ПЕНТАЦИКЛИЧЕСКИЕ ТРИТЕРПЕНЫ В ЛЕЧЕНИИ ВИТИЛИГО Российский патент 2024 года по МПК A61K36/37 A61K31/56 A61K31/192 A61P17/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере один пентациклический тритерпен, для применения в лечении витилиго.

Предшествующий уровень техники изобретения

Витилиго представляет собой кожную инфекцию, характеризующуюся появлением белых пятен на руках, ступнях, лице или любой другой части тела. Эти пятна вызваны депигментацией, т.е. исчезновением меланоцитов. Депигментация может быть различной степени тяжести и может проявляться белыми пятнами варьирующего размера. В некоторых случаях волосы на теле или голове, растущие в депигментированных областях, также являются белыми. Витилиго не является ни заразным, ни болезненным, но может вызывать значительный психологический стресс. Действительно, витилиго часто минимизируется и недостаточно контролируется врачами. Больше всего от него страдают темнокожие индивидуумы. Витилиго поражает от приблизительно 0,5 до 1% населения Земли, все этнические группы вместе взятые. Как правило, оно проявляется в возрасте от 10 до 30 лет, и половина заболевших поражается до 20 лет. Витилиго поэтому довольно редко встречается у маленьких детей. Оно затрагивает как мужчин, так и женщин.

Существует несколько типов витилиго.

- Сегментарное витилиго, расположенное на одной стороне тела, например, на части лица, верхней части тела, ноги или плеча. Эта форма витилиго чаще встречается у детей или подростков. Депигментированный участок соответствует области иннервации, т.е. участку кожи, иннервируемой определенным нервом. Эта форма быстро появляется в течение нескольких месяцев, а затем, как правило, прекращает развиваться.

- Генерализованное витилиго, которое проявляется в виде пятен, зачастую относительно симметричных, поражающих обе стороны тела, в частности, участки многократного трения или давления. Термин «генерализованный» не обязательно означает, что пятна являются обширными. Развитие непредсказуемо, поскольку пятна могут оставаться небольшими и локализоваться или быстро распространяться.

- Универсальное витилиго, которое встречается реже, быстро распространяется и может поражать почти все тело.

Чаще всего болезнь развивается с непредсказуемой скоростью и может прекращаться или распространяться без видимых причин. Витилиго может развиваться поэтапно и иногда ухудшается после психологического или физического триггерного события. В редких случаях пятна исчезают сами по себе. Помимо эстетического недостатка, витилиго не является серьезным заболеванием. Однако люди с витилиго характеризуются повышенным риском развития рака кожи, потому что депигментированные участки больше не действуют как барьер для солнечных лучей. Такие люди также чаще страдают другими аутоиммунными заболеваниями.

Причины витилиго до конца не ясны, хотя известно, что появление белых пятен связано с разрушением меланоцитов. В настоящее время выдвинуто несколько гипотез, объясняющих разрушение меланоцитов. Вероятно, витилиго является патологией, имеющей генетическое, экологическое и аутоиммунное происхождение. Витилиго представляет собой заболевание с сильным аутоиммунным компонентом. Действительно, у людей с витилиго вырабатываются аномальные антитела, которые непосредственно атакуют меланоциты и способствуют их разрушению. Кроме того, витилиго часто ассоциируется с другими аутоиммунными заболеваниями, такими как нарушения щитовидной железы, что говорит об общих механизмах. Витилиго также связано с генетическими факторами, не все из которых четко идентифицированы. Обычно в одной и той же семье несколько человек страдают витилиго. Считается, что в этом процессе задействовано не менее десяти генов. По данным нескольких исследований, в меланоцитах людей с витилиго накапливается большое количество свободных радикалов, что приводит к саморазрушению меланоцитов.

В самых последних литературных источниках внимание исследователей привлекают две гипотезы. Первая сосредоточена на гибели меланоцитов, которая, как считается, происходит под воздействием CD8 Т-лимфоцитов-«киллеров». Вторая гипотеза основана на отслоении меланоцитов, при этой патологии нарушается адгезия меланоцитов и кератиноцитов, обеспечиваемая Е-кадгерином, при этом данный белок специфически разрушается металлопротеазой 9 типа (ММР-9 (от англ. - matrix metalloproteinase-9 - матриксная металлопротеиназа-9)). ММР-9 сверхпродуцируется кератиноцитами, когда они подвергаются окислительному стрессу или индукторам, таким как интерлейкин-17 (IL-17 (от англ. - interleukine-17)) из дифференцированных CD4 Т-лимфоцитов (ТИ17 (от англ. - T-helper 17 - Т-хелпер 17)). ММР-9 специфически разлагает белок Е-кадгерин и заставляет меланоциты терять адгезию с кератиноцитами (Boukhedouni et al., Pigment Cell Melanoma Research, 31(6), P003, 756-757, 2018). Кроме того, продуцируемый лимфоцитами IL-17 индуцирует провоспалительные цитокины и хемокины в кератиноцитах, при этом последние также оказывают пагубное влияние на меланоциты, что приводит к нарушению их функции продуцирования меланина (Kotobuki et al., Pigment Cell Melanoma Research, 25(2), 219-230, 2012).

На сегодняшний день имеется обширный ряд видов лечения. Существует фототерапия с использованием ультрафиолетового излучения спектра В УФВ, местное лечение с помощью эксимерного лазера, хирургическое лечение, трансплантации клеток. Все эти виды лечения сопряжены с риском, и побочные эффекты могут быть значительными. Новые терапевтические подходы, которые рассматриваются для лечения витилиго, заключаются во введении биологических молекул путем инъекций. В настоящее время клинические испытания проходят антитела, способные специфически ингибировать путь Th17. Но имеются недостатки, поскольку эти виды лечения очень дорогие и не лишены побочных эффектов и привыкания.

Поэтому существует большой спрос на более эффективную, не имеющую побочных эффектов и более доступную по стоимости терапию. Альтернативой является местный путь, но только небольшие молекулы подходят для того, чтобы пройти через эпидермис и эффективно воздействовать на кератиноциты и меланоциты.

Краткое раскрытие сущности изобретения

В настоящей заявке представлены «de novo» молекулы в качестве состава местного применения для замедления и/или стабилизации прогрессирования или даже обращения витилиго.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции, содержащей по меньшей мере один пентациклический тритерпен или его фармацевтически приемлемую соль для применения в лечении и/или предупреждении витилиго.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или предупреждения витилиго путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один пентациклический тритерпен или его фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере один пентациклический тритерпен или его фармацевтически приемлемую соль, в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения витилиго.

Настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере один пентациклический тритерпен или его фармацевтически приемлемую соль, для лечения и/или предупреждения витилиго.

Подробное раскрытие изобретения

Определения

В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемый» означает применимый в получении фармацевтической композиции, которая, как правило, безопасна, нетоксична, не является биологически или иным образом нежелательной и приемлема как для ветеринарного, так и для фармацевтического применения людьми.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» соединения означает соль, которая является фармацевтически приемлемой, как определяется в настоящем документе, и обладает желаемой фармакологической активностью исходного соединения.

В частности, фармацевтически приемлемые соли включают

(1) фармацевтически соли присоединения кислоты, образованные с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.д.; или образованные с фармацевтически приемлемыми органическими кислотами, такими как уксусная кислота, бензенсульфоновая кислота, бензойная кислота, камфорсульфоновая кислота, лимонная кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, гидроксинафтойная кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муконовая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, дибензоил-L-винная кислота, винная кислота, п-толуолсульфоновая кислота, триметилуксусная кислота, трифторуксусная кислота и т.п., и

(2) фармацевтически приемлемые соли присоединения основания, образующиеся, когда протон кислоты, присутствующий в исходном соединении, либо заменяется на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочноземельного металла или ион алюминия, либо образует координационную связь с фармацевтически приемлемым органическим основанием, таким как диэтаноламин, этаноламин, N-метил глюкамин, три этанол амин, трометамин и т.п., или с фармацевтически приемлемым неорганическим основанием, таким как гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия, гидроксид натрия и т.п.

