СПОСОБ ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА ALTERNARIA SOLANI Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к технической области молекулярной диагностики и касается обнаружения и идентификации ДНК фитопатогенных грибов Alternaria solani Sorauer в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и может быть использовано с целью научных исследований для молекулярной идентификации Alternaria solani, либо для ранней диагностики альтернариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.

Альтернариоз - распространенная патология пасленовых сельскохозяйственных растений, вызываемый микромицетом Alternaria solani Sorauer. При заболевании участки поражения обнаруживаются на листьях, стебле и клубнях картофеля. Известны немногочисленные способы, позволяющие диагностировать альтернариоз, в том числе с помощью ПЦР-амплификации, однако они не оптимизированы для рутинного применения [1-3]. И в настоящее время на рынке России нет ПЦР-диагностикумов для быстрого эффективного определения альтернариоза в целях фундаментальных исследований или фитосанитарного мониторинга.

Известен патент на праймеры и способ детекции возбудителя картофеля Alternaria solani Sorauer [4], включающий праймеры для молекулярной детекции и способ детекции возбудителя альтернариоза картофеля. Недостатками данного способа являются многостадийность, низкая температура отжига праймеров (54°С), что приводит к увеличению продолжительности анализа за счет большой разницы температур в цикле и длительности времени, затрачиваемой амплификатором на нагрев/охлаждение термоблока.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи разработки удобного ПЦР-диагностикума, пригодного для выявления Alternaria solani и в поточном прикладном мониторинге, и в научной работе, при котором достигается высокая видоспецифичность, и избирательность праймеров, простота анализа результата.

Технический результат изобретения - праймеры и протокол ПЦР-реакции, позволяющей идентифицировать ДНК фитопатогенных грибов Alternaria solani в биологическом материале.

Для достижения технического результата по базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) проведен поиск и выбор последовательностей региона, кодирующего 18S рРНК, 5,8S рРНК, 28S рРНК и межгенные спейсеры ITS1, ITS2, Alternaria solani (проанализирована 231 последовательность), других видов Alternaria (проанализировано 156 последовательностей), других микромицетов - фитопатогенов пасленовых (возбудителей фитофтороза, фомоза, фузариоза - 183 последовательности), а также томатов и картофеля (20 последовательностей). Проведено множественное выравнивание выбранных последовательностей внутри групп и между характерными представителями групп, выявлены полиморфизмы, отличающих ДНК вида, Alternaria solani от других видов рода Alternaria, от других микромицетов - фитопатогенов картофеля и от ДНК растения-хозяина.

Множественное выравнивание выбранных последовательностей проводили с помощью приложения Align программного пакета VectorNTI Advance 11.5, а также оригинальной программы Yacwgui 1.2, работающих на основе алгоритма ClustalW. По результатам множественного выравнивания выявляли полиморфизмы, отличающие выбранный регион у Alternaria solani от представителей других организмов.

Дизайн праймеров, определение идентичности и специфичности олигонуклеотидных последовательностей - кандидатов для дизайна праймеров провидены с помощью сервиса Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn). Термодинамические характеристики, специфичность, отсутствие само- и взаимокомплементарностей, повторов определены в приложении Oligo Analysis программного пакета VectorNTI Advance 11.5. По сконструированным последовательностям олигонуклеотиды были синтезированы фосфоамидитным методом.

Технический результат достигается тем, что проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР), для которой используются олигонуклеотиды - праймеры, специфичные к области ДНК, имеющей отличия в последовательности, характерные для вида Alternaria solani.

Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение с выделенной ДНК полимеразной цепной реакции с использованием пар праймеров AltS1-F и AltS1-R, специфичных для области генов рибосомальных РНК и межгенных спейсеров, ограничивающих участок ДНК размером 325 пар нуклеотидов (п.н.) или AltS2-F и AltS2-R, ограничивающих участок ДНК размером 463 пары нуклеотидов, и анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Наличие на электрофореграмме ПЦР-продуктов размером 356 или 664 п.н., соответственно, свидетельствует о присутствии в исследуемом образце ДНК A. solani. При этом используемые праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

AltS1-F: 5'- AAG GAC САА ССС ATA AAC СТТ ТТТ GCA ATG -3',

AltS1-R: 5'- GAC ТТТ AAG GCG AGT CTC CCG САА G -3',

AltS2-F: 5'- CTC GTC CGG CCG GAC CTT CCT TTT AGC-3',

AltS2-R: 5'- TCT CGT AAG GTG CCG AGC GAG TCA GA-3',

ПЦР проводят в следующем температурно-временном режиме:

Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;

30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 67°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;

Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.

