Вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная.

Ящур - острая высококонтагиозная везикулярная болезнь домашних и диких парнокопытных жвачных животных, которая вызывается РНК-содержащим афтовирусом семейства Picornaviridae. Данное заболевание влечёт за собой значительные экономические потери, связанные с негативным влиянием на производство животноводческой продукции, и является препятствием для региональной и международной торговли животными и продуктами животного происхождения. По оценкам WOAH (Всемирная организация здравоохранения животных, основана как OIE), болезнь циркулирует у 77% мирового поголовья домашнего скота в Африке, на Ближнем Востоке и в Азии, а также на ограниченной территории Южной Америки [1]. В связи с чем существует риск заноса инфекции в страны, свободные от ящура без вакцинации. Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура [2].

В настоящее время выделяют 7 серотипов вируса ящура, а именно, O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом вирус серотипа О является очень распространенным и изученным, что определяет актуальность изготовления вакцин против ящура данного серотипа.

Серотипы генетически разделены на топотипы, а иногда на отдельные генетические линии и даже сублинии [3, 4]. Серотип О вируса ящура разделен на 11 топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (EA-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 and -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA). Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактики ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О [5-11].

По причине быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6-13]. С целью проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся вирусу определенного генотипа [14, 15]. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцинный препарат в неблагополучном пункте и окружающей угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

Высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О и, в частности, штамма «O/ARRIAH/Mya-98», представители которого распространены на территории Южной Америки и за ее пределами, где вспышки данного представителя вируса ящура имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами этого региона, в частности, Бразилией, Аргентиной, Чили, Венесуэлой и др. Имеются риски заноса возбудителя, имеющих высокую степень генетического родства с представленным штаммом на территорию Российской Федерации. Это обстоятельство является угрожающим фактором в отношении распространения данного представителя вируса ящура на территории нашей страны и требует исследования свойств появляющихся штаммов вируса ящура и изготовления на его основе вакцинных препаратов.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Федеративной Республики Бразилия в 1994 году. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был охарактеризован и получил название - штамм «О/ARRIAH/Mya-98» [9].

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 вируса ящура (фиг. 1) и значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О, в частности, штамма «О №2212/Приморский/2014».

Учитывая увеличение торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Южной Америки возникает опасность проникновение вируса ящура данного генотипа на территорию Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура серотипа О (штамм «О №2212/Приморский/2014», генотип O/SEA/Mya-98) [16], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «О №2212/Приморский/2014», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно штамма «O/ARRIAH/Mya-98» и близкородственных ему штаммов и изолятов вируса ящура.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата [17, 18, 19].

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против вируса ящура серотипа О, в частности, изолятов и штаммов, близкородственных штамму «O/ARRIAH/Mya-98».

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 5,0 мкг; 2) масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG с содержанием 70% по массе, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных; 3) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №488 - деп / 23-38 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,024% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,025% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [19, 20].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 5,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG в соотношении 30% на 70% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную эмульсию белого или бледно-желтого цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивают формирование специфического иммунного ответа.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 5,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в количестве 70% (по массе) в 1,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура не менее 5,0 мкг/см³ Масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG 70% (по массе) Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» и близкородственных ему изолятов и штаммов.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» и близкородственных ему изолятов и штаммов, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания ящуром в мире.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей 1D-гена (соответствует белку VP₁).

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура.

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип О, генотип O/SEA/Mya-98.

Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [10-12].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «O/ARRIAH/Mya-98» составили r₁ от 0,19 до 0,28, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О. Так антигенное родство штамма «O/ARRIAH/Mya-98» с производственными штаммами составляло:

«О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98) (прототип) - 0,28,

«О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) - 0,13,

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia) - 0,23,

«О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2) - 0,20,

«О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d) - 0,19.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,83×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,42 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,1°С).

Дополнительные признаки и свойства штамма вируса ящура

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - антиген не патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - антиген не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - неинактивированный вирус сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного штаммом «O/ARRIAH/Mya-98» и близкородственными ему изолятами, а также предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа О. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (вирусный белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (30 представителей) вируса ящура серотипа О.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «O/ARRIAH/Mya-98» с другими изолятами и штаммами.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «O/ARRIAH/Mya-98». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA X и алгоритма Neighbor-Joining [20, 21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 500 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 30 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 666 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA X.

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «O/ARRIAH/Mya-98» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа О определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, исследуемый штамм «O/ARRIAH/Mya-98» относится к генотипу O/SEA/Mya-98, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «O/ARRIAH/Mya-98» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 22-24 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,50±0,10 до 7,93±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,93±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,44±0,02 до 1,12±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,12±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 98,11 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в промышленных масштабах

В процессе промышленного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,02 - 38±0,02°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%.

