СНИЖЕНИЕ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ С ПОМОЩЬЮ ФОСФОЛИПАЗЫ Российский патент 2024 года по МПК A23C9/12 A23C19/00 A23C19/32 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к процессам производства молочных продуктов, в частности свежих молочных продуктов и сырных продуктов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Грамотрицательные бактерии, в частности принадлежащие к группе кишечной палочки, относятся к числу многих групп микроорганизмов, которые обычно присутствуют в сыром молоке. Они являются обычными загрязняющими агентами в сырах и других молочных продуктах. Является хорошо известной проблемой то, что все свежие молочные продукты с более высоким рН очень чувствительны к росту кишечных палочек.

Высокие уровни кишечной палочки в сыром молоке могут указывать на антисанитарные процессы на ферме, такие как недостаточное охлаждение. Поэтому колиформные бактерии были использованы в качестве показателей микробной гигиены в молочной промышленности.

Колиформные бактерии представляют собой аэробные или факультативно анаэробные грамотрицательные бактерии, неспорообразующие палочки, способные ферментировать лактозу с образованием газа и кислоты в течение 48 часов при температуре от 32 до 35°С. Стандарты для кишечной палочки включены в нормативные документы (например нормативный документ Управления США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов о пастеризованном молоке класса "А"). Большинство родов бактерий, составляющих группу кишечной палочки, относятся к семейству Enterobacteriaceae, в то время как по крайней мере один род со штаммами, признанными кишечной палочкой, Aeromonas, относится к семейству Aeromonadaceae. Более 20 грамотрицательных родов соответствуют фенотипическим критериям колиформных бактерий, в том числе Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Serratia и Enterobacter.

Рост или гибель колиформных бактерий в молочных продуктах, таких как сыр, зависит от различных параметров, таких как рН сыра, зрелость сыра, содержание влаги, содержание соли, содержание свободных жирных кислот и другие. В частности, колиформные бактерии преобладают в сыре с более высоким значением рН и более высокой водной активностью ( A., et al. "Coliform detection in cheese is associated with specific cheese characteristics, but no association was found with pathogen detection." Journal of dairy science 99 (2016): 6105-6120).

Для снижения риска заболеваний пищевого происхождения рекомендуется предпринять усилия, направленные на улучшение гигиены и практики производства молока на фермах. К ним относятся такие процессы, как регулярные проверки здоровья животных, тестирование молока и технологического оборудования и установление соответствия гигиеническим требованиям, а также мониторинг критических точек в таких процессах, как температура во время охлаждения и транспортировки.

Одной из стратегий снижения распространенности грамотрицательных бактерий, таких как кишечная палочка, в молочных продуктах является пастеризация. Например, пастеризация молока перед производством сыра проводят для уничтожения не менее 10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ)/г бактерий, чтобы обеспечить более безопасный продукт с увеличенным сроком годности. Однако пастеризация может влиять на свойства молока, такие как денатурация сывороточного белка и последующие взаимодействия с каппа-казеинами. Пастеризация молока также может привести к недостаточному развитию вкуса в сыре из-за инактивации ферментов и потери нативной микробной флоры, присутствующей в молоке.

Молочные продукты, такие как сырные продукты, с рН выше 6,0 очень чувствительны к росту кишечных палочек и поэтому имеют очень короткий срок хранения. Одним из таких сыров является "Кесо Фреско", происходящий из латиноамериканских стран. Это свежий, мягкий, белый сыр, который традиционно изготавливается из сырого коровьего или козьего молока и имеет мягкий, соленый вкус с рассыпчатой текстурой. Кесо Фреско, приготовленный из сырого молока, предназначен для употребления в течение 1-2 недель после получения из-за образования загрязняющих микроорганизмов, включающих бактерии, дрожжи и плесень. С другой стороны, Кесо Фреско, приготовленный из пастеризованного молока, имеет срок годности менее 30 суток, даже при хранении при температуре ниже 6°С. Нежелательный рост микроорганизмов может привести к образованию газа и сывороточной жидкости, а также к изменению текстуры и привкусу, таким образом делая продукт непригодным для употребления.

Во многих случаях производство Кесо Фреско является в большой степени ручным и риск постконтаминации кишечной палочкой является высоким. Содержание кишечной палочки в конечном продукте часто превышает 10⁴ КОЕ/г продукта в конце срока годности. Неудивительно, что сыр Кесо Фреско был связан с несколькими вспышками пищевых заболеваний.

Используя производственные методы, такие как хорошая гигиена, можно снизить риск загрязнения. Кроме того, для процесса производства Кесо Фреско была предложена переработка молока под высоким давлением (НРР) (Sandra, S., М.А. Stanford, and L. Meunier Goddik. "The use of high-pressure processing in the production of queso fresco cheese." Journal of food science 69.4 (2004): 153-158). Однако, было обнаружено, что НРР обработка приводит к измененным органолептическим свойствам и снижению твердости, эластичности и рассыпчатости при хранении, а также к увеличению неровности поверхности и появлению маслянистости.

В US 8241690 раскрыт способ сохранения сыра с высокой влажностью с помощью консервирующей смеси сорбиновой кислоты, низина и ферментной системы под названием Sea-i® от Bienca S. А (Бельгия). Sea-i® основана на лактопероксидазной системе (система LPS) и описана, например, в ЕР3030096 (Bienca, Бельгия), где раскрыта композиция на основе системы LPS, содержащая лактопероксидазу, тиоцианат, глюкозоксидазу и глюкозу. Глюкозооксидаза образует перекись водорода на основе окисления глюкозы.

Как и в случае с пероксидазами в целом, лактопероксидаза (LP) катализирует реакции, в которых восстанавливается перекись водорода и окисляется подходящий донор электронов. LP сама по себе не обладает антибактериальным действием, но в сочетании с некоторыми субстратами, тиоцианатом и перекисью водорода, образует антимикробную систему.

Однако возможное токсикологическое действие LPS и входящих в его состав компонентов изучено не полностью. В качестве примера было обнаружено, что тиоцианат-ион может препятствовать поглощению йода. По-прежнему существует необходимость в эффективной стратегии подавления нежелательных микроорганизмов или продления срока хранения молочных продуктов, оптимально без ущерба для органолептических свойств и внешнего вида продукта.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагается новое применение фермента фосфолипазы А1 (ЕС 3.1.1.32) в способе получения молочного продукта, в частности продукта с рН выше 5,0 и содержанием влаги выше 40%. При использовании в настоящем изобретении и, если не указано иное, рН и содержание влаги, упомянутые в связи с молочными продуктами, применимыми в настоящем изобретении, относятся к значению рН и содержанию влаги, определяемыми в момент, когда продукт готов к употреблению после изготовления.

Содержание влаги определяется согласно IDF (Международная молочная федерация) (1982) Определением общего содержания твердых веществ в сыре и плавленом сыре. Стандарт FIL-IDF 4А: 1982. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Молочные продукты с рН выше 5,0 и содержанием влаги выше 40% подвержены микробным загрязнениям, включая загрязнение грамотрицательными бактериями (например колиформными бактериями), дрожжами и плесенью, что может привести к заболеваниям, имеющим пищевое происхождение, если их не контролировать, неожиданно было обнаружено, что фосфолипаза А1 может быть использована для уменьшения роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени в молочных продуктах, особенно в свежих молочных продуктах с более коротким сроком хранения.

