СПОСОБ ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА FUSARIUM OXYSPORUM Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 C12Q1/6888 C12Q1/6895 

Изобретение относится к технической области молекулярной диагностики и касается обнаружения и идентификации ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и может быть использовано с целью научных исследований для молекулярной идентификации Fusarium oxysporum, либо для ранней диагностики фузариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.

Фузариоз, сухая гниль - распространенная патология пасленовых сельскохозяйственных растений, вызываемый микромицетом Fusarium oxysporum. При заболевании участки поражения обнаруживаются на листьях, стебле и клубнях картофеля. При неблагоприятных погодных условиях фузариоз наносит существенный урон урожаю картофеля. Фузариоз хорошо определяется морфологически, когда растение или клубни поражены в значительной степени, однако на ранних стадиях заражения Fusarium oxysporum может быть точно идентифицирован только молекулярными методами. Известны способы, позволяющие диагностировать фузариоз с помощью ПЦР-амплификации, однако они не оптимизированы для рутинного применения, либо требуют дорогостоящего оборудования [1-3]. И в настоящее время на рынке России нет доступных ПЦР-диагностикумов для быстрого эффективного определения фузариоза в целях фундаментальных исследований или фитосанитарного мониторинга.

Известен патент на праймеры и способ детекции возбудителя картофеля Fusarium oxysporum [3], включающий праймеры для молекулярной детекции и способ детекции возбудителя фузариоза картофеля. Недостатками данного способа являются многостадийность, низкая температура отжига праймеров (56°С), что приводит к увеличению продолжительности анализа за счет большой разницы температур в цикле и длительности времени, затрачиваемой амплификатором на нагрев/охлаждение термоблока.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи разработки удобного ПЦР-диагностикума, пригодного для выявления Fusarium oxysporum и в поточном прикладном мониторинге, и в научной работе, при котором достигается высокая видоспецифичность, и избирательность праймеров, простота анализа результата.

Технический результат изобретения – праймеры и протокол ПЦР-реакции, позволяющей идентифицировать ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале.

Для достижения технического результата по базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) проведен поиск и выбор последовательностей региона, кодирующего 18S рРНК, 5,8S рРНК, 28S рРНК и межгенные спейсеры ITS1, ITS2, Fusarium oxysporum (проанализирована 231 последовательность), других видов Fusarium (проанализировано 156 последовательностей), других микромицетов – фитопатогенов пасленовых (возбудителей фитофтороза, фомоза, фузариоза – 183 последовательности), а также томатов и картофеля (20 последовательностей). Проведено множественное выравнивание выбранных последовательностей внутри групп и между характерными представителями групп, выявлены полиморфизмы, отличающих ДНК вида Fusarium oxysporum от других видов рода Fusarium, от других микромицетов-фитопатогенов картофеля и от ДНК растения-хозяина.

Множественное выравнивание выбранных последовательностей проводили с помощью приложения Align программного пакета VectorNTI Advance 11.5, а также оригинальной программы Yacwgui 1.2, работающих на основе алгоритма ClustalW. По результатам множественного выравнивания выявляли полиморфизмы, отличающие выбранный регион у Fusarium oxysporum от представителей других организмов.

Дизайн праймеров, определение идентичности и специфичности олигонуклеотидных последовательностей – кандидатов для дизайна праймеров провндены с помощью сервиса Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn). Термодинамические характеристики, специфичность, отсутствие само- и взаимокомплементарностей, повторов определеныи в приложении Oligo Analysis програмного пакета VectorNTI Advance 11.5. По сконструированным последовательностям олигонуклеотиды были синтезированы фосфоамидитным методом.

Технический результат достигается тем, что проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР), для которой используются олигонуклеотиды - праймеры, специфичные к области ДНК, имеющей отличия в последовательности, характерные для вида Fusarium oxysporum.

Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение с выделенной ДНК полимеразной цепной реакции с использованием пар праймеров FsOx1-F и FsOx1-R, специфичных для области генов рибосомальных РНК и межгенных спейсеров, ограничивающих участок ДНК размером 285 пар нуклеотидов (п.н.) или FsOx2-F и FsOx2-R, ограничивающих участок ДНК размером 370 пары нуклеотидов, и анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Наличие на электрофореграмме ПЦР-продуктов размером 285 или 370 п.н., соответственно, свидетельствует о присутствии в исследуемом образце ДНК F. oxysporum. При этом используемые праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

FsOx1-F: 5'-CCC CTA AAC TCT GTT TCT ATA TGT AA-3',

FsOx1-R: 5'- ATT AAC GCG AGT CCC AAC ACC AAG CTG T-3',

FsOx2-F: 5'- TCTA TAT GTA ACT TCT GAG TAA AAC CAT-3',

FsOx2-R: 5'- ACG ATT ACC AGT AAC GAG GGT TTT AC-3',

ПЦР проводят в следующем температурно-временном режиме:

Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;

30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 62°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;

Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.

Выделение и подготовка ДНК для ПЦР-анализа микромицетов данным способом проводится любым стандартизованным коммерческим набором для выделения ДНК из растений и грибов. Образцы ДНК, пригодные для быстрого ПЦР-анализа могут быть получены путем механического лизиса с использованием микросфер и гомогенизатора, например, MagnaLyser, либо с помощью лизирующего буфера на основе цетилтриэтиламмония бромида либо гуанидинтиоционата и сорбента «диатомовая земля».

