СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДАНТРОЛЕНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕРВНО-ПАРАЛИТИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4178 A61P39/02 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает преимущество предварительной заявки США No. 62/554049, поданной 5 сентября 2017 года, и предварительной заявки США No. 62/674406, поданной 21 мая 2018 года, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам лечения субъектов, подвергшихся воздействию веществ с нейротоксическим нервно-паралитическим действием, с помощью дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли.

Уровень техники

Вещества с нейротоксическим нервно-паралитическим действием, также называемые нервно-паралитические вещества, представляют собой фосфорорганические соединения, которые нарушают передачу нервных импульсов в нервной системе путем блокирования ацетилхолинэстеразы. Эти вещества в газообразной, аэрозольной или жидкой форме чрезвычайно токсичны и оказывают очень быстрое действие. Отравление нервно-паралитическим веществом вызывает множество симптомов, включая односторонний или двусторонний миоз, головную боль, судороги, потерю сознания, кому и смерть. В частности, отравление нервно-паралитическим веществом вызывает судорожные припадки, которые могут быстро перерасти в эпилептический статус (SE), что приводит к повреждению мозга, связанному с судорожным припадком. Судорожные припадки, вызванные нервно-паралитическим веществом, обычно становятся невосприимчивыми к стандартной противоэпилептической терапии.

Медицинское обслуживание для лечения отравления нервно-паралитическим веществом, вероятно, будет отложено за пределы терапевтического окна возможности прекратить судорожные припадки, вызванные нервно-паралитическим веществом, и повреждение мозга, связанное с судорожным припадком, будет продолжаться вплоть патологического каскада. Таким образом, существует потребность в лечении лекарственными средствами, способном прерывать патологический каскад для обеспечения нейропротекции во время рефрактерной фазы судорожных припадков, вызванных нервно-паралитическим веществом.

Сущность

Настоящее изобретение относится к способам лечения субъектов, подвергающихся воздействию нейротоксического нервно-паралитического вещества, фармацевтической композицией, содержащей количество дантролена (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен), или его фармацевтически приемлемой соли.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана средняя масса тела испытуемой группы с течением времени.

На фиг. 2А показаны результаты теста предпочтения сахарозы в день исследования 14.

На фиг. 2В показаны результаты теста предпочтения сахарозы в день исследования 15.

На фиг. 3 показаны результаты теста принудительного плавания.

На фиг. 4 представлены средние показатели некроза лобно-теменной коры головного мозга.

На фиг. 5А представлена микрофотография из лобно-теменной коры головного мозга животного в группе E (положительный контроль, вода через 50 минут после начала SE). Стрелками обозначены выцветшие, сморщенные нейроны. Оценка некроза составила 4.

На фиг. 5В представлена микрофотография из лобно-теменной коры головного мозга животного в группе D (30 мг/кг контроль, через 20 минут после начала SE). Стрелки отмечают нормальные нейроны. Оценка некроза составила 0.

Подробное описание иллюстративных вариантов осуществления

Настоящее изобретение может быть более легко понято посредством ссылки на следующее подробное описание, взятое в связи с прилагаемыми фигурами и примерами, которые составляют часть этого изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными композициями или способами, описанными и/или показанными в настоящем документе, и что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для описания конкретных вариантов осуществления только в качестве примера и не предназначена для ограничения заявленного изобретения. Кроме того, как используется в описании, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа включают множественное число, и ссылка на конкретное числовое значение включает, по меньшей мере, это конкретное значение, если только контекст явно не диктует иного. Все диапазоны включены и комбинируются.

Модификатор «примерно» следует рассматривать как раскрывающий диапазон, определяемый абсолютными значениями двух конечных точек. Например, выражение «от примерно 2 до примерно 4» также раскрывает диапазон «от 2 до 4». При использовании для изменения одного числа термин «примерно» может относиться к плюс или минус 10% указанного числа и включает указанное число. Например, «примерно 10%» может указывать диапазон от 9% до 11%, а «примерно 1» означает от 0,9 до 1,1.

Следует принимать во внимание, что некоторые признаки изобретения, которые для ясности описаны в настоящем документе в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут предоставляться отдельно или в любой субкомбинации. Кроме того, ссылка на значения, указанные в диапазонах, включает каждое значение в этом диапазоне.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтическая композиция» будет означать композицию, которая подходит для введения человеку и содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, без ограничения, стабилизаторы, объемообразующие агенты, буферы, носители, разбавители, растворители, солюбилизаторы и связующие вещества. Используемая в настоящем описании фармацевтическая композиция включает, но не ограничивается этим, жидкую форму, готовую для подкожной инъекции или инфузии и внутримышечной инъекции.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству активного фармацевтического средства, описанного в настоящем документе, которое является достаточным для ингибирования, остановки или улучшения состояния, вызванного лечением расстройства или состояния у конкретного субъекта или популяции субъекта. В некоторых вариантах осуществления у человека или другого млекопитающего терапевтически эффективное количество может быть определено экспериментально в лабораторных или клинических условиях или может быть количеством, требуемым государственными руководствами для конкретного заболевания и субъекта, подлежащего лечению.

Как используется в настоящем описании, термин «облегчение» относится к уменьшению тяжести нарушения или состояния, подлежащего лечению, у конкретного субъекта или популяции субъекта.

Как используется в настоящем описании, термин «пациент» или «субъект» предназначен для обозначения млекопитающего. Таким образом, способы, описанные в настоящем документе, применимы к человеку и субъектам, не относящимся к человеку. Способы, описанные в настоящем документе, являются особенно применимыми для людей.

Термин «фармацевтически приемлемый», как используется в настоящем описании, означает, что объект, который является фармацевтически приемлемым, например, компоненты, включая контейнеры, фармацевтической композиции не вызывает неприемлемой потери фармакологической активности или неприемлемых побочных эффектов. Примеры фармацевтически приемлемых компонентов представлены в The United States Pharmacopeia (USP), The National Formulary (NF), adopted at the United States Pharmacopeial Convention, held in Rockville, Md. in 1990 and FDA Inactive Ingredient Guide 1990, 1996 issued by the U.S. Food and Drug Administration (оба включены в настоящее описании посредством ссылки, включая любые чертежи). Могут также использоваться другие марки растворов или компонентов, соответствующие необходимым ограничениям и/или спецификациям, не входящим в USP/NF.

Термин «фармацевтически приемлемая соль», как используется в настоящем описании, означает соль соединения по настоящему изобретению, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает желаемой фармакологической активностью исходного соединения. В частности, такие соли являются нетоксичными и могут представлять собой неорганические или органические кислотно-аддитивные соли и соли присоединения основания. В частности, такие соли включают: соли, образованные, когда протон кислоты, присутствующий в исходном соединении, либо замещается ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или координируется с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин и тому подобное. Соли, дополнительно, включают только в качестве примера натрий, калий, кальций, магний, аммоний, тетраалкиламмоний и тому подобное; и когда соединение содержит основную функциональность, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, таких как гидрохлорид, гидробромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и тому подобное.

Как используется в настоящем описании, термин «нейротоксическое нервно-паралитическое вещество» или «нервно-паралитическое вещество» относится к соединениям, которые влияют на передачу нервных импульсов в нервной системе. Нервно-паралитические вещества представляют собой фосфорорганические соединения, то есть они имеют формулу (R)₃P(O), где каждая группа R может быть одинаковой или различной. Нервно-паралитические вещества типа «G» включают O-пинаколилметилфосфонофторидат (зоман, GD), этил N, N-диметилфосфорамидоцианидат (табун, GA), пропан-2-ил метилфосфонофторидат (зарин, GB), циклогексил метилфосфонофторидат (циклозарин, GF) и 2-(диметиламино)этил (GV). Нервно-паралитические вещества типа «V» включают O-циклопентил S-(2-диэтиламиноэтил) метилфосфонотиолат (EA-3148), (S)-(этил{[2-(диэтиламино)этил]сульфонил}(этил)фосфонаты), такие как (S)-(этил{[2-(диэтиламино)этил]сульфанил}(этил)фосфинат) (VE), O, O-диэтил S-[2-(диэтиламино)этил] фосфоротиоат (VG), S-[2-(диэтиламино)этил] O-этилметилфосфонотиоат (VM), N, N-диэтил-2-(метил-(2-метилпропокси)фосфорил)сульфанилэтанамин (VR) и этил ({2-[бис(пропан-2-ил)амино]этил}сульфанил)(метил)фосфинат (VX). Способы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения субъекта, подвергшегося воздействию одного нервно-паралитического вещества. Способы, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для лечения субъекта, подвергшегося воздействию двух или нескольких нервно-паралитических веществ.

