СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ БИОМОЛЕКУЛ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/543 C07K16/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области отделения биомолекул и, в частности, относится к способу отделения биомолекул от клеточной культуры или от биологического раствора в магнитном сепараторе.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Отделение биомолекул с помощью магнитных адсорбирующих сфер известно в области техники. Например, в патенте США US 7506765 В2 описан высокоградиентный магнитный сепаратор для селективного отделения магнитных частиц от суспензии, которую пропускают через матрицу пластинчатых разделительных структур из магнитного материала, который расположен в магнитном поле. Патент США US 6602422 В1, который полностью включен в описание посредством ссылки, относится к способу отделения и высвобождения для очистки биологического материала на разделительной микро-колонке. Этот способ включает высвобождение биологического материала из магнитных носителей и элюирование из разделительной микро-колонки, при этом магнитные носители все еще магнитно удерживаются матрицей из ферромагнитных частиц внутри разделительной микро-колонки. В патентной публикации WO 2018122246 описан способ отделения биомолекул от клеточной культуры, включающий связывание биомолекул с магнитными сферами, отделение магнитных сфер, включающих связанные биомолекулы, от остальной части клеточной культуры с использованием магнитного сепаратора, направление магнитных сфер, включающих связанные биомолекулы, в виде суспензии с добавленным буфером в отдельную элюирующую ячейку, и элюирование биомолекул из магнитных сфер в элюирующей ячейке. Патентная публикация WO 2018122089 также относится к магнитным сферам, содержащим пористую матрицу и одну или более магнитных частиц, встроенных в матрицу, и дополнительно содержащим иммуноглобулин-связывающие лиганды, ковалентно связанные с пористой матрицей.

Обработка с помощью магнитных сфер - эффективный способ очистки целевой биомолекулы непосредственно из исходной смеси банка клеток, и эта технология может заменить средства очистки, такие как центрифугирование, фильтрация и улавливающая хроматография. Магнитные сферы функционализируют лигандами, которые обладают сродством к целевой биомолекуле. Магнитные сферы добавляют и смешивают с исходной смесью в течение определенного времени для специфического связывания всех целевых биомолекул, находящихся в смеси. После связывания магнитные сферы захватывают магнитом, а клетки и примеси декантируют. Промывочный буфер добавляют к магнитными сферам, магнит выключают и производят смешивание с промывочным буфером и магнитными с. После смешивания включают магнит для улавливания сфер и декантируют промывочный буфер. После нескольких промывок к магнитным сферам добавляют элюирующий буфер таким же образом, как и промывочный буфер, и целевую биомолекулу высвобождают из магнитных сфер с использованием нескольких стадий периодического элюирования. Все стадии промывки и элюирования выполняют в периодическом режиме и, поскольку для получения высокого выхода при элюировании требуется выполнить несколько стадий периодического элюирования, целевой объект будет более разбавлен при использовании этого способа по сравнению с колоночной хроматографией. Кроме того, при использовании периодического элюирования труднее оптимизировать условия элюирования, поскольку элюирующий буфер должен титровать промывочный буфер для достижения правильных условий элюирования для высвобождения целевой биомолекулы из магнитных сфер, и для этого требуются различные или большие объемы элюирующего буфера для каждой стадии элюирования. Один из способов преодоления этого недостатка заключается в переносе промытых сфер в хроматографическую колонку для проведения стадии элюирования, чтобы уменьшить объем элюирующего буфера, и в сборе элюата, используя фракционирование с одним оптимизированным элюирующим буфером. Однако для этого требуется дополнительное оборудование и наполнитель для колонки, что отнимает много времени.

Таким образом, в области техники существует потребность в улучшенных способах отделения биомолекул, включающих эффективное улавливание и очистку биомолекул из исходной смеси, одновременно достигающих сокращения времени и повышения экономичности способа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вышеупомянутую цель, состоящую в предоставлении улучшенных способов отделения биомолекул, достигают в изобретении, которое относится к способу отделения биомолекул путем одновременного применения проточного элюирования и перемешивания в магнитном сепараторе. Как показано в описании, таким образом можно проточно элюировать целевую биомолекулу непосредственно из магнитного сепаратора с неожиданно высоким выходом и чистотой за счет использования небольшого объема элюирования. Точность способа равна точности колоночной хроматографии, но при этом требуется значительно меньшее время обработки.

В частности, изобретение относится к способу отделения биомолекулы от клеточной культуры или от биологического раствора, включающему следующие стадии:

(a) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу;

(b) приведение клеточной культуры или биологического раствора, содержащего биомолекулу, в контакт с магнитными частицами с получением магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу;

(c) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(d) при необходимости, промывание магнитных частиц промывочной жидкостью;

(e) перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости магнитного сепаратора с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц в магнитном сепараторе;

(f) обеспечение потока элюирующей жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости, для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц при удержании магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе.

Дополнительное усовершенствование, осуществленное авторами изобретения, заключается в том, что после магнитного разделения может следовать мембранная хроматография для дополнительной очистки биомолекулы. Соответственно, изобретение относится к способу отделения биомолекулы от клеточной культуры или от биологического раствора, включающему следующие стадии:

(a) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу;

(b) приведение клеточной культуры или биологического раствора, содержащего биомолекулу, в контакт с магнитными частицами с получением магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу;

(c) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(d) при необходимости, промывание магнитных частиц промывочной жидкостью;

(e1) обеспечение потока элюирующей жидкости через магнитный сепаратор для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц при удержании магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(f1) направление биомолекулы, элюированной из магнитного сепаратора, в устройство для мембранной хроматографии;

(g1) отделение биомолекулы от примесей и/или загрязняющих веществ с помощью мембранной хроматографии.

Предпочтительные аспекты изобретения описаны ниже в подробном описании и в зависимых пунктах формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана блок-схема способа отделения биомолекулы согласно изобретению.

На фиг. 2 схематически показана система, подходящая для использования в раскрытом в описании способе.

На фиг. 3 показан схематический чертеж неограничивающего воплощения магнитного сепаратора, подходящего для использования в раскрытом в описании способе.

На фиг. 4 показана кривая элюирования для эксперимента с поликлональным антителом IgG, описанного ниже в примере 1.

На фиг. 5А, 5В и 5С показаны кривые элюирования для эксперимента с моноклональными антителами (mAb), описанного ниже в примере 2.

На фиг. 6 показана блок-схема альтернативного способа отделения биомолекулы по изобретению.

На фиг. 7 показано поперечное сечение устройства для мембранной хроматографии, которое можно использовать согласно одному воплощению альтернативного способа отделения биомолекулы по изобретению.

На фиг. 8А, 8В, 8С и 8D показаны кривые элюирования для эксперимента с моноклональными антителами (mAb), описанного ниже в примере 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение решает или по меньшей мере смягчает проблемы, связанные с существующими способами разделения биомолекул, обеспечивая, как показано на фиг. 1, способ отделения биомолекулы от клеточной культуры или биологического раствора, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу;

(b) приведение клеточной культуры или биологического раствора, содержащего биомолекулу, в контакт с магнитными частицами с получением магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу;

(c) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(d) при необходимости, промывание магнитных частиц промывочной жидкостью;

(e) перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости магнитного сепаратора с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц в магнитном сепараторе;

(f) обеспечение потока элюирующей жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости, для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц при удержании магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе.

Существенное преимущество раскрытого в данном документе способа состоит в том, что биомолекулу элюируют с неожиданно низким общим объемом элюирования, в частности, с таким объемом элюирования, который составляет максимум 10 объемов слоя элюирующей жидкости, например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 объем слоя; предпочтительно максимум 4 объема слоя, более предпочтительно максимум 3 объема слоя. В данном случае «объем слоя» следует понимать как объем осажденных магнитных частиц, обычно выражаемый в миллилитрах (мл) или литрах (л). Чем меньше общий объем элюирования, необходимый для элюирования биомолекулы, тем более концентрированным и менее диспергированным является образец элюированной биомолекулы. Высокая концентрация биомолекулы желательна для последующих стадий очистки, чтобы избежать обработки больших объемов образца.

Как было упомянуто выше, дополнительное усовершенствование раскрытого в данном документе способа может включать дополнительную очистку биомолекулы с помощью мембранной хроматографии после магнитной сепарации. Таким образом, изобретение обеспечивает, как показано на фиг. 6, способ отделения биомолекулы от клеточной культуры или биологического раствора, включающий следующие стадии:

(а) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу;

(b) приведение клеточной культуры или биологического раствора, содержащего биомолекулу, в контакт с магнитными частицами с получением магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу;

(c) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(d) при необходимости, промывание магнитных частиц промывочной жидкостью;

(e1) обеспечение потока элюирующей жидкости через магнитный сепаратор для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц при удержании магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(f1) направление биомолекулы, элюированной из магнитного сепаратора, в устройство для мембранной хроматографии;

(g1) отделение биомолекулы от примесей и/или загрязняющих веществ с помощью мембранной хроматографии.

Добавление мембранной хроматографии после магнитной сепарации приводит к неожиданно простому и быстрому способу, который обеспечивает биомолекулы высокой чистоты.

Термин «биомолекула» имеет свое обычное значение в области биотехнологии, а именно биомолекулы продуцируются (часто рекомбинантно) клетками в клеточной культуре, и их очищают из клеточной культуры любыми способами разделения и очистки. Альтернативно, биомолекулы присутствуют в биологическом растворе, который не обязательно происходит из клеточной культуры. Неограничивающими примерами биомолекул являются биомакромолекулы, которые представляют собой большие биологические полимеры, состоящие из мономеров, связанных вместе, например, пептиды и белки (которые могут быть нативными или рекомбинантными), включая, но не ограничиваясь ими, ферменты, антитела и фрагменты антител, а также углеводы и последовательности нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК. Другими неограничивающими примерами биомолекул являются плазмиды и вирусы. Биомолекула или биомакромолекула может быть, например, биофармацевтическим препаратом, то есть биологической молекулой, включая, но не ограничиваясь ей, биологическую макромолекулу, которая предназначена для использования в качестве фармацевтического соединения. В этом описании биомолекула, которая должна быть отделена от остальной части клеточной культуры или биологического раствора с помощью раскрытого в данном документе способа, может альтернативно называться «целевой биомолекулой» или «мишенью». Следует понимать, что термин «биомолекула» предназначен для обозначения типа биомолекулы и что форма этого термина в единственном числе может охватывать большое количество индивидуальных биомолекул.