В настоящем изобретении также предлагаются молочные продукты, предпочтительно свежие молочные продукты, приготовленные из молочной основы, к которой добавляют фосфолипазу А1 для подавления микробных загрязнений.

Фосфолипазы использовались в молочной промышленности для стабилизации жировой эмульсии, улучшения стабильности жира, увеличения выхода, переэтерификации, усиления вкуса и ускорения старения (Casado, Victor, et al. "Phospholipases in food industry: a review." Lipases and Phospholipases. Humana Press, 2012. 495-523). Их также использовали для удаления растительных масел, увеличения выхода масла и модификации яичного желтка. Однако никогда не предлагалось использование фосфолипаз в качестве биопротекторных агентов в молочных продуктах для борьбы с микробным загрязнением и продления срока годности.

В настоящем изобретении предлагаются, в первом аспекте, способы ингибирования роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени в молочном продукте, включающие стадии (а) добавления фосфолипазы А1 к молочной основе, и (б) подготовки молочной основы для получения молочного продукта.

В настоящем изобретении предлагается, во втором аспекте, применение фосфолипазы А1 для ингибирования роста грамотрицательных бактерий (таких как колиформные бактерии), дрожжей и плесени в продуктах, приготовленных из молока. В предпочтительных воплощениях фосфолипазу А1 используют для ингибирования роста колиформных бактерий в молочных продуктах с содержанием влаги более 40%, где фермент может быть добавлен в молочный продукт в количестве от 0,1 до 50 LEU на грамм жира. Количество кишечной палочки составляет менее 10⁵ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 сутки, при хранении при температуре 1-6°С.

В третьем аспекте настоящего изобретения предлагаются молочные продукты, которые содержат фосфолипазу А1. Молочные продукты могут быть ферментированными или неферментированными продуктами. Предпочтительно, продукт представляет собой продукт, подверженный загрязнению колиформными бактериями, такой как сырные продукты и, в частности, сырные продукты, являющиеся менее кислыми и с более высоким содержанием влаги.

В предпочтительных воплощениях молочные продукты готовят из свежего молока, которое может быть сырым (т.е. непастеризованным) или пастеризованным.

В других предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предлагаются молочные продукты, такие как сырные продукты, которые содержат фосфолипазу, где молочные продукты не содержат заквасочную культуру.

В предпочтительных воплощениях фосфолипаза А1 представляет собой фосфолипазу YieldMAX или фосфолипазу YieldMAX PL (Chr. Hansen A/S, Denmark).

Молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, могут характеризоваться тем, что в них уровень дрожжей ниже, чем в продукте, приготовленном тем же способом, но без добавления фосфолипазы.

Молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, могут быть охарактеризованы тем, что уровень плесени в них ниже, чем у продукта, приготовленного тем же способом, но без добавления фосфолипазы.

Молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, могут быть охарактеризованы тем, что уровень грамотрицательных бактерий, таких как колиформные бактерии, у них ниже, чем у продукта, приготовленного тем же способом, но без добавления фосфолипазы.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10⁵ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 сутки, при хранении при температуре 1-6°С.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10⁴ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

Содержание колиформных бактерий может быть определено согласно IDF (Международная молочная федерация) (1985) Определение количества кишечной палочки (в молоке и молочных продуктах) Стандарт FIL-IDF 73А: 1985. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показан профиль подкисления сыра Минас Фрескаль, обработанного и необработанного фосфолипазой А1.

На Фиг. 2 показано газообразование в сыре Минас Фрескаль, обработанном фосфолипазой (партии 1 и 2) и необработанном фосфолипазой А1 (партии 3 и 4).

На Фиг. 3 показан профиль подкисления сыра Кесо Фреско, обработанного (точки) и необработанного (пунктир) фосфолипазой А1 в течение 5 недель.

На Фиг. 4 показано содержание влаги в сыре Кесо Фреско, который обрабатывали (точки) и не обрабатывали (пунктир) фосфолипазой А1 в течение 5 недель.

На Фиг. 5 показан внешний вид сыра Кесо Фреско, обработанного (справа) и необработанного (слева) фосфолипазой А1.

На Фиг. 6 показано среднее логарифмическое количество колиформных бактерий в сыре Кесо Фреско, обработанном (справа) и необработанном (слева) фосфолипазой А1 в течение 5 недель.

На Фиг. 7 показаны чашки Петри для определения содержания колиформных бактерий для сыра Кесо Фреско, обработанного (слева) и необработанного (справа) фосфолипазой А1.

На Фиг. 8 показано влияние нагревания на гриле на образцы сычужного сыра, обработанного (снизу) и необработанного (сверху) фосфолипазой А1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большой проблемой в пищевой промышленности является микробное загрязнение, вызванное бактериями и грибами. Из них набольшие проблемы вызывают пищевые грамотрицательные бактерии, поскольку они способны вызывать недомогания или заболевания. Химические консерванты традиционно используются для борьбы с загрязнением во время обработки пищевых продуктов. Тем не менее, существует постоянно растущий спрос общества на менее обработанные или не содержащие консервантов продукты питания.

Настоящее изобретение основано, в частности, на неожиданном открытии, что фосфолипаза А1 оказывает положительное влияние на снижение микробного загрязнения в свежих молочных продуктах. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что путем добавления фосфолипазы А1 (ЕС 3.1.1.32) в процессе приготовления можно ингибировать рост грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени, тем самым продлевая срок годности продуктов. Это открытие позволяет уменьшить или ликвидировать необходимость использования химических консервантов.

Настоящее изобретение относится к фосфолипазе А1 (ЕС 3.1.1.32) и ее применению в качестве эффективной биопротекторной стратегии для молочных продуктов, чувствительных к микробному загрязнению грамотрицательными бактериями, дрожжами и плесенью.

Фосфолипазы являются важнейшими ферментами, которые играют решающую роль в живых организмах вообще, и в метаболизме и биосинтезе фосфолипидов. Ферменты участвуют в гидролизе фосфолипидов, и можно выделить несколько типов фосфолипазных активностей, включая фосфолипазу А, В, С и D. Фосфолипазу А можно дополнительно классифицировать как фосфолипазу А1 (ЕС 3.1.1.32) или А2 (ЕС 3.1.1.4.), которые гидролизуют одну жирнокислотную ацильную группу (в положении sn-1 и sn-2 соответственно) с образованием лизофосфолипида. Фосфолипаза А1 обладает гораздо более широкой специфичностью, чем А2.

Фосфолипаза А1 определяется в соответствии со стандартной классификацией ферментов, как ЕС ЕС 3.1.1.32:

Официальное название: фосфолипаза А1

Катализируемая реакция: фосфатидилхолин + вода <=> 2-ацилглицерофосфохолин + анион жирной кислоты.

