Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4425 A61P31/12 

Настоящее изобретение относится к области биохимии, фармацевтики, медицины, а именно к применению энисамия йодида для снижения воспалительных реакций у человека при острых респираторных инфекциях (ОРВИ).

Воспаление представляет собой защитно-приспособительную гомеостатическую реакцию организма, в том числе, активацию иммунной системы в ответ на повреждение, вызванное чужеродным фактором (патогенный микроорганизм, химический/физический раздражитель и т.д.) или поврежденным, измененным "своим" (продукты тканевого распада, кровоизлияния, и т.д.) с последующим отторжением этого повреждающего фактора и ликвидацией последствий повреждения.

В качестве стереотипного ответа воспаление представляет собой механизм врожденного иммунитета, по сравнению с приобретенным иммунитетом, который является специфичным для каждого патогена.

Патофизиологическая основа воспаления представляет собой комплексный ответ, основанный, в том числе, на различных индуцирующих воспаление молекулах и множестве опосредующих воспаление и сенсибилизирующих молекулах, которые, вызывают воспаление через дублирующий механизм.

Кроме того, помимо блокирования провоспалительных молекул, многие противовоспалительные лекарственные препараты также ингибируют регуляторные контуры, которые высвобождают эндогенные противовоспалительные молекулы.

Например, нестероидные противовоспалительные средства (далее - НПВС), уменьшают воспаление путем блокирования ферментативной активности циклооксигеназы, ключевого фермента, который катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландины и лейкотриены.

Таким образом, НПВС уменьшают воспаление, путем предотвращения синтеза всех простагландинов. То есть препараты данной группы влияют на синтез противовоспалительных простагландинов, блокируя эндогенный противовоспалительный ответ. Это обстоятельство зачастую продлевает хроническое воспаление и является отрицательным фактором, ограничивающим их применение.

Кроме того, известно, что при наличии в организме человека воспаления, в нем активируются универсальный индуцибельный фактор транскрипции NF-κВ.

После его активации индуцируется транскрипция провоспалительных генов, в том числе генов, кодирующих цитокины, хемокины, инфламмасомы.

При этом ингибирование активности NF-κВ, позволяет снизить уровни экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), определяющих ответ тканей на воспаление, повреждение и канцерогенез.

Таким образом, нарушение регуляции универсального индуцибельного фактора транскрипции NF-κB вызывает воспаление, аутоиммунные заболевания, а также развитие вирусных инфекций и рака.

Поэтому в настоящий момент существует актуальная потребность в регуляторах NF-κВ, iNOS и ЦОГ-2, обеспечивающих противовоспалительные и хемопротекторные эффекты.

Из уровня техники известна композиция для ингибирования экспрессии генов, кодирующих ферменты Циклооксигеназу-1 и Циклооксигеназу-2 (далее ЦОГ-1, ЦОГ-2) и способ ее применения под торговым наименованием «Мелоксикам» в форме раствора для внутримышечного введения, 10 мг/мл (ЛС-007393/09-220618).

Данная композиция является нестероидным противовоспалительным средством, обладающим противовоспалительным, жаропонижающим, антипиритическим действием (ЛС -007393/09 - 220618 далее - [1]).

Механизм действия данного препарата заключается в ингибировании синтеза простагландинов в результате избирательного подавления ферментативной активности циклооксигеназы ЦОГ-2.

Кроме того, при назначении Мелоксикама в высоких дозах, при длительном применении в сочетании с индивидуальными особенностями пациента, ингибирование им синтеза ЦОГ-1, 2 снижается.

Еще одним недостатком известного средства [1] является возможность вызывания им эрозивно-язвенного заболевания желудочно-кишечного тракта.

Поэтому недостатком применения известного решения [1] является то, что ингибирование постоянно присутствующего изофермента ЦОГ-1 приводит к побочным действиям со стороны желудка и почек.

При этом поиск и разработка новых соединений, проявляющих фармакологическую активность, сопряжены с определенными сложностями, поскольку необходимо, чтобы новое вещество не только оказывало нужное терапевтическое действие, но было бы безопасным для пациента, обладало бы низкой токсичностью и минимумом побочных эффектов.

