

15. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-14, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как KD и составляющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

16. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-15, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составляющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

17. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-16, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как KD и составляющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, а более предпочтительно 1000 нМ или более.

18. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составляющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, а более предпочтительно 1000 нМ или более.

19. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-18, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как KD и составлющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как KD и составлющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более, а более предпочтительно 1000 нМ или более, и/или

молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с человеческим CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составлющей 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее, где молекула L-нуклеиновой кислоты обладает аффинностью связывания с ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, выраженной как IC₅₀ и составлющей 100 нМ или более, предпочтительно 500 нМ или более и более предпочтительно 1000 нМ или более.

20. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 15-19, где аффинность связывания определяют при комнатной температуре, а предпочтительно при 25°С.

21. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 15-19, где аффинность связывания определяют при 37°C.

22. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-21, где молекула L-нуклеиновой кислоты способна ингибировать действия CXCL8 на его рецепторы CXCR1 и/или CXCR2, предпочтительно человеческим CXCL8, обезьяньим CXCL8, кроличьим CXCL8, свиным CXCL8, собачьим CXCL8, овечьим CXCL8 или CXCL8 морской свинки, а более предпочтительно человеческим CXCL8.

23. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 22, где молекула L-нуклеиновой кислоты не является антагонистом ELR-позитивных человеческих хемокинов CXC, отличающихся от человеческого CXCL8, или не способна подавлять активность, опосредуемую ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные хемокины CXC, отличающиеся от CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 и CXCL7.

24. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 23, где молекула L-нуклеиновой кислоты не является антагонистом ELR-позитивных человеческих хемокинов CXC, отличающихся от человеческого CXCL8, или не способна подавлять активность, опосредуемую ELR-позитивными хемокинами CXC, отличающимися от CXCL8, где ELR-позитивные человеческие хемокины CXC, отличающиеся от человеческого CXCL8, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из человеческого CXCL1, человеческого CXCL2, человеческого CXCL3, человеческого CXCL5, человеческого CXCL6 и человеческого СXCL7.

25. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 22-24, где антагонистическая активность молекулы L-нуклеиновой кислоты по отношению к активности, опосредуемой человеческими CXCR1 и/или CXCR2, и выраженной как IC₅₀, составляет 10 нМ или менее, предпочтительно 1 нМ или менее, более предпочтительно 100 пМ или менее, а наиболее предпочтительно 30 пМ или менее.

26. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 22-25, где антагонистическую активность молекулы L-нуклеиновой кислоты по отношению к активности, опосредуемой человеческим CXCL8, определяют при 37°C.

27. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-26, где модифицирующая группа присоединена к 5'-концевому нуклеотиду или 3'-концевому нуклеотиду молекулы L-нуклеиновой кислоты.

28. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-27, где модифицирующая группа присоединена к молекуле L-нуклеиновой кислоты посредством линкера.

29. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 28, где линкер представляет собой гидрофильный линкер, где гидрофильный линкер предпочтительно содержит одно или более звеньев этиленгликоля, а более предпочтительно гидрофильный линкер содержит триэтиленгликоль, гексаэтиленгликоль или полиэтиленгликоль.

30. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 28, где линкер представляет собой биоразлагаемый линкер.

31. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-30, где скорость экскреции молекулы L-нуклеиновой кислоты, содержащей модифицирующую группу, из организма снижается по сравнению со скоростью экскреции L-нуклеиновой кислоты, не содержащей модифицирующую группу.

32. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-30, где молекула L-нуклеиновой кислоты, содержащая модифицирующую группу, имеет более продолжительное время удерживания в организме по сравнению с временем удерживания в организме молекулы L-нуклеиновой кислоты, не содержащей модифицирующую группу.

33. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 31, 32, где организм представляет собой организм человека или животного, а предпочтительно организм человека.

34. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 и 33, где модифицирующая группа выбрана из группы, включающей биоразлагаемую модификацию и небиоразлагаемую модификацию, и где модифицирующая группа выбрана из группы, включающей полиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль с прямой цепью, разветвленный полиэтиленгликоль и гидроксиэтилированный крахмал.

35. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 34, где модифицирующая группа представляет собой полиэтиленгликоль, предпочтительно полиэтиленгликоль с прямой цепью или разветвленный полиэтиленгликоль, где молекулярная масса полиэтиленгликоля предпочтительно составляет приблизительно от 20000 до приблизительно 120000 Да, более предпочтительно приблизительно от 30000 до приблизительно 80000 Да, а наиболее предпочтительно приблизительно 40000 Да.

36. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 35, где молекулярная масса полиэтиленгликоля составляет приблизительно от 20000 до приблизительно 120000 Да, предпочтительно приблизительно от 30000 до приблизительно 80000 Да, а наиболее предпочтительно приблизительно 40000 Да.

37. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 34, где модифицирующая группа представляет собой гидроксиэтилированный крахмал, где молекулярная масса гидроксиэтилированного крахмала предпочтительно составляет приблизительно от 50 до приблизительно 1000 кДа, более предпочтительно приблизительно от 100 до приблизительно 700 кДа, а наиболее предпочтительно от 200 до 500 кДа.

38. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-30, где модифицирующая группа предназначена для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты.

39. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 38, где иммобилизация включает ковалентное связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты с поверхностью, где предпочтительной поверхностью является поверхность реакционного сосуда, поверхность устройства в реакционном сосуде или поверхность биосенсора.

40. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 38, где иммобилизация включает нековалентное связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты с поверхностью, где предпочтительной поверхностью является поверхность реакционного сосуда, поверхность устройства в реакционном сосуде или поверхность биосенсора.

41. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 38-40, где модифицирующая группа выбрана из группы, включающей карбоксил, гидроксил, фосфатидил, сложный эфир сульфоновой кислоты, амин, тиол, эпоксид, алкин, стерический циклоалкин, малеимид, азид, гидразид, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) и азадибензоциклооктин (ADIBO).

42. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 41, где модифицирующая группа представляет собой стерический циклоалкин, а предпочтительно дибензоциклооктил (DBCO).

43. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 40, где модифицирующая группа представляет собой биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин или олигонуклеотид, а предпочтительно модифицирующая группа представляет собой биотин.

44. Молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-30, где модифицирующая группа позволяет детектировать молекулу L-нуклеиновой кислоты, а предпочтительно модифицирующая группа представляет собой метку.

45. Молекула L-нуклеиновой кислоты по п. 44, где метка выбрана из группы, включающей биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин, олигонуклеотид, флуоресцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, УФ-метку, коллоидное золото, наночастицу и метку в виде молекулы, образующей хелатный комплекс.

46. Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 в лечении или профилактике заболевания, где заболевание ассоциировано с CXCL8-опосредуемым патогенным механизмом и выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание и рак, где воспалительное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание дыхательных путей, воспалительное заболевание кожи, аутоиммунное заболевание, воспалительное нервное заболевание, ишемическое заболевание, атеросклероз, отторжение трансплантата панкреатических островков, отторжение трансплантата органов, замедленную функцию органов, повреждение спинного мозга или цистит.

47. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, в эффективном количестве для лечения или профилактики заболевания, которое ассоциировано с CXCL8-опосредуемым патогенным механизмом и выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание и рак, где воспалительное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание дыхательных путей, воспалительное заболевание кожи, аутоиммунное заболевание, воспалительное нервное заболевание, ишемическое заболевание, атеросклероз, отторжение трансплантата панкреатических островков, отторжение трансплантата органов, замедленную функцию органов, повреждение спинного мозга или цистит, где композиция необязательно содержит дополнительный компонент, где дополнительный компонент выбран из группы, включающей фармацевтически приемлемый наполнитель, фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически активный агент.

48. Фармацевтическая композиция по п. 47, где фармацевтическая композиция содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 и фармацевтически приемлемый носитель.

49. Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое ассоциировано с CXCL8-опосредуемым патогенным механизмом и выбрано из группы, включающей воспалительное заболевание и рак, где воспалительное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание дыхательных путей, воспалительное заболевание кожи, аутоиммунное заболевание, воспалительное нервное заболевание, ишемическое заболевание, атеросклероз, отторжение трансплантата панкреатических островков, отторжение трансплантата органов, замедленную функцию органов, повреждение спинного мозга или цистит.