Фосфолипаза А1, используемая в настоящем изобретении, может быть любого происхождения, например животного происхождения (например полученной из млекопитающего), например из поджелудочной железы (например поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиньи), или из змеиного яда или пчелиного яда. В качестве альтернативы, фосфолипаза может иметь микробное происхождение, например может быть получена из нитчатых грибов, дрожжей или бактерий, таких как род или виды Aspergillus, например A. niger; Dictyostelium, например D. discoideum; Mucor, например М. javanicus, М. mucedo, М. subtilissimus; Neurospora, например N. crassa; Rhizomucor, например R. pusillus; Rhizopus, например R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, например S. libertiana; Trichophyton, например Т. rubrum; Whetzelinia, например W. sclerotiorum; Bacillus, например В. megaterium, В. subtilis; Citrobacter, например С. freundii; Enterobacter, например E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, например E. herbicola; Escherichia, например E.coli; Klebsiella, например K. pneumoniae; Proteus, например P. vulgaris; Providencia, например P. stuartii; Salmonella, например S. typhimurium; Serratia, например S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, например S. flexneri; Streptomyces, например S. violeceoruber; Yersinia, например Y. enterocolitica. Фосфолипаза может иметь грибковое происхождение, например может быть получена из класса Pyrenomycetes, например рода Fusarium, такого как штамм F. culmorum, F. heterosporum, F. solani, F. venenatum, или штамм F. oxysporum. Фосфолипаза также может быть получена из штамма нитевидного гриба рода Aspergillus, такого как штамм Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. Предпочтительная фосфолипаза имеет происхождение из штамма Fusarium, в частности из F. venenatum или F. oxysporum, например из штамма DSM 2672, описанного в WO 98/26057, особенно описанного в п. 36 в WO 98/26057. В других воплощениях, фосфолипаза представляет собой фосфолипазу, описанную в WO 00/32758 (Novozymes A/S, Denmark).

Фосфолипазы имеются в продаже. Фосфолипаза А1 из Thermomyces lanuginosusiFusarium oxysporum, экспрессируемая в Aspergillus oryzae, доступна под торговой маркой Lecitase®Ultra (Novozymes A/S, Denmark). Другую предпочтительную фосфолипазу А1, выпускаемую под торговой маркой YieldMAX® или YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Denmark), получают в результате глубинной ферментации штамма Aspergillus oryzae. Другая предпочтительная фосфолипаза представляет собой фосфолипазу А1 из Fusarium spp.

Другие пищевые фосфолипазы хорошо известны специалисту в данной области и могут быть найдены, например, в работе Casado, Victor, et al. "Phospholipases in food industry: a review." Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols (2012): 495-523.

В настоящем изобретении предлагается новое применение фосфолипазы А1 для ингибирования роста грамотрицательных бактерий (таких как пищевые грамотрицательные бактерии), дрожжей и плесени. Фосфолипазу А1 можно использовать для ингибирования колиформных бактерий. Примеры пищевых грамотрицательных бактерий, включают, без ограничения ими, Aeromonas spp.(например Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria), Campylobacter spp.(например Campylobacter jejuni), Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp.(например Escherichia coli, в том числе энтероинвазивная, энтеропатогенная и энтеротоксигенная Escherichia coli, а также Escherichia coli 0157:Н7, 026:Н11, O111H^-, О103:Н2), Plesiomonas shigelloides, Vibrio cholerae и Yersinia enterocolitica.

"Ингибирование" обычно означает частичное или полное снижение функции и активности клеток или микроорганизмов. Используемые здесь термины "ингибировать" или "ингибирование" в отношении бактерий, дрожжей или плесени означают, что рост, количество или концентрация бактерий не меняется или уменьшается. Это может быть измерено любыми методами, известными в области микробиологии. Ингибирование можно наблюдать, сравнивая рост, количество или концентрацию с референсным значением или контролем. Контролем может быть такой же продукт, полученный таким же образом, но без обработки фосфолипазой. Термин "ингибирование", используемый в настоящем изобретении, также относится к задержке роста микроорганизмов. Термин "задерживать" в общем случае означает акт остановки, отсрочки, торможения или вынуждение чего-либо происходить медленнее по сравнению с нормой. Используемая здесь "задержка роста бактерий, дрожжей или плесени" относится к акту отсрочки роста бактерий, дрожжей или плесени. Это можно наблюдать, сравнивая время, необходимое для роста микроорганизмов до заданного уровня в двух продуктах, один из которых обработан фосфолипазой, а другой нет (но в остальном такой же).

Уровень роста микроорганизмов, включая рост бактерий, можно оценивать с использованием любых обычных методов, известных в данной области техники, например, с использованием методов, описанных в Бактериологическом аналитическом руководстве (ВАМ) FDA (Управления по контролю за продуктами и лекарствами США), в котором представлены предпочтительные лабораторные методики агентства для микробиологических анализов пищевых продуктов и косметики. Например, анализ колиформных бактерий может быть выполнен в соответствии с Feng, Peter, et al. "ВАМ: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria." Bacteriological analytical manual (2002): 13-19.

Еще одним достоинством настоящего изобретения является продление срока годности молочных продуктов. Используемый здесь термин "срок годности" означает период времени, в течение которого пищевой продукт остается пригодным для продажи розничным покупателям. При переработке свежих молочных продуктов срок годности молочных продуктов составляет от 30 до 40 суток после приготовления, иногда даже менее, например, если в качестве исходного материала используется сырое молоко.

ПРОДУКТЫ

Свежее молоко

В одном предпочтительном воплощении молочным продуктом по настоящему изобретению является свежее молоко. Поскольку известно, что свежее молоко подвержено загрязнению колиформными бактериями, можно использовать фосфолипазу А1 в молоке, чтобы снизить риск загрязнения.

Сырные продукты

В других предпочтительных воплощениях молочный продукт по настоящему изобретению представляет собой сырный продукт, в частности сырный продукт с коротким сроком годности (например менее 2 месяцев). "Сырный продукт" представляет собой термин, определенный в соответствии с релевантными официальными правилами. Стандарты для таких продуктов хорошо известны в данной области.

Способ, описанный в настоящем документе, особенно применим к сырным продуктам с рН выше 5,0 и/или с содержанием влаги выше 40%.

В предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет рН выше 5,1, но ниже 7,0, например выше 5,2, например выше 5,3, например выше 5,4, например выше 5,5, например выше 5,6, например выше 5,7, например выше 5,8, например выше 5,9, например выше 6,0, например выше 6,1, например выше 6,2, например выше 6,3, например выше 6,4, например выше 6,5, например выше 6,6, например выше 6,7, например выше 6,8, например выше 6,9.

В предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет содержание влаги выше 40%, например выше 41%, например выше 42%, например выше 43%, например выше 44%, например выше 45%, например выше 46%, например выше 47%, например выше 48%, например выше 49%, например выше 50%, например выше 51%, например выше 52%, например выше 53%, например выше 54%, например выше 55%, например выше 56%, например выше 57%, например выше 58%, например выше 59%, например выше 60%, например выше 61%, например выше 62%, например выше 63%, например выше 64%, например выше 65%, например выше 66%, например выше 67%, например выше 68%, например выше 69%, например выше 70%, например выше 71%, например выше 72%, например выше 73%, например выше 74%, например выше 75%, например выше 76%, например выше 77%, например выше 78%, например выше 79%, например выше 80%, например выше 90% или например выше 95%. Измерение содержания влаги хорошо известно и может быть выполнено специалистом в данной области.

Значение рН может быть измерено любыми известными в данной области методами, такими как рН-зонды, электроды или измерители.