Как используется в настоящем описании, выражения "в результате воздействия нервно-паралитического вещества" и “вследствие воздействия нервно-паралитического вещества" относятся к эффектам, являющимся прямым следствием воздействия нервно-паралитического вещества, а также к эффектам, являющимся вторичным следствием воздействия нервно-паралитического вещества, а также к эффектам, которые являются косвенным следствием воздействия нервно-паралитического вещества.

Среди прочего, изобретение относится к способам лечения субъекта, подвергшегося воздействию нервно-паралитического вещества, фармацевтической композицией, содержащей количество дантролена или его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к способам лечения субъекта, подвергшегося воздействию нервно-паралитического вещества, фармацевтической композицией, содержащей количество метаболита дантролена, например, 5-гидроксидантолерина или его фармацевтически приемлемой соли. Например, в некоторых аспектах описанные способы предотвращают неврологические повреждения, вторичные по отношению к воздействию нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы обеспечивают нейропротективные эффекты после воздействия нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы облегчают повреждение тканей головного мозга, вторичное по отношению к воздействию нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы облегчают повреждение мозговой ткани, вторичное к эпилептическому статусу, вторичное к воздействию нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы предотвращают некроз нейронов вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы облегчают некроз нейронов вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы лечат внутриклеточную перегрузку кальцием вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы облегчают внутриклеточную перегрузку кальцием вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. В других аспектах описанные способы предотвращают внутриклеточную перегрузку кальцием вследствие воздействия нервно-паралитического вещества.

Субъекты, описанные в настоящем документе, могут подвергаться воздействию нервно-паралитического вещества через органы дыхания. В других аспектах субъекты подвергаются действию нервно-паралитического вещества посредством трансдермального проникновения вещества. В других аспектах субъекты подвергаются действию нервно-паралитического вещества через употреблении жидкости или пищи, которая была загрязнена нервно-паралитическим веществом. В других аспектах субъекты подвергаются воздействию нервно-паралитического вещества посредством подкожного, внутривенного или внутримышечного введения вещества субъекту.

В некоторых аспектах способы направлены на способы защиты субъекта от нейронального некроза после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В этих вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую количество дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли, вводят субъекту после того, как субъект подвергается воздействию нервно-паралитического вещества. Как используется в настоящем описании, термин «защита» от нейронального некроза включает уменьшение тяжести воздействия нервно-паралитического вещества или ослабление действия нервно-паралитического вещества или уменьшение нейронального повреждения, вызванного воздействием нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах «защита» от нейронального некроза включает предотвращение нейронального некроза у субъекта, подвергшегося воздействию нервно-паралитического вещества. То есть субъекты, которые “защищены” от нейронального некроза введением описанных дантроленсодержащих композиций (или композиций, содержащих метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен), лучше выполняют нейроповеденческие тесты, по сравнению с субъектами, подвергшимися воздействию нервно-паралитического вещества, которым не вводили описанные композиции.

В некоторых вариантах осуществления целостность центральной нервной системы субъекта защищена от нейронального некроза. В некоторых вариантах осуществления лобно-теменная доля, гиппокамп и/или таламус защищены от нейронального некроза. В других аспектах лобно-теменная доля будет защищена от нейронального некроза. В других аспектах гиппокамп защищен от нейронального некроза. В других вариантах осуществления таламус защищен от нейронального некроза.

Наличие и степень нейронального некроза можно определить с использованием способов, известных в данной области, включая нейроповеденческие тесты, радиологические исследования и оценку патологии.

Изобретение также относится к способам защиты субъекта от снижения функции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. Эти способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей количество дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли, после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

Изобретение также относится к способам защиты субъекта от дисфункции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. Эти способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей количество дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли, после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

Изобретение также относится к способам лечения изменений поведения у субъекта, возникающих вследствие воздействия нервно-паралитического вещества. Эти способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей количество дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли, после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

Как используется в настоящем описании, термин «защита» от снижения функции центральной нервной системы включает уменьшение тяжести эффектов нервно-паралитического вещества на центральную нервную систему или облегчения воздействия нервно-паралитического вещества на центральную нервную систему или уменьшение эффектов нервно-паралитического вещества на центральную нервную систему. Таким образом, субъекты, которые «защищены» от снижения функции центральной нервной системы путем введения описанных композиций, показывают лучшие результаты при проведении нейроповеденческих тестов по сравнению с субъектами, подвергшимися воздействию нервно-паралитического вещества, которым не вводили описанные композиции.

Изобретение также относится к способам лечения судорожных припадков, вызванных нервно-паралитическим веществом, субъекта, подвергшегося воздействию нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах судорожные припадки, подвергнутые лечению, являются эпилептическим статусом (SE). Эти способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей количество дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли. Как используется в настоящем описании, лечение судорожных припадков, вызванных нервно-паралитическим веществом, приводит к снижению тяжести или продолжительности припадков. В других аспектах лечение приводит к снижению как тяжести, так и продолжительности припадка.

Количество дантролена или его фармацевтически приемлемой соли, которое является терапевтически эффективным для лечения субъекта в соответствии с любым из описанных способов, должно быть определено специалистом в данной области. Терапевтически эффективным количеством может быть количество, необходимое для лечения субъекта однократной дозой. Альтернативно, терапевтически эффективное количество может представлять собой совокупное количество дантролена, необходимое для лечения субъекта более чем одной дозой, например, несколькими дозами, в течение хронического или длительного курса лечения.

В тех вариантах осуществления, где субъектом является человек, терапевтически эффективное количество дантролена составляет от 1 мг/кг до 30 мг/кг, вводимое в одной или двух дозах. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от 1 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 10 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 15 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 20 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 15 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 10 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг, предпочтительно от примерно 2 мг/кг до примерно 6 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет от примерно 15 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество дантролена составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или примерно 30 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество дантролена для лечения человека составляет более 30 мг/кг, например, от 30 мг/кг до примерно 100 мг/кг, вводимое в одной или двух дозах. В некоторых аспектах терапевтически эффективное количество дантролена для лечения человека составляет примерно 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или примерно 100 мг/кг.

Количество метаболита дантролена (такого как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемой соли, которое является терапевтически эффективным для лечения субъекта в соответствии с любым из описанных способов, должно быть определено специалистом в данной области. В тех вариантах осуществления, где субъектом является человек, терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от 1 мг/кг до примерно 30 мг/кг, вводимое в одной или двух дозах. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет 1 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 10 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 15 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 20 мг/кг до примерно 30 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 15 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 5 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 10 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг, предпочтительно от примерно 2 мг/кг до примерно 6 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет от примерно 15 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или примерно 30 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество метаболита дантролена для лечения человека составляет более 30 мг/кг, например, от 30 мг/кг до примерно 100 мг/кг, вводимое в одной или двух дозах. В некоторых аспектах терапевтически эффективное количество метаболита дантролена для лечения человека составляет примерно 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, или примерно 100 мг/кг.

В некоторых аспектах настоящего изобретения время введения фармацевтической композиции, содержащей дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, после воздействия нервно-паралитического вещества может влиять на степень защиты от нейронального некроза, предоставляемую субъекту.

В некоторых аспектах настоящего изобретения время введения фармацевтической композиции, содержащей дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, после воздействия нервно-паралитического вещества, может влиять на величину снижения функции центральной нервной системы, присущую субъекту.

В некоторых аспектах настоящего изобретения время введения фармацевтической композиции, содержащей дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, после воздействия нервно-паралитического вещества может повлиять на лечение вызванных нервно-паралитическим веществом судорожных припадков у субъекта.

Композиции, содержащие дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, могут вводиться субъекту длительно, в двух или более дозах, то есть в течение двух или нескольких недель, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более недель после того, как субъект подвергся воздействию нервно-паралитического вещества. Композиции, содержащие дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, могут быть введены пациенту остро, в одной или нескольких дозах, то есть в течение менее двух недель, например, в течение нескольких часов или дней, например, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов или через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 дней после того, как субъект подвергся воздействию нервно-паралитического вещества.

Что касается интервала введения фармацевтической композиции, содержащей дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, то в некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере одну дозу вводят субъекту через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 20 часов или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 16 часов или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 12 часов или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 8 часов или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 4 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 2 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту через 1 час или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере, одну дозу вводят субъекту в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, или в течение примерно 24 часов после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

Вместе с тем в некоторых аспектах фармацевтическая композиция, содержащая дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, может доставлять терапевтически эффективное количество дантролена (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества, в одной дозе. В других аспектах две или несколько доз фармацевтической композиции могут быть необходимы для доставки терапевтически эффективного количества дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества. Например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доз фармацевтической композиции могут быть необходимы для доставки терапевтически эффективного количества дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества. Эти дополнительные дозы можно вводить по существу одновременно с первой дозой. В других аспектах дополнительные дозы отделены во времени от первой дозы. В тех аспектах, где вводят 3 или более доз, каждая доза может быть отделена во времени от введения любой другой дозы.