В этом документе термин «клеточная культура» относится к культуре клеток или группе культивируемых клеток, где клетки могут быть клетками любого типа, такие как бактериальные клетки, вирусные клетки, клетки грибов, клетки насекомых или клетки млекопитающих. Клеточная культура может быть не очищенной от примесей, то есть содержать клетки, или может быть лишенной клеток, то есть культурой, не содержащей клеток или содержащей небольшое количество клеток, но содержащей биомолекулы, высвободившиеся из клеток перед удалением клеток. Кроме того, не очищенная от примесей клеточная культура, используемая в раскрытом в данном документе способе, может включать интактные клетки, разрушенные клетки, клеточный гомогенат и/или клеточный лизат.

Термин «биологический раствор» предназначен для обозначения раствора биологического происхождения, содержащего биомолекулу или смесь нескольких типов биомолекул. Примерами биологических растворов являются любые жидкости организма человека или животного, такие как плазма, кровь, мокрота, моча и молоко.

Термин «магнитная частица» определен в данном документе как частица, которая может притягиваться магнитным полем. В то же время магнитные частицы для использования в раскрытом в данном документе способе не должны агрегировать в отсутствие магнитного поля. Другими словами, магнитные частицы должны вести себя как суперпарамагнитные частицы. Частица может иметь любую симметричную форму, такую как сфера или куб, или любую асимметричную форму. Сферические магнитные частицы часто называют магнитными сферами. Следует понимать, что термины «магнитная частица», «магнитная сфера» могут быть использованы в данном документе взаимозаменяемо, без ограничения области применения магнитных частиц, имеющих сферическую форму.

Магнитные частицы, подходящие для использования в раскрытом в данном документе способе, описаны в WO 2018122089, который полностью включен в этот документ посредством ссылки. В частности, магнитные частицы могут иметь объемно-взвешенный средний диаметр (d50, v) в диапазоне от 8 до 300 мкм, например, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 105, 110, 150, 200, 250 или 300 мкм, предпочтительно в диапазоне от 20 до 200 мкм, более предпочтительно в диапазоне от 37 до 100 мкм. Кроме того, магнитные частицы, подходящие для использования в раскрытом в данном документе способе, могут иметь среднюю плотность 1,05-1,20 г/мл для осажденных магнитных частиц.

Магнитная частица, подходящая для использования в раскрытом в данном документе способе, может включать пористую матрицу, предпочтительно пористую полимерную матрицу, и одну или несколько магнитных гранул, внедренных в пористую матрицу. Магнитная частица может допустимо содержать примерно 5-15% масс. магнитных гранул. Магнитные гранулы, внедренные в пористую матрицу каждой магнитной частицы, могут иметь объемно-взвешенный средний диаметр (d50, v) от примерно 1 до примерно 5 мкм. Кроме того, в магнитной частице концентрация магнитных гранул в центральной области частицы может допустимо составлять по меньшей мере 200% от концентрации в поверхностной области магнитной частицы, при этом центральная область определена как имеющая расстояние >0,2 радиуса частицы от поверхности магнитной частицы, а поверхностная область определена, как имеющая расстояние <0,2 радиуса частицы от поверхности магнитной частицы.

Магнитные частицы для использования в раскрытом в данном документе способе содержат лиганды, способные связывать биомолекулу. Лиганды могут быть ковалентно связаны с пористой матрицей магнитных частиц. Следует понимать, что тип лиганда и его константу сродства k_off/k_on по отношению к биомолекуле выбирают на основе типа биомолекулы, которую необходимо отделить от клеточной культуры или биологического раствора. Кроме того, следует понимать, что концентрация лиганда (лигандов) на одну магнитную частицу зависит или взаимосвязана, например, с концентрацией биомолекулы в клеточной культуре или в биологическом растворе, размерами магнитных частиц и/или общим объемом магнитных частиц, добавленных в магнитный сепаратор.

В предпочтительном воплощении по изобретению магнитные частицы, используемые в раскрытом в данном документе способе отделения биомолекулы, представляют собой Mag Sepharose™ PrismA (GE Healthcare Bio-Sciences AB, арт. №17550000).

На фиг. 2 схематически показан неограничивающий пример разделительной системы 1, которую можно использовать для выполнения способа по изобретению. Система 1 включает магнитный сепаратор 5. Термин «магнитный сепаратор» имеет свое обычное значение в области процессов разделения и относится к устройству, которое отделяет магнитные частицы от текучей среды. В предпочтительном воплощении по изобретению магнитный сепаратор, используемый в способе отделения биомолекул, представляет собой сепаратор с высокоградиентным магнитным полем, альтернативно называемый системой разделения с высокоградиентным магнитным полем (HGMS), описанный в документе US 7506765 В2, который полностью включен в этот документ посредством ссылки. Части разделительной системы 1, показанные на фиг. 2, аналогичны частям системы, описанной в документе WO 2018122246, который полностью включен в этот документ посредством ссылки. Магнитный сепаратор 5 содержит вход 5а для приема исходного материала из клеточной культуры 3 или биологического раствора 3, содержащих указанную биомолекулу, и для приема магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать данную биомолекулу. Магнитный сепаратор 5 выполнен с возможностью отделения упомянутых магнитных частиц с упомянутой связанной биомолекулой от остального исходного материала. Магнитный сепаратор 5 включает части из магнитного или намагничиваемого материала внутри магнитного сепаратора, которые притягивают магнитные частицы при приложении магнитного поля.

Разделительная система 1, показанная на фиг. 2, включает улавливающую ячейку 9, которая соединена с входом 5а магнитного сепаратора 5. Улавливающая ячейка 9, показанная на фиг. 2, содержит вход 9а для клеточной культуры/биологического раствора для приема исходного материала из клеточной культуры 3 и по меньшей мере один вход 9b для магнитных частиц для приема магнитных частиц. Улавливающая ячейка 9 выполнена с возможностью смешивания исходного материала из клеточной культуры или биологического раствора с магнитными частицами, что позволяет целевой биомолекуле связываться с магнитными частицами перед ее отправкой в магнитный сепаратор 5. Однако следует понимать, что улавливающая ячейка 9 является необязательным компонентом системы 1. Клеточная культура 3 или биологический раствор 3 могут одинаково хорошо функционировать в качестве улавливающей ячейки, если магнитные сферы добавляют к клеточной культуре 3 или биологическому раствору, соответственно, с последующим добавлением исходного материала из смеси клеточной культуры и магнитных частиц или из смеси биологического раствора и магнитных частиц, соответственно, содержащих связанную биомолекулу, в магнитный сепаратор 5. Другой альтернативой может быть добавление магнитных сфер непосредственно в магнитный сепаратор 5. Раздельное добавление клеточной культуры или биологического раствора, соответственно, и магнитных сфер непосредственно в магнитный сепаратор возможно для всех воплощений.

Соответственно, стадия (b) раскрытого в данном документе способа может включать:

(i) добавление магнитных частиц в магнитный сепаратор с последующим добавлением исходного материала из клеточной культуры или биологического раствора в магнитный сепаратор, или

(ii) добавление исходного материала из смеси клеточной культуры и магнитных частиц или из смеси биологического раствора и магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу, в магнитный сепаратор.

Следует понимать, что после стадии (b), т.е. приведения клеточной культуры или биологического раствора, содержащих биомолекулу, в контакт с магнитными частицами для связывания биомолекулы с магнитными частицами, последние, указанные на стадиях (с), (d) и (е), содержат связанную биомолекулу.

Согласно стадии (d), упомянутой выше, способ по изобретению может при необходимости включать промывку магнитных частиц промывочной жидкостью. Для этой цели магнитный сепаратор 5 предпочтительно соединяют с промывочным устройством 13, предназначенным для вымывания других компонентов из магнитного сепаратора 5, кроме тех, которые связаны с частями из магнитного материала магнитным путем. Промывочное устройство 13 включает по меньшей мере одно устройство 15 для подачи промывочного буфера, подключенное к насосу и к входу 5а магнитного сепаратора, возможно, через улавливающую ячейку 9, и устройство 17 для сбора промывочного буфера, подключенное к выходу 5b магнитного сепаратора 5. Промывочное устройство 13 выполнено с возможностью пропускания промывочного буфера через магнитный сепаратор 5 для вымывания других компонентов из исходного материала, кроме тех, которые связаны с магнитными частями.

Согласно раскрытому в данном документе способу, магнитные сферы можно промывать в периодическом режиме в магнитном сепараторе, который выполнен с возможностью отключения магнитного поля, когда магнитные частицы должны быть промыты в периодическом режиме. В качестве альтернативы и предпочтительно вышеописанный способ включает применение по меньшей мере одной стадии промывки в непрерывном режиме, и в этом случае стадия (d) вышеописанного способа включает следующие подстадии:

(d1) перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц, и

(d2) обеспечение потока промывочной жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости, для удаления клеточной культуры или биологического раствора при удержании магнитных частиц в магнитном поле.

В данном документе фразу «по существу перпендикулярна указанной по меньшей мере одной плоскости» следует интерпретировать как значение угла 80-90° к указанной по меньшей мере одной плоскости.

Кроме того, стадия (d) раскрытого в данном документе способа может включать следующие подстадии:

(i) отключение магнитного поля;

(ii) повторное суспендирование магнитных частиц;

(iii) приведение магнитных частиц в контакт с частью промывочной жидкости;

(iv) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля; и

(v) удаление промывочной жидкости от удерживаемых магнитных частиц.