Это может быть натриевая соль, когда соединение имеет кислотную функцию.

Термин «местное нанесение» означает нанесение на кажу, слизистые оболочки и/ил и придатки кожи.

В соответствии с настоящим изобретением термин «лечение» означает ингибирование и/или снижение прогрессирования или развития, более конкретно регрессию, предпочтительно исчезновение витилиго.

В соответствии с настоящим изобретением термин «предупреждение» означает предотвращение, недопущение или задержку начала витилиго.

Пентациклические тритерпены

Пентациклические терпены известны в фитотерапии для лечения аутоиммунных заболеваний и некоторых воспалительных заболеваний, таких как псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит. Среди них известны пентациклические тритерпены из растений семейства Celastraceae {Tripterygium wilfordii, Tripterygium regelii, Tripterygium hypogiaucum, Celastrus paniculatus).

В соответствии с настоящим изобретением термин «пентациклические тритерпены» означает пентациклические тритерпены, продуцируемые в природе клетками растения семейства Celastraceae, и, в частности, тингенин А, также называемый тингеноном или майтенином, (приведенной ниже химической формулы I), тингенин В, также называемый 22-бета-гидрокси-тингеноном (приведенной ниже химической формулы II) и целастрол, также называемый триптерином (приведенной ниже химической формулы III).

Химическая формула I

Химическая формула II

Химическая формула III

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит один или несколько пентациклических тритерпенов, выбранных из тингенина А, тингенина В, целастрола и их фармацевтически приемлемых солей. Согласно предпочтительному варианту осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит тингенин А, тингенин В и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли.

Согласно варианту осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать по меньшей мере один пентациклический тритерпен или его фармацевтически приемлемую соль в очищенной форме.

В соответствии с настоящим изобретением термин «очищенная форма» пента циклического тритерпена или его фармацевтически приемлемой соли означает соединение в очищенной форме, т.е. содержащее по меньшей мере 90% по массе, в частности, по меньшей мере 95% по массе, в частности, по меньшей мере 99% по массе пентациклического тритерпенового соединения, в частности, тингенина А, тингенина В и/или целастрола, или его фармацевтически приемлемой соли.

Согласно варианту осуществления пентациклический(ие) тритерпен(ы) или его(их) фармацевтически приемлемая соль могут присутствовать в композиции в соответствии с настоящим изобретением в форме экстракта растения из семейства Celastraceae.

В соответствии с настоящим изобретением термин «растение из семейства Celastraceae* означает все растения, принадлежащие данному семейству, и, в частности, растения из родов Tripterygium, Bhesa, Kokkona, Catha, Euonymus, Orthosphenia, Dicarpellum, Celastrus, Maytenus, Peritassa, Siphonodon и Rzedowskia, в частности, Tripterygium, Maytenus и Celastrus. Предпочтительными являются растения, такие как Tripterygium wilfordii, Tripterygium regelii, Tripterygium hypoglaucum, Celastrus orbiculatus или Maytenus ilicifolia, в частности, Tripterygium wilfordii, Tripterygium hypoglaucum или Celastrus orbiculatus, особенно Tripterygium wilfordii.

Согласно варианту осуществления данный экстракт может быть не очищен или обогащен пентациклическим(ими) тритерпеном(ами), в частности, тингенином А, тингенином В и/или целастролом. Кроме того, экстракт необязательно может содержать компоненты (в том числе активные компоненты) из растения, отличные от пентациклических тритерпенов.

Термин «неочищенный экстракт» означает экстракт, полученный непосредственно из растений.

Термин «обогащенный неочищенный экстракт» означает экстракт, в котором количество пентациклического(их) тритерпена(ов), в частности, тингенина А, тингенина В и/или целастрола, составляет более 30% по массе, в частности, более 50% по массе, в расчете на количество пентациклических тритерпенов в неочищенном экстракте.

Согласно варианту осуществления обогащенный неочищенный экстракт композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит от 90% до 100% пентациклического(их) тритерпена(ов) по массе, в расчете на общую массу обогащенного неочищенного экстракта.

Очищенные, неочищенные или обогащенные экстракты могут быть получены из любой части растений семейства Celastraceae, в том числе из корней, семян и надземных частей.

В качестве альтернативы, они могут быть получены из культур растительных клеток этих растений. В случае культур растительных клеток данный экстракт может быть получен, в частности, из супернатанта, суспензии или биомассы указанных культур клеток (как раскрывается, в частности, у Coppede et al., Plant Cell Tiss Organ Cult, 118:33-43, 2014).

Согласно варианту осуществления обогащенный неочищенный экстракт получают согласно следующему процессу:

(i) фаза пролиферации клеток растения из семейства Celastraceae в среде для пролиферации,

(ii) фаза элиситации посредством добавления смеси для элиситации в культуру клеток, полученную на стадии (i), при этом указанная смесь для элиситации содержит по меньшей мере один элиситор типа монокарбонового соединения и по меньшей мере один биотический элиситор, и

(iii) получение неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами, из культуры клеток, полученной на стадии (ii).

В соответствии с настоящим изобретением термин «клетки растения из семейства Celastraceae* означает клетки любой части растения: семян, корней, надземных частей, и особенно надземных частей.

В соответствии с настоящим изобретением термин «надземные части» означает части растения, расположенные над почвой, например, листья, побеги, черешки и/или соцветия, особенно листья.

В соответствии с настоящим изобретением термин «фаза пролиферации клеток растения из семейства Celastraceae* означает фазу, в которой клетки растения из семейства Celastraceae суспендируют в среде для пролиферации и при условиях, подходящих для их пролиферации. Эти клетки, в частности, могут быть получены из каллуса перед суспендированием. При необходимости суспензии клеток можно регулярно пересевать для поддержания их при условиях пролиферации.

В соответствии с настоящим изобретением «каллус» означает кластер дедифференцированных клеток, также называемых стволовыми клетками или меристематическими клетками.

Индукция каллуса может быть осуществлена любым способом, известным специалисту в данной области. Каллус в соответствии с настоящим изобретением, в частности, может быть получен описанным ниже способом. Индукция каллуса из тканевого эксплантата из части растения, в частности, надземной части, из семейства Celastraceae, например Tripterygium wilfordii, хорошо известна специалисту. Индукция каллуса, в частности, может быть достигнута путем

- получения эксплантата растительной ткани, например, кусочка листа размером приблизительно 1 см²,

- культивирования эксплантата на среде для пролиферации с агаром,

- инкубации, в частности, в темноте, при температуре приблизительно 25-30°С.

Стадия (i). Фаза пролиферации клеток

Специалист, знакомый с культурами клеток растения из семейства Celastraceae, легко сможет определить необходимую для их пролиферации композицию среды для пролиферации. Предпочтительно данная среда для пролиферации будет обеспечивать пролиферацию клеток в дедифференцированных формах, т.е. в тотипотнтных формах. В частности, поддержание в дедифференцированной форме может быть достигнуто посредством применения конкретных отношений цитокинин/ауксин в среде для пролиферации. Среда для пролиферации, в частности, может содержать