В связи с этим актуальным является изучение новых аспектов применения уже известных соединений, лекарственных препаратов, так как их потенциально возможное негативное или позитивное влияние на организм человека уже достаточно хорошо изучено и подтверждено обширной клинической практикой.

При этом из уровня техники известен препарат Нобазит® включающий активное вещество энисамия йодид. Данное активное вещество является производным изоникотиновой кислоты (N-метил-4-бензилкарбомидопиридиний йодид).

Препарат выпускается в форме капсул, таблеток, раствора и сиропа (см. Инструкцию по применению лекарственного препарата для медицинского применения Нобазит® (энисамия йодид, таблетки, покрытые пленочной оболочкой) ЛП-003508 от 16.03.2016).

Препарат Нобазит® (МНН энисамия йодид) представляет собой противовирусное средство, подавляющее действие вирусов гриппа и других возбудителей ОРВИ за счет ингибирующего влияния на процесс проникновения вирусов через клеточную мембрану.

Энисамия йодид повышает резистентность организма к вирусным инфекциям, снижает острые клинические проявления вирусной интоксикации и способствует сокращению продолжительности заболевания.

Предложенная группа решений направлена на достижение следующих технических результатов:

- Ингибирование воспаления;

- Подавление образования радикалов;

- Воздействие на NF-κВ в качестве мишени;

- Инициация экспрессии мРНК;

- Фармакологическое влияние на медиаторы воспаления: ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κВ, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-альфа, ИЛ-4, ИЛ-10 и TGFb;

- Стабильное ингибирование синтеза ЦОГ-1, 2;

- Отсутствие возникновения эрозивно-язвенного заболевания желудочно-кишечного тракта.

Согласно первому независимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, для ингибирования экспрессии генов, кодирующих ЦОГ-1, 2, NF-κВ, ИЛ-1, ИЛ-6, TGF1b, до увеличения в крови - экспрессии мРНК, продукции ИЛ-10 и секреции мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

Согласно второму зависимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, при котором секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в крови увеличивается на 20-50%.

Согласно третьему зависимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, при котором одновременно с ингибированием генов в крови, кодирующих ЦОГ-1, 2, NF-κВ, ИЛ-1, ИЛ-6, TGF1b также увеличивается экспрессия мРНК и продукция ИЛ-10, причем секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 увеличивается на 20-50%.

Согласно четвертому независимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, при котором для ингибирования экспрессии генов, кодирующих ЦОГ-1 до увеличения в крови - экспрессии мРНК, продукции ИЛ-10 и секреции мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

Согласно пятому зависимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, при котором секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в крови увеличивается на 20-50%.

Согласно шестому зависимому пункту формулы предложенной группы решений заявлено применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, при котором одновременно с ингибированием генов в крови, кодирующих ЦОГ-1 также увеличивается экспрессия мРНК и продукция ИЛ-10, причем секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 увеличивается на 20-50%.

Графические материалы

Рисунок 1 - влияние ФГА 0,1 мг/мл на уровень экспрессии мРНК генов ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb в МНФК при инкубации 48 ч. Достоверное отличие от контроля при Р<0,05. Представлены данные 6 независимых экспериментов значения относительного уровня экспрессии генов ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb при инкубации с энисамия йодидом в течение 48 час.

Рисунок 2 - влияние энисамия йодида в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ на уровень экспрессии мРНК генов ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb в МНФК, стимулированных ФГА, при инкубации 48 ч. Представлены данные 6 независимых экспериментов.

Рисунок 3 - влияние энисамия йодида в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ на уровень экспрессии мРНК генов ЦОГ -1, ЦОГ -2, NF-κB, TGFlb в МНФК, нестимулированных ФГА, при инкубации 48 ч. Представлены данные 6 независимых экспериментов.

Рисунок 4 - влияние энисамия йодида в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ на экспрессию интерлейкинов 1,6,10 в ФГА-стимулированных МНФК при инкубации 48 часов. Представлены данные 6 независимых экспериментов.

Рисунок 5 - калибровочный график для определения концентрации ИЛ-1 в МНФК.

Рисунок 6 - концентрация ИЛ-1 после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 часов. Представлены значения трех экспериментов.