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет рН выше 5,5 и содержание влаги выше 45%, например выше 50%, 55% или 60%

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет рН выше 6,0 и содержание влаги выше 45%, например выше 50%, 55% или 60%.

В некоторых предпочтительных воплощениях, молочный продукт имеет рН выше 6,5 и содержание влаги выше 45%, например выше 50%, 55% или 60%.

В некоторых предпочтительных воплощениях, молочный продукт имеет рН выше 6,7 и содержание влаги выше 45%, например выше 50%, 55% или 60%.

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет рН 5,5-6,8 и содержание влаги от 45% до 80%.

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт имеет рН 6,1-6,7 и содержание влаги от 50% до 75%.

Такими молочными продуктами могут быть сырные продукты, такие как свежие сырные продукты с добавлением или без добавления закваски.

Предпочтительно, молочный продукт представляет собой сырный продукт с рН выше 6,0 и содержанием влаги выше 50%. Близкое к нейтральному значение рН и высокое содержание влаги в свежих, незрелых сырных продуктах делает их очень восприимчивыми к росту микробного загрязнения бактериями, дрожжами или плесенью.

Кесо Фреско

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт по настоящему изобретению представляет собой сыр Кесо Фреско. Кесо Фреско представляет собой незрелый сыр, происходящий из латиноамериканских стран, который готов к употреблению сразу или вскоре после его изготовления. Другие сыры, похожие на Кесо Фреско, включают Минас Фрескаль из Бразилии, бургосский сыр из Испании, сыр панела из Мексики, сыр кесито из Колумбии. Специалист в данной области может легко определить и идентифицировать эти сыры, например в соответствии с региональными правилами, такими как Технические правила идентификации и качества сыра (Regulamento Tecnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade de Queijos).

Сыр Коалхо

В некоторых предпочтительных воплощениях молочный продукт по настоящему изобретению представляет собой Бразильский сыр коалхо, также известный как queijo de coalho (сычужный сыр). Это фермерский сыр из северовосточной Бразилии, главным образом изготовленный из сырого молока. Его потребление распространилось по всей стране, особенно вдоль побережья. Это полутвердый сыр с влажностью от средней до высокой (например 40-42%), с полувареной или вареной массой и содержанием жира в общем количестве твердых веществ, составляющем от 35% до 60% (например 40-46%). Это твердый, легкий, желтоватый сыр с эластичной текстурой, который часто продается на палочке и который едят жареным на вертелах. При жарке сыр не должен плавиться.

Было обнаружено, что сыр коалхо, обработанный фосфолипазой, имеет более высокое значение рН по сравнению с необработанными продуктами. Неожиданным преимуществом этого является то, что продукт менее подвержен плавлению при нагревании, что делает его пригодным для потребления.

Молочные продукты без закваски

Данное изобретение особенно полезно для ингибирования роста грамотрицательных бактерий (таких как кишечные палочки), дрожжей и плесени в молочных продуктах, в которые не добавляют закваску, например в сырных продуктах, в которые не добавляют закваску. Из-за отсутствия закваски и высокого содержания воды такие продукты имеют более высокий риск микробиологического загрязнения. Фосфолипаза А1 может служить в качестве полезной стратегии для уменьшения загрязнения.

Молочный десерт

В других предпочтительных воплощениях молочные продукты по настоящему изобретению включают десертный крем (возможно с ароматизаторами, такой как карамельный, шоколадный, ванильный крем) или открытый пирог (flan), а также молочные десерты, такие как молочная пена (возможно с шоколадом, ванилью и другими ароматизаторами), молочный десерт с использованием сычужного свертывания, заварной крем или крем-брюле.

Способы

В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования роста грамотрицательных бактерий (таких как колиформные бактерии), дрожжей и плесени в молочном продукте, включающие стадию добавления фосфолипазы А1 (ЕС 3.1.1.32) к молочной основе.

Молочная основа

Для приготовления продуктов в соответствии с настоящей заявкой, в качестве исходного материала сначала берут молочную основу. "Молочная основа" широко используется в настоящей заявке для ссылки на композицию на основе молока или молочных компонентов, которая может быть использована для приготовления молочных продуктов

"Молоко" в общем случае относится к секреции молока, получаемой при доении любого млекопитающего, такого как коровы, овцы, козы, буйволы или верблюды. Молочная основа может быть получена из любого сырого и/или обработанного молочного материала, а также из восстановленного сухого молока. Молочная основа также может быть растительной, т.е. приготовленной из растительного сырья, например соевого молока, миндального молока, молока из кешью или кокосового молока. Предпочтительной является молочная основа, приготовленная из молока или молочных компонентов от коров.

Молочная основа включает, без ограничения ими, растворы/суспензии любого молока или молокоподобных продуктов, содержащих белок, таких как цельное или обезжиренное молоко, снятое молоко, пахта, восстановленное сухое молоко, сгущенное молоко и сухое молоко.

В некоторых предпочтительных воплощениях молочной основой является сырое молоко (т.е. непастеризованное), полученное от коров, овец, коз, буйволов или верблюдов. Сырое молоко является слабокислым, обычно с диапазоном рН от 6,5 до 6,7 из-за присутствия фосфатов, цитратов и других буферных солей.

Настоящее изобретение может быть предпочтительно использовано для обработки сырого молока с целью регулирования роста микроорганизмов или увеличения срока его хранения, что позволяет управлять производством, особенно когда требуется временное хранение или когда высок риск загрязнения (например из-за проблем с температурой, загрязнения резервуаров, плохого качества молока и т.д.).

Кроме того, для производства многих сыров, которые подлежат маркировке в соответствии с защищенным обозначением происхождения, закон требует наличия в сырье непастеризованного молока. Поэтому было бы особенно полезно использовать фосфолипазу А1 для контроля за ростом нежелательных микроорганизмов в таких продуктах, поскольку использование пастеризации ограничено.

В некоторых предпочтительных воплощениях молочную основу пастеризуют в соответствии с известными в данной области способами. Предпочтительно, пастеризацию выполняют путем поддержания определенной температуры в течение определенного периода времени. Специалисты в данной области способны выбрать температуру и продолжительность, чтобы убить или инактивировать определенные микроорганизмы. За этим может следовать стадия быстрого охлаждения.

В других предпочтительных воплощениях молочная основа является гомогенизированной. Гомогенизация является обычной процедурой для придания хорошей текстуры ферментированным молочным продуктам. Ее выполняют для того, чтобы разбить молочный жир на частицы меньшего размера. Более мелкие жировые шарики, созданные в этом процессе, могут легко суспендироваться в растворе, поэтому молочный жир не существует в виде слоя, отдельного от молока. Гомогенизация может быть выполнена, например, путем пропускания молока через фильтр тонкой очистки или ограничительный клапан при высоком давлении, посредством чего образуется эмульсия с уменьшенным размером частиц.

Добавление фосфолипазы А1

В соответствии с предпочтительными воплощениями настоящего изобретения фосфолипазу А1 добавляют в молочную основу в подходящих условиях. Если молоко следует пастеризовать или гомогенизировать, фосфолипазу А1 добавляют после пастеризации или гомогенизации.