Альтернативно или дополнительно, стадию (d) раскрытого в данном документе способа можно повторять по меньшей мере один раз, например, 1, 2, 3 или более раз, перед переходом к стадии (е) или, альтернативно, к стадии (e1).

Система 1, показанная на фиг. 2, дополнительно содержит накопительную ячейку 7 для сбора элюата и отходов. Следует понимать, что на стадии (f) раскрытого в данном документе способа поток элюирующей жидкости пропускают через магнитный сепаратор 5, при этом элюирующая жидкость поступает в магнитный сепаратор 5 через вход 5а и выходит из магнитного сепаратора 5 через выход 5b. Элюированная биомолекула выходит из магнитного сепаратора 5 вместе с элюирующей жидкостью и может быть собрана в накопительной ячейке 7, соединенной с выходом 5b магнитного сепаратора 5.

Следовательно, способ по изобретению может необязательно включать стадию (g) после стадии (f), включающую сбор элюированной биомолекулы, которая выходит из магнитного сепаратора с элюирующей жидкостью, в накопительную ячейку, при этом магнитные частицы удерживают с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе. Накопительная ячейка подключена к выходу магнитного сепаратора.

Согласно альтернативному воплощению вместо накопительной ячейки 7 система 1, показанная на фиг. 2, может включать устройство 101 для мембранной хроматографии для дополнительной очистки, также называемой «полировкой» биомолекулы. В этом воплощении на стадии (e1) способа по изобретению поток элюирующей жидкости пропускают через магнитный сепаратор 5, при этом элюирующая жидкость поступает в магнитный сепаратор 5 через вход 5а и выходит из магнитного сепаратора 5 через выход 5b. Элюированная биомолекула выходит из магнитного сепаратора 5 вместе с элюирующей жидкостью и может быть дополнительно очищена путем отделения от примесей и/или загрязняющих веществ в устройстве 101 для мембранной хроматографии, подключенном к выходу 5b магнитного сепаратора 5.

Следует понимать, что в системе 1, показанной на фиг. 2, клеточная культура 3 или биологический раствор 3, магнитный сепаратор 5 и накопительная ячейка 7 или, альтернативно, устройство 101 для мембранной хроматографии могут быть соединены предварительно стерилизованными, гибкими трубками и асептическими соединителями. Кроме того, накопительная ячейка 7 или, альтернативно, устройство 101 для мембранной хроматографии могут быть предварительно стерилизованы и быть одноразовыми. Таким образом, может быть получена закрытая и стерильная разделительная система для одноразового использования.

Магнитный сепаратор, используемый для осуществления способа по изобретению, дополнительно включает перемешивающее устройство (не показано на фиг. 2; один неограничивающий пример показан на фиг. 3, как дополнительно описано ниже). Перемешивающее устройство выполнено с возможностью приложения перемешивающего движения к магнитным частицам, чтобы заставить магнитные частицы перемещаться в плоскости, перпендикулярной направлению потока, проходящего через магнитный сепаратор. Перемешивающее устройство может содержать по меньшей мере один компонент, например, множество компонентов, предназначенных для изменения интенсивности магнитного поля, например, путем приложения переменного магнитного поля, то есть для регулярного изменения интенсивности вокруг центральной точки или плоскости. Таким образом, стадия (е) или, альтернативно, стадия (e1) способа по изобретению может включать перемешивание магнитных частиц путем изменения интенсивности магнитного поля по меньшей мере в одной плоскости магнитного сепаратора, например, путем приложения переменного магнитного поля хотя бы в одной плоскости магнитного сепаратора. Альтернативно, перемешивающее устройство может содержать по меньшей мере одну мешалку, например, множество мешалок, и в этом случае стадия (е) или, альтернативно, стадия (e1) способа по изобретению включает перемешивание магнитных частиц путем применения или включения мешалки (мешалок). В данном документе термин «мешалка» относится к любому типу устройства или вещества/материала, способному перемешивать, например, вращать или помешивать магнитные частицы в магнитном сепараторе. Неограничивающими примерами подходящих мешалок являются устройства, такие как вращающиеся разделительные конструкции, например, вращающиеся диски или вращающиеся лопасти, прикрепленные по меньшей мере к одной неподвижной конструкции магнитного сепаратора, например, установленные на центральном вращающемся несущем валу, образующем ротор. Разделительные конструкции могут, например, состоять из проволочной сетки, перфорированной металлической фольги или перфорированного металлического листа.

Мешалки преимущественно могут содержать намагничивающийся материал, и в этом случае мешалки могут действовать как части магнитного материала внутри магнитного сепаратора, которые притягивают магнитные частицы при приложении магнитного поля.

На фиг. 3 схематично показано поперечное сечение неограничивающего примера магнитного сепаратора 5, который можно использовать для выполнения способа по изобретению. Стрелки на фиг. 3 показывают поток жидкости (например, элюирующей жидкости), которая может входить в магнитный сепаратор 5 через вход 5а и выходить из магнитного сепаратора 5 через выход 5b. Магнитный сепаратор 5 содержит корпус 6 и дополнительно содержит полый цилиндрический электромагнит 11, предназначенный для создания магнитного поля в магнитном сепараторе при включении электромагнита. Магнитный сепаратор дополнительно содержит перемешивающее устройство 13, содержащее ротор 15, на котором установлено множество вращающихся дисков 17. Перемешивающее устройство 13 выполнено с возможностью перемешивания магнитных частиц 21 по меньшей мере в одной плоскости магнитного сепаратора 5 с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц в магнитном сепараторе в соответствии со стадией (е) или, альтернативно, со стадией (e1) способа по изобретению. Как показано на фиг. 3 магнитный сепаратор 5 дополнительно содержит множество неподвижных дисков 19, установленных на корпусе 6. Вращающиеся диски 17 и неподвижные диски 19 расположены поочередно в корпусе 6. Вращающиеся диски 17 и/или неподвижные диски 19 могут содержать намагничивающийся материал. Дополнительно вращающиеся диски 17 и/или неподвижные диски 19 могут быть перфорированы, чтобы позволить магнитным частицам и клеточной культуре/биологическому раствору проходить через диски. Следует понимать, что конфигурация вращающихся дисков и/или конфигурация неподвижных дисков может отличаться от конфигурации, показанной на фиг. 3. Например, неподвижные диски 19 могут быть соединены с ротором 15, например, с помощью уплотнительного материала. Кроме того, вращающиеся диски могут быть соединены или не соединены со стенкой корпуса 6. Кроме того, следует понимать, что перемешивающее устройство может содержать компоненты, отличные от показанных на фиг. 3. Например, вместо или в дополнение к частям намагничиваемого материала, прикрепленным к неподвижной конструкции магнитного сепаратора, предполагается, что внутри магнитного сепаратора будут находиться части из магнитного или намагничиваемого материала, которые не прикреплены к какой-либо неподвижной конструкции магнитного сепаратора, такие как комки или хлопья стальной ваты или проволочной ваты, которые притягивают магнитные частицы при приложении магнитного поля и обладают способностью удерживать магнитные частицы в магнитном поле в магнитном сепараторе.

Стадия (е) или, альтернативно, стадия (e1a) способа по изобретению может включать перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости, например, во множестве по существу параллельных или параллельных плоскостей магнитного сепаратора с образованием множества псевдоожиженных слоев магнитных частиц. В данном документе термин «по существу параллельные плоскости» следует интерпретировать как плоскости, расположенные под углом 0-10° по отношению друг к другу. В случае множества по существу параллельных или параллельных плоскостей стадия (f) или, альтернативно, стадия (e1b) включает пропускание потока элюирующей жидкости в направлении, по существу перпендикулярном или перпендикулярном указанному множеству плоскостей. Не желая ограничиваться теорией, считают, что если перемешивающее устройство содержит множество мешалок в виде вращающихся компонентов, расположенных параллельно внутри магнитного сепаратора и выполненных с возможностью перемешивания магнитных частиц во множестве параллельных плоскостей, то может быть образован псевдоожиженный слой между каждой парой мешалок.

В способе по изобретению скорость мешалки (мешалок) на стадии (е) или, альтернативно, на стадии (e1) может находиться в диапазоне от 15 до 1500 об/мин, например, составляет 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500, предпочтительно в диапазоне от 50 до 300 об/мин.

Согласно альтернативному воплощению описанные выше стадии (f) и (g), следующие за стадией (е), заменяют стадиями (f1) и (g1), которые следуют за стадией (e1):

(f1) направление биомолекулы, элюированной из магнитного сепаратора, в устройство для мембранной хроматографии;

(g1) отделение биомолекулы от примесей и/или загрязняющих веществ с помощью мембранной хроматографии.

Расположение устройства 101 для мембранной хроматографии в системе 1 согласно фиг. 2 было описано выше. В качестве альтернативы стадию (g1) можно назвать «полировкой» биомолекулы.

Термин «мембранная хроматография» имеет свое обычное значение в области биотехнологии. При мембранной хроматографии происходит связывание компонентов текучей среды, например, отдельных молекул, ассоциатов или частиц, с поверхностью твердой фазы, контактирующей с текучей средой. Активная поверхность твердой фазы доступна для молекул за счет конвективного переноса. Преимущество мембранных адсорберов перед набивными хроматографическими колонками заключается в том, что они пригодны для работы с гораздо более высокими скоростями потока. Такую хроматографию также называют конвекционной. Конвекционная хроматографическая матрица включает любую матрицу, в которой при приложении разницы гидравлического давления между входом и выходом матрицы усиливается перфузия матрицы, достигая по существу конвективного переноса вещества (веществ) в матрицу или из матрицы, который осуществляется очень быстро при высокой скорости потока. Конвекционная хроматография и мембранные адсорберы описаны, например, в US 20140296464 A1, US 20160288089 A1, WO 2018011600 A1, WO 2018037244 A1, WO 2013068741 A1, WO 2015052465 A1, US 7867784 B2, включенные в описание посредством ссылки.