Рисунок 7 - калибровочный график для определения концентрации ИЛ-8 в МНФК.

Рисунок 8 - концентрация ИЛ-8 после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 часов. Представлены значения трех экспериментов.

Рисунок 9 - калибровочный график для определения концентрации ФНО-альфа в МНФК.

Рисунок 10 - концентрация ФНО-альфа после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 ч. Представлены значения трех экспериментов.

Рисунок 11 - калибровочный график для определения концентрации ИЛ-4 в МНФК.

Рисунок 12 - концентрация ИЛ-4 после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 ч. Представлены значения трех экспериментов.

Рисунок 13 - калибровочный график для определения концентрации ИЛ-10 в МНФК.

Рисунок 14 - концентрация ИЛ-10 после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ и мелоксикамом в течение 72 ч. Представлены значения трех экспериментов.

Рисунок 15 - изменение интенсивности стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции МНФК при добавлении энисамия йодида и препарата сравнения мелоксикама.

Рисунок 16 - максимальные амплитуды интенсивности стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции МНФК при добавлении энисамия йодида и мелоксикама. Представлены значения трех независимых экспериментов.

Рисунок 17 - жизнеспособность МНФК (количество клеток), инкубированных с ФГА (0,1 мг/мл), энисамия йодидом (10,50 и 100 мкМ) в течение 48 ч. Представлены значения трех независимых экспериментов, в одном эксперименте на экспериментальные лунки по 4 повтора, на контрольные - 12 повторов.

Таблица 1 - «Состав изученной мононуклеарной фракции периферической крови».

Таблица 2 - «Провоспалительные и противовоспалительные цитокины».

Сущность заявленной группы изобретений

Для подтверждения возможности осуществления каждого из решений группы был проведен ряд исследований с использованием цельной донорской крови.

В качестве доноров крови использовались здоровые женщины в возрасте 26-43 года.

Из полученной донорской крови впоследствии выделяли мононуклеарную фракцию по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколла.

Таким образом, объектом исследования являлась мононуклеарная фракция периферической крови здоровых доноров 26-43 лет (далее - МНФК).

Состав фракции составил в среднем Т-лимфоциты 52,8±3,5%, В-лимфоциты 5,7±1,02%, моноциты 8,1±0,8%, что находится в пределах референсных значений.

Одним из наиболее информативных методов оценки показателей клеточного иммунитета является исследование функционального состояния лимфоцитов, которое определяют по пролиферативному ответу клеток на митогены или антигены.

Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови человека по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколла.

Гепаринизированную кровь разводили 1:1 физическим раствором и наслаивали на фиколл (р=1,077 г/см³, производитель ООО НИИ «ПанЭко»).

Центрифугировали при 1,6 тыс.об. 45 минут. Далее отбирали кольцо МНФК в пластиковую пробирку, разводили питательной средой RPMI 1640 с глутамином (производитель ООО НПП «ПанЭКО») до 7 мл.

Помещали пробирки в центрифугу на 15 минут при 1,6 тыс.об.

Повторяли отмывку 2 раза питательной средой RPMI 1640 с глутамином (производитель ООО НПП «ПанЭКО»).

Далее разводили осадок приготовленной средой (4,5 мл питательной среды (далее DMEM)+Амфотерицин В+Гентамицин (производитель ООО НПП «ПанЭКО»)+0,5 мл эмбриональной бычей сыворотки (производитель ООО НПП «ПанЭКО»).

Полученную суспензию клеток разливали в эппендорфы по 500 мкл.

В графических материалах в таблице 1 приведен состав изученной мононуклеарной фракции периферической крови.

Из представленных результатов в таблице 1 следует, что полученные данные находятся в пределах референсных значений состава мононуклеарной фракции периферической крови.

Разведение фитогемагглютинина (далее ФГА)

Разводили 1 мг ФГА (серия 88/4, производитель ООО НПП «ПанЭКО») в 1 мл среды питательной среды DMEM при добавлении Амфотерицина В (производитель ООО «Биохимик», Саранск, Россия) и Гентамицина (производитель ООО НПП «ПанЭКО»).

Добавляли по 50 мкл в пробы с МНФК общего объема 500 мкл, для достижения конечной концентрации 0,1 мг/мл.