Этот способ позволяет проводить раннюю диагностику альтарнариоза при отсутствии характерных морфологических признаков присутствия этого фитопатогена и может быть использован с целью научных исследований для молекулярной идентификации Fusarium oxysporum, либо для ранней диагностики фузариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. ПЦР-идентификация культуры микромицета Fusarium oxysporum

Материал мицелия микромицетов отбирают с поверхности чашки Петри с агаризованной средой одноразовьм шпателем в количестве от 5-50 мг, переносят в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ(10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток, гомогенизируют 5-кратным включением по 5 минут при скорости 5000 оборотов в минуту на аппарате MagNA Lyser, ROCHE, Швейцария, центрифугруют при 14000g в течении 3 минут, надосадочную жидкость прогревают при переносят в чистую микропробирку, прогревают 10 мин при 95°С для дезактивирования возможных примесей нуклеаз и используют для ПЦР-амплификации.

Амплификацию ДНК проводят следующим образом:

Для постановки ПЦР используют, в микропробирки объёмом 200 мкл или лунки мироплашки вносят компоненты ПЦР-реакции из расчёта: 10×ПЦР-буфер – 2,5 мкл; водный раствор, содержащего по 10 пикомоль праймеров FsOx1-F и FsOx1-R, либо

праймеров FsOx2-F и FsOx2-R – 5 мкл, термостабильную ДНК-полимеразу – 5 ед. активности; образец, содержащий анализируемую ДНК – 2,5 мкл, H₂O до 25 мкл. Содержимое пробирки смешивают 10 сек на вортексе.

Амплификацию проводят на программируемом термоциклере (амплификаторе) при следующем температурно-временном режиме:

Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;

30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 62°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;

Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.

Детекцию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле при напряженности электрического поля 5 В/см в течение 30 мин с последующим окрашиванием ДНК бромистым этидием. В качестве контроля для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют ДНК-маркерный набор, включающий диапазон размеров ДНК от 100 до 1000 п.н.

Визуализацию электрофоретического разделения и регистрацию результатов проводят на установке для гель-документации при ультрафиолетовой подсветке.

Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 285 или 370 п.н., (при использовании праймеров FsOx1-F и FsOx1-R или FsOx2-F и FsOx2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа – обнаружении ДНК Fusarium oxysporum, другие виды рода Fusarium, другие распространенные фитопатогены картофеля (Alternaria solani, Colletotrichum atramentarium, Phytophthora infestans, Phoma solanicola), а также ДНК самого картофеля не дают ПЦР-продукта – демонстрируют отрицательную реакцию (табл. 1).

Пример 2. ПЦР-идентификация культуры микромицета Fusarium oxysporum в растительном материале

Для анализа используют материал органов растений, предположительно зараженный Fusarium oxysporum. Образцы растительной ткани в размере 10-300 мг отбираются чистым скальпелем и помещаются в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток. Гомогенизацию, подготовку образца, амплификацию ДНК, электрофоретическое разделение и визуализацию проводят, как описано в примере 1.

Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 285 или 370 п.н. (при использовании праймеров FsOx1-F и FsOx1-R или FsOx2-F и FsOx2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа – обнаружении ДНК Fusarium oxysporum.

Литература

1. Toda, Т., Hanesaka, S., Shishido, К. et al. Development of specific primers for Fusarium oxysporum causing damping off of Lilium formolongi. J Genet Eng Biotechnol - 2020. - Vol. 18. - 1. https://doi.org/10.1186/s43141-019-0015-2.

2. Patent CN 101974650 B, Li Yuan, Cao Ao, Cheng Guo, Meixia Cui, Rui Wu Zhanfang, Zhao Haibin. Polymerase chain reaction (PCR) method for detecting fusarium oxysporum and kit, 2012.

3. Patent CN 109182582 B, Lu Guiyun, Li Jingrui, Zhong Xin, Wu Xiaolei, Gao Hongbo, Gong Binbin, Zhao Jing. Qualitative detection primer and detection method for fusarium oxysporum f.sp.cubense, 2021.

Изобретение относится к области молекулярной диагностики. Описан способ идентификации фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров. Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с ДНК-фрагментами маркера молекулярного размера. Наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 285 п.н. или 370 п.н. свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Fusarium oxysporum. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств для идентификации ДНК фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum в биологическом материале. 1 табл., 2 пр.

Способ идентификации фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров FsOx1-F: 5'-CCC CTA AAC TCT GTT TCT ATA TGT AA-3'/FsOx1-R: 5'- ATT AAC GCG AGT CCC AAC ACC AAG CTG T-3', или FsOx2-F: 5'- TCTA TAT GTA ACT TCT GAG TAA AAC CAT-3'/ FsOx2-R: 5'- ACG ATT ACC AGT AAC GAG GGT TTT AC-3', предусматривающий выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с ДНК-фрагментами маркера молекулярного размера, при котором наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 285 п.н. при использовании праймеров FsOx1-F/ FsOx1-R или 370 п.н. при использовании праймеров FsOx2-F / FsOx2-R свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Fusarium oxysporum.