В способе по изобретению устройство для мембранной хроматографии может включать хроматографический материал, содержащий одно или более полимерных нановолокон, полученных способом электроформования, которые при использовании образуют неподвижную фазу, содержащую множество пор, через которые может проникать подвижная фаза. Неподвижная фаза может иметь форму мембраны.

Альтернативно, устройство для мембранной хроматографии может содержать по меньшей мере одну адсорбционную мембрану. Адсорбционная мембрана может содержать полимерные нановолокна. При необходимости мембрана, например, адсорбционная мембрана, может содержать нетканое полотно из полимерных нановолокон.

Полимерные нановолокна могут иметь средний диаметр от 10 нм до 1000 нм. Для некоторых применений подходят полимерные нановолокна со средним диаметром от 200 нм до 800 нм. Полимерные нановолокна, имеющие средний диаметр от 200 нм до 400 нм, могут быть пригодными для определенных применений.

Хроматографический материал или мембрана, например, адсорбционная мембрана, может содержать полимер, выбранный из группы, состоящей из полисульфонов, полиамидов, нейлона, полиакриловой кислоты, полиметакриловой кислоты, полиакрилонитрила, полистирола и полиэтиленоксида и их смесей. Альтернативно или дополнительно, полимер может быть целлюлозным полимером, например, выбранным из группы, состоящей из целлюлозы и частичных производных целлюлозы, в частности, сложного эфира целлюлозы, например, ацетата целлюлозы, сшитой целлюлозы, привитой целлюлозы или целлюлозы, связанной с лигандом.

В способе по изобретению устройство для мембранной хроматографии может содержать хроматографический материал, функционализированный (i) положительно заряженной группой, такой как, например, четвертичная аминогруппа, четвертичная аммониевая группа или аминогруппа, или (ii) отрицательно заряженной группой, такой как, например, сульфонатная или карбоксилатная группы. Альтернативно или дополнительно, устройство для мембранной хроматографии может содержать хроматографический материал, функционализированный мультимодальным лигандом, выбранным из группы, состоящей из мультимодального анионообменного лиганда и мультимодального катионообменного лиганда. Мультимодальный анионообменный лиганд может представлять собой N-бензил-N-метилэтаноламинный лиганд, связанный с носителем, где указанный носитель связан с атомом азота лиганда через линкер. Альтернативно или дополнительно, устройство для мембранной хроматографии может содержать хроматографический материал, функционализированный (i) ионообменной группой, (ii) лигандом на основе аффинного пептида/белка, (iii) лигандом гидрофобного взаимодействия, (iv) лигандом IMAC или (v) лигандом на основе ДНК, таким как Oligo dT.

Для увеличения площади поверхности и пропускной способности конвекционных мембранных адсорберов размер конвективных пор конвективной матрицы может быть уменьшен, например, за счет использования нановолокон, как было упомянуто выше. Однако в результате сопротивление потоку будет увеличиваться. Для высоких скоростей потока через хроматографическое устройство, содержащее конвективную матрицу большой емкости, потребуются такие хроматографическое устройство и конструкции, которые могут выдерживать высокие рабочие давления.

В воплощении способа по изобретению, включающем мембранную хроматографию, можно использовать устройство для мембранной хроматографии, подробно описанное в ранее поданной заявке на патент IN 201911019289, внутренняя ссылка №502800-IN-1, полностью включенной в этот документ посредством ссылки.

Как показано на фиг. 7, устройство 101 для мембранной хроматографии содержит блок 103 хроматографического материала, который находится внутри кассеты 105. Устройство 101 для мембранной хроматографии дополнительно содержит систему 107 распределения текучей среды, которая выполнена с возможностью распределения текучей среды, поступающей в по меньшей мере один блок 103 хроматографического материала и выходящей из него. Блок 103 хроматографического материала расположен между распределительным устройством 109а и накопительным устройством 109b системы 107 распределения текучей среды, как было описано выше. Распределительное устройство 109а и накопительное устройство 109b идентичны в воплощении, показанном на фиг. 7, однако это необязательно. В воплощении, показанном на фиг. 7, кассета 105 включает блок 103 хроматографического материала и систему 107 распределения текучей среды в виде распределительного устройства 109а и накопительного устройства 109b. В другом воплощении указанная система 107 распределения текучей среды может быть предоставлена отдельно от кассеты 105, например, как отдельный блок, или может быть интегрирована в корпус 113 устройства 101 для хроматографии.

Устройство 101 для мембранной хроматографии дополнительно содержит корпус 113, в котором размещены по меньшей мере один блок 103 хроматографического материала и кассета 105. Корпус включает верхнюю пластину 125 и нижнюю пластину 127. Вход 115 для приема жидкого исходного материала предусмотрен в верхней пластине 125, а выход 119 для передачи текучей среды, вытекающей из хроматографического устройства, предусмотрен в нижней пластине 127. Верхняя пластина 125 и нижняя пластина 127 соединены друг с другом таким образом, что входной канал 117 для текучей среды соединяет вход 115 с блоком 103 хроматографического материала через систему 107 распределения текучей среды, а выходной канал 121 для текучей среды соединяет выход 119 с блоком 103 хроматографического материала через систему 107 распределения текучей среды.

Распределительное устройство 109а системы 107 распределения текучей среды может содержать пластину (не показана), которая выполнена с возможностью примыкания к входной поверхности 153а блока 103 хроматографического материала, при этом указанная пластина содержит несколько отверстий для распределения жидкого исходного материала, поступающего через вход 115 устройства 101 для хроматографии к блоку 103 хроматографического материала, при этом общая площадь указанных отверстий в пластине меньше остальной площади пластины или составляет менее 20% или менее 10% остальной площади пластины, при этом указанные отверстия соединены с входом 157а распределительного устройства через один или более трубопроводов для текучей среды (не показаны), предусмотренных в распределительном устройстве 109а.

Кроме того, накопительное устройство 9b системы 107 распределения текучей среды может содержать пластину (не показана), которая выполнена с возможностью примыкания к выходной поверхности 153b блока 103 хроматографического материала, при этом указанная пластина содержит несколько отверстий для сбора текучей среды из блока 103 хроматографического материала, при этом общая площадь указанных отверстий в пластине меньше остальной площади пластины или составляет менее 20% или менее 10% остальной площади пластины, при этом указанные отверстия соединены с выходом 157b накопительного устройства через один или более трубопроводов для текучей среды (не показаны), предусмотренных в накопительном устройстве 109b.

По меньшей мере один блок 103 хроматографического материала может содержать по меньшей мере одну адсорбционную мембрану и/или любой один или несколько хроматографических материалов, описанных в другом месте в данном документе. По меньшей мере один блок хроматографического материала может содержать по меньшей мере одну адсорбционную мембрану, находящуюся между по меньшей мере одним верхним разделительным слоем (не показан) и по меньшей мере одним нижним разделительным слоем (не показан), или может содержать по меньшей мере две адсорбционные мембраны, расположенные друг над другом и разделенные промежутками с разделительными слоями (не показаны) и находящимися между по меньшей мере одним верхним разделительным слоем и по меньшей мере одним нижним разделительным слоем.

По меньшей мере некоторые части указанного устройства 101 для хроматографии могут быть герметично соединены друг с другом, оставляя по меньшей мере вход 115 и выход 119 открытыми. В некоторых воплощениях по меньшей мере некоторые части указанного устройства 101 для хроматографии могут быть герметично соединены друг с другом пластиком или эластомером. Альтернативно или дополнительно, по меньшей мере некоторые части указанного устройства 101 для хроматографии могут быть подвергнуты накладному формованию и герметично соединены друг с другом. Дополнительно кассета 105 и/или корпус 113 могут быть подвергнуты накладному формованию. Накладное формование представляет собой процесс создания спайки и обеспечения устойчивости устройства, в результате чего получают прочное устройство 101 для мембранной хроматографии. После накладного формования устройство 101 для хроматографии может выдерживать рабочее давление по меньшей мере 1000 кПа (10 бар) или по меньшей мере 1500 кПа(15 бар).

На стадии (f) или, альтернативно, на стадии (e1b) способа по изобретению линейная скорость потока в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости или, альтернативно, по существу перпендикулярном указанному множеству плоскостей, находится в диапазоне от 10 до 3000 см/ч, предпочтительно в диапазоне от 50 до 600 см/ч. Аналогичная скорость потока может иметь место на других стадиях способа по изобретению, то есть скорость потока находится в диапазоне от 10 до 3000 см/ч, предпочтительно в диапазоне от 50 до 600 см/ч, например, на следующих стадиях, но не ограничиваясь ими: стадии (d), стадии (е) или, альтернативно, стадии (e1) и/или стадии (g) или, альтернативно, стадии (f1) и/или стадии (g1).

На стадии (g1) способа по изобретению время пребывания биомолекулы в устройстве для мембранной хроматографии может находиться в диапазоне от примерно 0,5 с до примерно 6 мин, предпочтительно от примерно 1 с до примерно 30 с. Это эквивалентно времени пребывания биомолекулы в мембране или хроматографическом материале, которое может находиться в диапазоне от примерно 0,5 с до примерно 6 мин, предпочтительно от примерно 1 с до примерно 30 с.

Следовательно, скорость потока элюирующей жидкости через устройство для мембранной хроматографии может находиться в диапазоне, который соответствует времени пребывания в устройстве для мембранной хроматографии на стадии (g1), которое находится в диапазоне от примерно 0,5 с до примерно 6 мин, предпочтительно от примерно 1 до примерно 30 с.

Поток элюирующей жидкости через мембрану или хроматографический материал может быть нормальным потоком или тангенциальным потоком.

Дополнительно мембранная хроматография на стадии (g1) может быть проточной мембранной хроматографией.