Разведение Мелоксикама. Мелоксикам разводили до конечной концентрации 0,0015 мг/мл в среде DMEM+Амфотерицин В+Гентамицин. На 0,5 мкл раствора (1,5 мг/мл) вносили в 500 мкл пробы с МНФК.

Так как средняя суточная доза мелоксикама для человека 7,5 мг, в экспериментах использовали конечную концентрацию 0,0015 мг/мл, а также в 10 и 100 раз большую концентрации.

Разведение Энисамия йодида. Базовая концентрация составила 10 мМ (взвешивали 35,4 мг энасмия йодида и разводили в 10 мл среды DMEM+Амфотерицин В+Гентамицин.

Разведения проводили непосредственно перед экспериментами.

Конечные концентрации в пробах составляли 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ.

Для проб с дальнейшей постановкой ПЦР использовали пробирки по 1,5 мл:

0 контроль не стимулированный ФГА;

1 контроль стимулированный ФГА;

2 - энисамия йодид 10 мкМ;

3 - энисамия йодид 50 мкМ;

4 - энисамия йодид 100 мкМ.

Пробы ставили в инкубатор на 48 часов при температуре 37°С и 10% CO₂.

По прошествии 48 часов верхний супернатант 250 мкл отбирали в эппендорфы по 1,5 мл на ИФА - определение интерлейкинов.

Остаток 250 мкл пипетировали и отбирали в пробирки по 1,5 мл для постановки РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР (экспрессия мРНК генов).

Эксперимент проводили по следующей схеме:

- Из цельной крови выделяли МНФК методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла по Boyum.

- Инкубация в течение 48 часов МНФК с энисамия йодидом следующим образом.

0 - контроль не стимулированный

1 - контроль стимулированный ФГА

2 - энисамия йодид 10 мкМ

3 - энисамия йодид 50 мкМ

4 - энисамия йодид 100 мкМ.

- Выделение мРНК из МНФК.

- Обратная транскрипция.

- ПЦР в реальном времени определение относительного изменения экспрессии мРНК.

За единицу принимали контрольную экспрессию мРНК, то есть в отсутствие какого-либо препарата.

Влияние энисамия йодида на уровеньэкспрессии генов: ЦОГ-1, ЦОГ-2 и NF-κB в мононуклеарных клетках периферической крови in vitro.

Одной из задач данного исследования являлась оценка экспрессии ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κВ, TGFb при инкубации с энисамия йодидом, как возможных медиаторов его противовоспалительного действия.

В качестве контролей использовали МНФК: стимулированные ФГА и нестимулированные ФГА.

Следует отметить, что экспрессия гена ЦОГ-2 (ЦОГ-2) не увеличивалась при воздействии ФГА - Рис. 1.

На Рис. 1 приведены значения влияние ФГА 0,1 мг/мл на уровень экспрессии мРНК генов ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb в МНФК при инкубации 48 ч.

Как видно из представленных данных, ФГА увеличивает экспрессию мРНК генов ЦОГ-1, NF-κB, TGF1b в МНФК при инкубации 48 ч на 79, 71 и 89% соответственно. Однако при этом ФГА 0,1 мг/мл снижает экспрессию ЦОГ-2 на 42%.

При этом известно, что разница в уровнях мРНК ЦОГ-2 в нестимулированной ФГА и стимулированной ФГА крови доноров может не наблюдаться. Однако зачастую у доноров, повергшихся стрессу, уровень мРНК ЦОГ-2 повышается.

Уровни экспрессии генов, участвующих во внутриклеточной передаче сигналов и активации мРНК ЦОГ-2 также увеличивается у лиц, повергшихся стрессу: это субъединицы A, D и Akt-киназы С, фосфатидилинозитолмонофосфат, митоген-активированная протеинкиназа (МАРК) Erk1, а также несколько факторов транскрипции, обнаруженных на промоторе ЦОГ-2 ССААТ / энхансер-связывающем белке альфа и бета (СЕВРА и СЕВРВ) и два транскрипционных фактора CREB1 и Est1.

Влияние исследуемого препарата - энисамия йодида на эксперссию генов ЦОГ-1,ЦОГ-2, NFkB, TGF1b оценивали в МНФК, стимулированных ФГА и в МНФК без стимуляции ФГА.