Подходящие условия для проведения обработки фосфолипазой могут быть определены квалифицированным специалистом с использованием известных в данной области методов оптимизации ферментативных реакций. Можно регулировать различные параметры, такие как температура и рН молочной основы, а также количество фосфолипазы А1, для достижения необходимых результатов, принимая во внимание примеры, приведенные в данном описании, а также желательные свойства продукта. Факторы, которые следует учитывать, включают величину активности ферментов, содержание жира, время взаимодействия, активность воды, срок годности, условия хранения, упаковку и т.д. Количество может быть определено специалистом в данной области с помощью рутинных экспериментов.

Фосфолипазу можно добавлять в молочную основу при любой температуре, а затем нагревать молоко до температуры, подходящей для активации фосфолипазы. Подходящие диапазоны температур известны специалисту в данной области или могут быть определены с помощью обычных экспериментов.

Например, фосфолипазу можно добавлять в молоко в резервуаре или в молочную основу при температуре выше 3°С, например при 3-12°С, и нагревать до подходящей температуры.

В других воплощениях фосфолипазу добавляют в молоко или в молочную основу при температуре 30-55°С, например при 30-50°С, например при 31-45°С, например при 32-50°С, например при 35-43°С, например при 35-40°С.

Количество фосфолипазы, которое используют в способе по изобретению, может зависеть от активности конкретной фосфолипазы в отношении фосфолипидов, присутствующих в конкретных условиях обработки. Например, когда фосфолипазу А1 используют, как показано в примере, количество добавленной фосфолипазы может составлять от 0,1 до 50 LEU (единицы лецитазы) на грамм жира, например от 0,5 до 25, от 1 до 10 LEU на грамм жира или от 3 до 8 LEU на грамм жира.

Активность фосфолипазы можно определять, как скорость потребления гидроксида натрия во время нейтрализации жирной кислоты. Такая активность может быть выражена в единицах лецитазы (LEU) относительно стандарта лецитазы (фосфолипазы). Такие методики известны в данной области техники. Например, активность фосфолипазы А1 может быть измерена относительно стандарта фосфолипазы с использованием лецитина в качестве субстрата. Фосфолипаза А1 катализирует гидролиз лецитина до лизо-лецитина и свободной жирной кислоты. Высвободившуюся жирную кислоту титруют 0,1 н. гидроксидом натрия в стандартных условиях (рН=8,0; 40°±0,5). 1 LEU определена как количество фермента, которое в стандартных условиях (рН=8,0; 40°±0,5) приводит к той же скорости потребления гидроксида натрия (в микроэкв./мин), что и стандарт лецитазы, разбавленный до номинальной активности 1 LEU/g. Этот метод может быть осуществлен с использованием либо автоматизированной системы, либо стандартного лабораторного оборудования для проведения экспериментов по титрованию. Заквасочная культура

Изобретение особенно полезно для ингибирования роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и плесени в молочных продуктах, в которые не добавляют закваску. Такие продукты могут представлять собой неферментированные продукты. Однако в объем настоящего изобретения также входит возможное инокулирование молочного продукта заквасочными культурами с получением ферментированных продуктов. Заквасочные культуры, предпочтительно молочнокислые бактерии, можно использовать для ферментации молочной основы в контролируемых условиях, с получением молочной кислоты из сахаров, которые присутствуют в природе. Ферментация вызывает снижение рН и позволяет развиваться ароматам. Термин "закваска" или "заквасочная культура", используемый в настоящем контексте, относится к культуре одного или нескольких пищевых микроорганизмов, в частности молочнокислых бактерий, которые отвечают за подкисление молочной основы. Закваски могут быть свежими, замороженными или сублимированными. Определение типа закваски и количеств, которые будут использоваться, в зависимости от необходимого молочного продукта, который будет произведен, входит в компетенцию обычных специалистов.

Створаживание

Для приготовления сырного продукта используют свертывающие вещества для створаживания молочной основы. Свертывающее вещество представляет собой фермент, который способен разделять молоко на твердые и жидкие компоненты. Итоговый твердый компонент известен как творог, в то время как жидкий компонент называется сывороткой.

Способы створаживания включают приведение молока в контакт с химозином, происходящим из сычуга теленка, или с имеющимся в продаже свертывающим веществом, таким как химозин (ЕС 3.4.23.4), хорошо известным в данной области техники и имеющимся в продаже, например CHY-MAX^® или CHY-MAX^® М (Chr. Hansen A/S, Denmark).

Другими полезными свертывающими веществами может быть мукорпепсиновые микробные свертывающие вещества, продуцируемые посредством ферментации с использованием грибов Rhizomucor miehei, которые имеются в продаже как Hannilase^® или Microlant (Chr. Hansen A/S, Denmark).

После добавления свертывающего вещества и приведения молочной основы в соответствующее состояние процесс створаживания начинается и продолжается в течение некоторого периода времени. Специалист, обладающий обычными навыками в данной области, может легко выбрать подходящие условия процесса, такие как тип сыра, температура, кислород, добавление углеводов, количество и характеристики молочной основы и время обработки. Этот процесс может занять от двух, трех, четырех, пяти, шести часов или более. Предпочтительно, створаживание осуществляют при 30-40°С, например при 32-39°С, например при 34-38°С.

Как только молоко свернется, молочный сгусток можно ферментировать до тех пор, пока не будет достигнуто заданное значение рН (например 6,4). Затем его отделяют от сыворотки и оставляют для образования мата. В этот момент мат разрезают на секции и наслаивают, чтобы удалить больше жидкости. Ферментация продолжается в этой слоистой форме до тех пор, пока рН дополнительно не снизится, достигнув, например, рН от 5,1 до 5,7. Затем молочный сгусток солят или помещают в солевой раствор. Дополнительная обработка может быть выполнена в зависимости от желательного типа сыра перед хранением, выдержкой и упаковкой продукта. Предпочтительно, чтобы продукт хранился при холодной температуре (ниже 15°С, например ниже 10°С или ниже 6°С), чтобы продлить срок годности.

В одном предпочтительном воплощении способ включает добавление фосфолипазы А1, доступной под торговой маркой YieldMAX^® или YieldMAX^®PL (Chr. Hansen A/S, Denmark), например в дозе 5-10 LEU-P/г молочного жира. Фосфолипазу А1 можно добавлять в молочную основу после пастеризации молока и во время наполнения резервуара. Предпочтительно, чтобы температура молока составляла от 30°С до 40°С при добавлении фосфолипазы. Затем молочную основу оставляют на некоторый период времени для ферментативной реакции, например на 5, 10, 15, 20, 25, или 30 минут.

Следующие стадии могут быть использованы для изготовления продукта Кесо Фреско в соответствии с одним воплощением настоящего изобретения:

а) обеспечение молочной основы и пастеризация этой молочной основы,

б) добавление фосфолипазы А1 к молочной основе,

в) нагревание молочной основы до температуры сычужного свертывания и добавление свертывающего вещества с получением молочного сгустка,

г) нарезка молочного сгустка,

д) удаление сыворотки,

е) добавление воды и перемешивание,

ж) формование молочного сгустка,

з) охлаждение и замачивание молочного сгустка в рассоле и

и) упаковка сыра.

Данный способ может дополнительно включать упаковку молочного продукта для уменьшения контакта с нежелательными микроорганизмами.

