Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза Российский патент 2021 года по МПК C12N5/77 A61F2/30 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, стоматологии, пластической хирургии, травматологии и ортопедии.

Уровень техники

Формообразование – процесс образования новых органных и тканевых структур, воссоздающих заново изначальную форму любого поврежденного органа, в том числе, любого органа опорно-двигательного аппарата. Возможность такой органотипичной репаративной регенерации крайне важна для практической медицины. Восстановить утраченную краевую часть кости или хряща существенно труднее, чем внутренний дефект органа, окруженный интактными собственными скелетными тканями. Спонтанная или естественная репаративная регенерация скелетных соединительных тканей с восстановлением первоначальной формы и целостности органа при краевых дефектах, захватывающих надхрящницу или надкостницу у млекопитающих и человека крайне ограничена, отсутствуют естественные механизмы спонтанной регенерации.

Костнопластические материалы позволяют проявить регенерационную способность млекопитающим, но в случае краевых дефектов часто мало эффективны, особенно при большом объеме потери скелетных тканей. Регенерирующая кость с одного края хуже проникает в костнопластические материалы, а окружающие собственные соединительные ткани - лучше, соответственно собственно соединительные ткани не оставляют места регенерирующим скелетным - остеогенез нарушается. Чтобы избежать прорастания волокнистой соединительной ткани при регенерации альвеолярных отростков челюсти и восстановления утраченных периодонтальных тканей в костнопластические материалы, стимулирующие остеоиндуктивный и остеокондуктивный остеогенез, широко используют направленную тканевую регенерацию (НТР, GTR) – методику восстановления утраченной костной ткани для установки имплантатов зубов, а также при заболеваниях пародонта. В настоящее время известны разные способы направленной тканевой регенерации, но наиболее востребована и распространена мембранная. Мембрана является барьером, который размещается между костной и параоссальными тканями. Такое ее расположение способно предотвратить распространение мягких тканей между гранулами или частицами костнопластического материала и создать условия для остеогенеза.

Одной из стратегий регенеративной медицины является наращивание (расширение in vitro) клеточной массы, например, клеток соединительной ткани (к этим клеткам относятся остеоциты и хондробласты) в лабораторных условиях. Однако, адгезивные клеточные культуры имеет существенный недостаток – условия культивирования существенно отличаются от живого организма, клетки начинают адаптироваться к питательной среде, газовому составу и взаимодействовать с дном культурального флакона, и происходит постепенная утрата этими клетками своей органоспецифичности.

Не выяснено и нет общего мнения об оптимальном количестве остеоцитов или хондроцитов, необходимых для заполнения дефекта тканей опорно-двигательного аппарата. Недостатки метода двухмерные системы культур клеток 2D (two-dimensional cell culture systems) в адгезивных клеточных культурах являются: значительное изменение экспрессии генов при адаптации in vitro, генетическая и фенотипическая нестабильность клеток, изменение клеточных ответов на действие цитокинов (нарушение межклеточной передача сигналов), снижение или изменение ключевых функций, истощение потенциала к дифференцировке при пассировании, замещение клетками волокнистой соединительной ткани, доминирование клеток, рассеивание клеток и не участие в регенеративных гистогенезах при обратной трансплантации.

Изолированные и размноженные в культуре аутологичные клетки скелетных тканей не могут производить полноценный внеклеточный матрикс при реплантации и, соответственно, таким живым материалом восстановить полноценную кость или суставной хрящ становится невозможно.

Разработка биочернил для биопринтинга и строительных блоков для тканевой инженерии сформировали новое направление в методе клеточных культур – культивирование в трехмерных системах (3D, three-dimensional cell culture systems) – биотехнологии производства клеточных сфероидов.

Известны технологии использования сфероидов, полученных из собственных клеток хряща, состоящих из расширенных в культуре аутологичных хондроцитов и связанных с ними внеклеточного матрикса (Spherox™ или Chondrosphere ™) форма ACI для восстановления дефектов 4–10 см², которая представлена как персонифицированная клеточная терапия дефектов гиалиновых хрящей суставов человека (Becher, C.; Laute, V.; Fickert, S. et al. Safety of three different product doses in autologous chondrocyte implantation: Results of a prospective, randomised, controlled trial. J. Orthop. Surg. Res. 2017, 12, 71).

Известен способ производства трехмерных живых хрящеподобных микротканей in vitro и их применения в качестве трансплантационного материала (US7887843 B2). Данный способ включает в себя получение клеточных сфероидов из культивированных хондроцитов суставного хряща в 96-ти луночных планшетах из неадгезивного пластика.