Раскрытый в этом документе способ может дополнительно включать между стадией (e1) и стадией (f1) выполнение корректировки рН элюирующей жидкости, разбавления элюирующей жидкости или корректировки проводимости элюирующей жидкости. В способе по изобретению по меньшей мере стадии (c)-(f) или, альтернативно, стадии (c)-(e1), такие как стадии (b)-(f) или, альтернативно, стадии (b)-(e1) могут быть выполнены в магнитном сепараторе.

В качестве альтернативы, стадии (b)-(f) или стадии (b)-(e1), соответственно, могут быть выполнены в системе, содержащей биореакторный сосуд, гидравлически соединенный с контактором, и контактор, гидравлически связанный с магнитным сепаратором. Биореакторный сосуд содержит клеточную культуру/биологический раствор перед началом отделения биомолекулы от клеточной культуры/биологического раствора. Приведение магнитных частиц в контакт с клеточной культурой/биологическим раствором можно осуществлять в контакторе, который может быть сосудом, в который транспортируют клеточную культуру/биологический раствор и магнитные частицы (например, их перекачивают, их уносит поток жидкости или подают под действием силы тяжести), и которые могут быть до некоторой степени перемешаны для обеспечения быстрого переноса массы в магнитные частицы. Биореакторный сосуд или контактор могут, например, быть гибким пакетом, таким как гибкий пластиковый пакет с одним или более входными и выходными портами.

Разделительная система, используемая в способе по изобретению, может дополнительно содержать нагнетательное устройство, например, перистальтический насос, предназначенный для создания потока через магнитный сепаратор. В качестве альтернативы, поток через магнитный сепаратор может быть обеспечен исключительно действием силы тяжести. В общем, давление, прикладываемое в системе для обеспечения функционирования способа по изобретению, может быть намного ниже, чем давление, прикладываемое в системе жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Связанные с этим преимущества состоят в более простой конструкции и меньшей стоимости. В качестве неограничивающего примера подходящий диапазон давлений, применяемых в разделительной системе, составляет 0-500 кПа (0-0,5 бар), например, 10-500 кПа (0,01-0,5 бар).

В способе по изобретению магнитный сепаратор может быть подключен к хроматографической системе (т.е. заменяет хроматографическую колонку в хроматографической системе), такой как система Pilot (GE Healthcare). Хотя производительность насоса, создающего давление в хроматографической системе, не имеет значения, может быть удобным использовать функции управления буфером, включая сдвоенные насосы для создания градиента, клапаны и детектор хроматографической системы.

Система и/или магнитный сепаратор и/или устройство для мембранной хроматографии, используемые в способе по изобретению, могут быть выполнены с возможностью автоматического, полуавтоматического или ручного управления. Их можно использовать как в экспериментальных, так и в производственных процессах с количеством магнитных частиц по меньшей мере, находящихся в интервале от 0,1 л до 10 л. Они применимы, в частности, для выделения биофармацевтических препаратов из неочищенных исходных материалов, таких как клеточные культуры, биологические растворы или клеточные лизаты.

Устройства, «содержащие» один или несколько перечисленных элементов, могут также включать другие элементы, не перечисленные специально. Термин «содержащий» включает в себя подмножество термина «состоящий по существу из», что означает, что устройство имеет перечисленные компоненты без других функций или компонентов. Подобным образом, способы, «включающие» одну или несколько перечисленных стадий, могут также включать в себя другие стадии, специально не перечисленные.

Единственное число должно толковаться как включающее также множественное число.

Магнитный сепаратор, используемый в следующих примерах, представляет собой систему разделения с высокоградиентным магнитным полем (HGMS), в частности, а именно MES 100 RS (Andritz KMPT GmbH). Однако следует понимать, что любой тип магнитного сепаратора, выполненный согласно подробному описанию выше, может быть использован для выполнения способа по изобретению.

Равным образом, следует понимать, что любой тип устройства для мембранной хроматографии, имеющий конструкцию, которая может выдерживать высокие рабочие давления, как было упомянуто выше, может быть использован для выполнения способа по изобретению, таким образом, способ не ограничивается использованием кассеты/блока для хроматографиии на целлюлозном волокне (известной как фиброхроматография), которую используют в некоторых из приведенных ниже примеров. Фиброхроматография (GE Healthcare Life Sciences) - это сверхбыстрая хроматографическая очистка с коротким временем проведения процесса и высокой производительностью, в которой используют высокие скорости потока и целлюлозное волокно с высокой емкостью (https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/products-and-solutions/downstream-bioprocessing/fibro-chromatography).

Кроме того, материал для мембранной хроматографии, используемый в устройстве для мембранной хроматографии, не ограничивается так называемым материалом Fibro adhere, который используют в некоторых из следующих примеров. Fibro adhere (GE Healthcare Life Sciences) представляет собой материал, содержащий нановолокна целлюлозы, которые могут быть модифицированы сильным ионообменным мультимодальным лигандом. Другим неограничивающим примером подходящего материала для мембранной хроматографии является Capto™ adhere (GE Healthcare Life Sciences), который основан на жесткой агарозной матрице, которая позволяет использовать высокие скорости текучей среды. Агарозную матрицу модифицируют мультимодальным анионообменным лигандом, N-бензил-N-метилэтаноламином.

Пример 1

Цель

Цель этого исследования состояла в связывании и элюировании IgG с использованием Mag Sepharose™ PrismA и системы разделения с высокоградиентным магнитным полем (HGMS), MES 100 RS (Andritz KMPT GmbH). Цель состояла в том, чтобы определить, можно ли элюировать IgG из системы HGMS с использованием проточного элюирования.

Материалы

Поликлональные антитела IgG (Gammanorm™), Octapharma

NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, чда, Merck

Na₂HPO₄ ⋅ 2H₂O, чда, Merck

Ацетат натрия тригидрат, чда, Merck

Уксусная кислота, чда, Merck

Tween™ 20, Merck

Трис-основание, чда, Merck

MagSepharose™ PrismA, GE Healthcare

Оборудование

Оборудование HGMS, MES 100 RS, Andritz KMPT GmbH

Пластиковые лотки для буфера объемом 25 л

Смесительный ротор RW20, Janke & Kunkel

Стерильные пластиковые флаконы объемом 125 мл, Nalgene

Спектрофотометр GENESYS™10S (ультрафиолетовая и видимая область спектра), Thermo Scientific

Стеклянный фильтр (размер пор G3) объемом ~ 700 мл, Scott Duran

Центрифуга 581 OR, Eppendorff

Буферы

20 мМ Na-фосфат + 0,15 М NaCl, рН 7А

11,35 г NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, 74,3 г Na₂HPO₄ ⋅ 2H₂O и 219,2 г NaCl разбавляли и смешивали с 25 л дистиллированной H₂O в контейнере для буфера объемом 25 л.

100 мМ ацетат натрия, рН 3,2

140 мл уксусной кислоты и 7,4 г ацетата натрия ⋅ 3Н₂О разбавляли и смешивали с 25 л дистиллированной H₂O в контейнере для буфера объемом 25 л.

1 М NaOH

40 г NaOH разбавляли и смешивали с 1000 мл воды качества Milli-Q.

Фосфатный солевой буфер (ФСБ) с 0.05% Твина

Две таблетки ФСБ от компании Medicago смешивали с 2000 мл воды качества Milli-Q. Пипеткой добавляли 1 мл Твина 20 и смешивали с полученным раствором.

100 мМ ацетата натрия, рН 2,9

5,7 мл уксусной кислоты и 0,02 г ацетата натрия ⋅ 3Н₂О смешивали с 1000 мл воды качества Milli-Q.

Протокол

Приготовление MagSepharose PrismA

200 мл MagSepharose PrismA промывали 5 объемами ФСБ на стеклянном фильтре (размер пор G3) перед использованием.

Приготовление IgG, 2 мг/мл в 6 л

12 г (73 мл с содержанием 165 мг/мл) человеческого IgG, Gammanorm, разводили в 6 л 20 мМ Na-фосфата + 0,15 М NaCl, рН 7,4. Общий объем составил 6080 мл, и концентрация IgG, определенная с помощью микрофотометра при 280 нм, составила 1,9 мг/мл.

Инкубация MagSepharose PrismA 37-100 с IgG

400 мл промытых сфер переносили в ведро с 6 л раствора, содержащего IgG, и перемешивали в течение одного часа.

Процесс HGMS

В системе MES 100 RS включали охлаждающую воду, давление воздуха и подачу дистиллированной воды. Перистальтический насос системы сначала калибровали водой, заполнив ей мерную колбу объемом 1 л при комнатной температуре для промывки трубок и удаления воздуха из системы, а затем приготовленными буферами.

После инкубации для магнитного сепаратора использовали следующую программу:

2 GE-IgG-purif:

Основная стадия 1: загрузка магнитных частиц (MP)

Подстадия 1: загрузка: остановка всего перед запуском, продолжительность стадии 250 сек, магнит включен, установка значения насоса + 50%, открытие клапанов XV01 и XV14.

Оставшийся исходный материал закачивали вручную с использованием ФСБ для промывки трубок.

Основная стадия 2: рециркуляция

Подстадия 1: рециркуляция: продолжительность стадии 30 секунд, магнит включен, установка значения насоса + 30%, открытие клапанов XV08 и XV13.

Основная стадия 3: промывочный буфер

Подстадия 1: подача буфера 1: продолжительность стадии 60 секунд, магнит включен, установка значение насоса + 70%, открытие клапанов XV02 и XV14.

Подстадия 2: смешивание буфера: остановка всего перед запуском, продолжительность стадии 20 секунд, установка значения миксера 60%.

Подстадия 3: улавливание: продолжительность стадии 10 секунд, магнит включен.

Подстадия 4: повторное улавливание: продолжительность стадии 60 секунд, магнит включен, установка значения насоса + 30%, открытие клапанов XV08 и XV13.

Подстадия 5: переход: продолжительность стадии 1 секунда, магнит включен, открытие клапанов XV02, XV08, XV13 и XV14.

Основная стадия 4: промывка Н₂О

Подстадия 1: подача буфера 2: продолжительность стадии 60 секунд, магнит включен, установка значения насоса + 70%, открытие клапанов XV03 и XV14.