- по меньшей мере один макроэлемент, в частности, выбранный из NH₄NO₃, KNO₃, CaCl₂⋅2H₂O, MgSO₄⋅7H₂O, KH₂PO₄ и их смеси, например, при общей концентрации макроэлементов от 1000 до 9000 мг/л, например, от 3000 до 8000 мг/л среды для пролиферации: в ходе фазы пролиферации общая концентрация макроэлементов в среде для пролиферации будет составлять, в частности, от 3000 до 5500 мг/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере один микроэлемент, в частности, выбранный из KI, Н₃ВО₃, MnSO₄⋅4H₂O, ZnSO₄⋅H₂O, Na₂MoO₄⋅2H₂O, CuSO₄⋅5H₂O, CoCl₂⋅6H₂O, FeSO₄⋅7H₂O, Ма₂ЭДТА(этилендиаминтетрауксусная кислота).2H₂O и их смеси, например, при общей концентрации микроэлементов от 10 до 200 мг/л, в частности, от 50 до 150 мг/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере один витамин, в частности, выбранный из миоинозита, никотиновой кислоты, пиридоксина-HCl, тиамина-HCl и их смеси, например, при общей концентрации витаминов, которая может варьировать от 0,01 до 3 г/л, в частности, от 0,05 до 1 г/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере одну аминокислоту, в частности, глицин, например, при общей концентрации аминокислот, которая может варьировать от 0,15 до 5 мг/л, в частности, от 1 до 4 мг/л среды для пролиферации: в ходе фазы пролиферации концентрация аминокислот в среде для пролиферации будет составлять, в частности, от 1 до 2,5 мг/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере один источник углерода, в частности, сахарозу, например, при общей концентрации источников углерода от 10 до 70 г/л среды для пролиферации, например, при приблизительно 30 г/л;

- по меньшей мере один растительный гормон (также называемый гормоном роста растений, или фактором роста растений, или регулятором роста растений), в частности, выбранный из одного или нескольких цитокининов, в частности, кинетина и/или 6-фурфуриламинопурина, одного или нескольких ауксинов, в частности, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4D) и/или нафталинуксусной кислоты (НУК), и их смеси. Входе фазы пролиферации среда для пролиферации, в частности, будет содержать по меньшей мере один цитокинин и по меньшей мере один ауксин.

Гормоны роста растений, в частности, будут добавлены в среду для пролиферации при концентрации и отношении, обеспечивающих пролиферацию клеток в дедифференцированных формах. Они будут выбраны, в частности, из кинетина, 6-фурфуриламинопурина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4D (от англ. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)), нафталинуксусной кислоты (НУК) и их смеси; будут выбраны, в частности, из кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4D), нафталинуксусной кислоты (НУК) и их смеси. В частности, они могут представлять собой смесь кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4D) и нафталинуксусной кислоты.

В частности, концентрация ауксинов будет составлять от 0,001 до 10 мг/л среды для пролиферации, например, от 0,1 до 3 мг/л среды для пролиферации.

В частности, концентрация цитокинов будет составлять от 0,01 до 0,5 мг/л среды для пролиферации, например, от 0,05 до 0,15 мг/л среды для пролиферации.

Согласно варианту осуществления отношение гормонов ауксин/цитокинин будет составлять 0,2-2,5/0,01-0,5, в частности, 1-2/0,05-0,2, в частности, будет составлять приблизительно 1,5/0,1.

В частности, среда для пролиферации в соответствии с настоящим изобретением может содержать 1,5 мг/л ауксина, в частности, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4D) и нафталинуксусной кислоты (НУК), а также 0,1 мг/л цитокинина, в частности, кинетина.

Среда для пролиферации будет стерильной и предпочтительно с рН, близким к нейтральному.

Пример среды для пролиферации, подходящей для пролиферации клеток растения из семейства Celastraceae в соответствии с настоящим изобретением, раскрывается, в частности, у Murashige & Skoog (1962) или в примерах настоящей заявки.

Данная среда для пролиферации может характеризоваться, например, следующей композицией (концентрации выражены относительно объема среды для пролиферации без клеток): питательные макроэлементы: NH₄NO₃ при 1650 мг/л, KNO₃ при 1900 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O при 440 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O при 370 мг/л, KH₂PO₄ при 170 мг/л; микроэлементы: KI при 0,83 мг/л, H₃BO₃ при 6,2 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O при 22,3 мг/л, ZnSO₄⋅H₂O при 6,6 мг/л, Na₂MoO₄⋅2H₂O при 0,25 мг/л, CuSO₄⋅5H₂O при 0,025 мг/л, CoCl₂⋅6H₂O при 0,025 мг/л, FeSO₄⋅7H₂O при 27,8 мг/л, Na₂ЭДТА⋅2H₂O при 37,3 мг/л; витамины: миоинозит при 100 мг/л, никотиновая кислота при 0,5 мг/л, пиридоксин-HCl при 0,5 мг/л, тиамин-HCl при 0,5 мг/л; аминокислоты: глицин при 2 мг/л; источник углерода: сахароза при 30 г/л; и гормоны растений: нафталинуксусная кислота при 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота при 0,5 мг/л, кинетин при 0,1 мг/л, все доведено до рН 6 перед стерилизация (например, путем автоклавирования в течение 20 минут при 121°С или фильтрации через фильтр 0,2 мкм).

В качестве альтернативы, среда для пролиферации может характеризоваться следующей композицией (концентрации выражены относительно объема среды для пролиферации без клеток): питательные макроэлементы: NH₄NO₃ при 1650 мг/л, KNO₃ при 2500 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O при 440 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O при 370 мг/л, KH₂PO₄ при 130 мг/л; микроэлементы: KI при 0,41 мг/л, H₃BO₃ при 6,2 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O при 22,3 мг/л, ZnSO₄⋅H₂O при 7,5 мг/л, Na₂MoO₄⋅2H₂O при 0,25 мг/л, CuSO₄⋅5H₂O при 0,025 мг/л, CoCl₂⋅6H₂O при 0,025 мг/л, FeSO₄⋅7H₂O при 19,85 мг/л, Nа₂ЭДТА⋅2H₂O до 26,64 мг/л; витамины: миоинозит при 50 мг/л, никотиновая кислота при 0,25 мг/л, пиридоксин-HCl при 0,25 мг/л, тиамин-HCl при 0,25 мг/л; источник углерода: сахароза при 30 г/л; и гормоны растений: кинетин при 0,083 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2.4D) при 0,575 мг/л, нафталинуксусная кислота (НУК) при 0,350 мг/л.

В качестве альтернативы, среда для пролиферации может иметь следующий состав (концентрации выражены относительно объема среды для пролиферации без клеток): NH₄NO₃ при 20 мМ, KNO₃ при 19 мМ, CaCl₂⋅2H₂O при 3 мМ, MgSO₄⋅7H₂O при 1,50 мМ, KH₂PO₄ при 1,2 мМ, KI при 0,005 мМ, Н₃ВО₃ при 0,1 мМ, MnSO₄⋅4H₂O при 0,1 мМ, ZnSO₄⋅H₂O при 0,04 мМ, Na₂MoO₄⋅2H₂O при 0,001 мМ, CuSO₄⋅5H₂O при 0,0001 мМ, CoCl₂⋅6H₂O при 0,0001 мМ, FeSO₄⋅7H₂O при 0,1 мМ, Nа₂ЭДТА⋅2H₂O при 0,1 мМ, миоинозит при 0,5 мМ, никотиновая кислота при 0,004 мМ, пиридоксин-HCl при 0,002 мМ, тиамин-HCl при 0,0015 мМ, глицин при 0,03 мМ, сахароза при 87,6 мМ, нафталинуксусная кислота при 0,005 мМ, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота при 0,002 мМ и кинетин при 0,0005 мМ.

Высевание на среду для пролиферации может быть выполнено путем суспендирования каллусных клеток при концентрации, составляющей от 20 до 300 г в 1 л среды для пролиферации и предпочтительно от 100 до 200 г в 1 л среды для пролиферации, например, приблизительно 150 г в 1 л среды для пролиферации. Фаза пролиферации будет осуществляться при условиях наращивания биомассы.

В соответствии с настоящим изобретением термин «условия наращивания биомассы» означает, в частности, условия температуры, продолжительности, встряхивания и освещения, необходимые для пролиферации суспендированных клеток. Специалист в данной области, знакомый с культурами клеток растения из семейства Celastraceae, сможет легко определить условия наращивания биомассы. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения стадия пролиферации биомассы будет осуществляться в темноте, при температуре, составляющей от 20 до 35°С, в частности, от 27 до 28°С, в частности, при приблизительно 27 или 28°С, в частности, со встряхиванием при 100-200 оборотах в минуту, в частности, при приблизительно 125 оборотах в минуту (при диаметре орбиты 22,5 мм) и на протяжении периода культивирования, составляющего от 10 до 30 суток, в частности, 15 суток.