В настоящую заявку включены молочные продукты, получаемые описанными здесь способами.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10⁶ КОЕ/г на 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 сутки, при хранении при температуре 1-6°С.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10⁵ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 сутки, при хранении при температуре 1-6°С.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10⁴ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10³ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

В некоторых воплощениях молочные продукты, приготовленные с использованием способов, описанных в настоящей заявке, имеют содержание колиформных бактерий менее 10² КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

АСПЕКТЫ

Следующие аспекты являются предпочтительными воплощениями настоящего изобретения:

1. Способ ингибирования роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и/или плесени в молочном продукте, включающий добавление фосфолипазы А1 (ЕС 3.1.1.32) в молочную основу.

2. Способ по п. 1, в котором молочной основой является сырое молоко или пастеризованное молоко.

3. Способ согласно любому из аспектов 1-2, который не включает стадию добавления заквасочных культур к молочной основе.

4. Способ по любому из аспектов 1-3, где молочный продукт имеет рН выше 5,0, предпочтительно 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8 или 6,9.

5. Способ по любому из аспектов 1-4, где молочный продукт имеет содержание влаги выше 40%, предпочтительно выше 50%, например 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% или 55-60%.

6. Способ по любому из аспектов 1-5, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сырный продукт, полученный из сырого молока.

7. Способ по любому из аспектов 1-6, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сыр Кесо Фреско, Минас Фрескаль, бургос, панела, кесито или коалхо.

8. Способ по любому из аспектов 4-6, дополнительно содержащий стадию коагуляции молочной основы, которая содержит фосфолипазу.

9. Способ по любому из аспектов 1-8, где фосфолипаза А1 представляет собой фосфолипазу А1 из Aspergillus oryzae.

10. Способ по любому из аспектов 1-9, где грамотрицательные бактерии представляют собой колиформные бактерии.

11. Применение фосфолипазы Al (ЕС 3.1.1.32) для подавления роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и/или плесени в молочном продукте.

12. Применение по п. 11, где фосфолипазу А1 (ЕС 3.1.1.32) добавляют к молочной основе с получением молочного продукта и, возможно, где молочная основа представляет собой сырое молоко или пастеризованное молоко.

13. Применение по любому из аспектов 11-13, где молочный продукт не содержит заквасочных культур, добавленных к молочной основе.

14. Применение по любому из аспектов 11-13, где молочный продукт имеет рН выше 5,0, предпочтительно 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8 или 6,9.

15. Применение по любому из аспектов 11-14, где молочный продукт имеет содержание влаги выше 40%, предпочтительно выше 50%, например 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% или 55-60%.

16. Применение по любому из аспектов 11-15, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сырный продукт, полученный из сырого молока.

17. Применение по любому из аспектов 11-16, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сыр Кесо Фреско, Минас Фрескаль, бургос, панела, кесито или коалхо.

18. Применение по любому из аспектов 11-17, где молочная основа, которая содержит фосфолипазу, свертывается с использованием свертывающего вещества.

19. Применение по любому из аспектов 11-18, где фосфолипаза А1 представляет собой фосфолипазу Al Aspergillus oryzae.

20. Применение по любому из аспектов 11-19, где грамотрицательные бактерии являются колиформными бактериями.

21. Молочный продукт, содержащий фосфолипазу А1, или молочный продукт, приготовленный способами по любому из аспектов 1-10.

22. Продукт согласно аспекту 21, где молочный продукт получают из молочной основы, содержащей фосфолипазу А1 (ЕС 3.1.1.32).

23. Продукт согласно аспекту 22, где молочная основа представляет собой сырое или пастеризованное молоко.

23. Продукт по любому из аспектов 21-23, где молочный продукт не содержит заквасочных культур, добавленных к молочной основе.

24. Продукт по любому из аспектов 21-23, где молочный продукт имеет рН выше 5,0, предпочтительно 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8 или 6,9.

25. Продукт по любому из аспектов 21-24, где молочный продукт имеет содержание влаги выше 40%, предпочтительно выше 50%, например 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% или 55-60%.

26. Продукт по любому из аспектов 21-25, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сырный продукт, полученный из сырого молока.

27. Продукт по любому из аспектов 21-26, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сыр Кесо Фреско, Минас Фрескаль, бургос, панела, кесито или коалхо.

28. Продукт по любому из аспектов 21-27, где молочная основа, которая содержит фосфолипазу, свертывается с использованием свертывающего вещества.

29. Продукт по любому из аспектов 21-28, где фосфолипаза А1 представляет собой фосфолипазу A1 Aspergillus oryzae.

30. Продукт по любому из аспектов 1-29, где грамотрицательные бактерии представляют собой колиформные бактерии.

31. Продукт по любому из аспектов 1-30, который отличается тем, что содержание колиформных бактерий в продукте составляет менее 10⁵ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или на 30 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

32. Продукт по любому из аспектов 1-31, который отличается тем, что содержание колиформных бактерий в продукте составляет менее 10⁴ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

33. Продукт по любому из аспектов 1-32, отличается тем, что содержание колиформных бактерий в продукте составляет менее 10³ КОЕ/г на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на 20 сутки при хранении при температуре 1-6°С.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. БИОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ФОСФОЛИПАЗЫ НА МИНАС ФРЕСКАЛЬ

ПРИМЕР 1.1

Получение сыра Минас Фрескаль

Для получения сыра Минас Фрескаль использовали следующие стадии:

- высокотемпературная кратковременная пастеризация молока (HTST) и нормализация до 3,0% жира и 3% белка,

- заполнение резервуара молоком при 34°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX^® PL Chr. Hansen A/S, Denmark, в дозе 5 LEU/г жира),

- добавление хлорида кальция, молочной кислоты и хлорофиллового красителя,

- нагрев до 38-39°С до окончания заполнения,

- добавление свертывающего вещества (CHY-MAX^®M от Chr. Hansen A/S, Denmark),

- разрезание молочного сгустка и выдерживание в течение 10 минут,

- перемешивание в течение 35-45 минут,

- формовка в формах и поворачивание,

- охлаждение,

- упаковка для хранения.

Контрольный сыр готовили с помощью тех же стадий, но без добавления фосфолипазы А1.

Результаты - рН профиль

На Фиг. 1 показан профиль подкисления образцов сыра, обработанных фосфолипазой А1 (тестируемый сыр) и необработанных фосфолипазой (контрольный сыр). рН сыров в сутки изготовления составлял 6,35-6,45. Из фигуры видно, что контрольный сыр демонстрировал более быстрое снижение рН. Это было связано с наличием загрязнения бактериями, особенно колиформными, которые нарастали в течение всего срока годности. Колиформные бактерии не только быстро снижали рН, но и образовывали ферменты и газы, которые неблагоприятно изменяли аромат сыра. Однако у сыра, обработанного фосфолипазой, наблюдалось более медленное снижение рН. Эта разница в рН в конце срока годности оказалась очень заметной для потребителей. Этот пример демонстрирует, что ферментативная обработка оказала положительное влияние на улучшение профиля снижения рН и может быть использована для продления срока годности.

