Штамм Streptomyces sp. YVZ013 - продуцент антибиотика поликетомицина Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C07H17/04 C12P19/60 A61K31/7042 A61P31/04 C12R1/465 

Область техники

Изобретение относится к микробной биотехнологии, микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма вида Streptomyces sp.YVZ013, продуцирующего поликетомицин.

Изобретение может быть использовано для получения антибиотика поликетомицина, обладающего выраженной активностью против грамположительных бактерий, в том числе метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus (MRSA), а также проявляющего цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеточных линий.

Уровень техники

В 1988 году группа японских микробиологов опубликовала сообщение о выделении из почвы актиномицетного штамма Streptomyces sp. MK277-AF1, синтезирующего ранее не описанный метаболит с антибактериальным и цитотоксическим действием, названный ими поликетомицином [Momose I., Chen W., Kinoshita N., Iinuma H., Hamada M., Takeuchi T. Polyketomycin, a New Antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1: I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities J. Antibiot. 1998a. 51. P. 21-25. https://doi.org/10.7164/antibiotics.51.26].

Очищенное вещество представляло собой оранжевый мелкокристаллический порошок, нерастворимый в воде и гексане, но хорошо растворимый во многих других органических растворителях (этилацетате, ацетоне, хлороформе, метаноле, пиридине и др.). Была установлена формула С₄₄Н₄₈О₁₈ (молекулярная масса 864.842824 Да) и характерный UV-спектр поглощения в метаноле с максимальными значениями при 208, 243, 282 и 445 нм [Momose I., Chen W., Nakamura H., Naganawa FL, Iinuma H., Takeuchi T. Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1 II. Structure determination J. Antibiot (Tokyo). 1998b. 51. P. 26-32. https://doi.org/10.7164/antibiotics.51.26.].

Поликетомицин состоит из тетрациклического декакетида и диметилсалициловой кислоты, связанных двумя дезоксисахарными фрагментами: β-D-амицетозой и α L-аксенозой (Фиг. 1). Было показано, что он проявляет антибиотическую активность в отношении грамположительных бактерий (меньше 0,006 мкг/мл для Bacillus subtilis), а также против некоторых штаммов Staphylococcus aureus с множественной лекарственной устойчивостью, MRSA, в концентрации менее чем 0,025 мкг/мл. Было установлено, что поликетомицин в концентрации 0,9-2,5 мкг/мл обладает выраженной способностью угнетать пролиферацию широкого ряда клеточных опухолевых линий. Также было показано острое цитотоксическое действие на мышей: LD₅₀ составил 6,25-12,5 мг/кг [Momose I. et al, 1988а - по ссылке выше].

Позднее в 1999 году путем экспериментов с меченными атомами ¹³С в ацетате натрия и пропионате натрия был охарактеризован путь биосинтеза поликетомицина у штамма Streptomyces distatochromogenes Tü 6028: поликетидное происхождение агликона и диметилсалицилоильных фрагментов, а также образование дезоксисахаров (β-D-амицетозы и α-L-аксенозы) из D-глюкозы [Paululat Т., Zeeck A., Gutterer J.M., Fiedler Н.Р. Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes Tti 6028. J Antibiot (Tokyo). 1999 Feb;52(2):96-101. doi: 10.7164/antibiotics.52.96. doi: 10.7164/antibiotics.52.96].

В 2009 году Мартина Даум с соавторами описали у штамма S. diastatochromogenes Т6028 биосинтетический генный кластер поликетомицина размером 52,2 тыс.п.н., содержащий 41 ген, и подтвердили последовательные стадии биосинтеза этого тетрациклического ароматического поликетида. Было показано, что делеция гена оксигеназы pokOIV приводит к образованию мутанта, неспособного к синтезу поликетомицина [Daum М, Peintner I, Linnenbrink A, Frerich A, Weber М, Paululat Т, Bechthold A. Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin. Chembiochem. 2009 Apr 17; 10(6): 1073-83. doi: 10.1002/cbic.200800823].

В 2018 году был уточнен один из этапов биосинтеза поликетомицина, связанный с последовательным превращением в клетках того же штамма-продуцента S. diastatochromogenes Т6028 с помощью ферментов - С-метилтрансфераз PokM3 и PokMT1 - 6-метилсалициловой кислоты в 3,6-диметилсалицилил-КоА, который служит прямым предшественник фрагмента 3,6-диметилсалициловой кислоты (Фиг. 1) [Guo X, Crnovcic I, Chang CY, Luo J, Lohman JR, Papinski M, Bechthold A, Horsman GP, Shen B. PokMT1 from the polyketomycin biosynthetic machinery of Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 belongs to the emerging family of c-methyltransferases that act on coa-activated aromatic substrates. Biochemistry. 2018 Feb 13;57(6): 1003-1011. doi: 10.1021/acs.biochem.7b01219].