В некоторых аспектах раскрытия изобретения введение дантролена (или метаболита дантролена, такого как 5-гидроксидантролен) субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества, является дополнительной терапией в отношении воздействия нервно-паралитического вещества. Субъектам, подвергшимся воздействию нервно-паралитического вещества, также можно вводить один или несколько антидотов нервно-паралитического вещества. Одним классом антидотов в отношении воздействия нервно-паралитического вещества является реактиваторы ацетилхолинэстеразы, например, азоксим хлорид (HI-6). Другим классом антидотов в отношении воздействия нервно-паралитического вещества являются обратные антагонисты ацетилхолиновых рецепторов, например, атропин, например, атропин метилнитрат. Субъектам, подверженным воздействию нервно-паралитических веществ, также могут назначать противосудорожные средства. Примеры противосудорожных средств альдегиды (например, паральдегид), ароматические аллиловые спирты (например, стирипентол), бензодиазепины (например, клобазам, клоназепам, клоразепат, диазепам, мидазолам, лоразепам, нитразепам, темазепам, нитразепам, темазепам, ниметазепам), барбитураты (например, фенобарбитал, метилфенобарбитал, барбексаклон), бромиды (например, бромид калия), карбаматы (например, фелбамат), карбоксамиды (например, карбамазепин, окскарбазепин, эсликарбазепина ацетат), жирные кислоты (например, вальпроевая кислота, натрия вальпроат, дивалпроекс натрия, вигабатрин, прогабид, тиагабин), топирамат, аналоги ГАМК (например, габапентин, прегабалин), гидантоины (например, этотоин, фенитоин, мефенитоин, фосфенитоин), оксазолидиндионы (например, параметадион, триметадион, этадион), пропионаты (например, бекламид), пиримидиндионы (например, примидон), пирролидины (например, бриварацетам, левитирацетам, селетрацетам), сукцинимиды (например, этоксусимид, фенсуксимид, мезуксимид), сульфонамиды (например, ацетазоламид, сультиам, метазоламид, зонизамид), триазины (например, ламотриджин), мочевины (например, фенетурид, фенацемид), вальпроиламиды (например, вальпромид, валноктамид), перампанел и их комбинации. В некоторых аспектах противосудорожное средство представляет собой бензодиазепин, например, мидазолам. В других аспектах противосудорожное средство представляет собой барбитурат. В еще других аспектах, противосудорожное средство представляет собой гидантоин. В некоторых аспектах противосудорожное средство представляет собой паральдегид. В других аспектах противосудорожное средство представляет собой бромид калия. В некоторых аспектах противосудорожное средство представляет собой жирную кислоту. В других аспектах противосудорожное средство представляет собой топирамат.

В тех аспектах, где субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества, вводят антидот, дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) вводят после введения антидота. Например, дантролен можно вводить после введения реактиватора ацетилхолинэстеразы и/или после введения обратного антагониста рецепторов ацетилхолина.

В тех аспектах, когда субъекту, подвергшемуся воздействию нервно-паралитического вещества, вводят противосудорожное лекарственное средство, дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) можно вводить одновременно с введением противосудорожного лекарственного средства. Дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) может вводиться в основном в настоящее время с введением противосудорожного средства, а также, например, в течение примерно 5 минут после введения противосудорожного средства. В других вариантах осуществления дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) вводят перед введением противосудорожного средства. В других вариантах осуществления дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) вводят после введения противосудорожного средства.

Фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, можно вводить внутривенно. В других аспектах, фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить трансдермально. В других аспектах, фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить внутримышечно. В других аспектах, фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить внутрикостно. В других аспектах, фармацевтическую композицию, содержащую дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить подкожно.

Предпочтительные фармацевтические композиции для использования в описанных способах включают дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Предпочтительные фармацевтические композиции включают дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат (например, полисорбат 80), повидон (например, повидон К12), необязательный регулятор рН (например, NaOH или HCl) и воду.

Особенно предпочтительной фармацевтической композицией, содержащей дантролен (или метаболит дантролена, такой как 5-гидроксидантролен) или его фармацевтически приемлемую соль, является RYANODEX® (дантролен натрия, Eagle Pharmaceuticals, Woodcliff Lake, NJ). RYANODEX® представляет собой инъекционную суспензию в виде стерильного лиофилизированного порошка. Он поставляется в 20 мл флаконах, содержащих 250 мг дантролена натрия, 125 мг маннита, 25 мг полисорбата 80, 4 мг повидона К12 и достаточное количество гидроксида натрия или хлористоводродной кислоты для корректировки значения рН. При восстановлении 5 мл стерильной воды для инъекций USP это дает суспензию.

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации некоторых концепций, описанных в настоящем изобретении. Хотя считается, что каждый пример обеспечивает конкретные индивидуальные варианты осуществления изобретения, ни один из примеров не должен рассматриваться как ограничивающий более общие варианты осуществления, описанные в настоящем документе. В следующих примерах были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых числовых значений (например, количества, температуры и т.п.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.

Примеры

Пример 1

Обзор исследования

Цель исследования состояла в определении, обладает ли RYANODEX® нейропротекторными эффектами в модели выживаемости у крыс с введением GD (зоман). Разовые дозы 10 или 30 мг/кг RYANODEX® вводили путем болюсной инъекции в/в через 20 или 50 минут после начала судорожных припадков, вызванных зоманом. Выживаемости способствовало лечение азоксим хлоридом (HI-6) за тридцать минут до подкожной (п/к) инъекции зомана, атропин метилнитратом через одну минуту после п/к инъекции зомана и мидазоламом через двадцать минут после начала индуцированных зоманом судорожных припадков, которые достигают уровня по шкале Расина по крайней мере 3. Контроли включали одну группу, не получавших лечение (наивных) крыс, и другую группу, которая получала бы стерильную воду через 50 минут после начала индуцированных зоманом судорожных припадков.

Серию нейроповеденческих тестов проводили в течение приблизительно 28 дней после однократного воздействия GD. На 29-й день всех крыс умерщвляли под наркозом путем обескровливания и внутрисердечной перфузии. У каждой крысы собирали мозг для микроскопического нейропатологического исследования, и сердце собирали у каждой крысы для исследования возможной патологии.

Экспериментальными субъектами были >8-недельные самцы крыс линии Спрег-Доули (Charles River Laboratories) с канюлированной яремной веной, массой 300-500 г в день воздействия. Тест предпочтения сахарозы и нейроповеденческие тесты принудительного плавания использовали для оценки потенциального нарушения в задачах, включающих обучение и/или сенсорно-моторную интеграцию.

Материалы

Зоман (GD) - разбавленный 0,9% хлоридом натрия. Зоман представляет собой фосфорорганическое вещество нервно-паралитического действия, которое деактивирует ацетилхолинэстеразу (AChE), образуя аддукт с ферментом.

• Химическое название: пинаколил метилфосфонофторидат

• Формула: C₇H₁₆FO₂P

• Молекулярная масса: 182,17

• MRIGlobal Lot#: GD090415-DOC-1

• ID основного стандарта: 13972-49-3

• Чистота: 100%

• Условия хранения: <4°C

HI-6: Химическое название: [(E)-[1-[(4-карбамоилпиридин-1-иум-1-ил)метоксиметил]пиридин-2-илиден]метил]оксоазаниум;метансульфонат (азоксим хлорид)

Структура:

Формула: C₁₄H₁₆Cl₂N₄O₃

Молекулярная масса: 359,207

Атропин метилнитрат: Химическое название: (8,8-диметил-8-азонийбицикло[3.2.1]октан-3-ил)-3-гидрокси-2-фенилпропаноат;нитрат

Структура:

Формула: C₁₈H₂₆N₂O₆

Молекулярная масса: 366,414

Мидазолам: Химическое название: 8-хлор-6-(2-фторфенил)-1-метил-4Н-имидазо[1,5-a][1,4]бензодиазепин

Структура:

Формула: C₁₈H₁₃ClFN₃

Молекулярная масса: 325,771

RYANODEX® представляет собой одобренное FDA лекарственное средство для лечения злокачественной гипертермии в сочетании с соответствующими поддерживающими мерами и для профилактики злокачественной гипертермии у пациентов с высоким риском.

Животные

Для этого исследования в исследовании использовали 48 самцов крыс линии Спрег-Доули (плюс 8 дополнительных/замен в общей сложности 56; Charles River Laboratories), возрастом > 8 недель и массой 300-500 г с сосудистыми катетерами в яремной вене, имплантированными поставщиком. Крыс идентифицировали по хвостовой метке или ушной бирке с уникальным буквенно-цифровым обозначением. (см. SOP MRI-1504, “Procedure for Identification of Animals and Cages”).

