Способ радионуклидной диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 Российский патент 2019 года по МПК A61B6/03 A61K51/00 A61K103/10 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, онкологии, в частности, к радионуклидной диагностике и может быть использовано для диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.

Несмотря на большое количество известных к настоящему моменту молекулярных мишеней большое внимание по-прежнему уделяется одному из представителей семейства рецепторов эпидермального роста EGFR - Her2/neu, наличие экспрессии которого выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. Особое место среди злокачественных новообразований занимает рак молочной железы (РМЖ) гиперэкспрессия и/или амплификация гена Her2 клетками при котором относится к одному из неблагоприятных прогностических факторов, обуславливающих агрессивное течение опухолевого процесса, а также низкие показатели общей и безрецидивной выживаемости [Romond Е.Н., Perez Е.А., Bryant J., et.al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684]. По данным различных исследований частота вновь выявленных случаев инвазивного РМЖ с гиперэкспрессией Her2/neu составляет 15-25%, и чаще всего этот показатель возрастает у пациенток с высокой степенью злокачественности и с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов.

В настоящее время для определения статуса Her2/neu активно применяются несколько методик: иммуногистохимическое исследование (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и хромогенная гибридизация in situ (CISH) [Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2/neu gene amplification by fluoroscence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163-170]. Однако, область применения известных способов ограничена. При несомненных достоинствах используемых методов они имеют ряд существенных недостатков, к которым можно отнести невозможность проведения in vivo исследования для оценки распространенности опухолевого процесса (первичный опухолевый узел, состояние регионарных лимфатических узлов, оценка отдаленных органов и тканей) [Orlando L., Viale G., Bria E. Lutrino E.S., Sperduti I, Carbognin L., Schiavone P., Quaranta A., Fedele P., Caliolo C, Calvani N., Criscuolo M., Cinieri S. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151-155], гетерогенность опухоли, а также недоступность материально-технического оснащения в большинстве лабораторий на территории Российской Федерации [Telugu R.B., Chowhan А.K., Rukmangadha N., Patnayak R., Phaneendra B.V., Prasad B.C., Reddy M.K. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531].

Одним из направлений молекулярной визуализации является использование неинвазивных радионуклидных методов [Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Г., Зельчан Р.В., Братина О.Д., Чойнзонов Е.Л. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018; 17 (1): 220-231]. Для таргетной доставки радионуклида необходимо использование структуры, обладающее высокой аффинностью, специфичностью связывания непосредственно с мишенью, локализующейся как в нормальных, так и в патологически измененных тканях, низкой иммуногенностью, и более того, высокой стабильностью, проявляющейся способностью к противостоянию с различными химическими средами в процессе мечения [Stumpp М.Т., Binz Н.К., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701]. Более того, в процессе медицинской визуализации высокоаффинные направленные молекулы должны быстро находить мишень в организме пациента, несвязанные компоненты быстро удаляться их организма, таким образом, облегчая визуализацию опухоли и сокращая время между введением препарата и обследованием [Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014; 1060: 309-30]. В последнее время активно изучается новый класс связывающих белков, получивший название «альтернативные каркасные белки», одним из представителей которого являются DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein), отвечающие всем необходимым требованиям для создания эффективного радиохимического соединения [ A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511].

Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики с использованием меченных индием-111 альтернативных каркасных белков аффибоди (¹¹¹In-ABY-025). Применяемый в известном способе радиофармацевтический препарат является специфическим и фиксируется на поверхности мембран опухолевых клеток, экспрессирующих Her2/neu, что позволяет их визуализировать как основной опухолевый узел, так и метастатические очаги [Sorensen J., Sandberg D., Sandstrom M, et.al. First-in-Human Molecular Imaging of HER2 Expression in Breast Cancer Metastases Using the ¹¹¹In-ABY-025 Affibody Molecule // Tee Journal of Nuclear Medicine. 2014. Vol. 55 (5). P. 730-735]. Основным недостатком данного метода являются недостаточно оптитмальные радиологические характеристики препарата, связанные с длительным периодом полураспада (T_1/2=2,8 сут) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а также наличием в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений. Существенным недостатком также является недоступность получения аффибоди на территории Российской Федерации.

Новый технический результат - повышение специфичности и информативности и доступности способа диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.