Известны несколько продуцентов поликетомицина, принадлежащие к роду Streptomyces:

Streptomyces sp. MK277-AF1 [заявка на патент JPH 09301989 (А), 1997-11-25]. Продуктивность данного штамма при экстракции поликетомицина последовательно бутилацетатом и метанолом из 8 литров культуральной жидкости составляет 27,9 мг, что составляет 3,4875 мг/л сухого вещества;

и Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Продуктивность данного штамма при извлечении поликетомицина экстракцией этилацетатом составляет до 100 мг/л [Paululat Т, Zeeck A, Gutterer JM, Fiedler HP. Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes Tu 6028. J Antibiot (Tokyo). 1999 Feb;52(2):96-101. doi: 10.7164/antibiotics.52.96.].

Однако, к серьезным недостаткам выше указанных штаммов продуцентов поликетомицина, можно отнести малую продуктивность при выработке целевого антибиотика.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение вышеуказанной в уровне техники проблемы.

Сущность изобретения

Технической решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.

Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось получение бактериального штамма, способного продуцировать ферментационную жидкость с высоким содержанием антибиотика поликетомицина. Техническим результатом настоящего изобретения является высокая продуктивность штамма-продуцента не менее 4 г/л поликетомицина в культуральной жидкости.

Задача может решаться тем, что выделен и охарактеризован штамм Streptomyces sp. YVZ013.

Штамм Streptomyces sp.YVZ013 был выделен при поверхностном посеве на овсяный агар [Shirling ЕВ & Gottlieb D. Methods for Characterization of Streptomyces Species. Int J System Bacteriol. 1966; 16(3):313-340. doi: 10.1099/00207713-16-3-313] из образца верхнего горизонта почвы (0-5 см), отобранного на экотропе «Времена года» курорта Красная поляна, г. Сочи, Краснодарский край (43.6651473 с. ш, 40.2615938 в.д.) в мае 2022 года.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ФГБУ «ФИЦ «Пущинский Научный Центр Биологических Исследований Российской Академии Наук» (Россия, 142290, Московская обл., Пущино, пр. Науки, 5, ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ Ac-3004D.

Идентификация штамма Streptomyces sp.YVZ013 ВКМ Ac-3004D основывалась на методологии полифазной таксономии, сочетающей анализ данных секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базе GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, дата обращения 18.12.2023], наряду с изучением фенотипических признаков: культуральных, морфологических и физиологических. Данный подход в настоящее время считается абсолютно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода и в большинстве случаев достаточным для определения видовой принадлежности.

Молекулярно-генетические признаки

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рибосомальной РНК длиной 1137 пар нуклеотидов (депонирован в GenBank под номером OR246885) и сравнение его с аналогичными последовательностями типовых штаммов, размещенных в той же базе данных [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov, дата обращения 20.11.2023] показывает, что ближайшим типовым штаммом является Streptomyces mirabilis JSM 4551^Т (уровень сходства составляет 99,82%).

Культурально-морфологические признаки

Штамм Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D характеризуется культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, согласующимися с таковыми, приведенными для представителей данного таксона [Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria, 2015, doi: 10.1002/9781118960608]. Культуральные характеристики штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D описаны на спектре твердых питательных сред (Фиг. 6), рекомендованных для фенотипического описания актиномицетов в рамках Международного проекта по изучению стрептомицетов - International Streptomyces Project [Shirling, Gottlieb, 1966 по ссылке выше].

Изучение морфологии Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D на 14 сутки роста на овсяном агаре с помощью сканирующего электронного микроскопа (Фиг. 2) позволило установить, что штамм образует разветвленный субстратный мицелий переменной толщины (0,3 до 0,6 мкм), на конце отдельных гиф встречаются колбовидные утолщения, воздушный мицелий на большинстве сред отсутствует или имеет фрагментарный характер. На минеральном агаре Гаузе 1 и ISP3 способен образовывать спиральные цепочки спор, размер которых составляет 0,50-0,56×1,50-1,56 мкм, с бородавчатой поверхностью (Фиг. 2).

