ПРОЦЕСС С ВЕРТИКАЛЬНЫМ ПРОБКОВЫМ ПОТОКОМ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2024 года по МПК A23L11/30 A23L11/50 C12P7/40 C12P7/54 C12P7/56 C12P19/00 C12M1/113 A23K10/12 A23K10/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к твердому субстрату, способу биоконверсии для получения ценного твердого продукта трансформации субстрата, причем биоконверсию осуществляют с использованием одного или нескольких микроорганизмов с применением непрерывного процесса с пробковым потоком в вертикальном реакторе без перемешивания, где перемещение опосредуется гравитационной силой.

Предпосылки создания изобретения

Существует потребность в биопродуктах, которые главным образом можно использовать как продукт питания или корм или в качестве ингредиентов в продукте питания или корме. Основными элементами в таких продуктах являются белки, жиры и углеводы. Подходящей биомассой для таких продуктов являются масличные сельскохозяйственные культуры, такие как масличные, зерновые и бобовые. Зерновые культуры имеют содержание белка, относительно сухого вещества, до 15%, например, пшеница, и бобовые имеют содержание белка до 40%, например, соевые бобы.

Подобная потребность существует в отношении разработки биопродуктов, включающих органические соединения, такие как органические кислоты, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, молочная кислота и янтарная кислота, или спирты, такие как этанол, которые можно получить рентабельным путем хорошо известными способами с использованием микроорганизмов видов, которые продуцируют одно или несколько органических соединений как продукт метаболизма биоконверсии углеводов.

Виды молочнокислых бактерий продуцируют органическую кислоту, в частности, молочную кислоту и уксусную кислоту, как основной конечный продукт их метаболизма при биоконверсии углеводов. Видами молочнокислых бактерий являются, в частности, но без ограничения, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus и Weisella.

Другие виды микроорганизмов также продуцируют кислоты как свои конечные продукты метаболизма при биоконверсии углеводов. Такими видами, которые продуцируют органическую кислоту, являются, в частности, но без ограничения, кислотообразующие Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacillus, Propionibacterium, Candida, Clostridium и Geobacillus.

Общей проблемой, связанной в особенности с бобами и плодами и семенами бобовых как источников биопродукта и органических кислот, является содержание неусвояемых олигосахаридов, таких как стахиоза и раффиноза, вызывающих метеоризм и диарею при ферментации в толстой кишке.

Недорогими способами инкубации, известными в технике, являются процессы ферментации твердого вещества или в твердом состоянии (SSF), выполняемые с низким содержанием воды. Процесс заключается в том, что твердый увлажненный субстрат инокулируют подходящими микроорганизмами и оставляют для биоконверсии в условиях регулируемой температуры на некоторый период времени.

Обычно субстрат инкубируют в горизонтальных слоях без перемешивания; один из примеров этого процесса известен как процесс с кодзи. Периодические процессы также выполняют с использованием средств для перемешивания.

Непрерывные SSF процессы также описаны в литературе с использованием следующих биореакторов: реактор с механическим перемешиванием, реактор с вращающимся внутри цилиндром и трубчатый реактор для непрерывного процесса. Одним из примеров трубчатого реактора для непрерывного процесса является транспортер типа шнекового транспортера.

В US 4735724 раскрывается вертикальный башенный реактор без перемешивания и процесс расщепления биоразлагаемой части сырья метанпродуцирующими микроорганизмами. Способ отличается тем, что имеется отвод жидкости из средней или нижней зоны в верхнюю часть башни.

В ЕР 2453004 В1 раскрывается способ анаэробной ферментации органического материла в закрытом реакторе и нисходящая подача сырья в реактор под действием гравитации. Способ отличается тем, что подвергающуюся ферментации массу перемешивают путем альтернативного возрастания давления образующегося газа и резкого сброса давления образующегося газа.

Целью настоящего изобретения является усовершенствованный способ производства твердого продукта трансформации субстрата биомассы в процессе биоконверсии в вертикальном пробковом потоке, выполняемом с использованием одного или нескольких подходящих микроорганизмов.

Другой целью является способ, который можно выполнять в большем реакторе, но более простой конструкции, чем конструкция уровня техники.

Еще одной целью является эффективный и быстрый способ биоконверсии биомассы, в частности, соевых бобов или семян рапса или их смесей, для того, чтобы произвести биопродукты, включающие органические соединения, такие как органические кислоты, например, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, молочную кислоту и янтарную кислоту, и спирты, из дешевых источников углеводов.

Эти цели реализуются способом по настоящему изобретению.

Сущность изобретения

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу производства твердого продукта трансформации субстрата, включающему следующие стадии:

- получение субстрата биомассы, включающей углеводы и белковое вещество, происходящие из соевых бобов, семян рапса или их смесей, необязательно в дополнительной смеси с углеводами и белковым веществом, происходящими из бобов фава, гороха, семян подсолнечника, люпина, зерновых и/или трав;

- смешивание указанного субстрата с живыми микроорганизмами или комбинацией живых микроорганизмов, причем живые микроорганизмы или комбинация живых микроорганизмов не являются живыми дрожжами, и добавление воды в количестве, которое обеспечивает начальную смесь для инкубации, имеющую содержание воды от 30% до 70%, и отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности в полученной смеси от 0,60 до 1,45;

- инкубация указанной начальной смеси для инкубации в течение 1-240 часов при температуре 15-70°С; и извлечение влажного твердого продукта трансформации из инкубированной смеси;

также включающему, что стадию инкубации выполняют как непрерывный процесс в пробковом потоке в вертикальном реакторе для инкубации без перемешивания с приспособлениями для впуска указанной смеси и добавок и приспособлениями для выпуска указанного твердого продукта трансформации.

В способе по настоящему изобретению для обработки биомассы используется гравитационная сила для перемещения/движения биомассы во время инкубации/биоконверсии. Хотя использование силы тяжести для транспортировки вообще является простым, требуется тщательный выбор условий реакции для конкретной цели, как в случае процесса с пробковым потоком в настоящем изобретении.

Обычно, когда содержание воды повышается, смесь для инкубации имеет склонность к уплотнению за счет уменьшения объема пустот, так что это негативно влияет на поведение при переносе. Когда определенное количество воды достигается, смесь уплотняется до степени, когда перенос за счет гравитационной силы прекращается. Материал может прилипнуть к стенкам реактора, или может начаться его седиментация, и равномерный пробковый поток разрушается, что приводит к колеблющемуся времени пребывания биомассы.

Кроме того, если биоконверсию выполняют при повышенном давлении, что может случиться под действием силы тяжести, реакция инкубации имеет склонность к замедлению.

Решение проблемы, связанной с переносом смеси для инкубации за счет гравитационной силы, согласно настоящему изобретению должно включать использование реактора для инкубации, определенного в формуле изобретения, причем поток материала можно поддерживать настолько высоким и равномерным, что условия пробкового потока достигаются и сохраняются. Скорость потока регулируют приспособлениями на впуске и выпуске и размерами (отношение ширины к высоте) реактора.

Кроме того, решение согласно настоящему изобретению должно обеспечивать баланс содержания воды в смеси для инкубации такой, чтобы действие воды на поверхности частиц было достаточным для реакционного процесса. Это достигается путем поддержания отношения мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности субстрата на низком уровне и в определенных пределах, как определено в п.1.

Конкретнее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что необходимого равномерного процесса можно достичь, используя начальную смесь для инкубации, имеющую содержание воды от 30 мас.% до 70 мас.% и отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности от 0,60 до 1,45. В комбинации с указанным, вертикальная конструкция для процесса пробкового потока может обеспечить равномерный пробковый поток и гарантировать одно и то же время переработки смеси для инкубации. Кроме того, способ по настоящему изобретению проводят без перемешивания. Если содержание воды превышает приблизительно 70 мас.%, биомасса не может удерживать воду, и смесь для инкубации становится взвесью, имеющей водную фазу и твердую фазу. Эти две фазы не текут с одинаковыми скоростями потока, и равномерный пробковый поток не получится, и смесь для инкубации может прилипать к стенкам инкубатора. Содержание воды более приблизительно 70 мас.% приведет к отношению мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности, превышающему 1,45, которое согласно изобретению является верхним пределом.

Вертикальная конструкция является менее затратной по вложениям, чем горизонтальная конструкция, из-за ее большей пропускной способности в единой производственной линии. Она также требует меньше затрат для поддержания из-за меньшего числа механических движений. Использование реактора без перемешивания также вносит вклад в снижение эксплуатационных затрат.

Таким образом, способ по настоящему изобретению дает возможность организовать эффективный и быстрый способ, в котором микроорганизм может размножаться в жидкой фазе и выполнять биоконверсию дешевых источников углеводов.

Способ по настоящему изобретению эффективен, в частности, если субстрат биомассы обработан предварительно до того, как его смешивают с живым микроорганизмом или комбинацией живых микроорганизмов, поскольку предварительная обработка улучшает доступ микроорганизмов к компонентам в биомассе, которые должны быть трансформированы. Предварительную обработку обычно выполняют путем химической или физической обработки, например, посредством разрушения, перемалывания, расплющивания, тепловой обработки, обработки под давлением, обработки ультразвуком, гидротермической обработки или обработки кислотой или щелочью.