Все крысы, включенные в исследование, имели удовлетворительное состояние, без каких-либо признаков клинического заболевания и имели проходимые катетеры, подходящие для дозирования в начале исследования. После доставки животных осматривали на наличие признаков ухудшения состояния здоровья и помещали на карантин в обычное помещение Спенсера для животных не менее чем на 48 часов. Ветеринар проверял здоровье животных и выпускал их для исследования. (см. SOP MRI-1501, “Acclimation and/or Quarantine Procedures for Animals”). В соответствии с SOP MRI-1500 животных взвешивали в течение трех дней после доставки. В течение периода со дня после прибытия животных в течение всего исследования сотрудники обрабатывали крыс не менее двух раз в день для акклиматизации и систематичности на протяжении всего исследования.

Всем крысам давали сертифицированный для грызунов лабораторный корм с указанием источника, номера партии и сертификата анализа, ad libitum. Никаких загрязняющих веществ, которые могли бы повлиять на результаты исследования, в корме не было, что подтверждается сертификатом анализа (для каждой партии, предоставленной поставщиком; см. SOP MRI-1510, “Procedure for Feeding Animals”). Бутылки с водой (одна бутылка с водой/клетку) обеспечивали водопроводной водой на протяжении всего исследования, за исключением периода акклиматизации и проведения теста предпочтения сахарозы (см. ниже), во время которого крысам предоставляли две бутылки с водой, содержащие водопроводную воду, или одну бутылка с водой, содержащей водопроводную воду, и одну бутылку с водой, содержащая 1% раствор сахарозы.

Животных содержали в поликарбонатной клетке Tecniplast с проволочной крышкой (Tecniplast, Phoenixville, PA) в течение периода акклиматизации/карантина и жизни. Животных размещали отдельно для предотвращения повреждения катетеров. Крыс содержали в помещениях с контролируемым микроклиматом, по меньшей мере, с 10 заменами воздуха в час. В комнатах поддерживали температуру от 20°С до 26,11°С и относительную влажность 50%±20% с 12-часовым циклом свет/темнота в сутки. Комнатную температуру, влажность и циклы освещения (12 часов:12 часов, переменные свет/темнота) контролировали с помощью системы мониторинга AmegaView 24 часа в сутки или с помощью гигротермографа во время исследования (см. SOP MRI-1170, “Temperature and Humidity Monitoring in Animal Rooms”).

Дозы

HI-6, зоман, атропин метилнитрат и мидазолам: Разовые дозы HI-6 (в/б, 125 мг/кг); зомана (п/к, 154 мкг/кг, 1,4 x LD₅₀), атропин метилнитрат (в/м, 2 мг/кг); и мидазолам (в/м, 2 мг/кг) были выбраны на основе предыдущего опыта с моделью. Ожидалось, что этот режим вызовет судороги, при которых оценка по шкале Расина составит по меньшей мере 3 и приемлемое количество выживших для последующего исследования.

RYANODEX®: При оценке переносимости однократной дозы у крыс внутривенные болюсные дозы 12, 40 и 60 мг/кг RYANODEX® давали отдельным группам крыс с канюлированной яремной веной. Двенадцать мг/кг хорошо переносились. Доза 40 мг/кг привела к незначительной потере массы тела через два дня после введения дозы, и 60 мг/кг привела к смерти подопытного животного приблизительно через двадцать четыре часа после введения дозы для всех пяти крыс, получавших эту дозу. Для данного исследования были выбраны однократные внутривенные болюсные дозы 10 и 30 мг/кг RYANODEX®, основанные на их ожидаемой переносимости. Дозы RYANODEX® 10 и 30 мг/кг у крыс эквивалентны человеческим дозам приблизительно 2 и 6 мг/кг, соответственно.

Схема дозирования

В общей сложности 48 плюс до 8 дополнительных самцов крыс линии Спрег-Доули с катетерами в яремных венах, имплантированными продавцом, использовали в 6 группах, как показано в таблице 1.

Таблица 1. Схема для предварительного исследования эффективности с RYANODEX®

Группа Предварительное введение HI-6 (в/б, за 30 минут до заражения GD) зоман “GD” (п/к) атропин метилнитрат (в/м, 1 мин после GD) мидазолам (в/м, ~20 минут после начала судорожной активности) RYANODEX® в/в через 20 или 50 минут после начала припадков A (n=8) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 50 мин с 10 мг/кг B (n=8) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 50 мин с 30 мг/кг C (n=8) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 20 мин с 10 мг/кг D (n=8) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 20 мин с 30 мг/кг E (n=8) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг Контроль стерильной воды через 50 мин F (N=8) 0 мг/кг 0 мкг/кг 0 мг/кг 0 мг/кг NA

Примечание: для групп C и D, RYANODEX® давали сразу после инъекции мидазолама.

Введение дозы начинали с группы D, за которой следуют группы B, A, C, E и F, соответственно.

Получение дозы

GD получали в ледяном 0,9% хлориде натрия согласно SOP MRI-5821 “Preparation of Standards and Samples from Research Development and Testing Evaluation (RDTE) Dilute Solutions”.

RYANODEX® получали путем добавления 5 мл стерильной воды для инъекций в один флакон с лиофилизированным продуктом.

План исследования

Подготовка животных

До или в день исследования 1 (день воздействия GD) крыс переводили в лабораторный комплекс для разведенных животных.

Дозирование

В день исследования 1 все животные в группах A-E получали реактиватор холинэстеразы, HI-6 (125 мг/кг) внутрибрюшинным (в/б) путем за 30 минут до заражения GD. Все крысы в группах A-E подвергались воздействию GD (154 мкг/кг или ~ 1,4 x LD₅₀) путем одной подкожной инъекции. Примерно через одну минуту после инъекции GD для групп A-E вводили путем внутримышечного введения атропин метилнитрат (AMN) (2,0 мг/кг). Примерно через 20 минут после начала судорожной активности после воздействия GD, как определено в таблице 1 выше, все животные в группах A-E получали мидазолам в дозе 2 мг/кг внутримышечно. Группа F не получала ни HI-6, ни GD, ни AMN, ни мидазолам, ни RYANODEX®. RYANODEX® вводили через микрошприц Hamilton, затем катетер промывали 0,2 мл стерильной воды для инъекций для обеспечения полной доставки в вену.

Инициация судорожной активности определялась баллом “3” по шкале Расина, как описано ниже:

1= иммобилизация и фиксация взгляда

2= качание головой, “отряхивание мокрой собаки”

3= клонус передних конечностей

4= билатеральный клонус передних конечностей

5= билатеральный клонус передних конечностей, подъем на задние лапы и потеря равновесия

Если крыса не достигала этого балла «3» примерно через 20 минут после воздействия GD, ее заменяли в исследовании.

Как показано в таблице 1, крысы в группах A и C получали дозу 10 мг/кг RYANODEX® в/в и крысы в группах B и D получали дозу 30 мг/кг RYANODEX® в/в через 50 или 20 минут после начала судорожных припадков (по шкале Расина «3»). Крысам группы E вводили контроль (стерильная воду для инъекций) в/в в объеме, сопоставимом с максимальной дозой RYANODEX® через 50 минут после начала судорожных припадков.

Примерно через 6 часов после контрольного заражения GD для групп A-E, а затем каждое утро и вечер крысам вводили 5 мл раствора Рингера с лактатом п/к в течение первых 7 дней после контрольного заражения, чтобы помочь восстановлению. После того, как животные оправились от заражения, как указано, наблюдая за тем, как они едят и пьют свободно, свободно передвигаются по клетке и не имеют никаких признаков обезвоживания (отсутствие сухости на коже спины), п/к регидратационнаую терапию прекращают. Это было частично на усмотрение ветеринарного врача на основании его/ее оценки животных. Кроме того, после контрольного заражения в течение того же периода времени (до 7 дней после контрольного заражения) животным предлагали гидрогели (ClearH₂O) и кашицу (увлажненный корм в глиняной посуде на полу клетки), чтобы помочь им восстановиться от эффектов введения GD.

Массы тела

Массы тела регистрировали для каждого животного при исследовании в течение первых 72 часов после получения от поставщика, а затем снова в дни исследования 1, 3, 5, 10, 17, 24 и 28. Более часто собирали данные по массе тела, если директор исследования выявил, что животные продолжали терять массу после контрольного заражения. Если какое-либо животное потеряло более 10% своей первоначальной массы тела, его взвешивали ежедневно до тех пор, пока животное не набирало, а не теряло массу. Массы тела всех групп показаны на фиг.1. Масса тела всех групп, подвергшихся воздействию зомана, получавших лечение RYANODEX® (группы A, B, C, D), восстановилась до значений отрицательного контроля (группа F) к дню исследования 25.