Результаты - сенсорная оценка

Ощущение свежести - еще один важный фактор, который очень ценится потребителями. Чтобы оценить это, был проведен двусторонний дискриминантный сенсорный анализ, чтобы найти "более свежий" или "более молодой" образец из двух образцов сыра, которые закодированы случайным образом. Более конкретно, каждому оценивателю были представлены два образца: тестируемый сыр (обработанный фосфолипазой) и контрольный сыр (не обработанный фосфолипазой) в последний день срока годности (D+30).

Было обнаружено, что 90% оценивателей определили сыр, обработанный фосфолипазой, как более свежий (рассчитанная статистическая ошибка 0,001%).

Результаты - газообразование

Кроме того, в сырах, обработанных фосфолипазой, в течение срока годности наблюдалось меньшее газообразование. На Фиг. 2 показано газообразование в сыре, обработанном фосфолипазой (партия 1 и 2) и в необработанном (партия 3 и 4). Все группы были изготовлены с использованием молока одинакового состава, хранились в одном и том же хранилище и были изготовлены в одних и тех же резервуарах.

Из Фиг. 2 можно видеть, что у сыра, обработанного ферментами (партии 1 и 2), не было видимых отверстий. Сенсорный тест также не показал никаких странных ароматов, появившихся в течение срока годности. Это свидетельствует о том, что фосфолипаза А1 способна подавлять рост газообразующих микроорганизмов.

ПРИМЕР 1.2

Получение сыра Минас Фрескаль

Для получения сыра Минас Фрескаль использовали следующие стадии:

- HTST (высокотемпературная, быстродействующая) пастеризация молока и нормализация до содержания жира 2,80% (соотношение жир/белок = 0,93),

- наполнение резервуара молоком при 39°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX^® PL Chr. Hansen A/S, Denmark, в дозе 5 LEU/г жира),

- добавление хлорида кальция и молочной кислоты (рН 6,45),

- добавление свертывающего вещества (CHY-MAX^® М, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- свертывание в течение 30 минут,

- разрезание молочного сгустка и выдерживание 2-3 минуты,

- перемешивание 18 минут,

- добавление соли в молочный сгусток (1,2% в расчете на объем молока),

- формовка в формы и поворачивание,

- охлаждение,

- упаковка для хранения.

Сырные продукты на 22 и 43 сутки оценивали в отношении рН, содержания жира, в лагос о держания и количества колиформных бактерий.

Содержание жира определяли методом IDF (Международная молочная федерация) (1986) в сыре и плавленом сырном продукте. Определение содержания жира - гравиметрическим методом (эталонный метод). Standard FIL-IDF 5 В: 1986. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Содержание влаги определяли методом IDF (Международная молочная федерация) (1982) Определение общего содержания сухих веществ в сыре и плавленом сыре. Standard FIL-IDF 4А: 1982. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Содержание колиформных бактерий определяли методом IDF (Международная молочная федерация) (1985) Определение количества колиформных бактерий (молоко & молочные продукты) Standard FIL-73А: 1985. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Результаты приведены в таблице 1 ниже.

Сенсорная оценка также показала, что обработанные образцы сыра сохранили свои характеристики даже в конце срока годности. В контрольных образцах наблюдались некоторые неблагоприятные сенсорные изменения.

ПРИМЕР 1.3

Приготовление сыра Минас Фрескаль

Для получения сыра Минас Фрескаль использовали следующие стадии:

- HTST пастеризация молока и нормализация до 3,0% жира и 3% белка,

- наполнение резервуара молоком при 34°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX®PL, Chr. Hansen A/S, Denmark, в дозе 5 LEU/г жира),

- добавление хлорида кальция, молочной кислоты и хлорофиллового красителя,

- нагревание до 38-39°С до окончания наполнения,

- добавление свертывающего вещества (CHY-MAX® М, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- разрезание молочного сгустка и выдерживание в течение 10 минут,

- перемешивание 35-45 минут,

- формовка в формы и поворачивание,

- охлаждение,

- упаковка для хранения.

Содержание колиформных бактерий определяли на 9, 15, 20 и 30-ые сутки, используя тот же метод, что описан в примере 1.2. Результаты приведены в Таблице 2.

Как видно из таблицы, в образцах сыра, обработанных фосфолипазой, рост колиформных бактерий был подавлен.

Сенсорная оценка показала, что сыры демонстрировали заметную разницу во вкусе. Обработанный образец сыра сохранял свои характеристики до конца срока годности, в отличие от контрольного сыра, который имел неблагоприятное изменение текстуры и вкуса.

ПРИМЕР 1.4

Приготовление сыра Минас Фрескаль

Для получения сыра Минас Фрескаль использовали следующие стадии:

- HTST пастеризация молока и нормализация до 2,50% жира (соотношение жир/белок = 0,81),

- наполнение резервуара молоком при 39°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- добавление хлорида кальция и молочной кислоты (рН 6,45),

- добавление свертывающего вещества (CHY-MAX^® М, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- свертывание в течение 18 минут,

- разрезание молочного сгустка и выдерживание в течение 2-3 минут,

- перемешивание в течение 15 минут,

- формовка в формы и поворачивание,

- засолка в 20% рассоле,

- охлаждение,

- упаковка для хранения.

Содержание колиформных бактерий определяли на 16-е сутки тем же методом, что и описанный в примере 1.2. Количество плесени и дрожжей измеряли методом IDF (Международная молочная федерация) (1995) Определение количества дрожжей & плесени (молоко & молочные продукт) Standard FIL-IDF 94 В: 1995. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Результаты приведены в таблице 3.

Этот пример демонстрирует, что фосфолипазу А1 можно использовать для ингибирования плесени и дрожжей, даже если обработанные продукты показали более высокую влажность.

ПРИМЕР 2 БИОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ФОСФОЛИПАЗЫ НА СЫР КЕСО ФРЕСКО

Получение сыра Кесо Фреско

Для приготовления сыра Кесо Фреско использовали следующие стадии

- HTST пастеризация молока и нормализация до 3,00% жира (соотношение жир/белок=0,93),

- наполнение резервуара молоком при 40°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Denmark в количестве 5 LEU/г молочного жира),

- добавление хлорида кальция и молочной кислоты (рН 6,45),

- добавление свертывающего вещества (CHY-MAX^® М, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- свертывание в течение 30 минут,

- разрезание молочного сгустка и выдерживание в течение 2-3 минут,

- перемешивание в течение 20 минут,

- формовка в формы и поворачивание,

- засолка в 20% рассоле,

- охлаждение,

- упаковка для хранения. Результаты - профиль подкисления

Нормальный срок годности Кесо Фреско составляет около 4 недель. рН сыра, обработанного фосфолипазой, и контрольного сыра измеряли еженедельно в течение 5 недель. Результаты показаны на интервальном графике на Фиг. 3 (CI 95% для среднего). Так как при изготовлении Кесо Фреско не использовали заквасочные культуры, продукты имели высокий уровень рН в течение срока годности (рН примерно 6,6-6,9 в 1-ю неделю). Хорошо видно, что рН обработанного сыра (точки) постоянно был выше, чем у контрольного сыра (пунктир) на протяжении всего срока годности. Это демонстрирует, что фосфолипаза может поддерживать высокое значение рН и продлевать срок годности.