На протяжении данной стадии клетки можно «субкультивировать» или размножать, например, каждые 7-15 суток. Субкультивирование клеток хорошо известно специалисту и, в частности, может заключаться в разбавлении части культуры клеток свежей концентрированной средой. Например, 1/5 культуры повторно суспендируют в объеме свежей среды, соответствующем объему исходной культуры. Это обеспечивает поддержание линии клеток в жидкой среде в состоянии пролиферации.

Стадия (ii). Фаза элиситации

После фазы пролиферации клетки, полученные в фазе (i), подвергают элиситации посредством добавления смеси для элиситации. Среда для пролиферации, в которую была добавлена смесь для элиситации, будет называться «средой для элиситации». Фаза элиситации представляет собой фазу, в которой клетки поддерживают в физиологическом состоянии, стимулирующем биосинтез вторичных метаболитов, таких как пентациклические тритерпены.

Продуцирование пентациклических тритерпенов происходит во время фазы элиситации в цитозоле клетки, и они могут частично диффундировать в среду для элиситации. Фаза элиситации в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, соответствует фазе продуцирования (биосинтеза) пентациклических тритерпенов и более конкретно целастрола, тингенина А и тингенина В.

Элиситацию предпочтительно осуществляют после фазы пролиферации, продолжающейся от 7 до 21 суток, в частности, от 12 до 20 суток, в частности, 15, 16 или 17 суток (в частности, без субкультивирования). В качестве альтернативы, смесь для элиситации может быть добавлена, когда концентрация клеток, полученная в ходе фазы пролиферации, удваивается, в частности, увеличивается в более чем два раза, по отношению к исходной концентрации клеток в среде для пролиферации. В частности, смесь для элиситации может быть добавлена, когда концентрация клеток составляет более 200 г/л, например, от 200 до 400 г/л, в частности, приблизительно 300 г/л (по числу клеток на литр среды для пролиферации). Согласно варианту осуществления смесь для элиситации будет добавлена в культуру, концентрация клеток которой увеличилась от 150 до 200 г/л в начале фазы пролиферации до концентрации, составляющей от 300 до 400 г/л в конце фазы пролиферации.

После фазы пролиферации растительные клетки потребляли большую часть элементов, если не все элементы, содержащиеся в среде для пролиферации, особенно источники углерода, такие как сахароза. Следовательно, может быть необходимо восстановление композиции среды до или во время добавления смеси для элиситации.

Для восстановления композиции среды культуру клеток, полученную после стадии пролиферации, можно, в частности, концентрировать, например, посредством декантации или фильтрования, затем к полученным таким образом клеткам добавляют свежую среду для пролиферации. В этом случае клетки будут повторно суспендированы в свежей среде для пролиферации так, чтобы получалась концентрация, составляющая от 200 г/л до 400 г/л, например, от 250 до 350 г/л, в частности, приблизительно 300 г/л (по числу клеток на литр среды для пролиферации).

В качестве альтернативы, в культуру клеток можно добавлять концентрированную смесь для восстановления концентраций элементов в среде для пролиферации. В частности, концентрированная смесь может быть добавлена непосредственно до, непосредственно после или в то же самое время, что и смесь для элиситации. Например, 1/5 культуры клеток может быть заменена эквивалентным объемом концентрированной в 5 раз среды для пролиферации.

Концентрация элементов в среде для пролиферации считается близкой или эквивалентной нулю после 14, 15 или 16 суток фазы пролиферации. В частности, концентрация минеральных элементов (более конкретно макроэлементов и микроэлементов) и углеродных элементов (более конкретно источников углерода) считается близкой или эквивалентной нулю после 14, 15 или 16 суток фазы пролиферации.

Согласно варианту осуществления среда для пролиферации в соответствии с настоящим изобретением в начале фазы элиситации будет содержать среди прочего - по меньшей мере один питательный макроэлемент, в частности, выбранный из NH₄NO₃, KNO₃, CaCl₂⋅2H₂O, MgSO₄⋅7H₂O, KH₂PO₄ и их смеси, например, при общей концентрации питательных макроэлементов, составляющей от 5000 до 8000 мг/л, предпочтительно более 6000 мг/л среды для пролиферации, преимущественно от 6000 до 8000 мг/л;

- по меньшей мере один микроэлемент, в частности, выбранный из KI, Н₃ВО₃, MnSO₄⋅4H₂O, ZnSO₄⋅H₂O, Na₂MoO₄⋅2H₂O, CuSO₄⋅5H₂O, CoCl₂⋅6H₂O, FeSO₄⋅7H₂O, Nа₂ЭДТА⋅2H₂O и их смеси, например, при общей концентрации микроэлементов, составляющей от 10 до 200 мг/л, в частности, от 50 до 150 мг/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере один витамин, в частности, выбранный из миоинозита, никотиновой кислоты, пиридоксина-HCl, тиамина-HCl и их смеси, например, при общей концентрации витаминов, которая может варьировать от 0,01 до 3 г/л, в частности, от 0,05 до 1 г/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере одну аминокислоту, в частности, глицин, например, при концентрации в среде для пролиферации, составляющей от 3 до 4 мг/л среды для пролиферации;

- по меньшей мере один источник углерода, в частности, сахарозу, например, при общей концентрации источников углерода от 10 до 70 г/л среды для пролиферации, например, при приблизительно 30 г/л. Согласно варианту осуществления среда для пролиферации в начале фазы элиситации не будет содержать или будет содержать незначительное количество, в частности, менее 0,001 г/мл, цитокинина и ауксина. Среда для пролиферации в ходе фазы элиситации преимущественно будет стерильной и предпочтительно при рН, близком к нейтральному.

Среда для пролиферации в ходе фазы элиситации, в частности, может характеризоваться следующей композицией: питательные макроэлементы: NH₄NO₃ при 2,8 г/л, KNO₃ при 3 г/л, CaCl₂⋅2H₂O при 0,45 г/л, MgSO₄⋅7H₂O при 74 мг/л, KH₂PO₄ при 34 мг/л; микроэлементы: KI при 0,16 мг/л, H₃BO₃ при 6,2 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O при 18,5 мг/л, ZnSO₄⋅H₂O при 6,6 мг/л, Na₂MoO₄⋅2H₂O при 0,25 мг/л, CuSO₄⋅5H₂O при 0,025 мг/л, CoCl₂⋅6H₂O при 0,025 мг/л, FeSO₄⋅7H₂O при 28 мг/л, Nа₂ЭДТА⋅2H₂O при 37 мг/л; витамины: миоинозит при 250 мг/л, никотиновая кислота при 1,7 мг/л, пиридоксин-HCl при 1 мг/л, тиамин-HCl при 1 мг/л; аминокислота: глицин при 4 мг/л; источник углерода: сахароза при 30 г/л.

В соответствии с настоящим изобретением термин «смесь для элиситации» означает смесь для остановки клеточного деления. Эта смесь для элиситации содержит по меньшей мере один элиситор типа монокарбонового соединения и по меньшей мере один биотический элиситор. Смесь для элиситации вводят в культуральную среду, например, посредством концентрированных маточных растворов.

В соответствии с настоящим изобретением термин «элиситор типа монокарбонового соединения» означает более конкретно элиситор, выбранный из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из 5-хлорсалициловой кислоты (5-хлор-СК), салициловой кислоты (СК), ацетилсалициловой кислоты (АСК), сложного метилового эфира, в частности, метилжасмоната (MeJa (от англ. - метилжасмонат)), и их смеси. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения элиситор типа монокарбонового соединения представляет собой метилжасмонат, салициловую кислоту и/или 5-хлорсалициловую кислоту, в частности, метилжасмонат. Элиситор типа монокарбонового соединения, в частности, будут добавлять таким образом, чтобы получить конечную концентрацию, составляющую от 0,005 до 0,1 г/л, в частности, от 0,01 до 0,05 г/л среды для элиситации, в частности, от 0,002 до 0,004 г/л среды для элиситации.