Способ по изобретению можно использовать для получения твердого продукта трансформации субстрата, который представляет собой продукт трансформации углеводов и/или белков, происходящих из указанной биомассы. Такие твердые продукты трансформации можно использовать, например, в переработанном продукте питания или в качестве ингредиента в продукте питания или корме или в качестве ингредиента косметического или фармацевтического продукта или пищевой добавки.

Определения

В контексте настоящего изобретения следующие далее термины предназначены для включения указанного далее, если в описании не определено иное.

Термины «примерно», «около», «приблизительно» или «~» предназначены для того, чтобы показать, например, обычно выраженную изменчивость измерения в технике, которая может иметь величины порядка, например, +/- 1, 2, 5, 10, 20 или даже 50%.

Термин «включающий» следует интерпретировать как определяющий наличие установленной(ых) части(ей), стадии(ий), особенности(ей), композиции(ий), химиката(ов) или компонента(ов), но не исключающий наличие одной или нескольких дополнительных частей, стадий, особенностей, композиций, химикатов или компонентов. Например, композиция, включающая химическое соединение, может, таким образом, включать другие химические соединения, и т.д..

Процесс с пробковым потоком

В этом типе непрерывного процесса реакционная смесь течет через, например, трубчатый или многогранный (polyhedral) реактор с ограниченным обратным смешиванием. Поток является ламинарным потоком, в котором состав реакционной смеси меняется вдоль осевого направления реактора, или однородным потоком массы.

Биомасса

Включает биологический материал как продуцированный фотосинтезом, так и материал, который можно использовать в качестве сырья в промышленном производстве. В таком контексте термин «биомасса» относится к растительному материалу в форме семян, зерен, бобов, трав, например, бобов и гороха, и т.д., и их смесям, в частности, плодов и семян бобовых. Кроме того, биомасса, включающая бобы, особенно применима из-за содержания и состава белков.

Субстрат биомассы можно разрушить путем предварительной обработки, такой как химическая или физическая предварительная обработка, например, посредством измельчения, перемалывания, расплющивания, тепловой обработки, обработки давлением, обработки ультразвуком, гидротермической обработки или обработки кислотой или щелочью.

Биоконверсия/Инкубация

Это процесс выращивания культур микроорганизмов на субстрате для определенной цели, например, выращивания микроорганизма на углеводе для продуцирования органических кислот или спиртов.

Твердый продукт трансформации субстрата

Вообще, общую обработку биомассы путем инкубации с микроорганизмами можно разделить на четыре типа:

- продуцирование биомассы - клеточного материала;

- продуцирование внеклеточных компонентов - химических соединений, метаболитов, таких как кислоты, ферментов;

- продуцирование внутриклеточных компонентов - ферментов и т.д.;

- трансформация субстрата - продуктом является трансформированный субстрат.

В контексте настоящего изобретения термин «твердый продукт трансформации субстрата» относится к продукту, образующемуся в результате инкубации выбранной биомассы с живым микроорганизмом и, необязательно, вспомогательной переработки.

Объемная плотность

Объемная плотность является параметром, важным для физического поведения биомассы, которая имеет форму порошка, гранул и т.п.. Параметр определяется как отношение массы к объему и может быть измерен, например, в г/мл. Он не является присущим свойством, но может изменяться в зависимости от переработки и может быть использован как показатель структурных изменений. Плотность материала определяют, помещая фиксированный объем материала в мерную чашку и определяя массу, или определяя массу измеренного объема порошка. С помощью такого теста можно определить указанные далее свойства.

Объемная плотность (также известная как насыпная плотность) = масса/объем в исходном сухом состоянии, в г/мл или кг/м³.

Мокрая объемная плотность (также известная как общая плотность) = отношение общей массы (M_s+M_l) к ее общему объему;

M_s=масса твердых веществ, и M_l=масса жидкостей.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения «сухая объемная плотность» представляет собой измеренную объемную плотность биомассы без добавления воды, а именно объемную плотность/насыпную плотность. «Мокрая объемная плотность» представляет собой объемную плотность, измеренную после добавления определенного количества воды.

Обычно объемную плотность измеряют в соответствии с Международными стандартами ISO 697 и ISO 60, но в силу природы веществ это неприемлемо в настоящем контексте. Отдельный используемый метод описан в примерах.

Олигосахариды и полисахариды

Олигосахарид представляет собой полимер сахарида, содержащий по меньшей мере два компонента простых сахаров. Полисахариды представляет собой полимеры сахаридов, содержащие несколько компонентов простых сахаров, также известные как сложные углеводы. Примеры включают полисахариды накопления, такие как крахмал, и структурные полисахариды, такие как целлюлоза.

Углеводы

Включают моно-, ди-, олиго- и полисахариды.

Белковые материалы

Включают органические соединения со значительным содержанием белков из аминокислот, выстроенных в одну или несколько цепей. При длине цепи приблизительно до 50 аминокислот соединение называют пептидом; при более высокой молекулярной массе органическое соединение называют полипептидом или белком.

Жиры

Включают сложные эфиры жирных кислот и глицерина. Одна молекула глицерина может быть этерифицирована одной, двумя и тремя молекулами жирной кислоты с образованием моноглицерида, диглицерида или триглицерида, соответственно. Обычно жиры состоят главным образом из триглицеридов и небольших количеств лецитинов, стеролов и т.д.. Если жир является жидкостью при комнатной температуре, его обычно называют маслом. В отношении масел, жиров и родственных продуктов в данном контексте, ссылка делается на «Physical and Chemical Characteristics of Oils, Fats and Waxes», AOCS, 1996, а также на «Lipid Glossary 2», F.D. Gunstone, The Oily Press, 2004.

Глицериды

Включают моно-, ди- и триглицериды.

Микроорганизмы

Микроорганизмы представляют собой организмы, которые являются микроскопическими, что делает их слишком маленькими, чтобы человек мог видеть их невооруженным глазом. Микроорганизмы включают бактерии, грибы, археи, протисты и вирусы. Большинство микроорганизмов являются одноклеточными организмами, но существуют одноклеточные протисты, которые видимы для глаза человека, а некоторые многоклеточные виды являются микроскопическими. Микроорганизмы живут почти всюду на Земле, где есть жидкая вода, включая горячие источники, на дне океана и глубоко в горных породах в земной коре. В таких условиях обитания живут экстремофилы.

В контексте настоящего изобретения микроорганизмы не включают живые дрожжи.

Молочнокислые бактерии

(Или лактобациллы) являются родом грамположительных с низким DC (содержание гуанина-цитозина), кислототолерантных бактерий, как правило, неспорообразующих, недышащих (non-respiring), в форме палочек или кокков бактерий, которые разделяют обычные метаболические и физиологические характеристики. Эти бактерии, которые обычно обнаруживают в разлагающихся растениях и молочных продуктах, продуцируют молочную кислоту как основной конечный продукт метаболизма при биоконверсии углеводов. Молочнокислые бактерии являются видами микроорганизмов, которые продуцируют органические кислоты, такие как молочная кислота и уксусная кислота, как продукты метаболизма при биоконверсии углеводов. Видами являются, в частности, но без ограничения перечисленным, Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Weisella, Streptococcus и Leuconostoc.

Другие виды

В контексте настоящего изобретения термин «другие виды» относятся к наиболее релевантным другим видам бактерий в связи с изобретением. Они включают ряд видов, которые при биоконверсии углеводов также продуцируют как продукты метаболизма органические кислоты, такие как молочная кислота и уксусная кислота, но обычно в меньшей степени, чем молочнокислые бактерии.

В контексте настоящего изобретения иные виды бактерий, чем молочнокислые, включают, но без ограничения перечисленным, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacillus, Propionibacterium, Clostridium и Geobacillus.

Bacillus являются видами рода Bacillales. Бактерии являются грамположительными в форме палочек и образуют эндоспоры в стрессовых условиях. Некоторые штаммы используют как пробиотики.

Вспомогательные агенты для обработки

1. Ферменты

Фермент(ы) представляет(ют) собой весьма большой класс белковых веществ со способностью действовать как катализаторы. Обычно они делятся на шесть классов, и основными классами, соответствующими объему данного изобретения, могут быть трансферазы, которые переносят функциональные группы, или гидролазы, которые гидролизуют различные связи. Типичные примеры могут включать протеазу(ы), пептидазу(ы), (α-)галактозидазу(ы), амилазу(ы), глюканазу(ы), пектиназу(ы), гемицеллюлазу(ы). фитазу(ы), липазу(ы), фосфолипазу(ы), трансферазу(ы), целлюлазу(ы) и оксидоредуктазу(ы).

2. Растительные компоненты и органические вещества для обработки

Некоторыми из функциональных свойств, которые являются важными в настоящем контексте, являются антиоксидантное антибактериальное действие, свойства смачивания и стимуляция ферментативной активности.

Список растительных компонентов для модуляции растворимых углеводов огромен, но наиболее важными являются следующие: розмарин, тимьян, орегано, флавониды, фенольные кислоты, сапонины и α- и β-кислоты из высушенных шишек хмеля, например, α-лупулиновая кислота.

Кроме того, органические кислоты, например, сорбиновая, пропионовая, молочная, лимонная и аскорбиновая кислота, и их соли для регулирования величины рН, консервации и свойств комплексообразования являются частью этой группы вспомогательных агентов для обработки.