50. Применение по п. 49, где лекарственное средство предназначено для использования в медицине или в ветеринарии.

51. Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 для получения диагностического агента, диагностического средства или биосенсора для детектирования CXCL8.

52. Применение по п. 51, где диагностический агент или диагностическое средство имеет поверхность на реакционном сосуде или поверхность на устройстве в реакционном сосуде.

53. Применение по п. 51, где биосенсор имеет поверхность.

54. Применение по любому из пп. 51-53, где CXCL8 представляет собой человеческий CXCL8.

55. Применение по любому из пп. 51-52, где CXCL8 детектируют посредством прямого связывания, в сэндвич-анализе на связывание или в анализе на конкурентное связывание.

56. Применение по п. 55, где прямое связывание включает способ детектирования, в котором используется только молекула L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 и в котором не используется или который не включает использование второй молекулы, отличающейся от молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, которая взаимодействует с CXCL8.

57. Применение по п. 55, где сэндвич-анализ представляет собой сэндвич-анализ на гибридизацию, в котором молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 иммобилизуют на поверхности, и комплекс молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 и CXCL8 детектируют с помощью детектирующего средства, которое связывается с эпитопом (эпитопами) CXCL8, который(е) отличается(ются) от эпитопа(ов), связанного(ых) с молекулой L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45.

58. Применение по п. 55, где сэндвич-анализ представляет собой сэндвич-анализ на гибридизацию, где средство, которое связывается с эпитопом (эпитопами) CXCL8, который(е) отличается(ются) от эпитопа(ов), связанного(ых) с молекулой L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, иммобилизуют на поверхности, и комплекс таких средств и CXCL8 детектируют с использованием молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45.

59. Применение по п. 55, где в анализе на конкурентное связывание молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 иммобилизуют на поверхности и связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 с CXCL8 конкурирует с олигонуклеотидными зондами, комплементарными молекуле L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, или с CXCL8, где комплементарность предпочтительно представляет собой комплементарность оснований, а более предпочтительно основана на спаривании оснований Уотсона-Крика.

60. Применение по п. 55, где в анализе на конкурентное связывание молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 не иммобилизуют на поверхности и связывание молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 с CXCL8 конкурирует с олигонуклеотидными зондами, комплементарными молекуле L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, или с CXCL8, где предпочтительно олигонуклеотидные зонды, комплементарные молекуле L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 или CXCL8, иммобилизуют на поверхности, где комплементарность предпочтительно представляет собой комплементарность оснований, а более предпочтительно такая комплементарность основана на спаривании оснований Уотсона-Крика.

61. Применение по любому из пп. 57-60, где для иммобилизации на поверхности используют молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 38-43.

62. Применение по любому из пп. 52-61, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора, выбрана из группы, состоящей из золота, серебра, титана, циркония, ванадия, хрома, марганца, кобальта, вольфрама, молибдена, платины, алюминия, железа, стали, меди, никеля, кремния, германия, фосфида индия, арсенида галлия и оксида, нитрида или их сплавов или смесей, оксида индия-олова, стеклообразного углерода, сапфира, силикатного стекла и боратного стекла.

63. Применение по любому из пп. 52-62, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора, модифицирована полилизином; аминосиланом; эпоксисиланом; нитроцеллюлозой; карбоксидекстраном; углеродной наномембраной; оксидом графена; углеродной поверхностью, такой как черная сажа, углеродное волокно, углеродная пластина, углеродная ткань, активированный углерод, стекловидный углерод, уголь, активированный уголь, графитовый порошок, графитовое волокно, углеродная нанотрубка; фуллереном; карбоксильной группой; азидной группой; тиоловой группой; гидроксигруппой; эпоксидом; малеимидом; алкином; стерическим алкином или любой их комбинацией.

64. Применение по п. 63, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 38-43, поверхность функционализируют первичным амином, тиоловой группой, азидом, алкином, алкеном, тетразином, тетразолом или стерическим циклоалкином, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) или азадибензоциклооктин (ADIBO).

65. Применение по п. 64, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 41, 42 проводят реакцию циклоприсоединения азида-алкина, стимулируемую стерическим алкином.

66. Применение по любому из пп. 51-65, где молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 43-45 используют для детектирования.