Как видно из представленных на Рис. 2, Рис. 3 данных в МНФК, стимулированных ФГА, энисамия йодид снижает экспрессию мРНК ЦОГ-1, ЦОГ-2, NFkB, TGFlb в концентрации 10 мкМ и 50 мкМ.

В концентрации 100 мкМ энисамия йодид снижает экспрессию ЦОГ-2 и TGFlb, но увеличивает - ЦОГ-1 и NF-κB, белков, экспрессирующихся на начальных стадиях воспалительного процесса, то есть с увеличением концентрации происходит активация медиаторов воспаления.

В МНФК без стимуляции ФГА энисамия йодид подавляет экспрессию мРНК ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb во всех трех концентрациях.

Прослеживается обратная концентрационная зависимость данного эффекта: в наибольшей степени экспрессия подавляется в концентрации 10 мкМ: ЦОГ-1 на 55%, ЦОГ-2 на 54%, NF-κB на 46%, TGFlb на 31%.

Энисамия йодид в меньшей степени подавляет экспрессию циклооксигеназ в концентрации 50 мкМ: ЦОГ-1 на 36%, ЦОГ-2 на 40, и в концентрации 100 мкМ на 21 и 34% соответственно.

Из уровня техники известно, что НПВС индометацин в концентрации 10 мкМ подавляет экспрессию мРНК интерлейкина-6 на 83 и 73% соответственно в МНФК, обработанных ЛПС, что свидетельствует об одинаковом порядке концентрации и степени ингибирования экспрессии медиаторов воспаления энисамия йодидом и индометацином.

Таким образом, прослеживается обратная концентрационная зависимость действия энисамия йодида на экспрессию ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGFlb в МНФК. Как без стимуляции, так и с одновременной стимуляцией ФГА, в МНФК энисамия йодид подавляет экспрессию ЦОГ-1, ЦОГ-2, NF-κB, TGF1b в концентрациях 10 и 50 мкМ.

В концентрации 100 мкМ проявляется индукция экспрессии NF-κB.

Данный эффект наблюдается в модельной системе, когда высокая концентрация энисамия йодида (превышает терапевтические) сохраняется длительное время.

По избирательности действия в отношении ингибирования обеих изоформ ЦОГ выделяют селективные и неселективные НПВС.

Неселективные в одинаковой степени подавляют оба изофермента, селективные преимущественно угнетают ЦОГ-2.

Причем селективные ингибиторы ЦОГ-2 менее эффективны при боли, связанной с воспалительными поражениями суставов и позвоночника, чем неселективные НПВС.

Ингибирование ЦОГ-2 рассматривается как один из важных механизмов противовоспалительной и анальгетической активности НПВС.

IKKβ также является мишенью действия НПВС.

Подавляя IKKβ (Inhibitor of kappa В kinase β), салицилаты угнетают фосфорилирование IkB (ингибитора нуклеарного фактора транскрипции NF-κВ) и тем самым препятствуют его транслокации в ядро клетки, что в результате подавляет продукцию провоспалительных цитокинов.

Неацитилированные салицилаты имеют меньше побочных эффектов, но сохраняют способность ингибировать NF-κВ путем прямого подавления IKKβ.

Согласно полученным в исследованиях данным, энисамия йодид ингибирует экспрессию циклооксигеназы и NF-κВ, что приводит к снижению воспалительных реакций.

Определение экспрессии мРНК интерлейкинов в МНФК при инкубации с энисамия йодидом в концентрациях 10, 50, 100 мкМ в течение 48 часов.

В дополнение к исследованию действия энисамия йодида на продукцию интерлейкинов методом ИФА, было протестировано его влияние на экспрессию мРНК провоспалительных интерлейкинов 1 и 6 и противовоспалительного интерлейкина 10.

Влияние энисамия йодида на экспрессию генов интерлейкинов 1,6, 10 было изучено методом реал-тайм ПЦР.

Анализ проводили на ФГА-стимулированных МНФК, то есть инкубированных в присутствии 0,1 мг/мл ФГА.

Данные представлены на Рис. 4.

