Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма "О N2620/Оренбургский/2021" культуральная инактивированная эмульсионная Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Описание патента на изобретение RU2815537C1

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 е из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральной инактивированной эмульсионной.

Являясь одним из наиболее заразных заболеваний домашнего скота в мире, ящур представляет постоянную глобальную угрозу при торговле животными и для национальной экономики. Заболевание остается серьезным препятствием на пути развития страны и сокращения бедности во всем развивающемся мире по многим причинам. Включая стоимость мер борьбы, закрытие доступа к ценным глобальным рынкам животноводческой продукции, свободной от ящура, потери производства из-за снижения надоев молока, снижения прироста живой массы. Вирус ящура поражает множество парнокопытных животных, включая крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, всех диких жвачных животных, с высокой заболеваемостью [2].

Ящур эндемичен в Африке, большей части Азии, на Ближнем Востоке и в некоторых частях Южной Америки. Выделяют следующие семь серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа О является наиболее распространенными, что определяет актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.

Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, а иногда на отдельные генетические линии и даже сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP1 [1]. Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5'-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3'-участке). Именно по этой причине в пределах серотипов выделяют более 60 генетических линий и сублиний.

Важность знания генетического разнообразия вируса ящура заключается в возможности тщательного анализа эпизоотической ситуации в конкретном регионе и детальном подборе подходящей вакцины, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Восстановление после переболевания животных каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3].

Выявление генетических связей между различными изолятами и штаммами проводят с помощью нуклеотидного секвенирования, что дает возможность в условиях вспышки определить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для анализа вспышек и создания оптимальных вакцин [4, 6].

Серотип О вируса ящура разделен на 11 топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA). Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О [5-11]. Представленное многообразие представителей серотипа О обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащих вирусов и активным перемещением данного возбудителя на территориях стран Азии, преимущественно Юго-Восточной, Центральной и Средней.

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой во всем мире. Наиболее эффективный способ реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней - применение цельновирионных вакцин, которые на сегодняшний день в отношении ящура признаются наиболее эффективными [8, 9, 12, 13].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран, так как отдельные регионы России граничат с эндемичными по ящуру странами Азии и подвержены очень высокой степени риска заноса инфекционного агента с территории данных государств. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Азиатского континента. Это может подорвать ветеринарное благополучие нашей страны по ящуру, в том числе в отношении возбудителя заболевания указанного генотипа, исходя из этого, требуется заранее принимать меры по созданию надежной вакцины.

В Российской Федерации вспышки ящура типа О регистрировались начиная с 2000 по 2021 гг. на территории Приморского, Хабаровского, Забайкальского краев, Амурской, Оренбургской областей, Республики Башкортостан. Вспышки болезни были вызваны вирусом ящура типа О и генотипов: O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.

На территории преимущественно Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e имеют спорадический характер. Обнаружено, что в Монголии были выявлены изоляты вируса ящура, которые принадлежат к генотипу O/ME-SA/Ind-2001d. Начиная с августа 2018 года в Монголии стали регистрировать вспышки, вызванные вирусом ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e. Данная генетическая модификация значительно отличается от своего предшественника и, соответственно, вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001d не обеспечивает полной защиты от генотипа O/ME-SA/Ind-2001e. В Российской Федерации на границах с Монголией с марта 2019 года стали фиксировать вспышки ящура нового генотипа, что является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d).

Изолят «O/Orenburg/RUS/2021» вируса ящура был выделен из патологического материала от крупного рогатого скота на территории поселка Карагач Беляевского района Оренбургской области в 2021 году. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «О №2620/Оренбургский/2021».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О (Фиг. 1).

Учитывая увеличение торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Азии, в которых стабильно стали регистрировать вспышки ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, возникает опасность их возникновения в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема при экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных приграничных районов. Таким образом, возникла необходимость разработать новую вакцину против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики этого особо опасного заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура серотипа О (штамм «О №2311/Забайкальский/2016», генотип O/ME-SA/Ind-2001d), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «О №2311/Забайкальский/2016», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см3, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см3 (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла MEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,40-7,60.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Франция). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно полевых изолятов вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, циркулирующих в странах Азии.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 е из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S полноценного иммуногенного компонента в дозе препарата.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа О и, в частности, генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см3 препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e) вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,5 мкг; 2) масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 60% по массе, 3) поддерживающая среда - до 1,0 см3.