Результаты репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1, из которой видно, что при репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 16-17 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,01±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,92±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в растворе Хэнкса с 5% ГБК и 2% сыворотки крови КРС при следующих температурах: 35,0±0,02; 36,0±0,02; 37,0±0,02; 38,0±0,02°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 16-27 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 16-17 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,01±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,92±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «O/ARRIAH/Mya-98» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли раствор Хэнкса с 5% ГБК и 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 17-29 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,01±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,92±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - раствор Хэнкса с 5% ГБК и 2% сыворотки крови КРС; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02⁰С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в промышленных масштабах

При промышленном культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Концентрацию катионов водорода (рН) поддерживали в диапазоне 7,50-7,70. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-28 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,98±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,45±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 2,78±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 2,75±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно ниже, а затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 10,14±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,02; 36,0±0,02; 37,0±0,02; 38,0±0,02°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,50-7,70. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 9-28 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 9-10 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,78±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 10,14±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 9-24 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (2,78±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 10,14±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98»

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,01°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор 1,2-аминоэтилэтиленимина (1,2-АЭЭИ) с рН, равным 8,3-8,4. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,024%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,50-7,70 с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения инактиванта.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,73±0,02 мкг/см³ (73%), а 146S+75S компонента - 3,61±0,02 мкг/см³ (96,5%).

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98»

Суспензию вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98», полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,020, 0,025 и 0,030%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» с помощью ПГМГ в концентрации 0,020% отмечали снижение концентрации балластного белка на 8%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,025% наблюдали снижение количества балластного белка на 22%, 146S компонента - на 2,5%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,030% содержание балластного белка уменьшалось на 36%, а иммуногенных компонентов - на 18%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98», пришли к выводу о том, что, с точки зрения экономической целесообразности, для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,025%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура

Культуральную инактивированною суспензию штамма «O/ARRIAH/Mya-98», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 6 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6000 Да (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 4 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 4,4 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 5,1 раза. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензии в 5,9 раз. Таким образом, технология танценциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант

Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в качестве адъюванта была выбран масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG. При изготовлении данного вакцинного препарата использовали масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в количестве 70% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» изготовили вакцину против ящура культуральную инактивированную эмульсионную с применением в качестве адъюванта - масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ антигена составило 15,69±0,02 мкг/см³ (таблица 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной

Из полученной вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. Свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой и 2 головы оставили без вакцинации в качестве контроля вируса. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение)

Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,8°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 8,05±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,85±0,14 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,10±0,34 log₂ SN₅₀ (таблица 7). Полученные данные РМН свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведении 1/5, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов). После заражения свиней, инокулированных вакциной в разведении 1/25, из 5 голов заболела 1 свинья (здоровых 4 из 5).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,52 ПД₅₀ и 0,05 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа О.

Источники информации

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 14.07.2023).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 04.08.2023).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5.

4. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_
reports.htm (Дата обращения 15.07.2023).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.

16. Патент № 2 665 849 Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О / Заявка: 2017144155, 2017.12.15. Опубликовано: 2018.09.04.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

Таблица 1
Результаты адаптации штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 при разных условиях
(n=3, M±m, p<0,01) Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DMEM+ 2% S_КРС 24-25 95-100 0,69±0,02 6,75±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 20-21 95-100 0,77±0,02 7,02±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК + 2% S_КРС 16-17 95-100 1,01±0,02 7,92±0,10 Температура, °С 35,0±0,02 26-27 85-90 0,32±0,02 4,74±0,10 36,0±0,02 23-25 85-90 0,41±0,03 5,59±0,10 37,0±0,02 16-17 95-100 1,01±0,02 7,92±0,10 38,0±0,02 19-20 90-95 0,59±0,02 6,20±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 25-26 90-95 0,53±0,02 5,70±0,10 0,01-0,001 16-17 95-100 1,01±0,02 7,92±0,10 0,001-0,0001 28-29 90-95 0,22±0,02 4,45±0,10

Примечание: S_КРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК - гидролизат белков крови,

DMEM - название среды Игла,

RPMI-1640 - название культуральной среды,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 2
Результаты репродукции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток
(n=3, M±m, p<0,01) Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением, млн кл./см³ 2,5 11 95-100 0,98±0,02 7,98±0,10 3,0 10-11 95-100 1,45±0,02 8,45±0,10 3,5 9-10 95-100 2,78±0,02 10,14±0,10 4,0 12-13 95-100 2,75±0,02 10,09±0,10 Температура, °С 35,0±0,02 26-28 85-90 0,74±0,02 7,45±0,10 36,0±0,02 20-21 85-90 1,15±0,02 8,11±0,10 37,0±0,02 9-10 95-100 2,78±0,02 10,14±0,10 38,0±0,02 13-15 95-100 2,15±0,02 9,47±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 14-16 95-100 1,30±0,02 8,27±0,10 0,01-0,001 9-10 95-100 2,78±0,02 10,14±0,10 0,001-0,0001 22-24 90-95 0,88±0,02 7,79±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 3
Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98»
(n=3, M±m, p<0,05) Время отбора проб с момента инактивации, ч Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³ 0 10,14±0,10 1 8,22±0,10 2 6,14±0,10 4 4,23±0,10 5 1,47±0,10 6 0 12 0