Клинические наблюдения

Наблюдения за общим состоянием здоровья проводили ежедневно в течение периода карантина и акклиматизации. Животных осматривали дважды в день в течение всего периода карантина и акклиматизации, а также в течение всей жизни. В день исследования 1 крыс обследовали до воздействия. После воздействия GD крыс часто подвергали мониторингу для оценки первоначального появления судорожных припадков. После введения мидазолама, RYANODEX® и/или стерильной воды животных наблюдали минимум два раза в день и по меньшей мере один раз в день эвтаназии. Клинические наблюдения, включая сгорбленную позу, обезвоживание, грубую шерсть и отсутствие аппетита, оценивали и записывали. Модифицированную оценку по шкале Расина регистрировали в каждой точке наблюдения, при необходимости. Любые другие патологические клинические наблюдения также зарегистрировали в это время в журнале для исследования или в соответствующей форме сбора данных согласно SOP MRI-1528 “Procedure for Observation of Animals”. Время смерти было задокументировано; любые животные, найденные мертвыми, были зарегистрированы в момент их обнаружения.

Предрасположение животного

День 1 исследования был днем воздействия зомана и лечения RYANODEX®. Все умершие крысы были найдены мертвыми (не подвергнуты эвтаназии в агональном состоянии). Указанное в протоколе число крыс составляло 8 выживших/группу, что не было достигнуто из-за смертности, связанной с высокой дозой зомана. Общая выживаемость составила 27 из 45 крыс, подвергшихся воздействию зомана (60%). См. таблицу 2.

Таблица 2

Группа Режим День смерти в исследовании Смертность /Всего (%) No. крыс, завершивших исследование A 10 мг/кг RYANODEX® через 50 мин 1 (3 крысы)^(a), 2, 15 5/10 (50%) 5 B 30 мг/кг RYANODEX® через 50 мин 1, 2, 3, 8 4/9 (44,4%) 5 C 10 мг/кг RYANODEX® через 20 мин 1, 15 2/8 (25%) 6 D 30 мг/кг RYANODEX® через 20 мин 1, 6, 11 3/9 (33%) 6 E Вода через 50 мин 1^(b), 2, 22, 23 4/9 (44,4%) 5 F Без воздействия/без лечения не предусмотрен 0/8 (0%) 8

(a) Одна крыса из группы А была найдена мертвой до получения мидазолама и RYANODEX®.

(b) Одна крыса из группы Е была найдена мертвой до получения воды.

Характеристики модели

Выживаемость: 27 из 45 крыс, подвергшихся воздействию зомана (60%) Время до начала судорожных припадков после инъекции зомана: 6,8 минут ± 1,93
Диапазон: 4-11 минут Время до максимальной оценки Расина^(a) после инъекции зомана: 8,4 минут ± 2,99
Диапазон: 4-17 минут Максимальная оценка по шкале Расина, полученная в день 1: 4,2 ± 0,59
Диапазон: 3-5 Клинические наблюдения судорожных припадков в течение 28-дневной фазы жизни: Несмотря на то, что крыс не наблюдали непрерывно, отдельные судороги по шкале 5 расина наблюдались у отдельных животных на протяжении всей фазы жизни. Масса тела в течение 28-дневной фазы жизни: Потеря массы тела на 15% произошла во всех группах после воздействия зомана; восстановление до контрольных уровней к дню исследования 25, за исключением животных с положительным контролем.

Нейроповеденческие тесты

Поврежденные зоманом области мозга включали гиппокамп, энторинальную, лобную и теменную кору. Эти области содержат структуры и нервную цепь для обучения, формирования памяти, обработки информации и других когнитивных процессов. Для оценки потенциальных нейропротективных эффектов RYANODEX®, крыс оценивали с использованием ряда установленных поведенческих тестов, которые требуют обучения, памяти, сенсорно-моторной интеграции и адаптационных реакций.

Были выбраны следующие тесты: 1) тест предпочтения сахарозы и 2) тест принудительного плавания.

Тест предпочтения сахарозы

Тест предпочтения сахарозы (SPT) использует естественную склонность крыс предпочитать сахарную воду обычной воде. Это общепринятый тест для измерения поведения в поисках удовольствия (гедония) или его отсутствия (ангедония) и требует, чтобы животные адаптировались к изменению в левом и правом размещении бутылок, содержащих водопроводную воду и 1% водный раствор сахарозы. SPT осуществили в дни исследования 14 и 15.

Крыс содержали индивидуально с доступом ad libitum к пище и воде (по одной бутылке с водой в каждой клетке) перед SPT. Для этапа акклиматизии SPT в домашнюю клетку каждой крысы помещали 2 бутылки с водой в течение 5-6 дней. Бутылки с водой были снабжены поилками, которые минимизируют утечку, и взвешивались примерно каждые 24 часа. После фазы акклиматизации одна бутылка с водой была заполнена приблизительно 200 мл 1% раствора сахарозы, а другая бутылка с водой приблизительно 200 мл водопроводной воды. Двадцать четыре часа спустя количество жидкости, оставшееся в каждой бутылке, регистрировали. Затем меняли Левое/Правое размещение бутылок, и количество жидкости, оставшейся в каждой бутылке, снова регистрировалось двадцать четыре часа спустя. Количество (мл) потребленного раствора сахарозы выражали в процентах от общего объема потребленной жидкости (вода с сахарозой плюс вода) за каждый из двух 24-часовых периодов и сравнивали по группам и дням.

Результаты SPT показаны на фиг. 2А и 2В. На второй день теста (день 15) группа положительного контроля (вода через 50 минут) не сохраняла предпочтения сахарозы, в отличие от 3 из 4 групп, получавших RYANODEX®.

Тест принудительного плавания

Тест принудительного плавания (FST) был разработан в конце 1970-х годов Porsolt как быстрый способ скрининга эффективности антидепрессантов у грызунов. Повышенная неподвижность, возникающая к концу 5-минутного FST у не получавших лечение («нормальных») грызунов, была интерпретирована как отражающая «поведенческое отчаяние», и ее изменение с антидепрессивными препаратами коррелировало с антидепрессивной эффективностью этих средств у человека. Тем не менее, конструктивная обоснованность этого теста ставится под сомнение по многим причинам, в том числе: 1) острые эффекты антидепрессантов проверяются при FST, тогда как у пациентов с клинической депрессией препараты требуют 4-6 недель для клинического улучшения; 2) зависимой переменной в FST является острый ответ животного на тест, а не характеристика животного; и 3) интерпретация плавающего поведения как «поведенческого отчаяния» является антропометрической. В настоящее время считается, что прогрессирующая неподвижность, наблюдаемая у не получавших лечение крыс, отражает адаптивный ответ на острый стресс, вызванный помещением в контейнер без возможности побега.

В FST плавательная активность и неподвижность измеряли в стеклянной цилиндрической камере (46 см В x 30 см Д), заполненной водой (высота 30 см, 25°C). Термометры использовали для того, чтобы температура воды была постоянной 24-26°С для всех животных. Были проведены два сеанса плавания, один в качестве начального 15 мин “предварительного теста”, за которым через 24 часа последовал второй 5-минутный “тест”. Cеансы тестирования записывали на видео. Время, проведенное в активном плавании, и время, проведенное в неподвижном состоянии, оценивалось для каждой минуты FST.

FST проводили в дни исследования 25 и 26. В день исследования 25 каждую крысу помещали в заполненный водой плексигласовый цилиндр на 15 минут. В день исследования 26 каждую крысу помещали обратно в заполненный водой плексигласовый цилиндр для 5-минутного теста. Время, проведенное в движении и неподвижности, оценивали для каждой крысы в течение каждой минуты теста. Результаты FST изображены на фиг.3. В группах, получавших лечение RYANODEX®, наблюдали ту же тенденцию, что и в группе с отрицательным контролем (без лечения), то есть прогрессивное увеличение времени, проведенного без движения в течение 5-минутной длительности теста.

Порядок проведения нейроповеденческих тестов

Порядок нейроповеденческих тестов проходил от наименее стрессовых до наиболее стрессовых. Два теста не проводили в один и тот же день. Все тесты проводили утром. Тесты проводили следующим образом (после дня исследования 1 в качестве дня провокации):

- На день исследования 8, тест предпочтения сахарозы (длится до 8 дней)

- На день исследования 25, тест принудительного плавания (длится 2 дня)

Порядок тестируемых животных был рандомизирован, и групповую идентичность крыс, проходящих оба теста, были замаскированы так, чтобы специалисты, проводившие эти тесты, были слепы по отношению к группе лечения. Оценку результатов тестирования проводили с использованием видеозаписей.

Эвтаназия и сбор и обработка тканей

Для каждой группы в день исследования 29 всех выживших крыс анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции целевых доз ≤200 мг/кг кетамина и ≤20 мг/кг ксилазина. Крыс перфузировали транскардиально гепаринизированным физиологическим раствором, а затем 0,4% параформальдегидом (протокол перфузии следует Rao, et al (2006). Сердце каждой крысы собирали и хранили в фиксаторе для возможной оценки.