Для достижения нового технического результата в способе радионуклидной диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, включающем введение радиофармпрепарата (РФП) и выполнение сцинтиграфических исследований, вводят инъекционную форму радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, который изготавливают непосредственно перед введением, для чего в асептических условиях 1 мл элюата ^99mTcO^4- 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°С в течение 30 минут, после инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут, далее выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с помощью очистительных колонок, полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту, через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере, оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез диагностируют злокачественную опухоль.

Способ осуществляют следующим образом, радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонила технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺ добавляют 1 мл (7 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл (1200 мкг) DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут (согласно лабораторному регламенту получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту. Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез диагностируют злокачественную опухоль.

Способ основан на анализе результатов экспериментальных клинических исследований, для подтверждения, эффективности которого в выявлении злокачественных опухолей молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu были проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99 т рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29. С этой целью была сформирована группа из 8 пациенток с верифицированным диагнозом рака молочной железы T₄N_0-3M_0-1: исследуемую подгруппу составляли 4 пациенток с гиперэкспрессией Her2/neu, контрольную - 4 пациентки без экспрессии данного параметра. Всем пациенткам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 в дозе 500 МБк. Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: для приготовления набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонила технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺ добавляли 1 мл (7 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонила технеция добавляли к 334 мкл (1200 мкг) DARPin9_29 при концентрация раствора основного вещества 3,6 мг/л, и инкубировали при температуре 40°С в течение 60 минут (согласно лабораторному регламенту получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняли очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляли в 10 мл физраствора и через стерилизующий фильтр медленно вводили пациенту.

Через 4 часа после внутривенного введения препарата в дозе 500 МБк выполняли ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере Е.САМ фирмы SIEMENS в стандартном режиме. Производили запись 64 проекций в матрицу 64×64 пикселя с применением низкоэнергетических коллиматоров с энергией 140КэВ. Окно дифференциального дискриминатора настроено на 20%, аппаратное увеличение не использовали.

Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). Патологическими считались участки повышенной аккумуляции препарата в ткани молочной железы. Кроме того, при постпроцессинговой обработке производился расчет индекса «опухоль/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани молочной железы. Результаты исследования продемонстрировали 100% чувствительность способа в диагностике вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, то есть с применением указанного радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 удалось выявить опухоль у всех 6 пациенток с гиперэкспрессией Her2/neu, включенных в исследование. Произведенные расчеты показали, что средние значения индекса «опухоль/фон» составили 2,01±1,54.

Клинический пример 1.

Пациентка М., 54 года: Рак правой молочной железы, ВОИФ, IIIB стадия (T4N0M0).

Гистологическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ-, РП-, Her2/neu+.

В плане обследования дополнительно выполнено исследование согласно предлагаемому способу однофотонная эмиссионная компьютерная томография с радиофармпрепаратом на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29. Ha На Фиг 1 через 4 часа после введения визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах правой молочной железы.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, позволяет отчетливо визуализировать вторичную отечно-инфильтративную форму рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu на метаболическом уровне, а степень аккумуляции представленного радиофармпрепарата в опухоли дает возможность получать сцинтиграфические изображения надлежащего качества. Способ позволит повысить эффективность и специфичность радионуклидной диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и лучевой радионуклидной диагностике, и может быть использовано для радионуклидной диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29. Вводят инъекционную форму радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, который изготавливают непосредственно перед введением. Для чего в асептических условиях 1 мл элюата ^99mTcO^4- 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°С в течение 30 минут. После инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут. Далее выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с помощью очистительных колонок. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту. Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере. Оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез диагностируют злокачественную опухоль. Технический результат обеспечивает повышение специфичности и информативности и доступности способа диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu. 1 ил., 1 пр.

Способ радионуклидной диагностики вторичной отечно-инфильтративной формы рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, включающий введение радиофармпрепарата (РФП) и выполнение сцинтиграфических исследований, отличающийся тем, что вводят инъекционную форму радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, который изготавливают непосредственно перед введением, для чего в асептических условиях 1 мл элюата ^99mTcO^4- 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°С в течение 30 минут, после инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут, далее выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с помощью очистительных колонок, полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту, через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере, оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез диагностируют злокачественную опухоль.