3. Неорганические вспомогательные агенты для обработки

Включают неорганические композиции, например, средства против слеживания и агенты, улучшающие текучесть конечного продукта, например, алюмосиликат калия, и т.д..

Включаются неорганические кислоты, например, хлороводородная кислота.

Обработанные пищевые продукты

Включают молочные продукты, переработанные мясные продукты, сладости, десерты, десерты из мороженого, консервы, сублимированную еду, заправки, супы, полуфабрикаты, хлеб, торты и т.д.

Обработанные корма

Включают готовые к употреблению корма для животных, таких как поросята, телята, домашняя птица, пушные звери, овцы, кошки, собаки, рыба и ракообразные, и т.д..

Фармацевтические продукты

Включают продукты типично в форме таблеток или гранулированной форме, содержащих один или несколько биологически активных ингредиентов, предназначенные для лечения и/или облегчения симптомов заболевания или состояния. Кроме того, фармацевтические продукты включают фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или носители. Твердые продукты, раскрытые в настоящем описании, очень хорошо подходят для применения в качестве фармацевтически приемлемого ингредиента в таблетке или грануле.

Косметические продукты

Включают продукты, предназначенные для личной гигиены, а также улучшения внешнего вида, такие как кондиционеры и средства для ванн.

Подробное описание изобретения

В первом воплощении способа по изобретению по меньшей мере 20 мас.% биомассы, например, по меньшей мере 30 мас.%, по меньшей мере 40 мас.%, по меньшей мере 50 мас.%, по меньшей мере 60 мас.%, по меньшей мере 70 мас.%, по меньшей мере 80 мас.% или по меньшей мере 90 мас.% составляет белковое вещество, происходящее из необязательно обезжиренной сои. Соя также может быть лущеной.

Во втором воплощении способа по изобретению по меньшей мере 20 мас.% биомассы, например, по меньшей мере 30 мас.%, по меньшей мере 40 мас.%, по меньшей мере 50 мас.%, по меньшей мере 60 мас.%, по меньшей мере 70 мас.%, по меньшей мере 80 мас.% или по меньшей мере 90 мас.% составляет белковое вещество, происходящее из необязательно обезжиренных семян рапса.

В третьем воплощении способа по изобретению биомасса включает белковое вещество, происходящее из необязательно обезжиренной сои, в количестве от 5 мас.% до 95 мас.%, в смеси с белковым веществом, происходящим из необязательно обезжиренных семян рапса, в количестве от 95 мас.% до 5 мас.%, необязательно дополнительно смешанное с белковым веществом, происходящим из бобов фава, гороха, семян подсолнечника и/или зерновых, в количествах, доводящих общее количество белкового вещества до 100 мас.%.

В любом из воплощений изобретения биомасса, включающая белковое вещество, может также включать олигосахариды и/или полисахариды, и/или также включает масла и жиры, например, из семян масличных растений.

В любом из воплощений изобретения твердый продукт трансформации субстрата может представлять собой продукт трансформации углеводов, в частности, олигосахаридов и полисахаридов, и/или белкового вещества, происходящих из указанной биомассы, такой как продукт трансформации бобов, таких как соя, горох, люпин, семян подсолнечника и/или зерновых, таких как пшеница или кукуруза, или из семян масличных растений, например, семян рапса.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или смесь живых микроорганизмов может представлять собой один или несколько микроорганизмов, которые могут продуцировать из углеводов одно или несколько органических соединений, таких как органические кислоты, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, молочная кислота и янтарная кислота, или спирты, например, этанол.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов может представлять собой микроорганизм(ы), продуцирующие(е) одну или несколько органических кислот.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов можно выбрать из следующего перечня видов:

- Lactobacillus,

- Lactococcus,

- Streptococcus,

- Pediococcus,

- Enterococcus,

- Leuconostoc,

- Weisella,

- Bifidobacterium,

- Bacillus,

- Brevibacillus,

- Propionibacterium,

- Clostridium,

- Trichoderma,

- Candida,

- Aspergillus.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов можно выбрать из штаммов Lactobacillus, и смесь можно инкубировать при температуре 15-50°С.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов можно выбрать из штаммов Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus и Weisella, и смесь можно инкубировать при температуре 15-50°С.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов можно выбрать из штаммов Bacillus, и смесь можно инкубировать при температуре 20-60°С.

В любом из воплощений изобретения живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов можно выбрать из штаммов Bifidobacterium, и смесь можно инкубировать при температуре 20-45°С.

В любом из вышеуказанных воплощений воду добавляют к указанному субстрату в количестве, которое обеспечивает начальную смесь для инкубации, имеющую отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности от 0,65 до 1,40, такое как 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30 или 1,35.

В любом из вышеуказанных воплощений живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов используют в количестве 10³-10¹¹ КОЕ (колониеобразующие единицы) на г указанного субстрата биомассы, таком как 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ КОЕ/г субстрата биомассы. Теперь специалист может выбрать подходящее количество в зависимости от выбранных условий процесса, таких как размер реактора, время и температура процесса, применяемые микроорганизмы, и продукта трансформации, который получают.

В любом из воплощений изобретения воду добавляют к субстрату в количестве, обеспечивающем отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности в субстрате от примерно 0,60 до 1,45, такое как от примерно 0,65 до примерно 1,40, например, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30 или 1,35.

В любом из воплощений изобретения по меньшей мере 40 мас.% биомассы, например, по меньшей мере 50 мас.%, по меньшей мере 60 мас.%, по меньшей мере 70 мас.%, по меньшей мере 80 мас.% или по меньшей мере 90 мас.%, могут включать белковое вещество, происходящее из необязательно обезжиренных семян рапса, в то время как воду можно добавлять к субстрату в количестве, обеспечивающем отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности в субстрате от примерно 0,65 до примерно 1,10, такое, как 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00 или 1,05.

В любом из воплощений изобретения один или несколько вспомогательных агентов для обработки, выбранных из ферментов, растительных компонентов и органических и неорганических вспомогательных агентов, можно добавлять к субстрату биомассы и/или к начальной смеси для инкубации.

В любом из воплощений изобретения степень заполнения указанного реактора для инкубации может оставаться постоянной. Это будет приводить к равномерному потоку.

В любом из воплощений изобретения вспомогательный агент для обработки, выбранный как препарат α-галактозидазы, можно добавлять к субстрату биомассы и/или к начальной смеси для инкубации в количестве от 0,05 до 50 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы, например, от 0,5 до 25 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы, например, от 1 до 10, от 2 до 8, от 3 до 6 или от 4 до 5 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы.

В любом из воплощений изобретения инкубацию можно выполнять в анаэробных условиях. Анаэробные условия облегчаются настоящим изобретением.

В любом из воплощений изобретения содержание воды в смеси для инкубации может составлять от 35 мас.% до 70 мас.%, например, 40 мас.%, 45 мас.%, 50 мас.%, 55 мас.%, 60 мас.% или 65 мас.%. Таким образом, содержание воды в начальной смеси не превышает 70 мас.%, и оно может изменяться, например, от 40% до 65%, от 45% до 60%, от 48% до 52% или от 50% до 55%, например, составлять 49, 50, 51, 52, 53 или 54%.

В любом из воплощений изобретения смесь инкубируют в течение 1-240 часов при 15-70°С. Теперь специалист знает, как оптимизировать время реакции и температуру реакции в связи с другими условиями реакции, такими как выбор микроорганизмов. Так, температура может изменяться, например, в пределах 20-65°С, 25-60°C, 30-55°C, 35-50°C или 40-45°C; и время реакции можно выбрать, например, как 2-180 часов, такое, как 5-150 часов, 7-120 часов, 10-80 часов, 20-60 часов или 28-48 часов, при любом из упомянутых в настоящем описании температурных интервалов.

В любом из воплощений изобретения твердый продукт трансформации субстрата может быть высушен, необязательно с последующим измельчением.

В любом из воплощений изобретения смесь субстрата может быть инкубирована в течение времени и при температуре, достаточных для инактивации микроорганизмов, антипитательных факторов и фермента(ов), если использованы частично или полностью и если желательно.

В любом из воплощений изобретения реактор для инкубации без перемешивания может быть закрытым.

В любом из воплощений изобретения реактор для инкубации без перемешивания может быть вертикального, вытянутоцилиндрического типа или типа многогранника. Преимуществом использования такого типа является то, что он компактный, и так как реактор без перемешивания, отсутствуют эксплуатационные расходы и расходы на обслуживание оборудования для перемешивания.

В любом из воплощений изобретения площадь в верхней части указанного реактора для инкубации без перемешивания может быть меньше, чем в нижней части, т.е., реактор имеет коническую форму. Преимуществом этого является то, что возрастает эффект скольжения, так что можно использовать биомассу с пониженной текучестью.

В любом из воплощений изобретения реактор для инкубации без перемешивания может иметь изоляцию матами или охлаждающую рубашку (thermal dimple jacket) и приспособления для регулирования температуры в реакторе для инкубации.

Твердый продукт трансформации субстрата по изобретению можно высушить до содержания воды не более 15 мас.%, 13 мас.%, 10 мас.%, 6 мас.%, 4 мас.% или 2 мас.% и он, необязательно, в измельченной форме.