После сбора ткани останки животных утилизировали в соответствии с SOP MRI-1526 “Disposal of Animal Carcasses and Medical Waste in the Spencer Animal Care Facility”.

Головной мозг оставляли в параформальдегидном фиксаторе в течение ночи при 4°C в течение по меньшей мере 4 дней, и затем отправляли в их индивидуальных флаконах, содержащих фиксатор, на пакетах со льдом в течение ночи в HSRL, Inc. для оценки. Каждый головной мозг равномерно разделяли на 7 срезов, как описано в Rao, et al (2014) and Bolon, et al (2013), для получения максимального анатомического представления всего головного мозга, включая области, о которых известно, что они подвержены воздействию зомана и других фосфорорганических нервно-паралитических веществ (например, пириформная кора, энторинальная кора, гиппокамп, миндалевидное тело, таламус, мозжечок). Срезы обычно обрабатывали, делали срезы по 5 мкм, погружали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином. Персонал работал с обезличенными данными по отношению к дозовым группам и лечению.

Невропатология

7 срезов головного мозга от каждой крысы оценивали под микроскопом с использованием полуколичественной 6-балльной системы. Микроскопические поражения оценивали по 6-балльной шкале:

0=в норме

1=1-5 пораженных клеток в 40X поле зрения микроскопа

2=6-20 пораженных клеток в 40X поле зрения микроскопа

3=21-50 пораженных клеток в 40X поле зрения микроскопа

4=50% - 80% пораженных клеток в 40X поле зрения микроскопа

5 = >80% пораженных клеток в 40X поле зрения микроскопа

В таблице 3 приведены данные патологии лобно-теменной коры с указанием доли животных в расчете на некроз по группам.

Таблица 3

Оценка некроза 0 1 2 3 4 5 Исследуемая группа В норме 1-5% некроз 6-20% некроз 21-50% некроз 51-80% некроз >80% некроз A: 10 мг/кг RYANODEX® 50 мин 20 40 20 20 0 0 B: 30 мг/кг RYANODEX® 50 мин 0 60 40 0 0 0 C: 10 мг/кг RYANODEX® 20 мин 34 50 0 17 0 0 D: 30 мг/кг RYANODEX® 20 мин 50 34 17 0 0 0 E: Вода 50 мин 20 0 0 60 20 0 F: нет заражения 100 0 0 0 0 0

Средние оценки некроза лобно-теменной коры показаны на фиг. 4.

Микрофотографии показаны на фиг. 5А и 5В. На фиг.5А представлена микрофотография животного из группы Е, положительный контроль, вода через 50 минут после начала SE. Стрелками отмечены обесцвеченные, сморщенные нейроны. Это животное получило оценку некроза 4. На фиг. 5В представлена микрофотография животного из группы D, 30 мг/кг RYANODEX® через 20 минут после начала SE. Стрелками отмечены нормальные нейроны. Это животное получило оценку некроза 0.

В таблице 4 показаны результаты микроскопической патологии. Животные группы F (без лечения) не имели существенных результатов. Группа Е (положительный контроль) ожидала результатов. Уменьшение объема некроза лобно-теменной коры у крыс, получавших лечение RYANODEX®, по сравнению с положительным контролем (группа Е) согласуется с литературными данными.

Таблица 4

Область мозга Средняя (SD) оценка патологии при некрозе A
10 мг/кг через 50 мин B
30 мг/кг через 50 мин C
10 мг/кг через 20 мин D
30 мг/кг через 20 мин E
Вода через 50 мин гиппокамп, CA3 1,4 (0,89) 1,0 (0,71) 0,8 (0,75) 1,8 (1,72) 0,8 (0,45) гиппокамп, CA2 4,8 (0,45) 4,2 (1,79) 3,5 (1,97) 4,7 (0,82) 5,0 (0,00) гиппокамп, CA1 4,4 (1,34) 4,8 (0,45) 3,7 (2,16) 4,7 (0,82) 5,0 (0,00) энторинальная кора 4,0 (1,73) 3,6 (2,19) 4,0 (1,10) 3,2 (2,48) 3,6 (1,14) лобно-теменная кора 1,4 (1,14) 1,4 (0,55) 1,0 (1,10) 0,7 (0,82) 2,6 (1,52) пириформная кора 0,4 (0,89) 0,8 (1,30) 0,8 (0,98) 0,3 (0,82) 0,4 (0,89) таламус 3,4 (1,69) 3,0 (0,00) 2,3 (1,03) 3,7 (0,52) 4,2 (0,04)

Выводы

В целом, животные, получавшие лечение RYANODEX®, показали лучшие результаты в нейроповеденческих тестах по сравнению с животными, не получавшими лечения. Животные, получавшие лечение RYANODEX®, показали более низкий уровень некроза клеток в коре головного мозга по сравнению с животными, не получавшими лечения. Животные, получавшие лечение RYANODEX®, показали дозозависимый и зависящий от времени эффект лечения, влияющий на гибель клеток. Эти нейроповеденческие тесты и результаты по нейропатологии совместимы и, по-видимому, напрямую связаны. RYANODEX® хорошо переносился во всех группах, и никаких новых сигналов по безопасности не наблюдалось.

Пример 2

Обзор исследования

Цель исследования состояла в определении, обладает ли RYANODEX® нейропротекторными эффектами в модели выживаемости у крыс с введением GD (зоман). Разовые дозы 10 или 30 мг/кг RYANODEX® вводят путем болюсной инъекции в/в через 20 или 60 минут после начала судорожных припадков, вызванных зоманом. Выживаемости будет способствовать лечение азоксим хлоридом (HI-6) за тридцать минут до подкожной (п/к) инъекции зомана, атропин метилнитратом через одну минуту после п/к инъекции зомана и атропин сульфатом, пралдоксим хлоридом (2-PAM-Cl) и мидазоламом через двадцать минут после начала индуцированных зоманом судорожных припадков, которые достигают уровня по шкале Расина по крайней мере 3. Контроли включают две отдельные группы: одну группу, не получавших лечение (наивных) крыс (отрицательный контроль), и другую группу, которая получает или стерильную воду или стерильную воду плюс носитель маннит, через 60 минут после начала индуцированных зоманом судорожных припадков.

На день 2 всех крыс умерщвляют под наркозом путем обескровливания и внутрисердечной перфузии. У каждой крысы собирают мозг для микроскопического нейропатологического исследования, и сердце собирают у каждой крысы для исследования возможной патологии.

Экспериментальные субъекты представляли собой >8-недельных самцов крыс линии Спрег-Доули (Charles River Laboratories) с канюлированной яремной веной, массой 300-500 г в день воздействия.

Материалы

Зоман (GD)- разбавленный 0,9% хлоридом натрия. Зоман представляет собой фосфорорганическое вещество нервно-паралитического действия, которое деактивирует ацетилхолинэстеразу (AChE), образуя аддукт с ферментом.

• Химическое название: пинаколил метилфосфонофторидат

• Формула: C₇H₁₆FO₂P

• Молекулярная масса: 182,17

• MRIGlobal Lot#: GD090415-DOC-1

• ID основного стандарта: 13972-49-3

• Чистота: 100%

• Условия хранения: <4°C

Терапии, способствующие выживанию в этой модели: 1) азоксим хлорид (HI-6); 2) стропин метил нитрат; 3) стропина сульфат; 4) пралдоксима хлорид; 5) мидазолам. HI-6 является реактиватором AChE, который может вытеснять органофосфаты, такие как зоман, из ацетилхолинэстеразы (AChE) и тем самым реактивировать фермент. Атропин сульфат является центральным действующим конкурентным и обратимым антагонистом мускариновых ацетилхолиновых рецепторов; атропин метилнитрат является периферически действующим конкурентным и обратимым антагонистом мускариновых ацетилхолиновых рецепторов; оба они используются клинически для противодействия острому холинергическому синдрому, вызванному зоманом и другими фосфорорганическими нервно-паралитическими веществами. Мидазолам предствляет собой бензодиазепины для лечения судорожных припадков. Эти средства выбраны потому, что оксимы, атропин и бензодиазепины представляют собой общепринятое клиническое лечение острой токсичности от нервно-паралитического вещества/фосфорорганического вещества. Схема из трех препаратов, состоящая из пралидоксима (реактиватор AChE), атропина и диазепама (бензодиазепин), в настоящее время является одобренной FDA контрмерой для военнослужащих.