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет в аэробных условиях, с оптимумом роста при рН 6-6,5 и температуре 28±2°С, при концентрации NaCl больше 5% рост отсутствует.

Используемые источники углерода: галактоза, лактоза, мальтоза, сахароза, трегалоза, фруктоза; слабо использует арабинозу, глюкозу, инозит, ксилозу, маннитол, маннозу, рамнозу, раффинозу; не использует - сорбитол (Фиг. 3).

Способен к гидролизу казеина, крахмала. В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты.

Образует антибиотик поликетомицин, активный в отношении грамположительных бактерий. Чувствителен к эритромицину в концентрации 5 мкг/мл.

Штамм Streptomyces sp.YVZ013 ВКМ Ac-3004D не патогенен.

Хранение и поддержание жизнеспособности штамма

Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 3-4 недели в пробирки со скошенным овсяным агаром.

Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -80°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-5 суток, и последующим разливом культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов и соблюдением условий стерильности.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

На Фиг. 1 изображена структурная формула молекулы поликетомицина. Фрагмент 3,6-диметилсалициловой кислоты выделен красным.

На Фиг. 2 представлена электронная микрофотография мицелия и спор штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D, сделанная на 12-е сутки роста культуры на овсяном агаре при 28°С (Cambridge Instruments CamScan S2).

На Фиг. 3 отражена способность штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D образовывать кислоту при росте на среде с единственным источником углерода (слева направо): глюкоза, сорбитол, фруктоза, лактоза, галактоза, трегалоза, арабиноза, среда без источника углерода, раффиноза, маннитол, сахароза, рамноза, мальтоза, манноза, ксилоза, инозит.

На Фиг. 4а представлены результаты тестирования исходной культуральной жидкости штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D на репортерном тест-организме Escherichia coli BW25113 с частичной делецией в гене 1ptD, трансформированном плазмидой pDualrep2. Референсные антибиотики эритромицин (Ery) и норфлоксацин (Nor). На рисунке 4б представлено подавление роста Staphylococcus aureus INA00761 (MRSA): 1 - кондиционированной культуральной жидкостью штамма Streptomyces sp. YVZ013 после 6 суток инкубации (100 мкл); 2 - экстрактом биомассы штамма Streptomyces sp. YVZ013 ацетоном (10 мкл), 3 - экстрактом кондиционированной культуральной жидкости Streptomyces sp. YVZ013 этилацетатом (10 мкл), 7 - фракцией кондиционированной культуральной жидкости штамма Streptomyces sp.YVZ013, элюированной с LPS-сорбента 75% раствором ацетонитрила в воде (10 мкл).

На Фиг. 5а представлены результаты ВЭЖХ-анализа экстракта из биомассы штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D: а - хроматограмма (λ=430 нм), с пиком поликетомицина; б - спектр поглощения поликетомицина в ультрафиолетовой и видимой областях; в - масс-спектры поликетомицина в отрицательной моде, главный пик с соотношением масса/заряд 863,3 [М-Н]^-.

на Фиг. 5б представлены аналогичные данные, полученные методом ВЭЖХ неочищенного экстракта штамма Streptomyces distatochromogenes Tü6028 после культивирования в течение 6 дней [Greule A., Zhang S., Paululat Т., Bechthold A. From а natural product to its biosynthetic gene cluster: a demonstration using polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. J Vis Exp.2017 Jan 13:(119):54952. doi: 10.3791/54952]: A - хроматограмма с пиком выхода поликетомицина на 25,9 мин; В - спектр поглощения поликетомицина в ультрафиолетовой и видимой областях; С - масс-спектры поликетомицина в отрицательной моде, главный пик с соотношением масса/заряд 863,2 [М-Н]^-.

На Фиг. 6 представлена таблица культуральных характеристик штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D.

Примеры осуществления изобретения

Сущность и практическая применимость настоящего изобретения поясняется следующими примерами:

Штамм Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D культивировали в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина 2 г, дрожжевой экстракт 2 г, NaCl 6 г, вода 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводили стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь вносили в криопробирки и помещали на хранение при температуре -80°С.

Пример 1. Выделение и культивирование Streptomyces sp .YVZ013 ВКМ Ac-3004D Для исследования в стерильный контейнер собирали образец верхнего горизонта почвы (0-5 см), на экотропе «Времена года» курорта Красная поляна, г. Сочи (43.6651473 с.ш, 40.2615938 в.д.), транспортировали в лабораторию и сразу использовали для посева на плотные питательные среды: овсяный агар [Гаузе и др., 1983]. Для ограничения роста грибов и грамотрицательных бактерий в среды перед разливом добавляли нистатин (250 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) соответственно. Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение двух недель.