Твердый продукт по изобретению может представлять собой продукт трансформации белкового вещества и/или углеводов, происходящих из указанной биомассы. Твердый продукт трансформации может иметь пониженное содержание антипитательных факторов, таких как ингибиторы трипсина, антигены, вызывающие метеоризм олигосахариды, например, стахиоза и раффиноза; фитиновой кислоты и лектина.

Твердый продукт по изобретению может включать по меньшей мере 40 мас.% белкового вещества от массы сухого вещества, происходящего из сои.

Твердый продукт по изобретению может включать по меньшей мере 40 мас.% белкового вещества от массы сухого вещества, происходящего из семян рапса.

Твердый продукт по изобретению может включать белки в количестве 30-65 мас.% от массы сухого вещества, происходящего из частей растений сои, семян рапса или подсолнечника или их смесей.

Наконец, изобретение относится к продукту питания, корму, косметическому или фармацевтическому продукту или пищевой добавке, содержащим от 1 мас.% до 99 мас.% твердого продукта трансформации, полученного согласно изобретению.

ПРИМЕРЫ

ОТНОШЕНИЕ ПЛОТНОСТЕЙ

Пример 1

Отношение мокрая объемная плотность/сухая объемная плотность для предпочтительных субстратов на основе различных биомасс

1.1. Биомассы, используемые в процедуре

Соя

Используемая соя представляет собой обезжиренную соевую муку (SBM).

Кукуруза

Используемая кукуруза представляет собой цельную кукурузу, измельченную на молотковой дробилке с ситом 3,5 мм.

Пшеница

Используемая пшеница представляет собой цельную пшеницу, измельченную на молотковой дробилке с ситом 3,5 мм.

Подсолнечник

Используемый подсолнечник представляет собой муку из подсолнечного жмыха (SSM).

Семена рапса

Используемые семена рапса представляют собой муку из рапсового жмыха (RSM).

Бобы фава

Используемые бобы являются цельными бобами фава.

Гороховый белок

Используемый гороховый белок представляет собой концентрат горохового белка.

1.2. Описание процедуры

Биомассу и воду в количествах, указанных в таблице далее, смешивают в закрытом контейнере в течение десяти минут с последующим пятиминутным уравновешиванием.

После этого материал выгружают в мерную 500-мл чашку, и определяют ее массу, взвешивая чашку и вычитая массу чашки как тары.

Объемную плотность вычисляют как масса/исходный объем в кг/м³.

Используемой сухой объемной плотностью является измеренная объемная плотность биомассы без добавления воды.

Мокрой объемной плотностью является объемная плотность биомассы с добавленной водой.

Отношение вычисляют как мокрая объемная плотность, деленная на сухую объемную плотность. Содержание влаги в биомассах определяют путем высушивания до постоянной массы.

После добавления воды влажность в смеси определяют путем вычисления.

1.3. Результаты

Результаты для 100% сои и смесей с 80% сои приводятся далее в таблице.

Соя Кукуруза Пшеница Подсолнечник Семена рапса Бобы фава Горох Вода в г Влажность в % Объемная плотность
кг/м³ Отношение 1000 г 0 10,9 665 - 1000 г 100 19,0 638 0,96 1000 г 250 28,7 500 0,75 1000 г 450 38,6 476 0,72 1000 г 750 49,1 470 0,71 1000 г 900 53,1 572 0,86 1000 г 1100 57,6 655 0,98 1000 г 1400 62,9 715 1,07 1000 г 1900 69,3 889 1,34 800 г 200 г 0 11,4 703 - 800 г 200 г 450 38,9 617 0,88 800 г 200 г 900 53,4 634 0,90 800 г 200 г 1900 69,4 1008 1,43 800 г 200 г 0 11,7 694 - 800 г 200 г 450 39,1 580 0,84 800 г 200 г 900 53,5 623 0,90 800 г 200 г 1900 69,5 960 1,38 800 г 200 г 0 10,4 683 - 800 г 200 г 450 38,2 554 0,81 800 г 200 г 900 52,9 598 0,88 800 г 200 г 1900 69,1 926 1,36 800 г 200 г 0 11,3 711 - 800 г 200 г 100 19,4 576 0,81 800 г 200 г 250 29,0 514 0,72 800 г 200 г 450 38,8 483 0,68 800 г 200 г 750 49,3 490 0,69 800 г 200 г 900 53,3 597 0,84 800 г 200 г 1100 57,8 528 0,74 800 г 200 г 1900 69,4 908 1,28 800 г 200 г 0 11,1 691 - 800 г 200 г 450 38,7 569 0,82 800 г 200 г 900 53,2 605 0,88 800 г 200 г 1900 69,3 941 1,36 800 г 200 г 0 11,2 703 - 800 г 200 г 450 38,7 488 0,69 800 г 200 г 900 53,2 728 1,04 800 г 200 г 1900 69,4 964 1,37

Результаты для смесей 60% и 40% сои с кукурузой, подсолнечником и семенами рапса, а также для 100% семян рапса приводятся далее в таблице.

Соя Кукуруза Подсолнечник Семена рапса Вода Влажность в % Объемная плотность кг/м³ Отношение 600 г 400 г 0 г 11,8 703 - 600 г 400 г 250 г 29,5 651 0,93 600 г 400 г 450 г 39,2 626 0,89 600 г 400 г 750 г 49,6 631 0,90 600 г 400 г 900 г 53,6 666 0,95 600 г 400 г 1100 г 58,0 723 1,03 600 г 400 г 1400 г 63,3 796 1,13 600 г 400 г 0 г 10,0 644 - 600 г 400 г 100 г 18,2 530 0,82 600 г 400 г 250 г 28,0 435 0,68 600 г 400 г 450 г 37,9 433 0,67 600 г 400 г 750 г 48,6 436 0,68 600 г 400 г 900 г 52,6 480 0,75 600 г 400 г 1100 г 57,1 449 0,70 600 г 400 г 1400 г 62,5 616 0,96 600 г 400 г 0 г 11,7 643 - 600 г 400 г 100 г 19,7 560 0,82 600 г 400 г 250 г 29,4 502 0,78 600 г 400 г 450 г 39,1 503 0,78 600 г 400 г 750 г 49,5 492 0,77 600 г 400 г 900 г 53,5 516 0,80 600 г 400 г 1100 г 57,9 545 0,85 600 г 400 г 1400 г 63,2 655 1,02 400 г 600 г 0 г 12,3 718 - 400 г 600 г 250 г 29,9 636 0,89 400 г 600 г 450 г 39,5 638 0,89 400 г 600 г 750 г 49,9 666 0,93 400 г 600 г 900 г 53,8 721 1,00 400 г 600 г 1100 г 58,2 802 1,12 400 г 600 г 1400 г 63,5 988 1,38 400 г 600 г 0 г 9,5 654 - 400 г 600 г 100 г 17,7 535 0,82 400 г 600 г 250 г 27,6 422 0,65 400 г 600 г 450 г 37,6 487 0,74 400 г 600 г 750 г 48,3 491 0,75 400 г 600 г 900 г 52,4 512 0,78 400 г 600 г 1100 г 56,9 585 0,89 400 г 600 г 1400 г 62,3 612 0,94 400 г 600 г 0 г 12,1 658 - 400 г 600 г 100 г 20,1 556 0,84 400 г 600 г 250 г 29,7 471 0,72 400 г 600 г 450 г 39,4 458 0,70 400 г 600 г 750 г 49,8 486 0,74 400 г 600 г 900 г 53,7 486 0,74 400 г 600 г 1100 г 58,1 531 0,81 400 г 600 г 1400 г 63,4 605 0,92 0 г 1000 г 0 г 12,9 616 - 0 г 1000 г 100 г 20,8 484 0,79 0 г 1000 г 250 г 30,3 438 0,71 0 г 1000 г 450 г 39,9 457 0,74 0 г 1000 г 750 г 50,2 507 0,82 0 г 1000 г 900 г 54,1 535 0,87 0 г 1000 г 1100 г 58,5 585 0,95 0 г 1000 г 1400 г 63,7 688 1,12

Пример 2

Отношение мокрая объемная плотность/сухая объемная плотность для субстратов на основе различных биомасс и использованных в экспериментах с различными микроорганизмами

Определение объемной плотности выполняют, помещая некое количество материала (приблиз. 150 мл) в 250-мл мерный цилиндр и считывая объем после выравнивания поверхности путем осторожного встряхивания цилиндра. После этого определяют массу материала. Определение сухих объемных плотностей и мокрых объемных плотностей повторяют три раза.

Результаты суммируют в следующей далее таблице.

Биомасса Сухое вещество в мас.% Отношение плотностей =
мокрая объемная плотность/сухая объемная плотность 100% SBM 35 1,13 100% SBM 40 0,95 100% SBM 42,5 0,86 100% SBM 52 0,85 100% SBM 55 0,84 80% SBM+20% RSM 35 1,05 80% SBM+20% RSM 42,5 0,88 80% SBM+20% RSM 52 0,78 60% SBM+40% SSM 35 0,94 60% SBM+40% SSM 42,5 0,84 60% SBM+40% SSM 52 0,73

ИСПЫТАНИЯ НОВОГО ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИНКУБАЦИИ В ЛАБОРАТОРНОМ МАСШТАБЕ

Следующие далее эксперименты 3-9 являются экспериментами в лабораторном масштабе, проводимыми в указанных далее условиях.