Одним из перспективных источников клеток для регенерации скелетных хрящевых тканей являются хондроциты, полученные из хряща носа взрослого человека. Было обнаружено, что взрослые хондроциты, полученные из носового хряща взрослого человека, обладали большей способностью к выработке коллагена II и глюкозаминогликанов, чем суставные хондроциты, при длительном культивировании, также хондроциты хрящей носа обладают более высоким пролиферативным потенциалом по сравнению с хондроцитами, забранных из суставного хряща колена взрослого человека. Существенным недостатком этого способа является ограниченное количество забираемого для выделения клеток исходного материала, которое можно получить из хряща перегородки носа, не создав заметный косметический дефект, что приводит к необходимости длительного культивирования клеток для накопления нужной биомассы клеток, в процессе формирования сфероидов происходит постепенная гибель клеток, сфероиды уменьшаются в размерах (Stuart MP Matsui RAM, Santos MFS, Côrtes I et al. Successful Low-Cost Scaffold-Free Cartilage Tissue Engineering Using Human Cartilage Progenitor Cell Spheroids Formed by Micromolded Nonadhesive Hydrogel// Stem Cells Int. . - 2017 г).

Известен способ эктопического формирования кости in vivo с использованием клеток, полученных из надкостницы человека, высеянных на носителе Collagraft ™. Образование костей происходило через восемь недель, когда на носители Collagraft ™ загружали не менее одного миллиона клеток надкостницы и имплантировали подкожно мышам NMRI nu/nu. Был обнаружен костный матрикс de novo, в основном секретируемый клетками надкостницы, в непосредственной близости от гранул фосфата кальция, этот минерал инициировал «остеоиндуктивную программу». Действительно, удаление гранул фосфата кальция путем декальцификации этилендиаминтетрауксусной кислоты до посева и имплантации клеток приводило к потере образования кости. Этот способ формирования кости аналогичен модели, наблюдаемой во время физиологического внутримембранозного развития кости, и может иметь значение при исследований стратегий тканевой инженерии. Недостатком способа является большая длительность остеогенеза и неясность с интеграцией конструкции с окружающими и интактной костной тканью (Eyckmans J. et al. A clinically relevant model of osteoinduction: a process requiring calcium phosphate and BMP/Wnt signalling. J Cell Mol Med. 2010 Jun; 14(6b): 1845–1856. Published online 2009 Jun 16). 

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является способ масштабируемого производства микросфероидов из клеток надкостницы мышей, формирование этих сфероидов происходит в дифференцировочной среде, клетки этих сфероидов дифференцируются в процессе и образуют клеточный агрегат, который назван авторами органоидом костной мозоли (каллусные органоиды). Эти органоиды по своей структуре и форме являются сфероидами, при трансплантации достигают автономии и обладают способностью запускать образование эктопических костных разрастаний in vivo за счет энхондрального остеогенеза. Органоиды каллуса в искусственных условиях самопроизвольно биоорганизуются in vitro в относительно крупные тканеинженерные ткани, способные лечить дефекты длинных костей критического размера у мышей. Восстановленная кость проявляет морфологические свойства, сходные с таковыми у голени. Эти каллусные органоиды можно рассматривать как живые «био-чернила», позволяющие производить многомодульные ткани снизу вверх со сложными геометрическими особенностями и встроенными качественными признаками (Nilsson Hall G, Mendes L., Gklava C. et al. Developmentally Engineered Callus Organoid Bioassemblies Exhibit Predictive In Vivo Long Bone Healing/ Advanced Science, (Weinh). 2020 Jan; 7(2): 1902295. Published online 2019 Dec 10. doi: 10.1002/advs.201902295 PMCID: PMC6974953).

В этом способе были созданы клеточные микросфероиды (состоящие из 250 клеток), диаметр которых не превышал бы 150 мкм, чтобы соответствовать шкале длины, по которой могут транспортироваться диффузные сигналы, и имитировать начальное событие развития формирования ростовой пластинки (конденсация), в результате чего лишь нужны немногие сотни клеток. Во время дифференцировки клетки подвергались каскаду молекулярных и клеточных событий, которые отражают эндохондральное окостенение, позволяя им трансформироваться из клеточных сфероидов в полуавтономные структуры микротканей, каллусные органоиды, способные подвергаться органогенезу. Кроме того, сборка органоидов каллуса в более крупные тканевые структуры привела к имплантатам, содержащим активные регенеративные компоненты по всей их структуре. Надо отметить, что размер сфероидов диаметром 150 мкм крайне затрудняет работу с ними при обратной трансплантации.