Таблица 4
Содержание компонентов штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензиях до и после очистки
(n=3, M±m, p<0,005) До очистки Условия очистки После очистки концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ 146S компонент 146S+75S компоненты 146S компонент 146S+75S компоненты 9,55±0,10 2,73±0,02 3,61±0,02 ПГМГ, 0,020% 8,79±0,05 2,68±0,02 3,54±0,02 ПГМГ, 0,025% 7,45±0,05 2,66±0,02 3,52±0,02 ПГМГ,
0,030% 6,11±0,05 2,24±0,02 2,96±0,02

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 5
Содержание компонентов антигена штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования
(n=3, M±m, p<0,01) Концентрация компонентов до концентрирования, мкг/см³ Методы концентрирования
(в 6 раз) Концентрация компонентов после концентрирования, мкг/см³ ОВБ 146S компонент 146S+75S компонент ОВБ 146S компонент 146S+75S компонент 3,65±0,02 2,66±0,02 3,52±0,02 ПЭГ-6000,
4 ч 16,06±0,02 11,70±0,02 15,49±0,02 ПЭГ-6000,
12 ч 18,62±0,02 13,57±0,02 17,95±0,02 Тангенциальная фильтрация,
4 ч 21,54±0,02 15,69±0,02 20,77±0,02

Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,

ОВБ - общий вирусный белок.

Таблица 6
Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98» № жив-о п/п Значение оптической плотности пробы Процент ингибиции (PI), % тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации СПК 0,401 -//- СПК 60,020 -//- ПК 0,092 ПК 90,828 ОК 1,003 ОК 0,000 1 -//- 0,910 0,896 -//- 9,272 10,668 2 0,915 0,892 8,774 11,067

Примечание: СПК - слабоположительный контроль,

ПК - положительный контроль,

ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.

Таблица 7
Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральной инактивированной эмульсионной на свиньях
(n=5, M±m) Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения ИмД₅₀/ПД₅₀ «О №2241/ Эфиопия/ 2011» без разведения 1 8,00 - 0,05/ 40,52 2 8,00 - 3 8,00 - 4 8,00 - 5 8,25 - M±m 8,05±0,11 0/5 1/5 6 5,00 - 7 4,75 - 8 5,00 - 9 4,75 - 10 4,75 - M±m 4,85±0,14 0/5 1/25 11 3,25 - 12 3,25 - 13 3,25 - 14 3,25 - 15 2,50 + M±m 3,10±0,34 1/5 контроль 1 - + контроль 2 - +

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН - реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ - иммуногенная доза,

ПД₅₀ - протективная доза.

--->

Перечень последовательностей

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV O Vaccine.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-08-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>536</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура серотипа О из

штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная

эмульсионная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>666</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..666</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacttctgcgggcgagtcagcggatcctgtcaccgccactgttgaaaact

acggtggcgaaacacagatccagaggcgccaacacacggacgtctcgttcatcatggacagatttgtgaa

agtgacaccgcaaaaccaaattaacattttggacctcatgcagattccatcacacactttggtgggagcg

ctcctacgcgcgtccacttactacttctctgacttggagatagcagtaaaacacgagggagacctcacct

gggttccaaatggagcgcctgaaaaggcgttggacaacaccaccaacccaactgcttaccacaaggcacc

actcacccggcttgccctgccctacaccgcgccccaccgcgtgttggcaaccgtgtacaacggtgagtgc

aggtacagcagaaatgctgtgcccaacgtgagaggtgaccttcaggtgttggctcaaaaggtggcacgga

cgctgcctacctccttcaactacggtgccatcaaagcgacccgggtcaccgagttgctttaccggatgaa

gagggccgaaacatactgtccaaggcccttgctggcaatccacccaactgaagccagacacaaacagaaa

attgtggcaccggtgaaacagactttgaattttgaccttctcaagttgcccccc</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>222</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..222</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADPVTATVENYGGETQIQRRQHTDVSFIMDRFVKVTPQNQINILD

LMQIPSHTLVGALLRASTYYFSDLEIAVKHEGDLTWVPNGAPEKALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAP

HRVLATVYNGECRYSRNAVPNVRGDLQVLAQKVARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLL

AIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAP</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана вакцина, содержащая авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «O/ARRIAH/Mya-98», представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, является абсолютно безопасной и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Южной Америки. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что состоит из активного вещества в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура Aphtae epizooticae «O/ARRIAH/Mya-98» сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, серотипа О, генотипа SEA/Mya-98, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №488 - деп / 23-38 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в эффективном количестве, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 5,0 мкг; адьюванта масляного - Montanide ISA-71 R VG с содержанием 70% по массе и поддерживающей среды - до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» генотипа SEA/Mya-98, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа О, генотипа SEA/Mya-98.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «O/ARRIAH/Mya-98» генотипа SEA/Mya-98 и масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG, в эффективном количестве:30 ÷ 70% по массе, соответственно.