Основа

Основой для последующих испытаний инкубации в лабораторном масштабе является имитация условий в способе по настоящему изобретению.

Материалы и методы

Материалы

Биомассы: соевая мука (SBM), мука из рапсового жмыха (RSM) и мука из подсолнечного жмыха (SSM) - как описано в разделе 1.1.

Вода: обычная водопроводная вода.

Микроорганизмы: используемый(е) микроорганизм является(ются) специфическим(и) для каждого примера. Во всех экспериментах, без указания в конкретном примере, микроорганизмы дозируют в количестве приблизительно 10⁸ КОЕ/г DM. Молочнокислые бактерии и Bifidobacteria выращивают в среде MRS, промывают в 0,9% NaCl и добавляют для инкубации на основании соотношения между OD₆₀₀ и КОЕ/мл. Количество мл, необходимых для дозы 10⁸ КОЕ/г DM, вычитают из общего количества воды, установленного для каждого примера. В случае штаммов Bacillus большинство из них дозируют в виде сухих препаратов культур, но Geobacillus denitrificans и Bacillus smithii выращивают в питательном бульоне, промывают таким же способом и дозируют таким же способом, как описано для штаммов молочнокислых бактерий.

Микроорганизмы, используемые в примерах, и их происхождение показаны в следующей далее таблице.

Штамм Происхождение Lactobacillus plantarum Pangoo Lactobacillus paracasei 5622 DSMZ Lactobacillus fermentum Bio Growing Lactobacillus acidophilus Bio Growing Lactobacillus delbruckii bulgaricus Bio Growing Lactobacillus debruckii sunkii 24966 DSMZ Lactobacillus farciminis Собственный изолят Lactobacillus formosensis Собственный изолят Lactobacillus salivarius 20554 DSMZ Bacillus coagulans Pangoo Bacillus licheniformis BioCat Bacillus subtilis BioCat Bacillus smithii 2319 DSMZ Lactococcus lactis Bio Growing Bifidobacterium animalis Bio Growing Pediococcus acidolactici Pangoo Enterococcus faecium Pangoo Enterococcus faecalis Pangoo Enterococcus durans Собственный изолят Weisella hellenica Собственный изолят Streptococcus thermophiles Bio Growing Geobacillus thermodenitrificans 466 DSMZ

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

Вспомогательный агент для обработки: α-галактозидаза от Bio-Cat (12500 Е/г). α-Галактозидазу дозируют в 1 мл воды, который вычитают из общего количества добавляемой воды, установленного в таблице для каждого примера.

Используемый экспериментальный метод

Реактор для инкубации

Для того, чтобы имитировать условия инкубации при биоконверсии, где кислород становится недоступным, биоконверсию выполняют в прочных пластиковых мешках, сдавливаемых руками для удаления воздуха и плотно закрываемых ремнем, позволяя еще высвобождаться СО₂.

Инкубация

Образцы инкубируют при различных температурах, различном содержании воды и различной длительности по времени, специфическим для каждого примера. Инкубацию останавливают путем нагревания при 100°С в течение 30 мин.

Аналитические методы

Анализ кислот

Анализ проводят в LUFA Oldenburg, Германия, с использованием гидролиза с мембранной фильтрацией и последующего измерения методом ионной хроматографии.

Сахароза и галактоза (сахара)

Содержание сахарозы и галактозы определяют тонкослойной хроматографией.

Неподвижная фаза силикагель 60 (Merck 1.05553.0001).

Подвижная фаза 120 мл н-бутанола, 80 мл пиридина и 60 мл деминерализованной воды.

Пятна визуализируют жидкостью, состоящей из смеси 335 мл ацетона, 8 мл анилина и 60 мл фосфорной кислоты с 8 г дифениламина.

Концентрацию сахара определяют путем сравнения с известными стандартами.

рН

Величину рН измеряют в 10% растворах DM с HQ 411d от HACH.

КОЕ

КОЕ определяют по разрастанию по пластинке, используя пластинки агара MRS для молочнокислых бактерий и питательный агар для штаммов Bacillus.

Пример 3

Проверка различно продуцирующих организмов (LAB) при 20°С в различных соотношениях с сухим веществом

Организация эксперимента

Штамм Сухое вещество, мас.% Уровень инокуляции, КОЕ/г DM SBM
(88% DM), г α-Галактозидаза мг Вода, мл Lactobacillus salivarius 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus debruckii sunkii 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus plantarum 35 1*10⁸ 113,6 120 172 Lactobacillus plantarum 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus plantarum 52 1*10⁸ 113,6 120 79 Lactobacillus paracasei 35 1*10⁸ 113,6 120 172 Lactobacillus paracasei 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122

Образцы инкубируют при 20°С на термостатической водяной бане.

Результаты

После 44-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM, % Молочная кислота % от DM Уксусная кислота % от DM Все кислоты % от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахаро за % от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 35 4,9 1,2 6,1 4,9 3*10¹⁰ 0 0 Lactobacillus plantarum 42,5 3,7 1,3 5,0 5,2 2*10¹⁰ 0 0 Lactobacillus
Plantarum 52 3,2 0,9 4,1 5,2 2*10¹⁰ 0 0

После 166-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus salivarius 42,5 3,4 1,0 4,4 4,9 9,5*10⁹ 0,5 1,6 Lactobacillus debruckii sunkii 42,5 3,7 0,5 4,2 4,9 3,9*10⁹ 0 1,6 Lactobacillus plantarum 35 7,3 1,1 8,4 4,5 2,0*10¹⁰ 0 0 Lactobacillus plantarum 42,5 5,7 1,1 6,8 4,7 2,3*10¹⁰ 0 0 Lactobacillus plantarum 52 5,1 1,2 6,3 4,8 2,2*10¹⁰ 0 0 Lactobacillus paracasei 35 4,7 0,8 5,5 4,8 1,9*10¹⁰ 6 0 Lactobacillus paracasei 42,5 3,2 0,6 3,8 4,8 1,8*10¹⁰ 6 0

В этом эксперименте часть сахаров еще остается связанной в олигосахаридах даже через 166 часов. Потенциал продуцирования кислот в связи с этим больший, чем получен в этом испытании.

Пример 4

Проверка различно продуцирующих организмов (LAB) при 30°С при 40% DM

Организация эксперимента

Штамм Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
(88% DM), г α- Галактозидаза мг Вода мл Lactobacillus plantarum 40 1*10⁸ 68,2 72 82 Lactococcus lactis 40 1*10⁸ 68,2 72 82 Enterococcus faecium 40 1*10⁸ 68,2 72 82

Образцы инкубируют при 30°С на термостатической водяной бане.

Результаты

После 45-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 40 6,2 1,1 7,3 4,6 1*10¹⁰ 0 1,4 Lactococcus lactis 40 3,7 0,9 4,6 4,8 1*10¹⁰ 1,8 1,8 Enterococcus faecium 40 5,1 1,4 6,5 4,8 2*10¹⁰ 0,4 1,4

После 69-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие конверсию сахаров и продуцирование кислот (КОЕ не определяют).

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 40 7,0 1,0 8,0 4,5 0 0,5 Lactococcus lactis 40 4,3 1,2 5,5 4,6 1,8 1,2 Enterococcus faecium 40 5,8 1,3 7,1 4,6 0 0,6

Пример 5

Проверка различно продуцирующих организмов при 37°С в различных соотношениях с сухим веществом

Организация эксперимента

Штамм № эксп. Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
(88% DM)
г α- Галактозидаза
мг Вода мл Lactobacillus plantarum 1 35 1*10⁸ 113,6 120 172 Lactobacillus plantarum 2 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus plantarum 3 42,5 1*10⁸ 113,6 Не добавляли 122 Lactobacillus plantarum 4 42,5 1*10⁷ 68,2 72 73 Lactobacillus plantarum 5 42,5 1*10⁹ 68,2 72 73 Lactobacillus plantarum 6 52 1*10⁸ 113,6 120 79 Lactobacillus paracasei 7 35 1*10⁸ 113,6 120 172 Lactobacillus paracasei 8 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus paracasei 9 52 1*10⁸ 113,6 120 79 Bacillus coagulans 10 35 1*10⁸ 68,2 72 103 Bacillus coagulans 11 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Bacillus coagulans 12 42,5 1*10⁸ 113,6 Не добавляли 122 Bacillus coagulans 13 42,5 1*10⁷ 68,2 72 73 Bacillus coagulans 14 55 1*10⁸ 68,2 72 41 Bacillus licheniformis 15 35 1*10⁸ 68,2 72 103 Bacillus licheniformis 16 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Bacillus licheniformis 17 55 1*10⁸ 68,2 72 41 Bacillus subtilis 18 35 1*10⁸ 68,2 72 103 Bacillus subtilis 19 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Bacillus subtilis 20 55 1*10⁸ 68,2 72 41 Lactobacillus fermentum 21 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Lactobacillus acidophilus 22 42,5 6*10⁷ 68,2 72 73 Lactobacillus delbruckii bulgaricus 23 42,5 2*10⁷ 68,2 72 73 Lactobacillus farciminis 24 42,5 6*10⁶ 68,2 72 73 Lactobacillus formosensis 25 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactococcus lactis 26 42,5 4*10⁷ 68,2 72 73 Bifidobacterium animalis 27 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Pediococcus acidolactici 28 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Enterococcus faecium 29 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Enterococcus faecalis 30 42,5 1*10⁸ 68,2 72 73 Enterococcus durans 31 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Weisella hellenica 32 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122 Lactobacillus salivarius +
Lactobacillus paracasei 33 42,5 1*10⁸ и
3*10⁷ 113,6 120 122 Streptococcus thermophilus+Bifidobacterium animalis 34 42,5 5*10⁷ и
5*10⁷ 113,6 120 122 Pediococcus acidolactici +
Lactobacillus plantarum 35 42,5 5*10⁷ и
5*10⁷ 113,6 120 122 Lactobacillus farciminis +
Lactobacillus plantarum 36 42,5 5*10⁷ и
5*10⁷ 113,6 120 122 Lactobacillus plantarum+sucrose (5% of DM) 37 42,5 1*10⁸ 113,6 120 122