Штамм вируса ящура «О №2620/Оренбургский/2021» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №417 - деп / 22-51 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно использовать перевиваемую суспензионную культуру клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применять среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,5% от общего объема при рН среды 7,45-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,030% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,013% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см3 не менее 3,5 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40% на 60% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивают формирование сильного иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 3,5 мкг в 1,0 см3 готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в количестве 60% (по массе) в 1,0 см3 готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-S A/Ind-2001 е вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма

«О №2620/Оренбургский/2021» генотипа не менее 3,5 мкг/см3

O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура

Масляный адъювант Montanide ISA-61 VG 60% (по массе)

Поддерживающая среда до 1,0 см3

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, циркулирующих в странах Азии.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противояшурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Азии.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP1 штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP1 штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

Штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура серотипа О относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP4, VP2, VP3, VP1.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Антигенное родство (r1) штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 102 ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [17, 18, 19].

Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r1 в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «О №2620/Оренбургский/2021» составили r1 от 0,04 до 0,29, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×106 Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP1 штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура принадлежит к генотипу O/ME-S A/Ind-2001е (Фиг. 1).

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы составляет 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,47-7,67. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,5°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом O/ME-SA/Ind-2001e, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральная инактивированная эмульсионная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP1) (639 н.о.) штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа О. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP1) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа О.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура вакцинного штамма «О №2620/Оренбургский/2021» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура представлена SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот ID-гена, кодирующего белок VP1 штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Проведен филогенетический анализ штамма «О №2620/Оренбургский/2021». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 400 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 28 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность ID-гена штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 639 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена lD (белок VP1) штамма «О №2620/Оренбургский/2021» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа О определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

Таким образом, исследуемый штамм «О №2620/Оренбургский/2021» относится к генотипу O/ME-SA/Ind-2001e, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,18-0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом 0,01-0,001 ТЦД50/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 14-16 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,50±0,10 до 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,45±0,10 lg ТЦД50/см3). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,35±0,02 до 0,98±0,03 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,98±0,03 мкг/см3). Степень достоверности (R2) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 97,55 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «О №2620/' Оренбургский/2021» генотипа О/МЕ-SA/Ind-2001е в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-ого на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0%-ов фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,18-0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла DMEM, позволяющая за 14-16 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,98±0,03 мкг/см3 и титром инфекционной активности 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DMEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 14-30 ч (таблица 2). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 14-16 ч развитие ЦПД достигало 95-100%) с накоплением 146S частиц, равным 0,98±0,03 мкг/см3 и титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «О №2620/Оренбургский/2021» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД50/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2%-и сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 14-26 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД50/кл. и составило 0,98±0,03 мкг/см3 с титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД50/см3.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Игла DMEM; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,1-0,01 ТЦД50/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма

«О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см3. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,46-7,66. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 13-14 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, при культивировании вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см3 составило 0,81±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,0 млн кл./см3 - 0,99±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,5 млн кл./см3 - 1,22±0,03 мкг/см3, и с концентрацией 4,0 млн кл./см3- 1,56±0,03 мкг/см3. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21 /SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см3. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 9,67±0,10 lg ТЦД50/см3. Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH с концентрацией 4,0 млн кл./см3.

Исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД50/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,46-7,66. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 80% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 13-25 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 13-14 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,56±0,03 мкг/см3) и титром инфекционной активности вируса 9,67±0,10 lg ТЦД50/см3.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-21 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 3, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД50/кл. (1,56±0,03 мкг/см3) с титром инфекционной активности вируса, равным 9,67±0,10 lg ТЦД50/СМ3.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-S A/Ind-2001 е вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см3; 2) температурный режим культивирования -37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,030%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,46-7,66 с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 4, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,53±0,03 мкг/см3, a 146S+75S компонента -2,06±0,03 мкг/см3.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

Суспензию вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010, 0,013 и 0,016%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 5, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 12%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,013%) наблюдали снижение количества балластного белка на 35%, 146S компонента - на 3,1%». Применяя ПГМГ в концентрации 0,016% содержание балластного белка уменьшалось на 53%, а иммуногенных компонентов - на 19%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «О №2620/Оренбургский/2021», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,013%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «О №2620/Оренбургский/2021», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 7 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 6,5 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,6 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 6, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 5,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 5,9 раз. Применяя метод сорбирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура в суспензии в 6,9 раз. Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» с высокой концентрацией вирусных белков.