Подстадия 2: смешивание буфера 2: остановка всего перед запуском, продолжительность стадии 20 секунд, установка значения смесителя 60%.

Подстадия 3: улавливание: продолжительность стадии 10 секунд, магнит включен.

Подстадия 4: повторное улавливание: продолжительность стадии 60 секунд, магнит включен, установка значения насоса + 30%, открытие клапанов XV08 и XV13.

Подстадия 5: переход: продолжительность стадии 1 секунда, магнит включен, открытие клапанов XV02, XV08, XV13 и XV14.

Основная стадия 5: элюирование

Подстадия 1: улавливание: продолжительность стадии 10 секунд, магнит включен.

Подстадия 2: повторное улавливание: продолжительность стадии 60 секунд, магнит включен, установка значения насоса + 30%, открытие клапанов XV08 и XV13.

Подстадия 3: переход: продолжительность стадии 1 секунда, магнит включен, открытие клапанов XV07, XV08 и XV13, и XV16.

Подстадия 4: подача элюата: продолжительность стадии 4200 секунд, магнит включен, установка значения смесителя 10%, установка значения насоса + 5%, открытие клапанов XV07 и XV16.

Элюат собирали в виде фракций по 100 мл вручную в пластиковые предварительно взвешенные флаконы объемом 125 мл. После элюирования каждый флакон взвешивали и определяли фактический элюированный объем в каждом флаконе путем вычитания от общего объема флакона объема пустого флакона (51,5 мг).

Анализ

Элюаты нейтрализовали до рН 5 с помощью 2М трис-основания. Титр определяли во всех фракциях при 280 нм с использованием спектрофотометра GENESYS от компании ThermoFisher.

Результаты, анализ и выводы

Концентрацию рассчитывали путем деления значения, полученного при 280 нм в кювете шириной 1 см, на коэффициент экстинкции 1,36 для получения значения концентрации IgG в мг/мл. Образцы разбавляли, если значение, полученное при 280 нм, было выше 1. Концентрацию и суммарный выход наносили на график в зависимости от суммарного объема элюирования.

На графике, показанном на фиг. 4, виден отчетливый пик элюирования с выходом 98% при объемном коэффициенте 2,7 (общий объем магнитных сфер 0,4 л).

Выводы

Скорость перемешивания и скорость потока были установлены таким образом, чтобы во время элюирования из магнитной камеры не выходили магнитные сферы. Перемешивание при одновременном включении магнита приведет к тому, что магнитные сферы будут подвешены в магнитной камере, что позволяет осуществлять непрерывное элюирование вместо периодического элюирования IgG.

Этот эксперимент показывает, что можно элюировать IgG в непрерывном режиме при перемешивании в магнитной камере с MagSepharose Prisma (37-100 мкм), что приводит к выходу 98% при объемном коэффициенте 2,7 для сфер MagSepharose.

Пример 2

Цель

Цель этого исследования состояла в том, чтобы осветлить и очистить клеточную культуру СНО, содержащую моноклональное антитело IgG1 с использованием MagSepharose PrismA (37-100 мкм) и системы разделения с высокоградиентным магнитным полем (HGMS), MES 100 RS (Andritz KMPT GmbH). Цель заключалась в том, чтобы определить, возможно ли элюировать моноклональное антитело (mAb) из системы HGMS с использованием проточного элюирования без потери MagSepharose.

Материалы

Клеточная культура яичника китайского хомячка (СНО), GE Healthcare

NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, чда, Merck

Na₂HPO₄ ⋅ 2H₂O, чда, Merck

Ацетат натрия тригидрат, чда, Merck

Уксусная кислота, чда, Merck

Tween 20, Merck

Трис-основание, чда, Merck

MagSepharose PrismA, 37-100 мкм, GE Healthcare

Стандарт mAb, 8,82 мг/мл, GE Healthcare

Оборудование

Оборудование HGMS, MES 100 RS, Andritz KMPT GmbH

Пластиковые лотки для буфера объемом 25 л

Смесительный ротор RW20, Janke & Kunkel

Стерильные пластиковые флаконы объемом 125 мл, Nalgene

ЖХВД 1260 Infinity, Agilent Technologies

Стеклянный фильтр с размером пор G3 объемом ~ 700 мл, Scott Duran

Центрифуга 5810R, Eppendorff

рН-метр, рН-метр 913, Metrohm

Колонка MabSelect SuRe HiTrap, 29-0491-04, GE Healthcare

Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare

Шприцевые фильтры 0,2 мкм, Sterivex HV, Millipore

Пипетка 10-100 мкл, Mettler Toledo

Пипетка 100-1000 мкл, Eppendorff

Cellbag™ 10 л, BC11, Basic, GE Healthcare

Условия и наблюдения

Приготовление растворов:

20 мМ Na-фосфат + 0,15 М NaCl, рН 7,4

11,35 г NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, 74,3 г Na₂HPO₄ ⋅ 2H₂O и 219,2 г NaCl разбавляли и смешивали с 25 л дистиллированной H₂O в контейнере для буфера объемом 25 л.

100 мМ ацетат натрия. рН 3,2

140 мл уксусной кислоты и 7,4 г ацетата натрия ⋅ 3H₂O разбавляли и смешивали с 25 л дистиллированной H₂O в контейнере для буфера объемом 25 л.

1 М NaOH

40 г NaOH разбавляли и смешивали с 1000 мл воды качества Milli-Q.

ФСБ с 0,05% Твина

Две таблетки ФСБ от компании Medicago смешивали с 2000 мл воды качества Milli-Q. Пипеткой добавляли 1 мл Твин 20 и смешивали с полученным раствором.

100 мМ ацетата натрия, рН 2,9

5,7 мл уксусной кислоты и 0,02 г ацетата натрия ⋅ 3Н₂О смешивали с 1000 мл воды качества Milli-Q.

Приготовление исходного mAb

Было использовано ~ 7 л клеток СНО, содержащих mAb. Плотность клеток составляла 23,81 МДК/мл, жизнеспособность - 66,4%, титр mAb - 2,7 мг/мл. Клетки перекачивали в мешок для клеток объемом 10 л (основной).

Приготовление способа анализа титра, связывание и элюирование на колонке Mab Select SuRe HiTrap

Колонку MabSelect SuRe HiTrap™ подключали к системе ЖХВД. Стандартная кривая для mAb (титр mAb 8,82 мг/мл) была построена с использованием пластиковых виал для ЖХВД объемом 250 мкл, в соответствии с приведенной ниже таблицей.

Описание, способ MabSelect SuRe Hitrap (титр с помощью ЖХВД):

Объем вводимой пробы: 50 мкл

Расход: 1 мл/мин.

Детектирование: 280 нм

А-буфер: ФСБ + 0,05% Твин, рН 7,4.

В-буфер: 100 мМ ацетата натрия, рН 2,9.

Определение титра клеточной культуры

~ 10 мл клеточной суспензии центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут и определяли объем клеточного дебриса (твердые вещества), который составил 5%, путем мониторинга общего объема клеточной суспензии и общего объема твердых веществ. Супернатант отфильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в виалу для ЖХВД объемом 1 мл. Титр супернатанта определяли согласно описанному выше способу определения титра.

Титр mAb в клеточном супернатанте:

Ответ = 11924 mAUs

Титр = 11924/4383,7 = 2,72 мг/мл

Приготовление MagSepharose PrismA

Перед использованием 400 мл MagSepharose PrismA промывали 5 объемами ФСБ на стеклянном фильтре (размер пор G3).

Инкубация MagSepharose PrismA с клеточной культурой

Промытые сферы объемом 400 мл переносили во флакон с 6250 г клеточной суспензии СНО. Магнитные сферы смешивали с клеточной суспензией СНО в течение одного часа. Один миллилитр образца центрифугировали и анализировали с помощью способа mAbSelect SuRe Hitrap (см. выше) для определения оставшегося mAb в исходном материале (не связанного с MagSepharose PrismA).

Процесс HGMS

В системе MES 100 RS включали охлаждающую воду, давление воздуха и подачу дистиллированной воды. Перистальтический насос системы сначала калибровали водой, заполнив ей мерную колбу объемом 1 л при комнатной температуре.

Впускные трубки и клапаны, которые будут использовать, XV01, XV02, XV03, XV07, заполняли дистиллированной H₂O. Пузырьки воздуха в магнитном сепараторе удаляли путем заливки системы и одновременного включения смесителя на 50% до тех пор, пока не был удален весь воздух. Шланг между циркуляционными клапанами XV08 и XV013 заполняли до полного отсутствия воздуха с использованием обратного потока в системе.

После заполнения водой систему заполняли действующими буферами.

XV01 = загрузка смеси магнитных сфер (заполненных 20 мМ Na-фосфата + 0,15 М NaCl, рН 7,4)

XV02 = 20 мМ Na-фосфата + 0,15 М NaCl, рН 7,4

XV03 = дистиллированная H₂O

XV07 = 100 мМ Na-ацетат, рН 3,2

После инкубации для магнитного сепаратора использовали следующую программу.

Стадия 1. Загрузка смеси магнитных частиц и исходного материала.

Время закачивания устанавливали на 250 секунд для закачивания 6 л исходного материала. Оставшийся исходный материал закачивали вручную с использованием ФСБ для промывания впускной трубки от смеси.

Систему настраивали на рециркуляцию, чтобы уловить все магнитные сферы на намагничиваемые диски в блоке разделения.

Стадия 2. Промывка 20 мМ Na-фосфата + 0,15 М NaCl, повторяли 4 цикла.

Подстадия 1. Загрузка буфер в течение 60 с при скорости насоса 70% (2 л буфера).

Подстадия 2. Перемешивание буфера и сфер в течение 20 с и скорости ротора 60%, магнит и клапаны выключены.

Подстадия 3. Улавливание сфер путем включения магнита.