Главным недостатком способа является невозможность васкуляризация подобных живых имплантатов размером более сантиметра. Хотя хондроциты обладают устойчивостью к стрессовым условиям, обнаруженным в месте имплантации, таким как гипоксия и низкая доступность питательных веществ, ожидается, что васкуляризация будет необходимым и главным условием для выживания клеток в таких крупных имплантатах. То, что удалось продемонстрировать остеогенез на мыши in vivo, будет невозможно воспроизвести на более крупной животной модели.

Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления скелетных соединительных тканей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанной проблемы.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из клеток надкостницы для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности, суставного хряща и кости.

Техническим результатом данного изобретения является разработка нового способа получение трансплантата на основе клеточных сфероидов из клеток надкостницы, обладающих выраженным регенеративным потенциалом, для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности, суставного хряща и/или кости, важным моментом является способность таких сфероидов участвовать в развитии как костной, так и хрящевой тканей, в зависимости от состава локальной среды регенерации. Особенностью такого способа производства сфероидов в агарозных микролунках является то, что данный способ не сопровождается гибелью клеток. Жизнеспособность сфероидов оценивалась с помощью метода LIVE/DEAD^® на всех сроках культивирования сфероидов в агарозных лунках. Кроме того, способ по изобретению исключает необходимость использования дифференцирующих хондрогенных или остеогенных сред, замедляющих наращивание клеточной биомассы. Помимо этого, способ по изобретению позволяет получить трансплантат на основе сфероидов, которые не требуют дополнительной дифференцировки и готовы к трансплантации. Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает минимально инвазивный забор надкостницы, например, с реберного хряща субъекта, миниоперация проводится в амбулаторных условиях под местной анестезией.

Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из надкостницы быстрее и большего объема, по сравнению со сфероидами из более дифференцированных клеточных элементов скелетных тканей - остеоцитов и хондробластов. Использование трансплантата по изобретению на основе более крупных сфероидов из надкостницы облегчает их трансплантацию, а восстановление скелетных соединительных тканей происходит быстро и эффективно. Репаративная регенерация скелетных соединительных тканей происходит из камбиальных (прогениторных и стволовых) клеток надкостницы, из которых выращены клеточные сфероиды. При этом, используя трансплантат на основе сфероидов по изобретению для трансплантации, удалось получить ткань, характеризующуюся высокой степенью васкуляризации при трансплантации.

Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановления скелетных соединительных тканей, включая суставные поверхности, субъекта на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, включающий следующие этапы:

а) выделение клеток из камбиального слоя надкостницы субъекта;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки;

в) перенесение клеток, полученных на стадии б) в агарозные лунки;

г) слияние клеток в клеточные сфероиды.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека. В частных вариантах воплощения изобретения скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или хрящ, в частности суставной хрящ.

В частных вариантах воплощения изобретения размер клеточных сфероидов составляет 200-450 мкм. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения надкостница представляет собой надкостницу собственного реберного хряща и/или кости голени субъекта.

В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии в) осуществляется из расчета 5 000 - 20 000 клеток на 1 (одну) лунку агарозного планшета.

В частных вариантах воплощения изобретения слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляется в агарозных лунках, где они пребывают до 7 дней.

Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления скелетных соединительных тканей, включающему клеточные сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и полученные способом по изобретению.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

В частных вариантах воплощения изобретения скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или суставной хрящ.

В частных вариантах воплощения изобретения размер клеточных сфероидов составляет 200-450 мкм. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает дополнительный компонент, в частности, альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты вместе с биологически активными веществами, влияющими на клеточную дифференцировку в остеогенном или хондрогенном направлении.

Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет применения аутологичных клеток надкостницы субъекта для получения трансплантата в виде клеточных сфероидов.

Определение и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.

Используемый в данном документе термин «дефект» относится к хрящевой или костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект скелетных соединительных тканей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы.

Термин «среда» относится к питательной культуральной среде, предназначенной для культивирования сфероидов по изобретению, к примеру среда может быть выбрана из сред с эмбриональной телячьей сывороткой или тромболизатов для культивирования клеток.

Термин «адгезивная культура» в настоящем документе означает монослойную культуру клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу, при наличии определенных условий эти клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме будут делиться и распространяться таким способом.

Клетки камбиального слоя надкостницы содержат скелетогенные клетки – остеобласты, преостеобласты и стволовые скелетогенные клетки.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. Сфероиды, согласно изобретению, характеризуются размером 200-450 мкм, в частных вариантах воплощения изобретения 250 мкм.

Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» — это процесс пересадки указанного трансплантата на основе сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта скелетных соединительных тканей.

