Streptomyces anthocyanicus IPS92w - перспективный продуцент антимикробных соединений Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для микробного синтеза ряда антибиотиков с использованием природного штамма бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D.

Задачей изобретения является получение штамма-продуцента антимикробных веществ природного происхождения для контроля роста и развития патогенов человека, животных и растений.

Задача решается тем, что предлагается штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ас-2991D, способный к синтезу широкого спектра антимикробных соединений.

Штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus депонирован во Всероссийской коллекции культур микроорганизмов и хранится под номером ВКМ 2991D.

Штамм Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D выделен из ила реки Ока.

Штамм Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D обладает следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D. На богатой среде образует колонии разного цвета в зависимости от источника углерода и энергии. На среде 5/5 (аналог лизогенного бульона) культура синтезирует пигмент синего цвета, на минеральной среде с сахарозой, глицерином, мальтозой и лактозой цвет культуральной жидкости варьирует от бледно-розового до малинового.

Физиолого-биохимические свойства штамма: аэроб, температурный оптимум +30°С до +37°С, оптимум рН нейтральный или слегка щелочной: 7-8, каталазоположительный, не требует для роста тиамина, хорошо растет на стандартных лабораторных средах. На минеральной среде в качестве ростовых субстратов использует сахарозу, мальтозу, лактозу, глицерин.

Молекулярно-биологическая характеристика: проведено полногеномное секвенирование штамма, установлено, что размер генома данного штамма составляет 8,326,612 п.о. Данные размещены в Банке данных, биопроект номер JAPFQR000000000 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JAPFQR000000000).

В геноме штамма обнаружен ряд генов, кодирующих антимикробные соединения, такие, как 2-метилизоборнеол (терпен), актинородин (поликетид II типа), альбафлавенон (терпен), целихелин (НРП), десферриоксамин В/Е, геосмин (терпен), гермицидин, изорениератен (терпен), ундецилпродигиозин. Наличие гена, кодирующего эктоин, указывает на потенциальную стрессоустойчивость штамма к условиям засоленности.

При хранении на агаризованной среде 5/5 в качестве единственного источника углерода и энергии штамм длительное время сохраняет жизнеспособность. Синтез антибиотических соединений начинается со вторых суток культивирования.

При культивировании штамма на богатой среде 5/5 синтез антибиотических компонентов был наименьший, при культивировании в минеральной среде с глицерином - наибольшим.

Штамм Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D способен к подавлению роста таких фитопатогенов, как Fusarium avenaceum ВКМ F-132, Rhizoctonia solani ВКМ F-895, Pythium vexans ВКМ F-1193, Aspergillus unguis ВКМ F-1754, Alternaria brassicicola ВКМ F-1864, Penicillium gladioli ВКМ F-2088, Bipolaris sorokiniana ВКМ F-4006, Botrytis cinerea BKM F-4549, Pythium ultimum ВКМ F-4782. Синтез антибиотических соединений оценивали по зоне подавления роста фитопатогенных штаммов при нанесении 10 мкл культуральной жидкости исследуемого штамма.

Показано, что антимикробной активностью обладает не только культуральная жидкость штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ас-2991D, но и ее экстракт, полученный в результате экстракции органических соединений этилацетатом.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Для культивирования штамма бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D используют или богатую среду 5/5 ИБФМ РАН или минеральную среду следующего состава (г/л): K₂HPO₄ 3.0; MgCO₃ 0.3; NaCl 0.2; KNO₃ 0.75; FeSO₄ × 7H₂O 0.001, мел 0.5, в которой используют 20 г глюкозы/ мальтозы/ сахарозы/ глицерина в качестве ростового субстрата.

Культуру для посевного материала выращивают в колбах объемом 750 мл с рабочим объемом 200 мл на одной из указанных выше сред. Клетки выращивают при перемешивании на качалке при 220 об/мин до плотности 0.5-0.7 оптических единиц. Синтез антимикробных соединений оценивают по подавлению зон роста гриба Fusarium avenaceum ВКМ F-132. Данный пример подтверждает, что штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D способен к синтезу антибиотических соединений. Из данных, представленных на Фигуре 1, понятно, что при росте штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ас-2991D в богатой среде происходит синтез пигментированного соединения синего цвета, а при культивировании в минеральной среде с индивидуальными ростовыми соединениями - синтезируются вещества разных цветов.

Пример 2. В зависимости от ростового субстрата штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D синтезирует антимикробные соединения разной эффективности. На фигуре 2 представлены зоны подавления роста фитопатогенного гриба Fusarium avenaceum ВКМ F-132 под действием культуральных жидкостей штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D. Из представленных данных видно, что зоны подавления роста фитопатогена составляли 7 мм и были максимальными для культуральной среды штамма, выращенного на глицерине.