Подстадия 4. Повторное улавливание. Выполняли рециркуляцию, чтобы захватить все сферы, при скорости насоса 30%.

Подстадия 5. Переход. Производили быстрое (1 с) открытие клапанов во избежание противодавления.

Стадия 3. Промывка водой, один цикл.

Для промывки водой использовали те же подстадии, что и для промывки 20 мМ Na-фосфата + 0,15 М NaCl, за исключением того, что воду прокачивали через клапан XV03.

Стадия 4. Элюирование.

На этой стадии осуществляли проточное элюирование mAb при включенных смесителе и магните.

Подстадия 1. Улавливание. Включали магнит.

Подстадия 2. Повторное улавливание. Выполняли рециркуляцию в течение 60 секунд при скорости насоса 30%.

Подстадия 3. Переход. Открывали клапаны на короткое время (1 с) во избежание противодавления.

Подстадия 4. Подача элюата: элюирование 100 мМ ацетатом натрия, рН 3,2, клапан XV07. Магнит включен, скорость насоса 5% (140 мл/мин), смеситель устанавливали на 10%. Элюирование продолжали в течение 4286 с.

Элюированный материал собирали фракциями по 100 мл вручную в предварительно взвешенные пластиковые флаконы на 150 мл.

После элюирования каждый флакон взвешивали и определяли фактический элюированный объем в каждом флаконе путем вычитания от общего объема флакона объема пустого флакона. См. таблицу 5 ниже.

Элюированные фракции были светло-желтыми и прозрачными.

Элюаты нейтрализовали до рН 5 с помощью 2 М трис-основания и после этого их отфильтровывали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фактический объем 2 М трис-основания включен в указанную выше массу элюатов. Титр определяли во всех фракциях с помощью способа связывания и элюирования MagSelect SuRe HiTrap, см. выше.

Наконец, фракции 7-18 объединяли, и 1 мл этих объединенных фракций разбавляли в 20 раз 200 мМ Na-фосфатом, рН 6,8 в виале для ЖХВД объемом 1,5 мл и анализировали с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC), используя систему ЖХВД, и сравнивали со стандартом mAb (который разбавили в 8 раз тем же буфером).

MagSepharose была выпущена из сепаратора и закачана обратно в сосуд. Смолу промывали 2 объемами 1 М NaOH в течение 30 минут на стеклянном фильтре с размером пор G3, приводили в равновесие с 5 объемами ФСБ и, наконец, промывали 2 объемами 20% этанола в качестве консервирующего раствора, после чего смолу переносили обратно в пластиковый флакон с 20% этанолом для хранения.

Чистота, определенная способом SEC

Объем вводимой пробы: 10 мкл

Расход: 0,8 мл/мин

Колонка: Superdex 200 Increase 10/300 GL

Стоп время: 26 мин

Обнаружение при 214 нм.

Анализ белка клетки-хозяина (НСР)

В исходные и объединенные элюированные образцы (450 мкл) добавляли 50 мкл консервирующего раствора перед анализом белка клетки-хозяина (НСР).

Анализ выполняли с использованием набора СНО-НСР ELISA 3-го поколения (Cygnus) на рабочей станции Gyrolab (Gyros Protein Technologies) с программным пакетом 5.3.0.

Результаты, анализ и выводы

На фиг. 5А показан профиль элюирования mAb из магнитного сепаратора. Объединенная фракция, фракции 7-18, соответствующая 1,2 л элюата, показывает, что выход mAb, составляющий 87%, может быть получен при объеме элюирущего буфера, составляющем 3 объема слоя (объем одного слоя = 400 мл). Концентрация в объединенном элюате составляла 10,7 мг/мл, что представляет собой 4-кратную концентрацию. Выход связывания на стадии инкубации составлял 94%, а общий выход элюирования составлял 91%.

Объединенный образец анализировали способами SEC и НСР и сравнивали с чистым стандартом mAb. Результаты показаны на фиг. 5В (меньший масштаб) и фиг. 5С (больший масштаб; увеличение в области основания пиков). Сплошная линия соответствует объединенному элюату mAb, а пунктирная линия стандарту чистого mAb. Хроматограмма нормализована. Агрегированный пик, основной пик и пик после основного пика проинтегрированы, и определена чистота, составляющая 98,5%.

Пример 3

Цель

Цель этого исследования состояла в том, чтобы выяснить, какая скорость перемешивания (скорость ротора) и скорость потока могут быть использованы для проточного элюирования IgG из Mag Sepharose PrismA с использованием магнитных псевдоожиженных сфер без миграции сфер. Также исследовали, как на профиль элюирования IgG влияет различная скорость перемешивания, объем сфер и их размер.

Оборудование

Сепаратор HGMS, MES100RS серийный номер 400213239, Andritz Gmbh

Смеситель, исользуемый при инкубации, IL82274-3, Janke-Kunkel

УФ-считыватель, SpectraMax™plus, Molecular Devices

Планшета для считывания в УФ, 96 ячеек, 3635 лот 33918007, Corning

Весы PG 5002 DeltaRange, Mettler

Пластиковые флаконы объемом 130 мл

Пластиковые флаконы для буфера объемом 25 л

Mag Sepharose PrismA 0-37 мкм, лот LS-033447, GE Healthcare

Mag Sepharose PrismA 37-100 мкм, лот LS-32871, GE Healthcare

Материалы

Человеческий IgG, Gammanorm, 165 мг/мл, Octapharma

NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, чда, Merck

Na₂HPO₄ ⋅ 2H₂O, чда, Merck

NaCl, чда, Merck

Уксусная кислота, чда, Merck

Na-ацетат ⋅ 3H₂O, чда, Merck

Условия и наблюдения

Приготовление растворов:

А-буфер, 20 мМ PO₄ + 0,15 М NaCl, рН 7,5

В-буфер, 0,1 М Na-ацетат, рН 3,2

IgG 2 мг/мл

73 мл IgG (Gammanorm) разводили до 6 л А-буферомс поучением концентрации IgG ~ 2,0 мг/мл.

Исследование влияния скорости вращения ротора и скорости потока на потерю сфер

100 мл, 300 мл или 400 мл (влажной осажденной смолы) Mag Sepharose Prisma 37-100 мкм или 0-37 мкм закачивали в систему HGMS с включенным магнитом. Ротор включали с разными скоростями, а скорость потока А-буфера также меняли с помощью насоса, чтобы исследовать, при какой скорости ротора и скорости потока магнитные сферы начинают мигрировать (визуально) из камеры HGMS.

Результаты показаны ниже в таблицах 6-10.

Загрузка 100 мл Mag Sepharose 0-37 мкм: сферы оставались уловленными при скорости потока до 2100 мл/мин и при скорости вращения ротора 150 об/мин. Сферы начинали мигрировать из камеры HGMS при скорости вращения ротора 225 об/мин.

Загрузка 300 мл Mag Sepharose 0-37 мкм: сферы оставались уловленными при скорости потока до 560 мл/мин и при скорости вращения ротора 75 об/мин.

Загрузка 100 мл Mag Sepharose 37-100 мкм: сферы оставались уловленными при скорости потока до 2100 мл/мин и при скорости вращения ротора 150 об/мин.

Загрузка 300 мл Mag Sepharose 37-100 мкм: сферы оставались уловленными при скорости потока до 560 мл/мин и при скорости вращения ротора 150 об/мин. Сферы также все еще оставались уловленными при скорости вращения ротора 300 об/мин и при скорости потока 140 мл/мин.

Загрузка 400 мл Mag Sepharose 37-100 мкм: сферы оставались уловленными при скорости потока до 1400 мл/мин и при скорости вращения ротора 75 об/мин.

Можно было обеспечить более высокую скорость потока для всех загрузок при более низкой скорости вращения ротора, чем та скорость вращения ротора, при которой сферы начинали мигрировать из системы HGMS, см. таблицы.

Исследование проточного элюирования IgG

400 мл каждого прототипа смолы инкубировали в течение > 1 ч с 6 л образца IgG концентрацией 2 мг/мл.

100 или 400 мл (1,6 л или 6,4 л смеси смол с IgG) с адсорбированным IgG на Mag Sepharose PrismA закачивали в систему, и магнитные сферы улавливали магнитом, после чего сферы промывали три раза А-буфером в количестве 1 л.

Элюирование проводили при разной скорости вращения ротора и при скорости потока 140 мл/мин, чтобы исследовать, как объем сфер и скорость вращения ротора влияют на эффективность элюирования.

При элюировании собирали фракции объемом ~100-2100 мл и для каждой фракции определяли оптическую плотность с использованием считывателя УФ-планшет, а также определяли точный объем каждой фракции с помощью взвешивания. Оптическую плотность при определенной длине волны (УФ-область) для каждой фракции наносили на график в зависимости от суммарного объема элюирования. См. фиг. 1-4.

В целом, при скорости вращения ротора 0% оказалось, что имеет место недостаточное элюирование IgG, поскольку после нескольких объемов колонки элюирующего буфера > 4000 мл, IgG все еще присутствовал в высокой концентрации в элюате, и из профиля элюирования видно, что тенденция к снижению концентрации не наблюдается.

Для сфер размером < 37 мкм меньший объем сфер приводит к меньшей зависимости от скорости вращения ротора. Формы пиков элюирования при скорости вращения ротора 75 об/мин и 150 об/мин для объема сфер 100 мл сопоставимы (фиг. 8А). Для объема сфер 400 мл формы пиков элюирования различались более значительно в зависимости от скорости вращения ротора, при этом наиболее эффективное элюирование IgG происходило при 150 об/мин (фиг. 8С).

Для сфер размером 37-100 мкм меньший объем сфер приводит к меньшей зависимости от скорости вращения ротора. Для объема сфер 100 мл формы пиков элюирования при скорости вращения ротора 75 об/мин и 150 об/мин сопоставимы (фиг. 8В). Для объема сфер 400 мл формы пиков элюирования резко различалась при скорости вращения ротора 150 об/мин и 0 об/мин. При скорости вращения ротора 150 об/мин пик элюирования IgG был симметричным, в то время как при скорости вращения 0 об/мин все еще происходило элюирование IgG после израсходования 6500 мл элюирующего буфера (фиг. 8D).