67. Применение по любому из пп. 51-66, где детектирующая система биосенсора основана на оптическом считывании, изменении массы, показателе преломления, заряде, поверхностном натяжении и микроскопии на основе межатомных сил.

68. Применение по п. 67, где детектирующая система биосенсора, основанная на оптическом считывании, представляет собой флуоресценцию, абсорбцию или люминесценцию.

69. Применение по п. 67, где детектирующая система биосенсора, основанная на изменении массы, представляет собой систему микробаланса на основе кварцевых кристаллов или микроэлектромеханические системы.

70. Применение по п. 67, где детектирующая система биосенсора, основанная на показателе преломления, представляет собой поверхностный плазмонный резонанс, круговой резонатор или эллипсометрию.

71. Применение по п. 67, где детектирующая система биосенсора, основанная на заряде, представляет собой электрохимическое сопротивление, вольтамперометрию, амперометрию, потенциометрию, проводимость или полевой транзистор.

72. Применение по п. 67, где детектирующая система биосенсора, основанная на поверхностном натяжении, представляет собой консольный биосенсор.

73. Применение по любому из пп. 51-54, где CXCL8 детектируют с помощью устройства для анализа на гомогенность.

74. Применение молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 для детектирования CXCL8, а предпочтительно человеческого CXCL8.

75. Применение по п. 74, где CXCL8 детектируют с помощью устройства для сэндвич-анализа на связывание, устройства для анализа на гомогенность или устройства для анализа на конкурентное связывание.

76. Применение по п. 75, где устройство для сэндвич-анализа на связывание, устройство для анализа на гомогенность или устройство для анализа на конкурентное связывание являются подходящими для прямого или опосредуемого детектирования CXCL8.

77. Применение по любому из пп. 73-76, где молекула L-нуклеиновой кислоты ковалентно иммобилизована на поверхности реакционного сосуда с диагностическим средством, на поверхности устройства в реакционном сосуде с диагностическим средством или на поверхности биосенсора.

78. Применение по п. 77, где для иммобилизации используют молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 38-43.

79. Применение по любому из пп. 77, 78, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора выбрана из группы, состоящей из золота, серебра, титана, циркония, ванадия, хрома, марганца, кобальта, вольфрама, молибдена, платины, алюминия, железа, стали, меди, никеля, кремния, германия, фосфида индия, арсенида галлия и оксида, нитрида или их сплавов или смесей, оксида индия-олова, стеклообразного углерода, сапфира, силикатного стекла и боратного стекла.

80. Применение по любому из пп. 77-79, где поверхность, а предпочтительно поверхность биосенсора модифицирована полилизином; аминосиланом; эпоксисиланом; нитроцеллюлозой; карбоксидекстраном; углеродной наномембраной; оксидом графена; углеродной поверхностью, такой как черная сажа, углеродное волокно, углеродная пластина, углеродная ткань, активированный углерод, стекловидный углерод, уголь, активированный уголь, графитовый порошок, графитовое волокно, углеродная нанотрубка; фуллереном; карбоксильной группой; азидной группой; тиоловой группой; гидроксигруппой; эпоксидом; малеимидом; алкином; стерическим алкином или любой их комбинацией.

81. Применение по п. 80, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 38-43 поверхность функционализируют активированным первичным амином, тиоловой группой, азидом или стерическим циклоалкином, где стерический циклоалкин предпочтительно выбран из группы, включающей дибензоциклооктил (DBCO), бицикло[6.1.0]нон-4-ин (BCN) или азадибензоциклооктин (ADIBO).

82. Применение по п. 81, где для иммобилизации молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 41, 42 проводят реакцию циклоприсоединения азида-алкина, стимулируемую стерическим алкином.

83. Применение по любому из пп. 77-82, где детектирующая система биосенсора основана на оптическом считывании, изменении массы, показателе преломления, заряде, поверхностном натяжении и микроскопии на основе межатомных сил.

84. Применение по п. 83, где детектирующая система биосенсора, основанная на оптическом считывании, представляет собой флуоресценцию, абсорбцию или люминесценцию.

85. Применение по п. 80, где детектирующая система биосенсора, основанная на изменении массы, представляет собой систему микробаланса на основе кварцевых кристаллов или микроэлектромеханическую систему.