HI-6: Химическое название: [(E)-[1-[(4-карбамоилпиридин-1-иум-1-ил)метоксиметил]пиридин-2-илиден]метил]оксоазаниум;метансульфонат (азоксим хлорид)

Структура:

Формула: C₁₄H₁₆Cl₂N₄O₃

Молекулярная масса: 359,207

Атропин метилнитрат: Химическое название: (8,8-диметил-8-азонийбицикло[3.2.1]октан-3-ил)-3-гидрокси-2-фенилпропаноат;нитрат

Структура:

Формула: C₁₈H₂₆N₂O₆

Молекулярная масса: 366,414

Мидазолам: Химическое название: 8-хлор-6-(2-фторфенил)-1-метил-4Н-имидазо[1,5-a][1,4]бензодиазепин

Структура:

Формула: C₁₈H₁₃ClFN₃

Молекулярная масса: 325,771

RYANODEX® (дантролен натрия) представляет собой одобренное FDA лекарственное средство для лечения злокачественной гипертермии в сочетании с соответствующими поддерживающими мерами и для профилактики злокачественной гипертермии у пациентов с высоким риском.

Дантролен натрия: Химическое название: гидрат 1-[[[5-(4-нитрофенил)-2-фуранил]метилен]амино]-2,4-имидазолидиндиона натриевой соли

Структура:

Молекулярная масса: 399

Эксципиенты: маннит (25 мг/мл), полисорбат 80 (5 мг/мл); повидон К12 (0,8 мг/мл

5% раствор маннита: 5% раствор маннита (в стерильной воде)

Формула: C₆H₁₄O₆

Животные

Для этого исследования в исследовании используют 120 самцов крыс линии Спрег-Доули (плюс 20 дополнительных/замен в общей сложности 140; Charles River Laboratories), возрастом > 8 недель и массой 300-500 г с сосудистыми катетерами в яремной вене, имплантированными поставщиком. Крыс идентифицируют по хвостовой метке или ушной бирке с уникальным буквенно-цифровым обозначением. (см., например, SOP MRI-1504, “Procedure for Identification of Animals and Cages”).

Все крысы, включенные в исследование, имеют удовлетворительное состояние, без каких-либо признаков клинического заболевания и имеют проходимые катетеры, подходящие для дозирования в начале исследования. После доставки животных осматривают на наличие признаков ухудшения состояния здоровья и помещают на карантин в обычное помещении для животных не менее чем на 48 часов. Ветеринар проверяет здоровье животных и выпускает их для исследования (см., например, SOP MRI-1501, “Acclimation and/or Quarantine Procedures for Animals”). Животных взвешивают в течение трех дней после доставки. В течение периода со дня после прибытия животных в течение всего исследования сотрудники обрабатывают крыс не менее двух раз в день для акклиматизации и систематичности на протяжении всего исследования.

Всем крысам предоставляют сертифицированный для грызунов лабораторный корм, с указанием источника, номера партии и сертификата анализа, ad libitum. Никаких загрязняющих веществ, которые могли бы повлиять на результаты исследования, в корме не присутствует, что подтверждается сертификатом анализа (для каждой партии, предоставленной поставщиком; см., например, SOP MRI-1510, “Procedure for Feeding Animals”). Бутылки с водой (одна бутылка с водой/клетку) обеспечивают водопроводной водой на протяжении всего исследования.

Животных содержат в поликарбонатной клетке Tecniplast с проволочной крышкой (Tecniplast, Phoenixville, PA) в течение периода акклиматизации/карантина и жизни. Животных размещают отдельно для предотвращения повреждения катетеров. Крыс содержат в помещениях с контролируемым микроклиматом, по меньшей мере, с 10 заменами воздуха в час. В комнатах поддерживают температуру от 20°С до 26,11°С и относительную влажность 50%±20% с 12-часовым циклом свет/темнота в сутки. Комнатную температуру, влажность и циклы освещения (12 часов:12 часов, переменные свет/темнота) контролируют с помощью системы мониторинга AmegaView 24 часа в сутки или с помощью гигротермографа во время исследования (см., например, SOP MRI-1170, “Temperature and Humidity Monitoring in Animal Rooms”).

Дозы

HI-6, зоман, атропина сульфат, атропин метилнитрат, 2-PAM Cl и мидазолам: Разовые дозы HI-6 (в/б, 125 мг/кг); зоман (п/к, 154 мкг/кг, 1,4 x LD₅₀), атропин метилнитрат (в/м, 2 мг/кг); атропина сульфат (0,45 мг/кг), 2-PAM Cl (25 мг/кг), и мидазолам (в/м, 1,8 мг/кг) выбирают на основе предыдущего опыта с моделью. Включение HI-6, атропин метилнитрат, и мидазолам необходимы для обеспечения адекватного выживания. Ожидается, что этот режим вызовет судороги, при которых оценка по шкале Расина составит по меньшей мере 3 и приемлемое количество выживших для последующего исследования.

RYANODEX®: При оценке переносимости однократной дозы у крыс внутривенные болюсные дозы 12, 40 и 60 мг/кг RYANODEX® дают отдельным группам крыс с канюлированной яремной веной. Дозы RYANODEX® 10 и 30 мг/кг у крыс эквивалентны человеческим дозам приблизительно 2 и 6 мг/кг, соответственно.

Схема дозирования

В общей сложности 120 плюс до 20 дополнительных самцов крыс линии Спрег-Доули с катетерами в яремных венах, имплантированными продавцом, использовали в 6 группах, как показано в таблице, ниже. Количество животных составляет 20 в группах. Все распределения по группам будут распределены случайным образом с условием, что каждая дозовая группа будет представлена по крайней мере одним животным в каждой группе животных.

Таблица. Присвоение вида лечения по группам

Группа Предварительное введение HI-6 (в/б, за 30 минут до заражения GD) зоман “GD” (п/к) атропин метилнитрат (в/м, 1 мин после GD) мидазолам (в/м, ~20 минут после начала судорожной активности) RYANODEX® в/в через 20 или 60 минут после начала припадков A (n=20) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 60 мин с 10 мг/кг B (n=20) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 60 мин с 30 мг/кг C (n=20) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 20 мин с 10 мг/кг D (n=20) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг 20 мин с 30 мг/кг E (n=20) 125 мг/кг 154 мкг/кг (1,4 x LD₅₀) 2,0 мг/кг 2,0 мг/кг Стерильная вода (контроль) или стерильная вода+маннит (контроль) через 50 мин F (N=20) 0 мг/кг 0 мкг/кг 0 мг/кг 0 мг/кг NA

Примечание: для групп C и D, RYANODEX® давали сразу после инъекции мидазолама.

Получение дозы

GD получали в ледяном 0,9% хлориде натрия согласно, напимер, SOP MRI-5821 “Preparation of Standards and Samples from Research Development and Testing Evaluation (RDTE) Dilute Solutions”.

RYANODEX® получают путем добавления 5 мл стерильной воды для инъекций (без бактериостатического агента) в один флакон с лиофилизированным продуктом.

HI-6 получают до концентрации 250 мг/мл путем добавления стерильного 0,9% солевого раствора в ампулу шприца.

Атропин метилнитрат получают до концентрации 4 мг/мл путем добавления стерильной воды для инъекций (WFI) в ампулу шприца.

Атропина сульфат получают до концентрации 0,8 мг/мл стерильным физиологическим раствором.

2-PAM Cl получают до концентрации 100 мг/мл стерильным физиологическим раствором.

Атропина сульфат и 2-PAM Cl затем смешивают 1:1 и вводят внутримышечно в дозе 0,5 мл/кг.

Мидазолам закупают у поставщика в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл и вводят, как есть.

План исследования

Подготовка животных

До или в день исследования 1 (день воздействия GD) крыс переводят в место проведения исследования.

Дозирование

В день исследования 1 всех животных взвешивали с точностью до грамма, и все дозы для лечения рассчитывали на основе этих масс. Группы A-E получали реактиватор холинэстеразы, HI-6 (125 мг/кг) внутрибрюшинным (в/б) путем за 30 минут до заражения GD. Все крысы в группах A-E подвергались воздействию GD (154 мкг/кг (308 мкг/мл) или ~1,4 x LD₅₀) путем одной подкожной инъекции. Примерно через одну минуту после инъекции GD для групп A-E вводили путем внутримышечного введения атропин метилнитрат (AMN) (2,0 мг/кг). Примерно через 20 минут после начала судорожной активности после воздействия GD, как определено в таблице выше, все животные в группах A-E получали атропина сульфат (0,45 мг/кг), смешанный с 2-PAM-Cl (25 мг/кг) внутримышечно, и получали мидазолам в дозе 1,8 мг/кг внутримышечно. Группа F не получала ни HI-6, ни GD, ни AMN, ни мидазолам, ни RYANODEX®. RYANODEX® вводили с помощью микрошприца Hamilton 100 мкл или шприца с наконечником Люэр-Лок (1 см³), в зависимости от объема дозы, которая будет вводиться, затем катетер промывали по меньшей мере 0,2 мл стерильной воды для инъекций для обеспечения полной доставки в вену.