Сравнивая сферы размера 0-37 мкм с сферами размера 37-100 мкм, формы пиков элюирования сопоставимы при использовании объема сфер 100 мл (см. фиг. 8А и 8В, соответственно). При объеме сфер 400 мл и скорости вращения ротора 150 об/мин более крупные сферы с размером 37-100 мкм показали гораздо более острый пик элюирования, чем сферы объемом 400 мл с размером < 37 мкм. При использовании более крупных сфер большая часть IgG, по-видимому, элюируется до израсходования 2000 мл элюирующего буфера, в то время как для сфер с размером < 37 мкм концентрация не достигает стабильного базового уровня при израсходовании 4000 мл (см. фиг. 8С и 8D, соответственно).

Пример 4

Цель

Цель этого исследования состояла в оценке эффекта дополнительной стадии мембранной хроматографии для «полировки» биомолекулы после магнитной сепарации. В частности, исследование включало «полировку» моноклонального антитела (mAb) IgG1 с помощью мембранной хроматографии с прототипами устройства Fibro adhere после очистки с помощью MagSepharose PrismA с использованием системы разделения с высокоградиентным магнитным полем.

Материалы

Исходный образец: моноклональное антитело IgG1 после культивирования XDR-10 в клетках СНО, жизнеспособность 66,4%, концентрация 2,7 г/л.

Superdex™ 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare

MagSepharose PrismA 37-100 мкм, 400 мл, GE Healthcare

Прототипы устройств Fibro Adhere, 0,4 мл:

• Fibro Adhere 1: материал был сшит с дивинилсульфоном (DVS) после добавления аллилглицидилового эфира (AGE), концентрация при реакции Adhere 167 г/л. Титр 563 мкмоль/г;

• Fibro Adhere 2: материал был сшит с DVS перед добавлением AGE, концентрация при реакции Adhere 167 г/л. Титр 212 мкмоль/г;

• Fibro Adhere 3: материал был сшит с DVS перед добавлением AGE, концентрация при реакции Adhere 500 г/л. Титр 478 мкмоль/г.

Оборудование

Pure 25, GE Healthcare

ЖХВД Infinity 1200, Agilent technologies

Буферы

25 мМ Na-фосфат + 0,15 M NaCl, рН 6,3

4,88 г NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, 2,6 г Na₂HPO₄ и 17,5 г NaCl разбавляли и смешивали с 2 л дистиллированной H₂O.

25 мМ Na-фосфат, рН 7

1,16 г NaH₂PO₄ ⋅ H₂O и 2,367 г Na₂HPO₄ разбавляли и смешивали с 1 л дистиллированной H₂O.

25 мМ Na-фосфат + 1М NaCl, рН 7

0,464 г NaH₂PO₄ ⋅ H₂O, 3,851 г Na₂HPO₄ и 58,44 г NaCl разбавляли и смешивали с 1 л дистиллированной H₂O.

25 мМ Na-фосфат, рН 7,5

0,73 г NaH₂PO₄ ⋅ Н₂О и 3,508 г Na₂HPO₄ разбавляли и смешивали с 1 л дистиллированной Н₂О.

100 мМ уксусная кислота, рН 3,0

6 мл ледяной уксусной кислоты разбавляли и смешивали с 1 л дистиллированной н₂о.

Условия и наблюдения

Элюат, полученный после MagSepharose PrismA с использованием системы разделения с высокоградиентным магнитным полем (HGMS), как описано в примере 2, использовали для дальнейшей очистки с помощью мембранной хроматографии с прототипами устройства Fibro adhere.

Устройства Fibro Adhere подключали к системе Pure 25 и оценивали три различных набора условий (рН и проводимость), используя 25 мМ Na-фосфатные буферы, см. таблицу 11. Уравновешивание проводили при скорости потока 16 мл/мин с 50 объемами (20 мл), затем добавляли 4 мл образца mAb со скоростью 16 мл/мин и собирали элюат. Устройство Fibro Adhere промывали 20 объемами (8 мл) и очищали 25 объемами (10 мл) 100 мМ уксусной кислоты с рН 3,0 при скорости потока 16 мл/мин перед повторным уравновешиванием с 50 объемами (20 мл). Оптическую плотность все время контролировали при 280 нм.

Результаты, анализ и выводы

Из хроматограмм при очистке mAb с помощью Fibro Adhere при различных условиях с использованием буферов видно, что имеется высокое значение УФ-излучения во время добавления образца при всех трех наборах условий с использованием различных буферов. Элюат во время добавления образца собирали и дополнительно анализировали, см. таблицу 12. Концентрацию mAb и процент агрегатов анализировали с помощью эксклюзионной ЖХВД (SEC-HPLC), Superdex 200 Increase 10/300 GL при скорости потока 0,8 мл/мин в течение 26 мин для одного образца с 0,2 М Na-фосфатным буфером. Уровень белка клетки-хозяина в элюируемых фракциях анализировали с помощью набора СНО НСР ELISA Cygnus 3-го поколения.

Заключение: при «полировке» mAb его получали с высокими выходами, составляющими 93-100%, при значительном снижении количества белков клетки-хозяина (НСР). Наибольшее снижение НСР было достигнуто при рН 7,5 и проводимости 3,5 мСм/см с выходом 93-99%, а снижение НСР было самым высоким с прототипами Fibro Adhere с самой высокой плотностью лигандов.

Следует понимать, что изобретение не ограничено описанными выше иллюстративными воплощениями и что несколько возможных модификаций изобретения возможны в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу отделения биомолекулы от клеточной культуры. Способ включает (а) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу; (b) приведение клеточной культуры, содержащей биомолекулу, в контакт с магнитными частицами; (c) удерживание магнитных частиц в магнитном сепараторе; (d) по меньшей мере одну стадию промывки в непрерывном режиме, включающую: (d1) перемешивание магнитных частиц и (d2) обеспечение потока промывочной жидкости для удаления клеточной культуры; (e) перемешивание магнитных частиц путем приложения переменного магнитного поля с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц в магнитном сепараторе; (f) обеспечение потока элюирующей жидкости для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц. Настоящее изобретение обеспечивает эффективное улавливание и очистку биомолекул из клеточной культуры, что приводит к сокращению времени и повышению экономичности способа. 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 12 табл., 4 пр.

1. Способ отделения биомолекулы от клеточной культуры, включающий следующие стадии:

(а) обеспечение магнитных частиц, содержащих лиганды, способные связывать биомолекулу;

(b) приведение клеточной культуры, содержащей биомолекулу, в контакт с магнитными частицами с получением магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу;

(c) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

(d) промывание магнитных частиц промывочной жидкостью, включающее по меньшей мере одну стадию промывки в непрерывном режиме, включающую следующие стадии:

(d1) перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц, и

(d2) обеспечение потока промывочной жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости, для удаления клеточной культуры при удержании магнитных частиц в магнитном поле;

(e) перемешивание магнитных частиц по меньшей мере в одной плоскости магнитного сепаратора с образованием псевдоожиженного слоя магнитных частиц в магнитном сепараторе;

(f) обеспечение потока элюирующей жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанной по меньшей мере одной плоскости, для элюирования связанной биомолекулы из магнитных частиц при удержании магнитных частиц с помощью магнитного поля в магнитном сепараторе;

при этом стадия (е) включает перемешивание магнитных частиц путем приложения переменного магнитного поля.

2. Способ по п. 1, в котором стадии (b) или (c) включают добавление магнитных частиц в магнитный сепаратор, содержащий по меньшей мере одну мешалку, например, множество мешалок, и стадия (e) включает перемешивание магнитных частиц путем включения мешалки или мешалок.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадия (e) включает перемешивание магнитных частиц во множестве по существу параллельных плоскостей магнитного сепаратора с образованием множества псевдоожиженных слоев магнитных частиц, и в котором стадия (f) включает обеспечение потока элюирующей жидкости в направлении, по существу перпендикулярном указанному множеству плоскостей.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором биомолекулу элюируют максимум 10 объемами слоя элюирующей жидкости, например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 объемом слоя; предпочтительно максимум 4 объемами слоя, более предпочтительно максимум 3 объемами слоя.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере стадии (c)-(f), например, стадии (b)-(f), выполняют в магнитном сепараторе, причем магнитный сепаратор предпочтительно представляет собой систему разделения в высокоградиентном магнитном поле.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадия (b) включает:

(i) добавление магнитных частиц в магнитный сепаратор с последующим добавлением исходного материала из клеточной культуры в магнитный сепаратор, или

(ii) добавление исходного материала из смеси клеточной культуры и магнитных частиц, содержащих связанную биомолекулу, в магнитный сепаратор.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадии (b)-(f) проводят в комбинированном биореакторном сосуде/контакторе и магнитном сепараторе.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадия (d) включает следующие подстадии:

(i) отключение магнитного поля;

(ii) повторное суспендирование магнитных частиц;

(iii) приведение магнитных частиц в контакт с частью промывочной жидкости;

(iv) удерживание магнитных частиц с помощью магнитного поля; и

(v) удаление промывочной жидкости от удерживаемых магнитных частиц.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадию (d) повторяют по меньшей мере один раз перед переходом к стадии (e).

10. Способ по любому из пп. 2-9, в котором скорость мешалки или мешалок на стадии (е) находится в диапазоне от 15 до 1500 об/мин, предпочтительно в диапазоне от 50 до 300 об/мин.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором магнитный сепаратор соединен с хроматографической системой.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором магнитные частицы имеют объемно-взвешенный средний диаметр d50,v в диапазоне от 8 до 300 мкм, предпочтительно в диапазоне от 37 до 100 мкм.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором каждая из магнитных частиц содержит пористую полимерную матрицу и одну или более магнитных гранул, внедренных в пористую полимерную матрицу.