Как видно из Рис. 4, экспрессия ИЛ-1 и ИЛ-6 подавляется при действии энисамия йодида.

В концентрации 10 мкМ энисамия йодид подавляет экспрессию ИЛ-1 на 62%, в 50 мкМ 67%, в 100 мкМ-на 53%.

В концентрации 10 мкМ энисамия йодид подавляет экспрессию ИЛ-6 на 72%, в 50 мкМ -73%, в 100 мкМ-на 70%.

Экспрессия ИЛ-10 повышается в присутствии энисамия йодида в концентрации 10 мкМ на 73%.

В более высоких концентрациях 50 и 100 мкМ энисамия йодид незначительно снижает экспрессию ИЛ-10 на 21 и 12% соответственно, отличия от контроля недостоверны.

Исследование влияния энисамия-йодида на продукцию мононуклеарными клетками периферической крови провоспалительных цитокинов; ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-альфа и противовоспалительных цитокинов: ИЛ-4, ИЛ-10.

Исследование влияния энисамия-йодида на уровень провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-альфа и противовоспалительных цитокинов: ИЛ-4, ИЛ-10 в среде с инкубируемыми мононуклеарными клетками периферической крови проводилось методом ИФА с использованием наборов АО «Вектор-бест-Европа», Россия.

В качестве препарата сравнения использовали мелоксикам. Мелоксикам добавляли в концентрации 1,5 мг/мл по 5 мкл в пробу с МНФК 500 мкл.

В данном эксперименте требуется более длительная инкубация с МНФК, так как измеряли собственно белок, а не его мРНК, то изменения концентрации регистрировали после 72-часовой инкубации, а не 48-часовой инкубации, как при определении экспрессии мРНК.

Определение концентрации ИЛ-1 после инкубации с энисамия йодидом в концентрации 10,.50 и 100 мкМ с МНФК в течение 72 часов.

Как видно из Рис. 6, энисамия йодида в трех исследованных концентрациях - 10, 50 и 100 мкМ, как и препарат сравнения мелоксикам в концентрации 0,015 мг/мл, не оказывают достоверно значимого влияния на уровень ИЛ-1 МНФК крови. При этом ФГА, 0,1 мг/мл, незначительно (на 9%) стимулировал продукцию ИЛ-1.

Определение концентрации ИЛ-8 после инкубации с энисамия йодидом в концентрации 10,.50 и 100 мкМ МНФК в течение 72 ч.

В эксперименте по определению влияния энисамия йодида на уровень ИЛ-8 было обнаружено, что ФГА не влиял на него (Рис. 8).

При этом ни энисамия йодид во всех исследованных концентрациях, ни препарат сравнения мелоксикам в концентрации 0,015 мг/мл, статистически достоверно не влияли на концентрацию ИЛ-8 при инкубации с МНФК.

Определение концентрации ФНОα после инкубации с энисамия йодидом в концентрации 70,50 и 100 мкМ с МНФК в течение 72 часов.

В экспериментах по изучению влияния энисамия йодида на уровень про- и противовоспалительных цитокинов ФГА не оказывал значимого влияния на ИЛ-1 и ИЛ-8.

Иммуномодулирующее действие ФГА впервые проявилось в значительной степени при исследовании действия энисамия на продукцию ФНО-альфа мононуклеарами, где ФГА простимулировал выработку ФНО-α на 2808% - Рис. 10.

На фоне стимуляции МНФК с помощью ФГА, ни энисамия йодид во всех трех изученных концентрациях, ни препарат сравнения мелоксикам, не влияли на продукцию ФНО-альфа.

Полученные данные не противоречат наличию противовоспалительной активности у мелоксикама и энисамия йодида.

Известно, что тебуфелон, двойной ингибитор циклооксигеназы (СО) / 5-липоксигеназы (LO), усиливает синтез ИЛ-1 (α и β) и ФНО-альфа при концентрациях, которые подавляют образование лейкотриенов.

Противовоспалительное действие энисамия йодида, таким образом, может быть не связано со снижением уровня ИЛ-1, ИЛ-8 или ФНО-альфа.

Определение концентрации ИЛ-4 после инкубации с энисамия йодидом в концентрации 10,.50 и 100 мкМ с МНФК в течение 72 часов.