86. Применение по п. 83, где детектирующая система биосенсора, основанная на показателе преломления, представляет собой поверхностный плазмонный резонанс, круговой резонатор или эллипсометрию.

87. Применение по п. 83, где детектирующая система биосенсора, основанная на заряде, представляет собой электрохимическое сопротивление, вольтамперометрию, амперометрию, потенциометрию, проводимость или полевой транзистор.

88. Применение по п. 83, где детектирующая система биосенсора, основанная на поверхностном натяжении, представляет собой консольный биосенсор.

89. Применение по любому из пп. 74-76, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит модифицирующую группу, которая позволяет детектировать молекулу L-нуклеиновой кислоты, а предпочтительно модифицирующая группа представляет собой метку.

90. Применение по п. 89, где метка выбрана из группы, включающей биотин, бромдезоксиуридин, дигоксигенин, олигонуклеотид, флуоресцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, УФ-метку, коллоидное золото, наночастицу и метку в виде молекулы, образующей хелатный комплекс.

91. Набор для детектирования CXCL8, где набор содержит молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 и по меньшей мере вкладыш с инструкцией или реакционный сосуд.

92. Способ детектирования CXCL8 с использованием L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 в образце, где указанный способ включает стадии:

a) получения образца с неизвестной концентрацией CXCL8;

b) контактирования образца или его разведения с диагностическим агентом, диагностическим средством или биосенсором по любому из пп. 51-73;

c) измерения сигнала с использованием диагностического агента, диагностического средства или биосенсора по любому из пп. 51-73;

d) сравнения, но необязательно, сигнала с эталоном;

e) где, необязательно, концентрацию CXCL8 в образце с неизвестной концентрацией CXCL8 определяют путем сравнения с сигналами, полученными по меньшей мере из одного образца с известной концентрацией CXCL8, а предпочтительно по меньшей мере один образец с известной концентрацией CXCL8 подвергают стадиям b)-c).

93. Комплекс, содержащий молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 и CXCL8 для иммобилизации CXCL8 на поверхности, где комплекс предпочтительно представляет собой кристаллический комплекс.

94. Способ скрининга соединения на способность ингибировать действия CXCL8 на его рецепторы CXCR1 и/или CXCR2, где способ включает следующие стадии:

- получение соединения-кандидата,

- получение молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45;

- создание тест-системы, которая будет передавать сигнал в присутствии соединения, способного ингибировать действия CXCL8 на его рецепторы CXCR1 и/или CXCR2, и

- определение того, является ли соединение-кандидат соединением, способным ингибировать действия CXCL8 на его рецепторы CXCR1 и/или CXCR2.

95. Способ детектирования L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 в образце, где указанный способ включает стадии:

a) получения зонда для захвата, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, и зонда для детектирования, где зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45; или, альтернативно, где зонд для захвата по меньшей мере частично комплементарен второй части молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, а зонд для детектирования по меньшей мере частично комплементарен первой части молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45;

b) добавления зонда для захвата и зонда для детектирования отдельно или в комбинации к образцу, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, или, предположительно, содержащему молекулу L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45;

c) обеспечения взаимодействия зонда для захвата и зонда для детектирования либо одновременно, либо последовательно в любом порядке с молекулой L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, или ее части;

d) необязательно, определения того, гибридизуется ли зонд для захвата с молекулой L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, как описано в стадии a); и

e) детектирования комплекса, полученного в стадии c) и состоящего из молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45, зонда для захвата и зонда для детектирования.

96. Способ по п. 95, где зонд для детектирования содержит детектирующее средство и/или где зонд для захвата иммобилизован на носителе, а предпочтительно на твердом носителе.

97. Способ по п. 95 или 96, где любой зонд для детектирования, который не является частью комплекса, полученного в стадии с), удаляют из реакционной смеси так, чтобы в стадии е) детектировался только зонд для детектирования, который является частью комплекса.

98. Способ по любому из пп. 95-97, где стадия е) включает стадию сравнения сигнала, генерируемого детектирующим средством, если зонд для захвата и зонд для детектирования гибридизуются в присутствии молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45 или ее части и в отсутствие указанной молекулы L-нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-45.