Результаты - содержание влаги

Кесо Фреско представляет собой сыр с высокой влажностью, обычно около 60%. Содержание влаги как в обработанном сыре, так и в контрольном сыре измеряли методом IDF (Международная молочная федерация) (1982) Определение общего содержания сухих веществ в сыре и плавленом сыре. Standard FIL-IDF 4А: 1982. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Результаты показаны на интервальном графике на Фиг. 4 (CI 95% для среднего). Содержание влаги в сыре Кесо Фреско, обработанном фосфолипазой А1, было выше, чем в контрольном сыре в течение 5 недель. Это демонстрирует, что фосфолипаза может поддерживать высокое содержание влаги.

Снижение содержания влаги является показателем засыхания в упаковке и изменений текстуры сыра, что не ценится потребителями. На Фиг. 5 показан внешний вид обоих образцов сыра. Сыр, обработанный ферментом, демонстрирует меньшее усыхание и имеет более приятный внешний вид, который предпочитает потребитель.

Результаты - количество колиформных бактерий.

Количество колиформных бактерий для обоих сыров измеряли каждую неделю в течение 5 недель методом IDF (Международная молочная федерация) (1985) Подсчет колиформных бактерий (молоко и молочные продукты) Standard FIL-IDF 73А: 1985. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

На Фиг. 6 показано среднее логарифмическое количество колиформных бактерий в сыре, обработанном (справа) и необработанном (слева) фосфолипазой. В обработанном сыре наблюдается явное ингибирование бактерий.

Кроме того, оба образца сыра с 4-й недели тестировали на наличие колиформных бактерий на чашках, определенное методом IDF (Международная молочная федерация) (1985) Определение количества колиформных бактерий (молоко и молочные продукты) Standard FIL-IDF 73А: 1985. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

На Фиг. 7 показаны чашки для подсчета колиформных бактерий для сыра Кесо Фреско, обработанного (слева) и необработанного фосфолипазой (справа) (по 2 реплики). Каждая черная точка указывает на колиформную колонию. В сыре Кесо Фреско, обработанном фосфолипазой, наблюдается явное уменьшение колиформных образований.

ПРИМЕР 3 БИОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ФОСФОЛИПАЗЫ НА СЫР КОАЛХО

ПРИМЕР 3.1 Получение сыра коалхо

Для получения сыра коалхо использовали следующие стадии

- HTST пастеризация молока и нормализация до 3,2% жира (соотношение жир/белок 1,0),

- наполнение резервуара молоком при 34°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- добавление хлорида кальция (20 г/100 л сырного молока),

- добавление свертывающего вещества (28 IMCU/л (Международная молокосвертывающая единица/л) и свертывание в течение примерно 30 минут,

- разрезание молочного сгустка на 5-7 мм кубики,

- перемешивание в течение 20 минут,

- ошпаривание при 42°С (1°С/1,5 минуты),

- перемешивание 45-50 минут,

- осушение,

- засолка (1-2% начального объема молока),

- предварительное прессование (20 минут),

- формовка в формы и поворачивание,

- прессование при 4 6 кг/см в течение 1,5-2 часа,

- упаковка для хранения.

Результаты - рН, содержание влаги и содержание колиформных бактерий

рН, содержание влаги и содержание колиформных бактерий в образцах сыра измеряли на 41-е и 62-е сутки.

Содержание влаги определяли методом IDF (Международная молочная федерация) (1982) Определение общего содержания сухих веществ в Сыре и плавленом сыре. Standard FIL-IDF 4А: 1982. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

Колиформные бактерии определяли методом IDF (Международная молочная федерация) (1985) Подсчет колиформных бактерий (молоко и молочные продукты) Standard FIL-IDF 73А: 1985. International Dairy Federation, Брюссель, Бельгия.

В таблице ниже показано общее количество колиформных бактерий, влаги и рН образцов сыра.

Результаты - тесты на плавление

рН продукта влияет на плавление продукта при нагревании. Оба образца сыра коалхо, взятые на 41 сутки (слева) и 62 сутки (справа), тестировали на горячем гриле. Как показано на Фиг. 8, в обоих испытаниях обработанный ферментом сыр (снизу) не плавился, в отличие от контрольного сыра (сверху).

ПРИМЕР 3.2

Приготовление сыра коалхо

Для получения сыра коалхо использовали следующие стадии:

- HTST пастеризация молока и нормализация до 3,2% жира (соотношение жир/белок 1,0),

- наполнение резервуара молоком при 34°С,

- добавление фосфолипазы Al (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Denmark),

- добавление хлорида кальция (20 г/100 л сырного молока),

- добавление свертывающего вещества (28 IMCU/L) и свертывание в течение примерно 30 минут,

- разрезание молочного сгустка на 5-7 мм кубики,

- перемешивание в течение 20 минут,

- ошпаривание при 42°С (1°С/1,5 минуты),

- перемешивание в течение 45-50 минут,

- осушение,

- засолка (от 1 до 2% от первоначального объема молока),

- предварительное прессование (20 минут),

- формовка в формы и поворачивание,

- прессование при 4 6 кг/см² в течение 1,5-2 часов,

- упаковка для хранения.

Результаты - рН, содержание жира, влаги и содержание колиформных бактерий

рН, содержание жира, влаги и содержание колиформных бактерий в сыре измеряли на 6, 27 и 63-е сутки с использованием методов, описанных в примере 1.2.

В таблице ниже показано общее количество колиформных бактерий, влаги, жира и рН образцов сыра. На 6-е сутки количество колиформных бактерий как для контрольных, так и для обработанных образцов не может быть рассчитано из-за недостаточного разведения. Тем не менее, визуально можно наблюдать более низкую плотность колиформных бактерий для обработанного образца.

Этот пример демонстрирует, что фосфолипазу можно использовать в изготовлении сыра коалхо для ингибирования роста колиформных бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано применение фосфолипазы A1 класса EC 3.1.1.32 для ингибирования роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и/или плесени в молочном продукте. Фосфолипазу A1 класса EC 3.1.1.32 добавляют к молочной основе с получением молочного продукта, где молочный продукт не содержит заквасочных культур, добавленных к молочной основе, и имеет pH выше 5,0 и содержание влаги выше 40%. Изобретение расширяет арсенал средств для снижения микробного загрязнения в процессе приготовления молочного продукта с одновременным поддержанием значений рН и содержанием влаги в молочном продукте. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 5 пр.

1. Применение фосфолипазы A1 класса EC 3.1.1.32 для ингибирования роста грамотрицательных бактерий, дрожжей и/или плесени в молочном продукте.

2. Применение по п. 1, где указанные бактерии представляют собой колиформные бактерии.

3. Применение по п. 1 или 2, где фосфолипазу A1 класса EC 3.1.1.32 добавляют к молочной основе с получением молочного продукта.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где молочный продукт не содержит заквасочных культур, добавленных к молочной основе.

5. Применение по любому из пп. 1-4,

- где молочный продукт имеет pH выше 5,0, предпочтительно 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8 или 6,9, и/или

- где молочный продукт имеет содержание влаги выше 40%, предпочтительно выше 50%, например 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% или 55-60%.

6. Применение по любому из пп. 1-5, где молочный продукт представляет собой сырный продукт, предпочтительно сырный продукт, полученный из сырого молока, или

- где молочный продукт представляет собой сыр Кесо Фреско, минас фрескаль, бургос, панела, кесито или коалхо.