Выделение и подготовка ДНК для ПЦР-анализа микромицетов данным способом проводится любым стандартизованным коммерческим набором для выделения ДНК из растений и грибов. Образцы ДНК, пригодные для быстрого ПЦР-анализа могут быть получены путем механического лизиса с использованием микросфер и гомогенизатора, например, MagnaLyser, либо с помощью лизирующего буфера на основе цетилтриэтиламмония бромида либо гуанидинтиоционата и сорбента «диатомовая земля».

Этот способ позволяет проводить раннюю диагностику альтарнариоза при отсутствии характерных морфологических признаков присутствия этого фитопатогена и может быть использован с целью научных исследований для молекулярной идентификации Alternaria solani, либо для ранней диагностики альтернариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также для фитосанитарного контроля наличия данного фитопатогена.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. ПЦР-идентификация культуры микромицета Alternaria solani.

Материал мицелия микромицетов отбирают с поверхности чашки Петри с агаризованной средой одноразовым шпателем в количестве от 5-50 мг, переносят в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ(10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток, гомогенизируют 5-кратным включением по 5 минут при скорости 5000 оборотов в минуту на аппарате MagNA Lyser, ROCHE, Швейцария, центрифугируют при 14000g в течении 3 минут, надосадочную жидкость прогревают при переносят в чистую микропробирку, прогревают 10 мин при 95°С для дезактивирования возможных примесей нуклеаз и используют для ПЦР-амплификации.

Амплификацию ДНК проводят следующим образом:

Для постановки ПЦР используют, в микропробирки объемом 200 мкл или лунки мироплашки вносят компоненты ПЦР-реакции из расчета: 10×ПЦР-буфер - 2,5 мкл; водный раствор, содержащего по 10 пикомоль праймеров AltS1-F и AltS1-R, либо праймеров AltS2-F и AltS2-R - 5 мкл, термостабильную ДНК-полимеразу - 5 ед. активности; образец, содержащий анализируемую ДНК - 2,5 мкл, H2O до 25 мкл. Содержимое пробирки смешивают 10 сек на вортексе. Амплификацию проводят на программируемом термоциклере (амплификаторе) при следующем температурно-временном режиме:

Предварительный прогрев: 94°С, 120 сек;

30 циклов, включающих: 94°С, 20 сек, 67°С, 20 сек, 72°С, 30 сек;

Дополнительная элонгация: 72°С, 120 сек.

Детекцию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле при напряженности электрического поля 5 В/см в течение 30 мин с последующим окрашиванием ДНК бромистым этидием. В качестве контроля для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют ДНК-маркерный набор, включающий диапазон размеров ДНК от 100 до 1000 п.н.

Визуализацию электрофоретического разделения и регистрацию результатов проводят на установке для гель-документации при ультрафиолетовой подсветке.

Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 325 или 463 п.н., (при использовании праймеров AltS1-F и AltS1-R или AltS2-F и AltS2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа - обнаружении ДНК Alternaria solani. Другие виды рода Alternaria, другие распространенные фитопатогены картофеля (Fusarium oxysporum, Colletotrichum atramentarium, Phytophthora infestans, Phoma solanicola), а также ДНК самого картофеля не дают ПЦР-продукта - демонстрируют отрицательную реакцию (табл.1).

Пример 2. ПЦР-идентификация культуры микромицета Alternaria solani в растительном материале.

Для анализа используют материал органов растений, предположительно зараженный Alternaria solani. Образцы растительной ткани в размере 10-300 мг отбираются чистым скальпелем и помещаются в пластиковую микропробирку объемом 2 мл, содержащую буфер ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и микросферы для гомогенизации клеток. Гомогенизацию, подготовку образца, амплификацию ДНК, электрофоретическое разделение и визуализацию проводят, как описано в примере 1.