Пример 3. Антимикробные соединения, синтезируемые штаммом бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D в среду культивирования, могут быть выделены при экстракции этилацетатом. Ингибирование этилацетатными экстрактами культуральной жидкости штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D, выращенного на СР1 среде, роста таких бактериальных фитопатогенов, как Aeromonas veronii (а) и Bacillus cereus GAST (b) (Фигура 3) и грибного фитопатогена Fusarium avenaceum ВКМ F-132 культуральными экстрактами штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D, выращенного на разных субстратах (Фигура 4). На фигуре 3 приведены результаты анализа влияния этилацетатного экстракта культуральной жидкости штамма Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D, выращенного на СР1 среде, на рост и развитие фитопатогена. Этот пример подтверждает, что данный штамм синтезирует в культуральную среду соединения, ингибирующие рост микроорганизмов, экстрагируемые этилацетатом.

Пример 4. Штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D содержит в своем геноме гены, кодирующие синтез антимикробных соединений. В таблице перечислены антимикробные соединения, гены синтеза которых обнаружены при анализе полного генома штамма бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D. Из данных таблицы можно сделать вывод о том, что данный штамм способен к синтезу целого ряда антимикробных соединений, гены которых характеризуются невысоким процентом сходства с ранее описанными и имеющимися в базе данных генов. Данный набор антимикробных средств позволяет рассматривать заявляемый штамм как потенциально биотехнологически-перспективный для разработки антимикробных препаратов.

Штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ас-2991D отличается от известных штаммов-бактерий, являющихся продуцентами антибиотических соединений. Это следует из примера 4 и литературных данных. Предлагаемый штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ас-2991D обеспечивает синтез антимикробных агентов, количественный состав которых больше, чем показано для известного из литературы штамма Streptomyces sp. JS520, продуцента ундецилпродигиозина (N. Stankovic, Radulovic V., Petkovic М., Vuckovic L, Jadranin M., Vasiljevic В., Nikodinovic-Runic J. Streptomyces sp. JS520 produces exceptionally high quantities of undecylprodigiosin with antibacterial, antioxidative, and UV-protective properties. Appl Microbiol Biotechnol., DOI 10.1007/s00253-012-4237-3). Однако в данной статье показана способность штамма синтезировать только одно указанное соединение. Описанный нами штамм бактерий Streptomyces anthocyanicus ВКМ Ac-2991D способен к синтезу более широко ряда антимикробных соединений.

Из литературы известны штаммы Streptomyces anthocyanicus SCM3037, Streptomyces anthocyanicus SCM5058, Streptomyces anthocyanicus SCM4739, полные геномы которых депонированы в базу данных. Однако о характере синтеза антимикробных соединений и эффективности их воздействия на эукариотные и прокариотные микроорганизмы информация отсутствует.

При проведении патентного поиска в Российской базе данных по запросу «Streptomyces anthocyanicus» результат нулевой. Таким образом, нет данных по патентам на штамм или штамм-продуцент Streptomyces anthocyanicus.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм бактерий S. anthocyanicus ВКМ Ac-2991, депонированный во Всероссийской коллекции культур микроорганизмов под номером ВКМ Ас-2991D. На богатой среде образует колонии разного цвета в зависимости от источника углерода и энергии. На среде 5/5 ИБФМ культура синтезирует пигмент синего цвета, на минеральной среде с сахарозой, глицерином, мальтозой и лактозой цвет культуральной жидкости варьирует от бледно-розового до малинового. Размер генома данного штамма составляет 8,326,612 п.о. Наличие гена, кодирующего эктоин, указывает на потенциальную стрессоустойчивость штамма к условиям засоленности. Штамм S. anthocyanicus ВКМ Ac-2991D способен к подавлению роста таких фитопатогенов, как Fusarium avenaceum ВКМ F-132, Rhizoctonia solani ВКМ F-895, Pythium vexans ВКМ F-1193, Aspergillus unguis ВКМ F-1754, Alternaria brassicicola ВКМ F-1864, Penicillium gladioli ВКМ F-2088, Bipolaris sorokiniana ВКМ F-4006, Botrytis cinerea ВКМ F-4549, Pythium ultimum ВКМ F-4782, Aeromonas veronii (а) и Bacillus cereus GAST. 4 ил.

Streptomyces anthocyanicus IPS92w BKM Ac-2991D - продуцент антимикробных соединений.