В соответствии с настоящим изобретением термин «биотический элиситор» означает более конкретно биотический элиситор, выбранный из группы содержащей, предпочтительно состоящей из N-ацетиламиноглюкозамина, в частности, хитина, хитозана, экстрактов микроорганизмов или грибков, олигосахаридов (полисахаридов, пектинов, целлюлозы). Согласно варианту осуществления биотическим элиситором является хитин. Хитин представляет собой линейный полимер с повторяющимся звеном бета-1,4-N-ацетил-D-глюкозамином. В частности, биотический элиситор будут добавлять таким образом, чтобы получить конечную концентрацию, составляющую от 0,05 до 50 г/л среды для элиситации, например, от 0,1 до 10 г/л, например, от 0,5 до 7 г/л, в частности, от 1 до 5 г/л среды для элиситации.

Согласно варианту осуществления смесь для элиситации содержит метилжасмонат, в частности, при конечной концентрации в среде для элиситации от 0,002 до 0,005 г/л, и хитин, в частности, при конечной концентрации от 1 до 4 г/л среды для элиситации.

Согласно варианту осуществления смесь для элиситации в соответствии с настоящим изобретением будет дополнительно содержать по меньшей мере один фактор дифференцировки растительной клетки и/или по меньшей мере один предшественник пути синтеза терпенов.

«Фактор дифференцировки растительной клетки» в соответствии с настоящим изобретением, в частности, может быть выбран из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из цитокинина, в частности, бензиламинопурина (ВАР (от англ. - benzylaminopurine)), абсцизовой кислоты, кинетина, тидиазурона, 6-γ,γ-Диметилаллиламинопурина (2iP или изопентениладенина) или зеатина, гиббереллина и их смеси, в частности, ВАР и/или 2iP, в частности, 2iP.

«Предшественник синтеза терпенов» в соответствии с настоящим изобретением, в частности, может быть выбран из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из пирувата натрия; пирофосфата калия; мевалоновой кислоты; гераниола; фарнезола; изопентенила, диметилаллила, в том числе его пирофосфатных форм; ацетата натрия; пировиноградной кислоты и ее смесей, в частности, гераниола, фарнезола, пирувата натрия, пирофосфата калия и их смесей, таких как пируват натрия и/или пирофосфат калия.

В частности, ВАР может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации, составляющей от 0,01 до 5 мг/л, например, от 0,5 до 5 мг/л среды для элиситации.

В частности, 5-хлорсалициловая кислота (5-хлор-СК) может быть использована при конечной концентрации в среде для элиситации, составляющей от 0,1 до 15 мг/л.

В частности, салициловая кислота может быть использована при конечной концентрации в среде для элиситации, составляющей от 0,1 до 100 мг/л, например, от 20 до 60 мг/л, например, приблизительно 45 мг/л.

В частности, фарнезол может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации от 1 до 100 мг/л, например, от 15 до 30 мг/л, например, приблизительно 30 мг/л.

В частности, гераниол может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации от 1 до 100 мг/л, например, от 20 до 30 мг/л.

В частности, пируват натрия может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации от 100 до 5000 мг/л, например, от 500 до 2000 мг/л.

В частности, пирофосфат калия может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации от 1 до 2 000 мг/л, например, от 100 до 1 000 мг/л среды для элиситации.

В частности, 2iP может быть использован при конечной концентрации в среде для элиситации от 0,005 до 10 мг/л, например, от 0,01 мг/л до 3 мг/л, например, от 0,1 до 2 мг/л.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения смесь для элиситации содержит метилжасмонат, хитин, пируват натрия, пирофосфат калия или их смесь.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения смесь для элиситации содержит метилжасмонат, хитин, пируват натрия, пирофосфат калия и необязательно ВАР и/или 2iP.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения смесь для элиситации содержит или состоит из (концентрации, приведенные в скобках, соответствуют концентрации в среде для элиситации в качестве исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной в зависимости от предусматриваемого разбавления) пирувата натрия (от 500 до 2000 мг/л), пирофосфата калия (от 100 до 1000 мг/л), 2iP (от 0,1 до 2 мг/л), метилжасмоната (от 0,002 до 0,005 г/л) и хитина (от 1 до 4 г/л).

Согласно другому варианту осуществления смесь для элиситации содержит или состоит из (концентрации, приведенные в скобках, соответствуют концентрации в среде для элиситации в качестве исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной в зависимости от предусматриваемого разбавления) бензиламинопирувата (ВАР) (от 0,5 до 5 мг/л, в частности, от 0,5 до 3 мг/л); 5-хлорсалициловой кислоты (5-хлор-СК) (от 2 до 6 мг/л, в частности, от 3 до 5 мг/л, например, приблизительно 3 или приблизительно 5 мг/л), ацетилсалициловой кислоты (АСК) и/или салициловой кислоты (СК) (от 20 до 60 мг/л, в частности, от 30 до 50 мг/л, в частности, от 33 до 45 мг/л); метилжасмоната (MeJA) (от 0,002 до 0,005 г/л, в частности, от 10 до 40 мг/л); хитина (от 1 до 4 г/л) и фарнезола (F-OH) (от 19 до 40 мг/л) и/или гераниола (от 20 до 30 мг/л).

Согласно другому варианту осуществления смесь для элиситации содержит или состоит из (концентрации, приведенные в скобках, соответствуют концентрации в среде для элиситации в качестве исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной в зависимости от предусматриваемого разбавления) пирувата натрия (от 500 до 2000 мг/л), пирофосфата калия (от 100 до 1000 мг/л), 2iP (от 0,1 до 1 мг/л), метилжасмоната (MeJA) (от 0,002 до 0,005 г/л, в частности, от 10 до 40 мг/л) и хитина (от 1 до 4 г/л).

Согласно другому варианту осуществления смесь для элиситации содержит или состоит из (концентрации, приведенные в скобках, соответствуют концентрации в среде для элиситации в качестве смеси, которая может быть более или менее концентрированной в зависимости от предусматриваемого разбавления) пирувата натрия (приблизительно 1,5 г/л), пирофосфата калия (приблизительно 0,4 г/л), 2iP (приблизительно 0,4 мг/л), метилжасмоната (MeJA) (приблизительно 0,03 мг/л), хитина (приблизительно 2 г/л).

В ходе фазы элиситации, после добавления смеси для элиситации, культуру поддерживают при встряхивании, в частности, при от 50 до 200 оборотах в минуту, в частности, при приблизительно 125 оборотах в минуту, на протяжении периода от 3 до 30 суток, в частности, от 10 до 25 суток, в частности, от 12 до 15 суток, в частности, при температуре, составляющей от 20 до 35°С, в частности, при приблизительно 27°С, и преимущественно с уровнем растворенного кислорода в культуральной среде от 2 до 40%, предпочтительно при приблизительно 16%. При необходимости может быть обеспечена подача стерильного воздуха, достаточно обогащенного кислородом, в частности, в мертвое пространство биореактора или посредством диффузии в среду. Предпочтительно фазу элиситации (iii) проводят в темноте. В ходе фазы элиситации культуру клеток предпочтительно не субкультивируют.

Стадия (iii). Получение неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами

После фазы элиситации процесс включает стадию получения неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами.

В частности, обогащенный неочищенный экстракт может быть получен путем разделения биомассы и культурального супернатанта. В частности, разделение может быть выполнено путем непосредственной фильтрации (0-50 мкм), путем центрифугирования или путем декантации клеток.