Пример 8. Компоновка вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001е культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «О №2620/Оренбургский/2021» изготовили вакцину против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральную инактивированную эмульсионную с применением масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG, в количестве 40% к 60% по массе, соответственно. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см3 антигена составило 10,21±0,06 мкг/см3 (таблица 6).

Пример 9. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральной инактивированной эмульсионной был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-х кратным шагом. 17 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой и в качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см3. Первую группу животных (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№11-15) -вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.

Пример 10. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 7, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней <50%).

Пример 11. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001е культуральной инактивированной эмульсионной.

В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. Для определения авирулентности вакцины отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см3. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см3 (тройная доза по 2,0 см3). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,5°С и удерживаться на этом уровне в течение 1 -2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральная инактивированная эмульсионная была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 12. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа О/МЕ-SA/Ind-2001е культуральной инактивированной эмульсионной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001 е культуральной инактивированной эмульсионной у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 9,20±0,11 log2 SN50, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,90±0,14 log2 SN50, с разведением 1/25 (5 голов) -3,70±0,21 log2 SN50. (таблица 8). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2 SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 13. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных.

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 8, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральная инактивированная эмульсионная в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см3) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 55,9 ПД50 и 0,036 ИМД50 для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальная резервная вакцина для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного изобретения; вакцина, изготовленная из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e в соответствии с предлагаемым изобретением - обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа О, генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, циркулирующего в странах Азии.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа O/ME-S A/Ind-2001 е из штамма

«О №2620/Оренбургский/2021» культуральная инактивированная эмульсионная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 18.12.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 19.12.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, T. Doel [et. al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 12.11.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина м1жвщ. тем. наук. Харюв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов / Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy / Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine FMDV

genotype O ME-SA Ind-2001e_1672991995473 xml.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-01-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-01-06</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>481</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-01-06</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim lgorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

O/ME-SA/Ind-2001e из штамма «О №2620/Оренбургский/2021»

культуральная инактивированная эмульсионная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actacctccacaggtgagtccgctgatcccgtgaccaccaccgttgaga

actacggtggagaaacacaggtccagagacgtcagcacactgacgtttctttcatcttggacagatttgt

gaaagtaacaccaaaagaccaaatcaatgtgttggacctgatgcaaacccctgctcacactttggtaggc

gcgctcctccgcaccgccacctactacttcgcagatttagaagtggcagtgaagcacgagggcaacctca

cctgggtcccaaacggggcgcccgaggcggcgctggataacaccaccaacccgacggcctaccacaaggc

accgctcacccgtcttgctttgccttacacagcaccacaccgtgttttggctaccgtttacaacgggaac

tgcaagtacggcgagggcgccgtgaccaacgtgaggggtgacctccaagtcttggcccagaaagcagcaa

gaacgctgcccacctccttcaactacggtgccattaaggccacccgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggccgaaacatactgcccccggcccctgctggccattcacccggaacaagctagacacaagcag

aagattgtggcacctgtcaaacagttgttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYGEGAVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPEQARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Похожие патенты RU2815537C1