Трансплантат по изобретению включает сфероиды из аутологичных клеток надкостницы, полученные согласно способу по изобретения, наряду с этим трансплантат опционально включает, по меньшей мере, один дополнительны компонент. Так, в частности, таким компонентом может быть альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты (указанный гель может быть получен, в частности, способом описанным в Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al/ In vivo engineering of organs: The bone bioreactor/ PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl₂ в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл. В частных вариантах, гель на основе ГК, HA (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГА получают смешиванием равных объемов 2% (мас./об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) включают в количестве (0,4 моль/литр) во время гелеобразования. Кроме того, трансплантат, может содержать физиологически приемлемый носитель, который, в частности, представляет собой Ham's F12 культуральная среда, базовая, CLS. В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат может содержать комплекс NCTF® (компания LABORATOIRES FILORGA).

Подробное раскрытие изобретения

В качестве источника клеток скелетных соединительных тканей для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используются клетки внутреннего слоя надкостницы, являющиеся для скелетных соединительных тканей камбиальной зоной, поставляющей прогениторные и стволовые клетки для физиологической и репаративной регенерации, следовательно, содержащая большее количество прогенеторных клеток. При формировании сфероидов из клеток надкостницы и их последующем росте в агарозных лунках по изобретению не происходит уменьшения их диаметра, что труднопреодолимо для более дифференцированных соединительнотканных клеток хондрогенного или остеогенного дифферона, полученных из хрящей или костей. Одним из преимуществ этой технологии —достижение плотности клеток на единицу объема, сопоставимую с плотностью клеток в органах. В силу отсутствия контакта с внешним внеклеточным матриксом и без индукторов дифференцировки в сфероидах клеточный рост не сопровождается повышением уровня дифференцировки клеток.

Забор клеток надкостницы осуществляется малоинвазивным методом. Проводится местная анестезия кожи, подкожной клетчатки и надкостницы. Через меленький разрез, достигаем надкостницы, с помощью иглы с физиологическим раствором отделяет надкостницу от ребра, наполняем пространство между компактной костью ребра и его надкостницей, а затем аккуратно иссекаем лоскут – надкостницу. Выделение клеток из надкостницы производили путем предварительного механического выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей этого слоя до единичных клеток.

Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37⁰С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).

Субкультивирование монослойной культуры прогениторных клеток скелетных соединительных тканей осуществляют до третьего - четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.

После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 миллионов клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.

Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.

Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, с диаметром не менее 1 мм². Трансплантация может производиться эндоскопически.

Осуществление изобретения

Пример 1.

Взятие надкостницы осуществляли с ребра и голени крыс, кроликов, овец, человека. Для отделения надкостницы от нижележащей кости под нее инъекционным путем вводили изотонический раствор натрия хлорида.

Выделение клеток из надкостницы производили путем выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей.

Для получения первичной культуры выделенные клетки высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37⁰ С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования). Субкультивирование монослойной культуры клеток надкостницы осуществляли до четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.

После четвертого пассажа клетки снимали с пластика (пластиковых флаконов) трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывали от трипсина/ЭДТА, в том числе средой ДМЕМ с 10% сывороткой и с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), затем и переносили в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 млн клеток на планшет, после чего начинают формироваться сфероиды.

Культивирование сфероидов производили в течение 14 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.

В результате сфероиды из надкостницы увеличивались в размере в течение 7 дней процесса культивирования. Известно, что сфероиды, полученные из более дифференцированных клеток кости и хряща, уменьшаются в размерах внутри агарозных лунок со временем. Это связано с биологическими особенностями клеток соединительной ткани, неоптимальными условиями культивирования дифференцированных клеток, гибелью части клеток и утратой их структурных элементов. В случае осуществления способа по изобретению такого эффекта не наблюдается, что является абсолютно неожиданным для специалиста. По существу, осуществляется клеточный рост при культивировании в трехмерной структуре - 3D-культивирование, можно говорить о выращивании микротканей или сфероидов. Авторы настоящего изобретения установили, что клетки объединяются в сферу и увеличение биомассы этой конструкции происходит в течение 7 суток, потом прирост веса сфероида существенно меньше.

Таким образом, при выращивании (получении) сфероидов согласно способу по изобретению в агарозных лунках получают сфероиды из прогениторных клеток надкостницы, которые увеличивают свою биомассу в агарозных лунках.

Гистологически сфероиды из надкостницы на 7 сутки культивирования содержали волокнистый внеклеточный матрикс. Указанный матрикс при трансплантации создает временную матрицу, по которой и вокруг которой происходит регенерация собственных тканей реципиента и обеспечивается возможность восстановления. Сами сфероиды в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, клетки служат источником регенерации, а из матрикса создается модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию - дополнительно реализуется способ регенерации – регенерация по трансплантату.