Согласно варианту осуществления обогащенный неочищенный экстракт, включенный в композицию для применения в соответствии с настоящим изобретением, может состоять из культурального супернатанта, восстановленного таким образом.

Обогащенный неочищенный экстракт также может быть получен после лизиса биомассы. Например, клетки, содержащиеся в восстановленной биомассе, могут быть лизированы с помощью физического (обработка ультразвуком или растирание) или химического (кислотный лизис) способа, затем данный лизат подвергают экстракции растворителем. Затем извлекают органическую фазу, содержащую, в частности, тритерпены из цитозоля, в частности, посредством декантации или центрифугирования. Растворитель будет представлять собой, в частности, растворитель, и более конкретно алкилацетат, при этом ал кил более конкретно является линейным или разветвленным с 1-6 атомами углерода, в частности, этилацетат или изопропилацетат. Объем используемого растворителя будет составлять, в частности, 2 объема на массу биомассы.

Предпочтительно, обогащенный неочищенный экстракт композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением будет соответствовать органической фазе, извлеченной таким образом.

В качестве альтернативы, обогащенный неочищенный экстракт может быть получен после выпаривания растворителя, и, в частности, он может быть заменен носителем, подходящим для области применения данного экстракта (косметического, фармацевтического), и, в частности, растительными маслами или растворителями, такими как, в частности, пентиленгликоль (или Pentiol) или Myritol 318®.

Обогащенный неочищенный экстракт не очищают. Обогащенный неочищенный экстракт необязательно может быть очищен на следующей стадии.

При очистке обогащенного неочищенного экстракта с получением очищенного экстракта процесс в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает стадию (iv) получения очищенного экстракта одного или нескольких пентациклических тритерпенов из обогащенного неочищенного экстракта, полученного на стадии (iii).

Очищенный экстракт в соответствии с настоящим изобретением тогда будет содержать более 90%, в частности, более 95%, в частности, более 98% по массе одного или нескольких пентациклических тритерпенов в соответствии с настоящим изобретением, в расчете на общую массу экстрактов.

Согласно варианту осуществления очищенный экстракт в соответствии с настоящим изобретением содержит 60% или больше, в частности, 80% или больше, в частности, 90% или больше, в частности, 95% или больше, в частности, более 98% или больше, в частности, 100% целастрола по массе, в расчете на общую массу экстракта. Он может содержать, в частности, от 50% до 98%, в частности, от 70% до 90%, в частности, от 76% до 84% целастрола по массе, в расчете на общую массу экстракта.

Согласно варианту осуществления очищенный экстракт в соответствии с настоящим изобретением содержит от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% тингенина А по массе, в расчете на общую массу экстракта.

Согласно варианту осуществления очищенный экстракт в соответствии с настоящим изобретением содержит от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% тингенина В по массе, в расчете на общую массу экстракта.

Согласно варианту осуществления очищенный экстракт в соответствии с настоящим изобретением содержит

- от 50% и 98%, в частности, от 70% до 90%, в частности, от 76% до 84% целастрола по массе, в расчете на общую массу экстракта;

- от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% тингенина А по массе, в расчете на общую массу экстракта; и

- от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% тингенина В по массе, в расчете на общую массу экстракта.

Очистка обогащенного экстракта в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена, в частности, посредством фазы отделения пентациклического(их) тритерпена(ов), в частности, целастрола, тингенина А и/или тингенина В, в частности, путем фракционирования с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в ходе которого пики при 426 нм, характеризующие целастрол, тингенин А и тингенин В, появляются через 19,75 минуты, 18,03 минуты и 16,21 минуты, соответственно.

Композиции

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит целастрол от 0,002 до 10% по массе, исходя из массы всей композиции, в частности, от 0,01 до 2%, в частности, от 0,1 до 1%.

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит тингенин А от 0,002 до 10% по массе, исходя из массы всей композиции, в частности, от 0,01 до 2%, в частности, от 0,1 до 1%.

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит тингенин В от 0,002 до 10% по массе, исходя из массы всей композиции, в частности, от 0,01 до 2%, в частности, от 0,1 до 1%.

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит от 0,002 до 10% по массе пентациклического(их) тритерпена(ов), исходя из массы всей композиции, в частности, от 0,01 до 2%, в частности, от 0,1 до 1%, пентациклического(их) тритерпена(ов), в частности, выбранного(ых) из целастрола, тингенина А, тингенина В и их фармацевтически приемлемых солей.

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит от 0,002 до 10% неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическим(ими) тритерпеном(ами) по массе, исходя из массы всей композиции, в частности, от 0,01 до 2%, в частности, от 0,1 до 1%.

Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит от 0,5 до 2% целастрола, от 0,01% до 1% тингенина А и/или от 0,01% до 1% тингенина В. Согласно варианту осуществления композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит от 0,5 до 2% целастрола, от 0,01% до 1% тингенина А и от 0,01% до 1% тингенина В.

Композиция для применения в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных средств.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к композициям в соответствии с настоящим изобретением в форме, подходящей для местного применения.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, могут быть в формах, которые, как правило, известны для местного введения, т.е. в частности, лосьоны, шампуни, бальзамы, пенки, гели, дисперсии, эмульсии, аэрозоли, сыворотки, маски или кремы, со вспомогательными средствами, которые обеспечивают, в частности, проникновение для улучшения свойств и доступности активных компонентов.

Эти композиции, как правило, содержат, помимо пентациклического(их) тритерпена(ов) в соответствии с настоящим изобретением, физиологически приемлемую среду, как правило, на основе воды или растворителя, например, спиртов, эфиров или гликолей. Они также могут содержать поверхностно-активные вещества, комплексообразователи, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, загустители, желирующие средства, смачивающие средства, смягчающие средства, микроэлементы, эфирные масла, ароматизаторы, красители, увлажнители или геотермальные воды и т.д.

Эти композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы ежедневно, один или несколько раз в сутки без ограничения продолжительности лечения.

Описание графических материалов

Фиг. 1. Хроматограмма ВЭЖХ экстракта CCV.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение экстракта CCV культуры растительных клеток Tripterygium wilfordii. обогащенного пентациклическими тритерпенами

Культивирование выполняли в волновом реакторе Sartorius Stedim Biotech (Германия) (объем 5 л). Реактор инокулировали суспензией клеток Tripterygium wilfordii из колбы Эрленмейера (композиция среды, параметры указаны выше). При непрерывном встряхивании после достижения максимальной биомассы через приблизительно 17 суток проводили элиситацию с помощью смеси элиситоров (метилжасмоната и хитина). Культивирование останавливали после 15 суток элиситации. Большую часть биомассы извлекали путем фильтрования клеточной суспензии через нейлоновый фильтр (20-50 мкм). Из 5 л суспензии извлекали приблизительно 1925 г биомассы. Эту биомассу экстрагировали этилацетатом (или изопропилацетатом) в отношении 2:1 (объем:масса) к массе биомассы (в данном случае 3850 мл растворителя для 1925 г биомассы). Смесь биомассы и растворителя затем подвергали физической экстракции с помощью обработки ультразвуком или с помощью измельчения. Органическую фазу затем извлекали после мацерации при встряхивании. Добавление растворителя (с последующей мацерацией при встряхивании и извлечением органической фазы) повторяли дважды. Растворитель можно концентрировать в вакууме, затем солюбилизировать, например, в пентиленгликоле, и завершить стадию вытяжкой в вакууме для удаления остаточного органического растворителя. Таким образом получали раствор, названный «экстрактом CCV», содержащий следующие пентациклические тритерпены: целастрол (основной пик), тингенин А и тингенин В (см. фигуру 1).