название год авторы номер документа
Штамм "О N 2620/Оренбургский/2021" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/ME-SA/Ind-2001e для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура 2023
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Фомина Светлана Николаевна
  • Кременчугская Светлана Ревдитовна
  • Чвала Илья Александрович
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Щербаков Алексей Владимирович
  • Тимина Анна Михайловна
  • Майорова Тамара Константиновна
  • Солошенко Алина Константиновна
  • Шмелев Алексей Андреевич
  • Максимова Юлия Николаевна
RU2806606C1
Вакцина против ящура генотипа О/ЕА-3 из штамма "О N2241/Эфиопия/2011" культуральная инактивированная эмульсионная 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Мороз Наталья Владимировна
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Ручнова Ольга Ивановна
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Фомина Светлана Николаевна
  • Будина Олеся Олеговна
RU2816264C1
Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2из штамма "О N2356/Пакистан/2018" культуральная инактивированная сорбированная 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Мороз Наталья Владимировна
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Гусева Марина Николаевна
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Шевченко Максим Александрович
RU2810131C1
Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма "О N2383/Приморский/2019" культуральная инактивированная эмульсионная 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Воеводина Маргарита Эдуардовна
  • Оковытая Татьяна Владимировна
  • Елькина Юлия Сергеевна
  • Никифоров Виктор Викторович
RU2804803C1
Вакцина против ящура генотипа O/EA-2 из штамма "O/Кения/2017" культуральная инактивированная сорбированная 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Луговская Наталия Николаевна
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Фомина Светлана Николаевна
RU2802192C1
Штамм "O N 2241/Эфиопия/2011" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-3 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура 2023
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Доронин Максим Игоревич
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Фомина Светлана Николаевна
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Майорова Тамара Константиновна
  • Воеводина Маргарита Эдуардовна
  • Гочмурадов Ыхлас Мурадович
RU2809223C1
Вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Гусева Марина Николаевна
  • Константинов Алексей Влалимирович
  • Суровцева Маргарита Георгиевна
  • Будина Олеся Олеговна
RU2816944C1
Штамм "О N 2222/Тайвань/1/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура 2023
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Константинов Алексей Владимирович
  • Луговская Наталия Николаевна
  • Жбанова Татьяна Валентиновна
  • Будина Олеся Олеговна
  • Майорова Тамара Константиновна
  • Ручнова Ольга Ивановна
RU2817031C1
Штамм "О/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2 2022
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Гусева Марина Николаевна
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Воеводина Маргарита Эдуардовна
  • Фомина Светлана Николаевна
RU2793828C1
Вакцина против ящура из штамма "A/Египет/EURO-SA/2022" культуральная инактивированная сорбированная 2023
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Доронин Максим Игоревич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Малыгин Максим Павлович
  • Мороз Наталья Владимировна
  • Воеводина Маргарита Эдуардовна
  • Никифоров Виктор Викторович
  • Гочмурадов Ыхлас Мурадович
RU2817381C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 815 537 C1

Реферат патента 2024 года Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e из штамма "О N2620/Оренбургский/2021" культуральная инактивированная эмульсионная

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральной инактивированной эмульсионной. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, является абсолютно безопасной и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Азии. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 13 пр.

Формула изобретения RU 2 815 537 C1

1. Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2620/Оренбургский/2021» генотипа O/ME-SA/Ind-2001e, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №417 - деп / 22-51» - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,5 мкг; в качестве адъюванта она содержит Montanide ISA-61 VG в количестве 60% по массе и поддерживающую среду до 1,0 см3 готового препарата.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001e в количестве не менее 3,5 мкг в 1,0 см3 готового препарата.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2815537C1

Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О 2017
  • Лозовой Дмитрий Анатольевич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Стариков Вячеслав Алексеевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Доронин Максим Игоревич
RU2665849C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ 2012
  • Лозовой Дмитрий Анатольевич
  • Михалишин Валерий Васильевич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Стариков Вячеслав Алексеевич
  • Лёзова Татьяна Николаевна
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Юрчишин Василий Дмитриевич
  • Смоленский Владимир Иванович
  • Уласов Валентин Ильич
RU2526570C2
ЕЛЬКИНА Юлия Сергеевна, ПРОТИВОЯЩУРНЫЕ ВАКЦИНЫ ТИПОВ О, АЗИЯ-1, А ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ РАННЕГО ИММУНИТЕТА У ЖИВОТНЫХ, диссертация, Владимир, 2021, с
Спускная труба при плотине 0
  • Фалеев И.Н.
SU77A1
KR 2021012696 A, 03.02.2021
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ 2002
  • Лезова Т.Н.
  • Михалишин В.В.
  • Мамков Н.С.
  • Гусев А.А.
  • Михалишин Д.В.
  • Фомина Т.А.
RU2220744C1

RU 2 815 537 C1

Авторы

Доронин Максим Игоревич

Михалишин Дмитрий Валерьевич

Чвала Илья Александрович

Борисов Алексей Валерьевич

Воеводина Маргарита Эдуардовна

Никифоров Виктор Викторович

Фомина Светлана Николаевна

Будина Олеся Олеговна

Даты

2024-03-18Публикация

2023-03-27Подача