Результаты

После 18,5-20-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм № эксп. DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота % от DM Все кислоты
% от DM pH Инокуляция КОЕ/г DM Сахароза % от DM Галактоза % от DM Lactobacillus plantarum 1 35 6,1 1,2 7,3 4,6 nd 1 2 Lactobacillus plantarum
Инок. 10⁸ КОЕ/г 2 42,5 5,3 1,2 6,5 4,7 nd 1 2 Lactobacillus plantarum
Инок. 10⁷ КОЕ/г 4 42,5 5,5 1,2 6,7 5,0 nd 2 2 Lactobacillus plantarum
Инок. 10⁹ КОЕ/г 5 42,5 6,5 1,2 7,7 4,8 nd 1 2 Lactobacillus plantarum 6 52 4,7 1,1 5,8 4,8 nd 2 2 Lactobacillus paracasei 7 35 5,3 0,1 5,4 4,4 nd 2 2 Lactobacillus paracasei 8 42,5 4,5 0,1 4,6 4,5 nd 2,6 2 Bacillus coagulans
Инок. 10⁸ КОЕ/г 11 42,5 4,5 1,4 5,9 5,3 8*10⁹ 2,5 2 Bacillus coagulans
Инок. 10⁷ КОЕ/г 13 42,5 3,6 1,4 5,0 5,4 7*10⁹ 2,5 2 Lactobacillus farciminis (без 1) 24 42,5 4,2 0,1 4,3 4,8 nd 4 3,5 Lactococcus lactis 26 42,5 3,0 2,0 5,0 5,0 nd 2 2 Bifidobacterium animalis 27 42,5 4,1 2,0 6,1 5,0 nd 2 2 Pediococcus acidolactici 28 42,5 3,7 1,5 5,2 5,1 nd 2 2 Enterococcus faecium 29 42,5 5,4 1,4 6,8 5,1 nd 2 2 Lactobacillus salivarius +
Lactobacillus paracasei 33 42,5 5,1 0,1 5,2 4,4 nd 2 2 Streptococcus thermophiles+Bifidobacterium animalis 34 42,5 4,1 1,9 6,0 4,9 nd 2 2 Pediococcus acidolactici +
Lactobacillus plantarum 35 42,5 5,4 1,2 6,6 4,7 nd 1 2 Lactobacillus farciminis +
Lactobacillus plantarum 36 42,5 6,0 0,9 6,9 4,5 nd 1 2 Lactobacillus plantarum+сахароза 37 42,5 5,3 1,1 6,4 4,7 nd 6 2

nd: не определялось

После 42,5- и 44-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм № эксп. DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота % от DM Все кислоты % от DM pH Инокуляция КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 1 35 7,3 1,0 8,3 4,4 1*10¹⁰ 0 1,4 Lactobacillus plantarum
Инок. 10⁸ КОЕ/г 2 42,5 6,8 1,2 8,0 4,4 1*10¹⁰ 0 1,8 Lactobacillus plantarum (без α-gal) 3 42,5 3,6 1,2 4,8 5,1 5*10⁹ 0 0 Lactobacillus plantarum
Инок. 10⁷ КОЕ/г 4 42,5 7,3 1,5 8,8 4,6 nd 0 1,1 Lactobacillus plantarum
Inoc: 10⁹ КОЕ/г 5 42,5 7,9 1,1 9,0 4,6 nd 0 1,25 Lactobacillus plantarum 6 52 6,6 1,2 7,8 4,5 1*10¹⁰ 0 1,8 Lactobacillus paracasei 7 35 7,2 0,1 7,3 4,1 3*10¹⁰ 0 2,4 Lactobacillus paracasei 8 42,5 6,6 0,1 6,7 4,2 2*10¹⁰ 0,5 2,6 Lactobacillus paracasei 9 52 5,3 0,1 5,4 4,4 2*10¹⁰ 3 3 Bacillus coagulans 10 35 6,9 1,2 8,1 4,5 nd 0 1,3 Bacillus coagulans
Инок. 10⁸ КОЕ/г 11 42,5 8,2 1,3 9,5 4,6 4*10⁹ 0,4 1 Bacillus coagulans (без α-gal) 12 42,5 5,5 1,2 6,7 4,7 2*10⁹ 0 0 Bacillus coagulans
Инок. 10⁷ КОЕ/г 13 42,5 7,3 1,3 8,6 4,7 3*10⁹ 0,5 1 Bacillus coagulans 14 55 3,7 0,8 4,5 5,1 nd 2 2 Bacillus licheniformis 15 35 2,7 0,0 2,7 5,1 nd 2,5 4 Bacillus licheniformis 16 42,5 0,8 0,0 0,8 6,0 nd 2,5 4 Bacillus licheniformis 17 55 0,2 0,0 0,2 6,4 nd 2,7 3,3 Bacillus subtilis 18 35 2,4 0,1 2,5 5,1 nd 3 4 Bacillus subtilis 19 42,5 2,5 0,9 3,4 5,3 3*10⁹ 3,6 2,6 Bacillus subtilis 20 55 0,5 0,1 0,6 6,0 nd 5 2 Lactobacillus fermentum 21 42,5 4,6 2,1 6,7 4,9 5*10¹⁰ 1 1 Lactobacillus acidophilus 22 42,5 4,2 0,2 4,4 4,7 4*10⁹ 1 1 Lactobacillus delbruckii bulgaricus 23 42,5 3,7 1,7 5,4 5,2 8*10⁹ 3,3 2,5 Lactobacillus farciminis 24 42,5 7,9 0,3 8,2 4,2 5*10⁹ 0,8 2,8 Lactobacillus formosensis 25 42,5 6,5 0,2 6,7 4,2 3*10⁹ 0,5 2 Lactococcus lactis 26 42,5 4,0 2,3 6,3 4,8 8*10⁹ 0,8 1 Bifidobacterium animalis 27 42,5 4,5 2,1 6,6 4,9 6*10⁹ 1 0,8 Pediococcus acidolactici 28 42,5 6,9 1,5 8,4 4,6 9*10⁹ 0,5 0,7 Enterococcus faecium 29 42,5 7,6 1,5 9,1 4,6 7*10⁹ 0,5 0,7 Enterococcus faecalis 30 42,5 5,8 1,5 7,3 4,7 9*10⁹ 0,3 0,3 Enterococcus durans 31 42,5 2,7 0,2 2,9 4,9 2*10⁹ 3 2 Weisella hellenica 32 42,5 4,1 1,6 5,7 4,9 3*10⁹ 1 1 Lactobacillus salivarius +
Lactobacillus paracasei 33 42,5 6,2 0,1 6,3 4,2 1*10¹⁰ 1 1,9 Streptococcus thermophiles+Bifidobacterium animalis 34 42,5 5,1 2,0 7,1 4,8 8*10¹⁰ 0,2 1 Pediococcus acidolactici +
Lactobacillus plantarum 35 42,5 6,9 1,2 8,1 4,4 1*10¹⁰ 0 1 Lactobacillus farciminis +
Lactobacillus plantarum 36 42,5 7,4 1,0 8,4 4,4 9*10⁹ 0 1.4 Lactobacillus plantarum+sucrose 37 42,5 6,5 1,0 7,5 4,4 1*10¹⁰ 4 2.2

nd: не определялось

После 116-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм № эксп. DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Сахароза % от DM Галактоза % от DM Bacillus coagulans 10 35 7,7 1,2 8,9 4,3 0 0 Bacillus coagulans 11 42,5 7,7 1,2 8,9 4,3 0,1 0,5 Bacillus coagulans 14 55 4,8 0,7 5,5 4,8 1,2 1,6 Bacillus licheniformis 15 35 2,5 0,1 2,6 4,8 0,3 3,5 Bacillus licheniformis 16 42,5 1,7 0,1 1,8 5,5 2 3,3 Bacillus licheniformis 17 55 0,4 0,1 0,5 6,3 2,9 3,3 Bacillus subtilis 18 35 1,6 0,1 1,7 4,9 0 3,5 Bacillus subtilis 19 42,5 1,4 0,1 1,5 5,1 1,5 3,5 Bacillus subtilis 20 55 0,8 0,2 1,0 5,9 5 3

Пример 6

Проверка различно продуцирующих организмов при 44°С при 40% DM

Организация эксперимента

Штамм Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
88% DM, г α- Галактозидаза мг Вода мл Lactobacillus plantarum 40 1*10⁸ 68,2 72 73 Pediococcus acidolactici 40 1*10⁸ 68,2 72 73 Bacillus coagulans 40 1*10⁸ 68,2 72 73 Bacillus licheniformis 40 1*10⁸ 68,2 72 73 Bacillus subtilis 40 1*10⁸ 68,2 72 73

Образцы инкубируют при 44°С на термостатической водяной бане.