Условия ВЭЖХ: аппарат для жидкостной хроматографии Alliance (Waters 2695, версия 2.03); колонка Sunfire С18, 100 Å, 5 мкм (4,6 мм × 150 мм). Градиент растворителя: вода/ацетонитрил, скорость потока 3 мл/минута, выявление тритерпенов при λ 460 нм. Этот экстракт, используемый для фармакологических активностей (примеры 2 и 3), титровали при концентрации целастрола. Целастрол, тингенин А и тингенин В могут быть очищены путем сбора после разделения с помощью ВЭЖХ. Очищенные соединения повторно суспендировали в диметилсульфоксиде ДМСО, а затем разбавляли соответствующими буферами для каждого теста

Пример 2. Противоспалительная активность и активность против ММР-9 двух экстрактов и очищенных молекул тингенина А. тингенина В и целастрола

В данном примере тестировали два разных экстракта, при этом они были получены из культуры растительных клеток. Экстракт 2 получали согласно примеру 1, экстракт 1 получали из той же культуры, но с другой элиситацией с использованием метилжасмоната и ацетилсалициловой кислоты вместо метилжасмоната и хитина. Экстракты 1 и 2 выражены в % каждого тритерпенового компонента (тингенина А: ТА, тингенина В: ТВ, целастрола: CEL), исходя из общего количества ТА, ТВ и CEL в экстракте в приведенной ниже таблице 1.

Маточные растворы экстрактов в мкг/мл (сухой массы ТА, ТВ и CEL) количественно определяли с помощью ВЭЖХ (относительно стандартов). Тестируемые продукты растворяли в ДМСО (маточный раствор). Тестировали три концентрации: 45, 135 и 405 нг/мл для ТА и ТВ. Для целастрола также тестировали три концентрации: 15, 45 и 135 нг/мл. Для обоих экстрактов также тестировали три концентрации: для экстракта 1 (45, 135 и 405 нг/мл) и для экстракта 2 (20, 60 и 180 нг/мл).

Положительный контроль состоял из ингибитора JAK (от англ. - Janus kinase - Янус-киназа) (CAS 457081-03-7 Calbiochem), тестируемого при 10 мкМ (разбавленного с помощью ДМСО).

Используемая линия клеток представляла собой линию кератиноцитов человека, которую культивировали при 37°С в атмосфере с 5% CO₂.

Кератиноциты человека высевали в 24-луночные планшеты (75000 клеток на лунку) и культивировали в течение 48 часов в культуральной среде (Keratinocyte-SFM, дополненной 0,25 нг/мл фактора роста эпителия, 25 мкг/мл экстракта гипофиза и 25 мкг/мл гентамицина). Затем культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей подлежащие тестированию образцы или не содержащей образцы (контрольная группа), клетки снова инкубировали в течение 24 часов (среда для теста: Keratinocyte-SFM, дополненная 25 мкг/мл гентамицина). Процедуру снова повторяли в присутствии смеси стимулирующих кератиноциты цитокинов: IL-17, онкостатина М и TNFα при 3 нг/мл каждого. Время культивирования составляло 24 часа для экспериментов с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени кПЦР-РВ и 48 часов для экспериментов с помощью ELISA (от англ. - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ферментный иммуносорбентный анализ). Затем клетки промывали в забуференном фосфатом солевом (PBS (от англ. - phosphate-buffered saline)) растворе и сразу же замораживали при -80°С. Эксперименты выполняли в трех повторностях.

Анализ кПЦР-РВ

Экспрессию маркеров DEFB4A, S100A7, CXCL10, CXCL11, CXCL16, CCL5, CCL20, IL-8 (CXCL8), IL-23A и ММР-9 кератиноцитами после индуцирования определяли с помощью кПЦР-РВ, как раскрывается в литературе, с помощью обратной транскриптазы (Roche) и наборов для количественной полимеразной цепной реакции ПЦР. Параллельно использовали два положительных контроля ПЦР (RPS28 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ГАФДГ, конститутивно экспрессируемых) для нормализации полученных результатов.

Анализ ELISA маркерных белков IL-8 и ММР-9

В данном эксперименте тестировали одну концентрацию для каждого соединения: ТА (500 нг/мл), ТВ (500 нг/мл), экстракт 1 (200 нг/мл) и экстракт 2 (150 нг/мл), положительный контроль (ингибитор JAK, 10 мкМ). Кератиноциты человека высевали в 24-луночные планшеты (75000 клеток на лунку) и культивировали только 24 часа в той же культуральной среде, что раскрывается выше. В остальном протокол идентичен предыдущему, все экспериментальные условия выполняли в трех повторностях. По окончании времени инкубации супернатанты извлекали для количественного определения маркеров (IL-8 и ММР-9). Необработанные данные анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Сравнение между группами выполняли с помощью непарного t-критерия Стьюдента.

Результаты (кПЦР-РВ)

Стимуляция кератиноцитов смесью цитокинов IL-17, онкостатина М и TNFα при 3 нг/мл каждого в течение 24 часов индуцировала типичный воспалительный профиль, характеризующийся сильной повышающей регуляцией генов, кодирующих маркеры врожденного иммунитета и другие воспалительные маркеры (таблица 2).

Эталонное соединение (ингибитор JAK), тестируемое при 10 мкМ, противодействует всем эффектам стимуляции кератиноцитов, при этом фактически все гены, которые были подвергнуты повышающей регуляции, больше не регулируются в присутствии этого ингибитора. Этот результат подтверждает правильность теста.

Эффекты в отношении воспалительных маркеров тингенина А, тингенина В, целастрола и двух экстрактов подытожены в приведенных ниже таблице 3 (эффект тингенина А и В, а также целастрола в отношении экспрессии генов в стимулированных кератиноцитах человека) и в таблице 4 (эффект экстрактов 1 и 2 в отношении экспрессии генов в стимулированных кератиноцитах человека).

При данных экспериментальных условиях тингенин А и тингенин В, тестируемые при 45, 135 и 405 нг/мл, демонстрируют понижающую регуляцию этих генов зависимым от концентрации образом в отношении всех оцениваемых маркеров. Эффекты тингенинов А и В являются особенно сильными при самой высокой тестируемой концентрации. Подобным образом, эффекты двух тестируемых экстрактов снижают экспрессию маркеров, оцениваемых в данном тесте, зависимым от концентрации образом.

Таким образом, авторы настоящего изобретения показывают, что тритерпены, присутствующие в двух экстрактах, обладают эффектом против ТМ7, главным образом, при двух самых высоких концентрациях.

Результаты (ELISA для IL-8 и ММР-9)

Эффекты тингенина А, тингенина В, целастрола и обоих экстрактов в отношении высвобождения IL-8 и ММР-9 подытожены в приведенной ниже таблице 5 (* р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001 по сравнению с контролем).

В условиях без стимуляции кератиноцитами секретируются низкие уровни IL-8 и ММР-9. Стимуляция кератиноцитов смесью цитокинов приводит к высокой степени высвобождения IL-8 и ММР-9. Ингибитор JAK (10 мкМ), выбранный в качестве эталонного соединения, сильно и статистически подавляет высвобождение этих двух маркеров. Эти ожидаемые результаты подтверждают правильность данного теста.

В данных экспериментальных условиях все из тингенина А (500 нг/мл), тингенина В (500 нг/мл), целастрола (100 нг/мл), экстракта 1 (200 нг/мл) и экстракта 2 (150 нг/мл) четко демонстрируют ингибиторный эффект в отношении высвобождения IL-8 и ММР-9 благодаря стимуляции кератиноцитов. Два экстракта и целастрол демонстрируют более сильную противовоспалительную активность по сравнению с тингенинами А и В.

Авторы настоящего изобретения, таким образом, демонстрируют на модели кератиноцитов человека, стимулированных смесью цитокинов, что экстракты 1 и 2, а также пентациклические тритерпены, присутствующие в этих экстрактах и тестируемые отдельно, обладают эффектом против Th17 на уровне экспрессии генов, и что этот эффект подтверждается на уровне белков. Важно отметить, что экстракты, содержащие регулируемые количества трех пентациклических тритерпенов, обладают еще более сильными ингибирующими активностями (Th17). Кроме того, все эти соединения отдельно и тестируемые экстракты способны ингибировать ММР-9, которая является одной из основных мишеней для лечения витилиго.