Пример 2

В дефекты критических размеров лучевой кости крыс и кроликов помещали аутологичные сфероиды из надкостницы, полученные согласно данному изобретению, до полного покрытия ими зоны дефекта. В качестве контроля использованы аутологичные сфероиды из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.

Через 8 месяцев при гистологическом исследовании регенерата обнаружена полноценная костная ткань, причем произошла реканализация регенерата с формированием костномозговой полости. В контроле регенерация кости – замещение дефекта костной тканью отсутствовало.

Таким образом, обнаружено, что сфероиды из надкостницы обеспечили восстановление целостности кости, в сравнении с контрольной группой объем регенерировавшей костной ткани был больше, форма кости восстановлена в полном объеме. При этом, используя сфероиды, в частности, с применением геля с индукторами костной регенерации, по изобретению для трансплантации, удалось получить ткань, характеризующуюся высокой степенью васкуляризации. При этом индукторы дифференцировки используется только тогда, когда осуществляется трансплантация сфероидов. То есть, в частных вариантах воплощения изобретения трансплантат содержит сфероиды с гелями-носителями, несущими индукторы дифференцировки, в соотношении объемов, в частности, 1:1, а смешение сфероидов и геля осуществляется непосредственно перед пересадкой. Приживление сфероидов in vivo происходит в локальной среде регенерации.

Пример 3.

На животной модели (кролик, крыса) создавался в ходе операции дефект суставной поверхности хряща, захватывающий всю толщину хряща и всю субхондральную кость до губчатой кости диаметром 3 мм. В область дефекта трансплантировались сфероиды, полученные способом по изобретению, причем трансплантат также содержал гиалуроновую кислоту с индукторами хондрогенеза. На 5 суток накладывалась иммобилизирующая повязка. Через 8 месяцев на месте дефекта кости и хряща образовывалась губчатая кость с кортикальной пластинкой и гиалиново-фиброзный регенерат суставного хряща, с восстановлением конгруэнтности суставной поверхности. В контрольной группе – оставался дефект кости и суставной поверхности. При этом, индукторы дифференцировки используется только тогда, когда осуществляется трансплантация сфероидов. То есть, в частных вариантах воплощения изобретения трансплантат содержит сфероиды с гелями-носителями, несущими индукторы дифференцировки, в соотношении объемов, в частности, 1:1, а смешение сфероидов и геля осуществляется непосредственно перед пересадкой. Приживление сфероидов in vivo происходит в локальной среде регенерации.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине. Предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Способ включает выделение клеток из камбиального слоя надкостницы субъекта, их культивирование в адгезивной культуре с последующим переносом в агарозные лунки, где происходит их слияние с образованием клеточных сфероидов. Изобретения обеспечивают получение трансплантата в виде клеточных сфероидов из аутологичных клеток надкостницы субъекта, обладающих выраженным регенерационным потенциалом для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности суставного хряща и кости. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, включающий следующие этапы:

а) выделение клеток из камбиального слоя надкостницы субъекта;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки;

в) перенесение клеток, полученных на стадии б), в агарозные лунки;

г) слияние клеток в клеточные сфероиды.

2. Способ по п.1, в котором субъект представляет собой человека.

3. Способ по п.1, в котором надкостница представляет собой надкостницу собственного реберного хряща и/или кости голени субъекта.

4. Способ по п.1, в котором размер сфероидов составляет 200-450 мкм.

5. Способ по п.1, в котором культуральная питательная среда представляет собой среду с эмбриональной телячьей сывороткой или тромболизат для культивирования клеток.

6. Способ по п.1, в котором скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или суставной хрящ.

7. Способ по п.1, в котором культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней.

8. Способ по п.1, в котором перенесение клеток на стадии в) осуществляется из расчета 5000-20000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.

9. Способ по п.1, в котором слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляется в агарозных лунках, где клетки пребывают до 7 дней.

10. Трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, включающий клеточные сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и полученный способом по п.1.

11. Трансплантат по п.10, в котором субъект представляет собой человека.

12. Трансплантат по п.10, в котором размер сфероидов составляет 200-450 мкм.

13. Трансплантат по п.10, который дополнительно включает альгинатный гель с индукторами остеогенеза или гель на основе гиалуроновой кислоты с индукторами хондрогенеза.

14. Трансплантат по п.10, в котором скелетные соединительные ткани представляют собой кость и/или суставной хрящ.