Результаты

После 20-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 40 5,1 0,2 5,3 4,8 Nd 3 2,5 Pediococcus acidolactici 40 4,7 0,2 4,9 4,8 Nd 3 3 Bacillus coagulans 40 4,4 0,1 4,5 5,0 2*10¹⁰ 2 2,5 Bacillus licheniformis 40 1,1 0,0 1,1 6,0 2*10⁸ 2,5 3,6 Bacillus subtilis 40 0,7 0,2 0,9 6,0 1*10⁹ 6,5 3,8

Nd: не определялось

После 44-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот (КОЕ не определяли).

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Lactobacillus plantarum 40 6,8 0,3 7,1 4,4 3 2,2 Pediococcus acidolactici 40 6,6 0,3 6,9 4,4 2 1,5 Bacillus coagulans 40 7,2 0,2 7,4 4,4 0,5 1,0 Bacillus licheniformis 40 1,5 0,1 1,6 5,9 1 2,9 Bacillus subtilis 40 1,3 0,1 1,4 5,7 4,5 2,9

Пример 7

Проверка различно продуцирующих организмов при 52°С при 52% DM

Организация эксперимента

Штамм Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
(88% DM) г α- Галактозидаза мг Вода мл Bacillus smithii 42,5 1*108 113,6 120 172 Bacillus smithii 42,5 1*108 113,6 Не добавляют 172 Bacillus licheniformis 42,5 1*108 113,6 120 172 Bacillus licheniformis 42,5 1*108 113,6 Не добавляют 172 Bacillus coagulans 42,5 1*108 113,6 120 172

Образцы инкубируют при 52°С на термостатической водяной бане.

Результаты

После 116,5-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM
% Молочная кислота
% от DM Уксусная кислота
% от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза
% от DM Галактоза
% от DM Bacillus smithii 42,5 3,3 0,1 3,4 5,2 1*10⁶ 4 2 Bacillus smithii (без α-gal) 42,5 2,2 0,1 2,3 5,3 Nd 2 0 Bacillus licheniformis 42,5 3,8 0 3,8 5,4 5*10⁷ 3 2 Bacillus licheniformis (без α-gal) 42,5 2,7 0 2,7 5,5 Nd 0,5 0 Bacillus coagulans 42,5 1,8 0,2 2,0 4,9 4*10⁸ 1,5 1,5

Nd: не определялось

Пример 8

Проверка различно продуцирующих организмов при 60°С

Организация эксперимента

Штамм Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
(88% DM) г α- Галактозидаза мг Вода мл Bacillus coagulans 42,5 1*108 113,6 120 122 Bacillus smithii 42,5 1*108 113,6 120 122 Geobacillus thermodenitrificans 35 1*108 113,6 120 172

Образцы инкубируют при 60°С в инкубаторе.

Результаты

После 44,5- и 116,5-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм Время инокуляции, часы DM
% Молочная кислота % от DM Уксусная кислота % от DM Все кислоты % от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза % от DM Галактоза % от DM Bacillus coagulans 116,5 42,5 1,3 0,2 1,5 5,3 6*10⁶ 7 4 Bacillus smithii 116,5 42,5 0,8 0,4 1,2 5,7 5*10⁶ 7 4 Geobacillus thermodenitrificans 44,5 35 2,0 0,2 2,2 5,2 9*10⁷ 8 4

Пример 9

Биоконверсия различных биомасс

Инкубация при 37°С в течение 42,5-45,5 часов.

Штамм Сухое вещество мас.% Уровень инокуляции КОЕ/г DM SBM
(88% DM)
г RSM
(88% DM)г SSM
(91% DM)г α- Галактозидаза мг Вода мл Lactobacillus plantarum 35 1*10⁸ 113,6 - - 120 172 Lactobacillus plantarum 42,5 1*10⁸ 113,6 - - 120 122 Lactobacillus plantarum 52 1*10⁸ 113,6 - - 120 79 Lactobacillus plantarum 35 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 172 Lactobacillus plantarum 42,5 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 122 Lactobacillus plantarum 52 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 79 Lactobacillus plantarum 35 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 174 Lactobacillus plantarum 42,5 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 124 Lactobacillus plantarum 52 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 81 Bacillus coagulans 35 1*10⁸ 68,2 - - 72 103 Bacillus coagulans 42,5 1*10⁸ 113,6 - - 120 122 Bacillus coagulans 55 1*10⁸ 68,2 - - 72 41 Bacillus coagulans 35 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 172 Bacillus coagulans 42,5 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 122 Bacillus coagulans 52 1*10⁸ 90,1 22,8 - 120 79 Bacillus coagulans 35 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 174 Bacillus coagulans 42,5 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 124 Bacillus coagulans 52 1*10⁸ 67,8 - 43,8 120 81

Результаты

После 42,5-45,5-часовой инкубации получают приведенные далее результаты, показывающие рост, конверсию сахаров и продуцирование кислот.

Штамм DM
% Биомасса Молочная кислота % от DM Уксусная кислота % от DM Все кислоты
% от DM pH Уровень инокуляции КОЕ/г DM Сахароза % от DM Галактоза % от DM Lactobacillus plantarum 35 SBM 7,2 0,1 7,3 4,1 3*10¹⁰ 0 2,4 Lactobacillus plantarum 42,5 SBM 6,8 1,2 8,0 4,4 1*10¹⁰ 0 1,8 Lactobacillus plantarum 52 SBM 6,6 1,2 7,8 4,5 1*10¹⁰ 0 1,8 Lactobacillus plantarum 35 SBM/
RSM 7,3 0,9 8,2 4,4 5*10⁹ 0 1 Lactobacillus plantarum 42,5 SBM/
RSM 6,8 1,0 7,8 4,4 5*10⁹ 0 1 Lactobacillus plantarum 52 SBM/
RSM 5,9 0,9 6,8 4,5 7*10⁹ 0,8 1 Lactobacillus plantarum 35 SBM/
SSM 6,5 0,7 7,2 4,4 4*10⁹ 0 1 Lactobacillus plantarum 42,5 SBM/
SSM 6,3 0,7 7,0 4,4 4*10⁹ 0 1 Lactobacillus plantarum 52 SBM/
SSM 5,7 0,7 6,4 4,4 4*10⁹ 0,8 1 Bacillus coagulans 35 SBM 6,9 1,2 8,1 4,5 Не опр. 0 1,3 Bacillus coagulans 42,5 SBM 6,5 1,3 7,8 4,5 7*10⁹ 0 0,5 Bacillus coagulans 55 SBM 3,7 0,8 4,5 5,1 Не опр. 2 2 Bacillus coagulans 35 SBM/
RSM 7,2 0,9 8,1 4,4 2*10⁹ 0 0,5 Bacillus coagulans 42,5 SBM/
RSM 6,3 1,0 7,3 4,4 3*10⁹ 0,3 0,8 Bacillus coagulans 52 SBM/
RSM 5,6 0,9 6,5 4,5 2*10⁹ 1 1 Bacillus coagulans 35 SBM/
SSM 6,1 0,7 6,8 4,4 2*10⁹ 0 0 Bacillus coagulans 42,5 SBM/
SSM 5,8 0,7 6,5 4,4 5*10⁹ 0,3 0,5 Bacillus coagulans 52 SBM/
SSM 4,7 0,7 5,4 4,6 3*10⁹ 1 1

Пример 10

Биоконверсия в пилотном масштабе

Инкубатор

Инкубатор представляет собой лабораторный вертикальный реактор с общим объемом 2,0 м³. Инкубатор снабжен температурным зондом на впуске, а также на выпуске.

Смесь для инкубации

В инкубатор загружают предварительно нагретую смесь 250 кг соевой муки (88% DM), 264 г α-галактозидазы от Bio-Cat (12500 Е/г), сухого препарата Bacillus coagulans для достижения конечного уровня инокуляции 1*10⁷ клетки/г DM и 268 литров водопроводной воды. Отношение мокрая объемная плотность/сухая объемная плотность в смеси для инкубации составляет 0,88. Это приводит к DM 42,5% в смеси для инкубации.

Процедура испытания

После заполнения реактора его продувают газом N₂ для того, чтобы избавиться от О₂. Биомассу инкубируют в течение 60 часов при 37°С.

Результаты

Через 60 часов получают продукт, включающий 7,5% от DM молочной кислоты и 1,3% от DM уксусной кислоты.

Величина рН падает до 4,6.

Пример 11

Биоконверсия в крупном масштабе

Инкубатор

Используемый реактор представляет собой вертикальный цилиндр с эффективной высотой 7,3 м и диаметром 4,3 м.

В верхней части вертикального реактора поступающую смесь загружают почти по центру реактора. Для равномерного распределения поступающая во впускное отверстие смесь распределяется по периметру реактора ножом скрепера или планирной штангой.

Продукт извлекают в донной части реактора, добиваясь постоянного времени пребывания для любого разброса частиц в верхней части реактора.