Согласно рисунку 12. Концентрация ИЛ-4 после инкубации МНФК с энисамия йодидом 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 ч.

На рис. 12 представлены значения трех экспериментов.

На рис. 12 приведены сведения, демонстрирующие увеличение ФГА уровень ИЛ-4 почти в 10 раз.

В целом количества ИЛ-4 в МНФК были невысоки - в диапазоне 26-37 пкг/мл. На фоне индукции ФГА мелоксикам и энисамия йодид в трех тестированных концентрациях достоверно не влияли на концентрацию ИЛ-4.

Определение концентрации ИЛ-10 после инкубации с энисамия йодом в концентрации 10,.50 и 100 мкМ с МНФК в течение 72 ч.

Данные, представленные на рис. 14 демонстрируют, что ФГА вызвал повышение уровня ИЛ-10 почти в 10 раз.

На фоне индукции ФГА мелоксикам вызывал достоверно значимое снижение уровня ИЛ-10 почти в 4 раза.

Энисамия йодид и достоверно значимо увеличивал уровень ИЛ-10 в концентрации 50 мкМ - в 1,5 раза.

Использованный в работе индуктор выработки интерлейкинов ФГА, 0,1 мг/мл, незначительно (на 9%) стимулировал продукцию ИЛ-1 в МНФК и не влиял на продукцию ИЛ-8.

Так как задача эксперимента состояла в исследовании действия энисамия йодида на выработку интерлейкинов, а не ФГА, то контрольная экспрессия интерлейкинов при стимуляции ФГА была принята за 100%, относительно нее оценивали влияние собственно энисамия йодида.

Действие изучаемых препаратов на уровень цитокинов оценивалось при одновременной инкубации МНФК с ФГА и препаратами, то есть увеличение или снижение их выработки оценивалось относительно ФГА-стимулированных МНФК.

Показано, что ни энисамия йодид во всех исследованных концентрациях, ни препарат сравнения мелоксикам в концентрации 0,015 мг/мл, статистически достоверно не влияли на концентрацию ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО-альфа при инкубации с ФГА-стимулированными МНФК.

В научной литературе имеются некоторые сведения о влиянии НПВС на экспрессию мРНК цитокинов и количественном определении цитокинов в МНФК, имеются одиночные сведения.

Так, согласно данным Komatsu Н, 1991, НПВС индометацин, аспирин, ибупрофен, фенилбутазон снижают концентрацию провоспалительного цитокина ИЛ-6 в МНФК после 40-часовой инкубации на 50% в концентрациях 0,09 мкМ, 0,18 мкМ, 6,29 мкМ и 0,22 мкМ соответственно.

Эти цифры соотносились с IC₅₀ для выработки ПГЕ2: самым эффективным в этом ряду оказался индометацин.

Что касается действия энисамия йодида на продукцию противовоспалительных цитокинов, то нами была обнаружена стимуляция выработки ИЛ-10 в МНФК, максимально в 1,5 раза в присутствии 50 мкМ энисамия йодида.

Ранее предоставленные данные о предсказании наиболее вероятных медиаторов противоспалительной активности энисамия также свидетельствует о том, что энисамия йодид является стимулятором ИЛ-10.

Условно цитокины можно подразделить на провоспалительные и противовоспалительные. Их перечень приведен в таблице 1.

Несмотря на условное разделение, изменение экспрессии ключевых цитокинов может служить критерием оценки противовоспалительного действия новых соединений.

Таким образом, согласно полученным нами данным, механизмы противовоспалительного действия энисамия йодида могут быть связаны с ингибированием экспрессии ИЛ-1, ИЛ-6, TGFb и увеличением экспрессии и продукции ИЛ-10.

Исследования влияния энисамия-йодида на оксидантную активность такрофагов и их жизнеспособность.

Активированная хемилюминесценция является очень ценным показателем, позволяющим оценивать некоторые важные виды активности лекарственных препаратов антиоксидантную, противовоспалительную и противоаллергическую.

По изменению интенсивности стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции МНФК при добавлении энисамия йодида и препарата сравнения мелоксикама было оценено их действие на оксидантную активность макрофагов.