Пример 3. Антиоксидантная активность двух экстрактов и очищенных молекул тингенина А, тингенина В и целастрола

Окислительный стресс является одной из возможных причин развития витилиго. Целью данного эксперимента является измерение антиоксидантной активности каждого пентациклического тритерпена и двух экстрактов в сравнении с хорошо известным положительным контролем - витамином С.Используемый in tubo способ представляет собой способ оценивания ORAC (от англ. - Oxygen Radical Antioxidant Capacity) (способность поглощать радикалы кислорода), адаптированный из способа, раскрываемого у Davalos et al. (J Agric Food Chem 52(1):48-54, 2004). Индекс ORAC позволяет оценивать антиоксидантную способность каждого соединения, тестируемого в примере 2. Данный тест позволяет оценивать и классифицировать различные тестируемые соединения в соответствии с их антиоксидантной способностью по отношению к пероксильным свободным радикалам. ААРН (от англ. - 2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride) (2,2'-азобис-2-метил-пропанимидамида дигидрохлорид) является источником пероксильных свободных радикалов. Данный тест использовали для имитации кинетики разложения флуоресцеина свободными радикалами. В результате происходило снижение флуоресценции в зависимости от времени и концентрации антиоксидантного активного средства, присутствующего в тестируемом экстракте. 3,4-Дигидро-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-2Н-1-бензопиран-2-карбоновую кислоту или Trolox использовали в качестве стандарта, она представляет собой гидрофильный аналог витамина Е (известный антиоксидант). Добавление Trolox (в эталонном диапазоне), или экстракта, или пентациклического тритерпена защищает флуоресцеин от разложения. Это позволяет оценивать антиоксидантную активность, измеряемую по отношению к диапазону Trolox.

Все растворы готовили в 75 мМ фосфатного буфера, рН 7,6. Флуоресцеин составлял 1,17 мкМ (117 мМ маточный раствор). ААРН при 125 мМ готовили непосредственно перед применением, Trolox составлял 1 мМ. В черный 96-луночныйц планшет добавляли 20 мкл антиоксиданта (в диапазоне Trolox или тестируемого соединения), 160 мкл флуоресцеина при 1,17 мкМ. Планшет покрывали пленкой, а затем инкубировали в течение 15 минут при 37°С. Раствор ААРН добавляли вручную и как можно быстрее из расчета 20 мкл на лунку. Затем планшет немедленно инкубировали при 37°С в спектрофлуорометре (SpectraMax). Показания регистрировали каждую минуту в течение 90 минут. Длина волны возбуждения составляла 485 нм, а длина волны эмиссии составляла 520 нм. Каждый тест проводили в трех повторностях.

Вычисляли площадь под кривой (AUC (от англ. - areas under curve)) для каждого из испытаний. Чистые AUC определяли следующим образом:

Чистая AUC = AUC точки диапазона или образца - AUC холостой пробы.

Строили калибровочную прямую, при этом концентрацию Trolox (в мкМ) сравнивали с чистой AUC. Использовали линейное уравнение для определения эквивалента Trolox (в мкМ) для каждого из определяемых образцов.

Эквивалент Trolox в мкМ = а × (чистая AUC)2 + b × (чистая AUC), при этом а и b определяют линейным уравнением.

Для определения образцы разбавляли таким образом, чтобы измеренные значения находились в пределах стандартного диапазона, используемого для определения. В качестве эталона использовали аскорбиновую кислоту (витамин С).

Индекс ORAC соответствовал % молей Trolox/100 г материала.

Приведенные ниже результаты рассчитывали для тритерпенов, тингенина А, тингенина В и целастрола в 100 г экстракта, т.е. согласно расчету:

Индекс ORAC = эквивалент Trolox в мкМ × 20 (тестируемая часть) × (100000/[мкг/мл тестируемого экстракта] × 20 (тестируемая часть)).

Результаты

Результаты данного эксперимента с точки зрения антиоксидантной активности и сравнения индекса ORAC/100 г тритерпенов представлены в приведенной ниже таблице 6.

Таким образом, чем выше индекс ORAC, тем выше антиоксидантная активность. В порядке убывания (индекс ORAC/100 г тритерпенов): экстракт 1 > экстракт 2 > целастрол > тингенин В > витамин С > тингенин А.

Авторы настоящего изобретения показывают, что при данных экспериментальных условиях экстракты 1 и 2 обладают более высокой антиоксидантной способностью, чем эталон (витамин С), и что экстракты обладают более сильной антиоксидантной активностью, чем тритерпены, взятые по отдельности. Только тингенин А обладает более низкой антиоксидантной способностью, чем витамин С.

В заключение, авторы настоящего изобретения удивительным образом продемонстрировали, что экстракты, содержащие тритерпены (тингенины А и В, целастрол), не только обладают сильной активностью против Th17, но также характеризуются значительными антиоксидантными свойствами. Эти два эффекта в совокупности оказывают очень благоприятное воздействие на сохранение нормальных функций меланоцитов и кератиноцитов, на предотвращение, стабилизацию прогрессирования витилиго и потенциальное возвращение пигментации.

Группа изобретений относится к области медицины и раскрывает применение композиции, содержащей тингенин A, тингенин B и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли, для лечения или предупреждения витилиго. Также раскрыто применение композиции, содержащей тингенин A, тингенин B и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли, для ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9). Техническим результатом группы изобретений является обеспечение эффективной, не имеющей побочных эффектов терапии с сильной противовоспалительной и большей антиоксидантной активностями. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 табл., 1 ил., 3 пр.

1. Применение композиции, содержащей тингенин A, тингенин B и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли, для лечения или предупреждения витилиго.

2. Применение по п. 1, где витилиго опосредовано Th17-цитокинами и хемокинами.

3. Применение по п. 2, где Th17-цитокины индуцируют ингибирование продуцирования меланина меланоцитами.

4. Применение по п. 2 или 3, где белок MMP-9 сверхэкспрессируется кератиноцитами.

5. Применение композиции, содержащей тингенин A, тингенин B и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли, для ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9).

6. Применение по любому из пп. 1-5, где тингенин A, тингенин B и целастрол или их фармацевтически приемлемые соли присутствуют в экстракте растения из семейства Celastraceae.

7. Применение по п. 6, где растение из семейства Celastraceae выбрано из Tripterygium wilfordii, Tripterygium hypoglaucum и Celastrus orbiculatus.

8. Применение по п. 6 или 7, где экстракт представляет собой обогащенный неочищенный экстракт, полученный следующим способом:

(i) фаза пролиферации клеток растения из семейства Celastraceae в среде для пролиферации,

(ii) фаза элиситации посредством добавления смеси для элиситации в культуру клеток, полученную на стадии (i), при этом указанная смесь для элиситации содержит по меньшей мере один элиситор типа монокарбонового соединения и по меньшей мере один биотический элиситор, и

(iii) получение неочищенного экстракта, обогащенного тингенином A, тингенином B и целастролом, из культуры клеток, полученной на стадии (ii).

9. Применение по п. 8, где композиция содержит от 0,01 до 2% масс. обогащенного неочищенного экстракта в расчете на общую массу композиции.

10. Применение по п. 8 или 9, где обогащенный неочищенный экстракт содержит от 90% до 100% масс. тингенина A, тингенина B и целастрола в расчете на общую массу обогащенного неочищенного экстракта.

11. Применение по любому из пп. 8-10, где обогащенный неочищенный экстракт содержит

от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% масс. тингенина A в расчете на общую массу экстракта,

от 1 до 20%, в частности, от 5 до 15%, в частности, от 8 до 12% масс. тингенина B в расчете на общую массу экстракта, и

по меньшей мере 60%, в частности, по меньшей мере 80% масс. целастрола в расчете на общую массу экстракта.

12. Применение по любому из пп. 1-11, где композиция находится в форме, подходящей для местного применения.