Инициацию судорожной активности определяли баллом “3” по шкале Расина, как описано ниже:

1= иммобилизация и фиксация взгляда

2= качание головой, “отряхивание мокрой собаки”

3= клонус передних конечностей, ритмичное стучание ушей, сопровождаемое миганием глаз и лицевым клонусом

4= билатеральный клонус передних конечностей

5= билатеральный клонус передних конечностей, подъем на задние лапы и потеря равновесия

Если крыса не достигает этого балла “3” примерно через 20 минут после воздействия GD, ее заменяли в исследовании.

Как показано в таблице, выше, крысы в группах A и C получали дозу 10 мг/кг RYANODEX® в/в и крысы в группах B и D получали дозу 30 мг/кг RYANODEX® в/в через 60 или 20 минут после начала судорожных припадков (по шкале Расина «3»). Крысам группы E вводят контроль (стерильная вода или 5% раствор маннита (количество маннита, доставляемого дозой 30 мг/кг RYANODEX) в стерильной воде для инъекций) в/в в объеме, сопоставимом с максимальной дозой RYANODEX® через 60 минут после начала судорожных припадков.

Примерно через 6 часов после контрольного заражения GD для групп A-E, крысам вводят 5 мл раствора Рингера с лактатом, чтобы помочь восстановлению.

Массы тела

Массы тела регистрируют для каждого животного при исследовании в течение первых 72 часов после получения от поставщика, а затем снова в дни исследования 1 и и 2. Любое животное, которое не набирает массу между первым взвешиванием при получении и взвешиванием в день исследования 1, заменяли.

Клинические наблюдения

Наблюдения за общим состоянием здоровья проводят ежедневно в течение периода карантина и акклиматизации. Животных осматривают дважды в день в течение всего периода карантина и акклиматизации, а также в течение всей жизни. В день исследования 1 крыс обследуют и взвешивают до воздействия. После воздействия GD крыс постоянно контролировали для документирования первоначального появления судорожных припадков. После введения мидазолама, RYANODEX® и/или контрольного раствора животных обследуют через 1, 2, 4 и 6 часов после начала судорожных припадков и по меньшей мере один раз в день эвтаназии. Клинические наблюдения, включая сгорбленную позу, обезвоживание, грубую шерсть и отсутствие аппетита, оценивают и записывают. Оценку по шкале Расина регистрируют в каждой точке наблюдения, при необходимости. Любые другие патологические клинические наблюдения также регистрировали в это время в журнале для исследования или в соответствующей форме сбора данных согласно, например, SOP MRI-1528 “Procedure for Observation of Animals”. Время смерти документировали; любых животных, найденных мертвыми, регистрировали в момент их обнаружения.

Эвтаназия и сбор и обработка тканей

Для каждой группы в день исследования 2 всех выживших крыс подвергают общей анестезии с помощью внутрибрюшинной инъекции >75 мг/кг раствора пентобарбитала. Крыс перфузируют транскардиально гепаринизированным физиологическим раствором, затем 0,4% параформальдегидом или 10% нейтральным забуференным формалином (протокол перфузии следует Rao, et al (2006). Сердце каждой крысы собирают и хранят в фиксаторе для возможной оценки.

После сбора ткани останки животных утилизируют в соответствии с, например, SOP MRI-1526 “Disposal of Animal Carcasses and Medical Waste in the Spencer Animal Care Facility”.

Мозг хранят в течение ночи при 4°C в параформальдегиде, на следующий день его откачивают и заменяют холодным PBS и содержат при 4 C в течение ночи. На следующий день PBS сливают и заменяют 10% раствором сахарозы и хранят при 4°С в течение ночи, а затем переносят в 10% нейтральный забуференный формалин на ночь. В качестве альтернативы, мозг оставляют в 10% формалиновом фиксаторе в течение по крайней мере 4 дней при комнатной температуре и затем извлекают. Каждый головной мозг равномерно разделить на 7 срезов, как описано в Rao, et al (2014) и Bolon, et al (2013), для получения максимального анатомического представления всего головного мозга, включая области, о которых известно, что они подвержены воздействию зомана и других фосфорорганических нервно-паралитических веществ (например, пириформная кора, энторинальная кора, гиппокамп, миндалевидное тело, таламус, мозжечок). Срезы обычно обрабатывают, делают срезы по 5 мкм, погружают в парафин и окрашивают гематоксилином и эозином. Персонал работает с обезличенными данными по отношению к дозовым группам и лечению.

Невропатология

7 срезов головного мозга от каждой крысы оценивают под микроскопом с использованием полуколичественной 6-балльной системы. Микроскопические поражения оценивают по 6-балльной шкале.

Нейроповеденческие тесты

Необязательно до эвтаназии, но после дня 1 воздействия GD, крыс подвергают нейроповеденческим тестам, таким как описанные в Примере 1.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способам защиты субъекта-человека от нейронального некроза после воздействия на субъекта-человека органофосфатного нервно-паралитического вещества, защиты субъекта-человека от снижения функции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, к способам профилактики эпилептического статуса и профилактики изменений поведения, возникающих вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, к способу защиты субъекта-человека от дисфункции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества. Способ защиты субъекта-человека от нейронального некроза после воздействия на субъекта-человека органофосфатного нервно-паралитического вещества включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Способ защиты субъекта-человека, подвергшегося воздействию органофосфатного нервно-паралитического вещества, включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Способ защиты субъекта-человека от снижения функции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Способ профилактики эпилептического статуса включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Способ защиты субъекта-человека от дисфункции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Способ профилактики изменений поведения, возникающих вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включает введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества. Вышеописанная группа изобретений позволяет проводить эффективную профилактику и защиту от воздействия нервно-паралитических веществ. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 2 пр.

1. Способ защиты субъекта-человека от нейронального некроза после воздействия на субъекта-человека органофосфатного нервно-паралитического вещества, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

2. Способ по п. 1, где лобно-теменная кора, гиппокамп и/или таламус защищена от нейронального некроза.

3. Способ защиты субъекта-человека, подвергшегося воздействию органофосфатного нервно-паралитического вещества, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

4. Способ защиты субъекта-человека от снижения функции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

5. Способ профилактики эпилептического статуса, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

6. Способ защиты субъекта-человека от дисфункции центральной нервной системы, возникающей вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

7. Способ профилактики изменений поведения, возникающих вследствие воздействия органофосфатного нервно-паралитического вещества, включающий введение субъекту-человеку фармацевтической композиции, содержащей от 1 мг/кг до 30 мг/кг дантролена или его фармацевтически приемлемой соли и 125 мг/кг азоксим хлорида, 2 мг/кг атропин метилнитрата и 2 мг/кг мидазолама;

где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду;

где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку через 24 часа или менее после воздействия на субъекта нервно-паралитического вещества.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нервно-паралитическое вещество представляет собой O-пинаколилметилфосфонофторидат (зоман), этил N,N-диметилфосфорамидоцианидат (табун), пропан-2-ил метилфосфонофторидат (зарин), циклогексил метилфосфонофторидат (циклозарин) или 2-(диметиламино)этил (GV).

9. Способ по любому из пп. 1-8, где нервно-паралитическое вещество представляет собой О-циклопентил S-(2-диэтиламиноэтил) метилфосфонотиолат (ЕА-3148), (S)-(этил{[2-(диэтиламино)этил]сульфанил}(этил)фосфинат) (VE), О,О-диэтил S-[2-(диэтиламино)этил]фосфоротиоат (VG), S-[2-(диэтиламино)этил] О-этилметилфосфонотиоат (VM), N,N-диэтил-2-(метил-(2-метилпропокси)фосфорил)сульфанилэтанамин (VR) или этил ({2-[бис(пропан-2-ил)амино]этил}сульфанил)(метил)фосфинат (VX).

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармацевтическую композицию вводят субъекту-человеку в одной или нескольких дозах.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармацевтическую композицию вводят после введения реактиватора ацетилхолинэстеразы.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармацевтическую композицию вводят после введения реактиватора ацетилхолинэстеразы и после введения обратного антагониста ацетилхолиновых рецепторов.

13. Способ по п. 12, где фармацевтическую композицию вводят одновременно или по существу одновременно с введением противосудорожного средства.

14. Способ по п. 12, где фармацевтическую композицию вводят после введения противосудорожного средства.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармацевтическую композицию вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутрикостно или трансдермально.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармацевтическая композиция содержит дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, маннит, полисорбат, повидон, необязательный регулятор рН и воду.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где введение фармацевтической композиции, содержащей дантролен или его фармацевтически приемлемую соль, приводит к улучшению нейроповеденческих характеристик по сравнению с субъектом-человеком, подвергнутым воздействию нервно-паралитического вещества, которому не вводили фармацевтическую композицию, содержащую дантролен или его фармацевтически приемлемую соль.