Обнаружение продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих размерам 325 или 463 п.н (при использовании праймеров AltS1-F и AltS1-R или AltS2-F и AltS2-R, соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа - обнаружении ДНК Alternaria solani.

Литература

1. Lees А.K., Roberts D.M., Lynott J., Sullivan L., Brierley J.L. Real-Time PCR and LAMP Assays for the Detection of Spores of Alternaria solani and Sporangia of Phytophthora infestans to Inform Disease Risk Forecasting//Plant Dis. -2019. -Vol. 103(12). - P. 3172-3180.

2. Patent CN 104120170 A Zhu Jiehua, Yang Zhihui, Xu Jin, Guo Qianqian, Yang Yiqing, Geng Shuo, Zhang Weihong, Cui Yajing. Alternaria solani Sorauer detection kit and detection method thereof, 2016.

3. Patent CN 105112413 A Zhao Jianwei, He Yuxian, Lan Chengzhong. Alternaria solani PCR detection specific primer and detection method thereof, 2015.

4. Patent CN 108148923 A Wang Xiaodan, Bai Yanju, Lu Dianqiu, Min Fanxiang, Yang Shuai, Zhang Jinghua, Gao Yunfei, Wei Qi, Dong Xuezhi, Wang Wenzhong, Fan Guoquan, Su Feifei, Ma Ji. The molecular detection primer and its detection method of potato plant tikka class disease Alternaria solani sorauer pathogen, 2018.

5. Patent CN 110699475 B Zhao Yuqiang, Tian Yanli, Zhu Cancan, Chen Yu, Wang Min, Hu Baishi. Padlock probe of pecan Alternaria alternata and detection method thereof, 2022.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно молекулярной диагностике, и касается обнаружения и идентификации ДНК фитопатогенных грибов Alternaria solani Sorauer в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Предложен способ идентификации фитопатогенного гриба Alternaria solani методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров для ПЦР AltS1-F: 5' - AAG GAC САА ССС ATA AAC СТТ ТТТ GCA ATG-3' / AltS1-R: 5' - GAC ТТТ AAG GCG AGT CTC CCG CAA G-3', или AltS2-F: 5' - CTC GTC CGG CCG GAC СТТ CCT TTT AGC-3' / AltS2-R: 5' - TCT CGT AAG GTG CCG AGC GAG TCA GA-3'. Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с маркерными ДНК-фрагментами маркера молекулярных масс и/или ампликонами контрольного образца. Наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 325 или 463 пар нуклеотидов при использовании праймеров AltS1-F и AltS1-R или AltS2-F и AltS2-R, соответственно, свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Alternaria solani. Способ позволяет осуществлять раннюю диагностику альтернариоза пасленовых растений в полевых условиях, а также проводить фитосанитарный контроль наличия данного фитопатогена. 1 табл., 2 пр.

Способ идентификации фитопатогенного гриба Alternaria solani методом ПЦР, основанный на использовании видоспецифических пар праймеров для ПЦР AltS1-F:

5' - AAG GAC САА ССС ATA AAC СТТ ТТТ GCA ATG-3' / AltS1-R: 5' - GAC ТТТ AAG GCG AGT CTC CCG CAA G-3', или AltS2-F: 5' - CTC GTC CGG CCG GAC СТТ CCT TTT AGC-3' / AltS2-R: 5' - TCT CGT AAG GTG CCG AGC GAG TCA GA-3',

предусматривающий выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции с выделенной ДНК и видоспецифическими праймерами, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле, их визуализацию и идентификацию путем сравнения по размеру с маркерными ДНК-фрагментами маркера молекулярных масс и/или ампликонами контрольного образца, при котором наличие в пробе ПЦР-продуктов размером 325 или 463 пар нуклеотидов при использовании праймеров AltS1-F и AltS1-R или AltS2-F и AltS2-R, соответственно, свидетельствует о присутствии в исследуемом образце Alternaria solani.