Проверка равномерности пробкового потока

Впускные и выпускные приспособления реактора регулируются для достижения ожидаемого времени пребывания 12 часов. Для того, чтобы удостовериться в постоянном времени распределения, в загружаемую смесь добавляют инертное индикаторное вещество. Загружаемая смесь, используемая в эксперименте, имеет естественное содержание железа около 143 мг/кг сухого вещества (= начальная концентрация); поэтому в качестве индикатора используют сульфат железа (FeSO₄) в концентрации 1167 мг FeSO₄/кг сухого вещества загружаемой смеси, что равно общему содержанию железа 572 мг Fe/кг всего сухого вещества. В момент времени 0 часов FeSO₄ добавляют в загружаемую смесь, подаваемую в реактор в течение 60 минут. Образцы берут каждые 20 минут, сушат и анализируют на содержание железа, и обнаруживают, что обогащенный FeSO₄ продукт выходит из реактора через 12-13 часов после добавления FeSO₄ в смесь, загружаемую во впускное отверстие, а максимальную концентрацию Fe 355 мг/кг обнаруживают через 12,5 часов от начала эксперимента.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Описан способ производства твердого продукта, выбранного из твердого кормового или пищевого ингредиента, или твердой пищевой добавки, включающий получение субстрата биомассы, включающей углеводы и белковое вещество, происходящие из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей, причем по меньшей мере 20 мас.% указанной биомассы включают углеводы и белковое вещество, происходящие из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей, смешивание указанного субстрата с живым микроорганизмом или комбинацией живых микроорганизмов, выбранных из бактерий, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов не являются или не включают живые дрожжи, и добавление воды в количестве, которое обеспечивает начальную смесь для инкубации, имеющую содержание воды от 30 до 70 мас.% и отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности от 0,60 до 1,45, инкубацию указанной начальной смеси для инкубации в течение 2-180 ч при температуре 15-70°С и извлечение конечных продуктов, при этом стадию инкубации выполняют как непрерывный процесс в равномерном пробковом потоке в вертикальном реакторе для инкубации без перемешивания с приспособлениями для впуска указанной смеси и добавок и приспособлениями для выпуска указанного твердого продукта, а перемещение биомассы опосредовано гравитационной силой. Изобретение позволяет осуществлять эффективный и быстрый способ биоконверсии биомассы, чтобы произвести биопродукты, включающие органические кислоты, из дешевых источников углеводов, в промышленном масштабе. 35 з.п. ф-лы, 23 табл., 11 пр.

1. Способ производства твердого продукта, выбранного из твердого кормового или пищевого ингредиента, или твердой пищевой добавки, где способ включает следующие стадии:

- получение субстрата биомассы, включающей углеводы и белковое вещество, происходящие из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей, причем по меньшей мере 20 мас.% указанной биомассы включают углеводы и белковое вещество, происходящие из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей;

- смешивание указанного субстрата с живым микроорганизмом или комбинацией живых микроорганизмов, выбранных из бактерий, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов не являются или не включают живые дрожжи, и добавление воды в количестве, которое обеспечивает начальную смесь для инкубации, имеющую содержание воды от 30 до 70 мас.% и отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности от 0,60 до 1,45;

- инкубация указанной начальной смеси для инкубации в течение 2-180 ч при температуре 15-70°С, и

- извлечение из инкубированной смеси указанного твердого продукта, выбранного из твердого кормового или пищевого ингредиента, или твердой пищевой добавки, полученного в результате инкубации белкового вещества и/или углеводов, происходящих из указанной биомассы, с указанным живым микроорганизмом или комбинацией живых микроорганизмов, выбранных из бактерий, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов не являются или не включают живые дрожжи;

также включающий, что стадию инкубации выполняют как непрерывный процесс в равномерном пробковом потоке в вертикальном реакторе для инкубации без перемешивания с приспособлениями для впуска указанной смеси и добавок и приспособлениями для выпуска указанного твердого продукта, и

где перемещение биомассы опосредовано гравитационной силой.

2. Способ по п. 1, где указанная биомасса дополнительно смешана с углеводами и белковым веществом, происходящими из семян бобов фава, семян гороха, семян подсолнечника, семян люпина и/или семян зерновых.

3. Способ по п. 1 или 2, также включающий предварительную обработку указанного субстрата биомассы до его смешивания с указанным живым микроорганизмом или указанной комбинацией живых микроорганизмов, такую как химическая или физическая предварительная обработка, например, посредством разрушения, перемалывания, расплющивания, тепловой обработки, обработки под давлением, обработки ультразвуком, гидротермической обработки или обработки кислотой или щелочью.

4. Способ по любому из пп. 1-3, причем по меньшей мере 30 мас.% указанной биомассы, например, по меньшей мере 40 мас.%, по меньшей мере 50 мас.%, по меньшей мере 60 мас.%, по меньшей мере 70 мас.%, по меньшей мере 80 мас.% или по меньшей мере 90 мас.% указанной биомассы включают углеводы и белковое вещество, происходящие из соевых бобов, семян рапса или их смесей.

5. Способ по п. 4, где указанная биомасса включает углеводы и белковое вещество, происходящие из обезжиренных и/или лущеных соевых бобов, обезжиренных семян рапса или их смесей.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная биомасса включает олигосахариды и/или полисахариды.

7. Способ по п. 6, где указанная биомасса дополнительно включает масла и жиры, например, из семян масличных растений.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где твердый кормовой или пищевой ингредиент, или твердая пищевая добавка, получены в результате инкубации углеводов и/или белкового материала, происходящих из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей, в дополнительной смеси с материалом, происходящих из бобов, и/или зерновых, и/или из семян масличных растений.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где твердый кормовой или пищевой ингредиент, или твердая пищевая добавка, получены в результате инкубации белкового вещества и/или углеводов, происходящих из семян соевых бобов, семян рапса или их смесей, в дополнительной смеси с материалом, происходящих из семян гороха, люпина, подсолнечника, пшеницы, кукурузы или семян рапса.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов, которые могут продуцировать одно или несколько органических соединений.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов, которые могут продуцировать одну или несколько органических кислот, например муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, молочную кислоту и янтарную кислоту, из углеводов.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов, которые могут продуцировать один или несколько спиртов, например этанол, из углеводов.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинация живых микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов, продуцирующих органические кислоты.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из следующего перечня видов:

- Lactobacillus,

- Lactococcus,

- Streptococcus,

- Pediococcus,

- Enterococcus,

- Leuconostoc,

- Weisella,

- Bifidobacterium,

- Bacillus,

- Brevibacillus,

- Propionibacterium,

- Clostridium.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Lactobacillus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

16. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Pediococcus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

17. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Enterococcus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

18. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Lactococcus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

19. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Streptococcus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

20. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Weisella, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

21. Способ по любому из пп. 1-15, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из одного или нескольких штаммов Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus и Weisella, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 15-50°С.

22. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Bacillus, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 20-60°С.

23. Способ по любому из пп. 1-14, причем живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов выбирают из штаммов Bifidobacterium, и причем начальную смесь для инкубации инкубируют при температуре 20-45°С.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанную начальную смесь для инкубации инкубируют в течение 2-150 ч, 5-150 ч, 7-120 ч, 10-80 ч, 20-60 ч или 28-48 ч.

25. Способ по любому из пп. 1-3, причем воду добавляют к указанному субстрату биомассы в количестве, которое обеспечивает начальную смесь для инкубации, имеющую отношение мокрой объемной плотности к сухой объемной плотности от 0,65 до 1,40, такое как 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30 или 1,35.

26. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем содержание воды в указанной начальной смеси для инкубации составляет от 35 до 70 мас.%, такое как 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%.

27. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанный живой микроорганизм или комбинацию живых микроорганизмов используют в количестве 10³-10¹¹ КОЕ (колониеобразующие единицы) на г указанного субстрата биомассы, таком как 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹¹ КОЕ на г субстрата биомассы.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем к субстрату биомассы и/или к начальной смеси для инкубации добавляют один или несколько вспомогательных агентов для обработки, выбранных из ферментов, растительных компонентов и органических или неорганических агентов для обработки.

29. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем к субстрату биомассы и/или к начальной смеси для инкубации добавляют α-галактозидазу.

30. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем препарат α-галактозидазы добавляют к субстрату биомассы и/или к начальной смеси для инкубации в количестве от 0,05 до 50 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы, таком как от 0,5 до 25 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы, например от 1 до 10, от 2 до 8, от 3 до 6 или от 4 до 5 единиц α-галактозидазы на г сухого вещества субстрата биомассы.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, также включающий то, что вертикальный реактор для инкубации без перемешивания является закрытым.

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанную инкубацию выполняют в анаэробных условиях.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанный реактор для инкубации без перемешивания является вертикальным, вытянутоцилиндрическим или типа многогранника.

34. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем площадь верхней части указанного реактора для инкубации без перемешивания меньше, чем площадь нижней части, т.е. реактор имеет форму конуса.

35. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанный реактор для инкубации без перемешивания имеет изоляцию матами или охлаждающую рубашку и приспособления для регулирования температуры в реакторе.

36. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем степень заполнения указанного реактора для инкубации поддерживают постоянной.