Данные, представленные на Рис. 15 и 16, свидетельствуют о подавлении интенсивности стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции МНФК в присутствии энисамия йодида, зависящем от его концентрации: с увеличением концентрации до 100 мкМ кривая приближается к изолинии (Рис. 15).

Максимальные амплитуды интенсивности стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции МНФК снижались в присутствии энисамия йодида и мелоксикама.

Если принять контрольную хемилюминесценцию МНФК, то есть в отсутствие препаратов, за 100%, то в присутствии 10 мкМ энисамия этот показатель составил 82%, в присутствии 50 мкМ энисамия 79%, а в присутствии 100 мкМ энисамия йодида 5% (Рис. 16).

Препарат сравнения мелоксикам в концентрации 0,0015 мг/мл, соответствующей средней терапевтической дозе для человека (7,5 мг в сутки), практически не влиял на стимулированную люминол-зависимую хемилюминесценцию МНФК незначительно.

В присутствии 0,015 мг/мл, в 10 раз более высокой концентрации мелоксикама, максимальная амплитуда СЛХЛ составила 58% от контрольной, а в присутствии 0,15 мг/мл мелоксикама - 1% от контрольной: было обнаружено практически полное, 100% ингибирование СЛХЛ.

Полученные данные свидетельствуют о подавлении окислительных реакций в МНФК в присутствии как энисамия йодида, так и мелоксикама, а также о наличии антиоксидантной и противовоспалительной активности у этих препаратов.

Исследования влияния энисамия-йодида на жизнеспособность МНФК методом МТТ

МНФК выделяли из свежей донорской крови и вносили в лунки 96-луночного планшета с добавлением во все лунки, кроме контрольной, ФГА 0,1 мг/мл и энисамия йодида в концентрация 10, 50 и 100 мкМ.

Через 48 ч оценивали жизнеспособность клеток методом МТТ.

На Рис. 17 представлены данные о влиянии энисамия-йодида на жизнеспособность МНФК, где оптическая плотность лунок характеризует жизнеспособность клеток.

Сведения, приведенные на рис. 17, демонстрируют, что статистически значимого влияния энисамия йодида на жизнеспособность МНФК не выявлено. Это обстоятельство свидетельствует об отсутствии цитотоксического действия энисамия йодида на МНФК в диапазоне исследованных концентраций и подтверждает обусловленность их антиоксидантного действия вследствие развития специфических эффектов, в том числе подавления образования радикалов.

Группа изобретений относится к области биохимии, фармацевтики, медицины, а именно к применению энисамия йодида для снижения воспалительных реакций у человека при острых респираторных инфекциях. Раскрыто применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном количестве, для ингибирования экспрессии генов, кодирующих ЦОГ-1, 2, NF-κB, ИЛ-1, ИЛ-6, TGF1b, увеличения в крови экспрессии мРНК, продукции ИЛ-10 и секреции мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала средств определенного назначения. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном количестве, для ингибирования экспрессии генов, кодирующих ЦОГ-1, 2, NF-κB, ИЛ-1, ИЛ-6, TGF1b, увеличения в крови экспрессии мРНК, продукции ИЛ-10 и секреции мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

2. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном количестве, по п. 1, отличающееся тем, что секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в крови увеличивается на 20-50%.

3. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном количестве, по п. 1 отличающееся тем, что одновременно с ингибированием генов в крови, кодирующих ЦОГ-1, 2, NF-κB, ИЛ-1, ИЛ-6, TGF1b также увеличивается экспрессия мРНК и продукция ИЛ-10, причем секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 увеличивается на 20-50%.

4. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном количестве, для ингибирования экспрессии генов, кодирующих NF-κB, увеличения в крови экспрессии мРНК, продукции ИЛ-10 и секреции мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

5. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, по п. 4, отличающееся тем, что секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в крови увеличивается на 20-50%.

6. Применение композиции, включающей действующее вещество энисамия йодид в эффективном его количестве, по п. 4, отличающееся тем, что одновременно с ингибированием генов в крови, кодирующих NF-κB, также увеличивается экспрессия мРНК и продукция ИЛ-10, причем секреция мононуклеарами противовоспалительного цитокина ИЛ-10 увеличивается на 20-50%.