Выросшие колонии мицелиальных прокариот выделяли в отдельные изоляты, среди которых проводился скрининг на антагонистическую активность в отношении ряда тест-организмов, в частности, репортерного штамма Е. coli BW25113 с частичной делецией в гене 1ptD, трансформированного плазмидой pDualrep2 и метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus INA00761.

Таким образом, был выявлен штамм Streptomyces sp. YVZ013, вызывавший значительное ингибирование роста выше указанных тест-организмов (Фиг. 4 а, б).

Пример 2. Получение поликетомицина с использованием нового штамма-продуцента

Пример 2.1. Культивирование штамма-продуцента. Клетки Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D выращивали в жидкой овсяной среде, приготовленной следующим образом: 20 г овсяной муки кипятили в литре дистиллированной воды, охлаждали, отстаивали, декантировали надосадочную жидкость, разливали в колбы и стерилизовали при 121°С и 1 атм в течение 20 минут (рН после автоклавирования должен составлять 7,0-7,2). После автоклавирования асептически добавляли по 0,1% об/об стерильного раствора микроэлементов, содержащего по 0,1 г FeS04 7Н20, MnCl₂ 4Н₂0 и ZnS04 7Н₂О в 100 мл дистиллированной воды.

Для посева использовали суспензию спор, собранных с 14-суточных культур на среде ISP3. В конические колбы объемом 250 мл вносили по 1 мл споровой суспензии, содержащей 10⁷ кл/мл и культивировали при 28°С и перемешивании на орбитальном шейкере в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость с клетками продуцента использовали как посевной материал, засевая им в объеме внесения 2-5% конические колбы общим объемом 250 мл, содержащие 50 мл жидкой овсяной среды вышеприведенного состава. Засеянные колбы в течение 6 суток инкубировали на шейкере при 28°С.

По окончании срока ферментации культуральную жидкость с клетками микроорганизмов сливали из колб и центрифугировали 10 минут при скорости 4500 об/мин, чтобы разделить культуральную жидкость и биомассу.

Пример 2.2. Выделение и идентификация и поликетомицина.

Отделенную биомассу экстрагировали 4-кратным объемом ацетона путем встряхивания на шейкере при 180 об/мин в течение 120 минут. С помощью центрифугирования отделяли супернатант и упаривали его на роторном испарителе при 35°С и 400 бар. Перерастворяли осадок в 10 мл этилацетата, переносили в делительную воронку, добавляли 10 мл воды и встряхивали течение 30 минут при 180 оборотах. Сливали водную фракцию, а этилацетатную - собирали, упаривали на роторном испарителе при ранее указанных условиях до постоянного веса. Таким образом, после взвешивания была установлена масса сухого активного вещества - 218 мг, синтезированные к концу ферментации в 50 мл среды. Продуктивность штамма по содержанию поликетомицина в культуральной жидкости составила 4,36 г/л.

Затем сухой осадок был перерастворен в ацетоне, по 10 мкл было отобрано для проверки антимикробной активности в отношении штаммов Е. coli BW25113 с частичной делецией в гене 1ptD и метициллин-резистентного штамма. Staphylococcus aureus INA00761, как описано в Примере 1.

После этого ацетоновая фракция была проанализирована на ВЭЖХ-МС для определения хроматографической чистоты полученного экстракта (Фиг. 5а).

Идентификацию активного вещества проводили методом хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, с использованием масс-спектрометра Bruker maXis II 4G ETD, хроматографа UltiMate 3000, оснащенного колонкой Acclaim RSLC 120 C18 2.2um 2.1×100mm. Масс-спектры обрабатывали с использованием программ OpenChrom Lablicate Edition (1.4.0.202201211106), TOPPView v. 2.6.0 [Kohlbacher O, Reinert K, Gröpl C, et al. TOPP - the OpenMS proteomics pipeline. Bioinformatics. 2007 Jan 15;23(2):e191-7. doi: 10.1093/bioinformatics/btl299]. Структура активного вещества была установлена с использованием GNPS [Wang М, Carver JJ, Phelan VV, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016 Aug 9;34(8):828-837. doi: 10.1038/nbt.3597], NPAtlas [van Santen JA, Poynton EF, Iskakova D, et al. The Natural Products Atlas 2.0: a database of microbially-derived natural products. Nucleic Acids Res. 2022 Jan 7;50(D1):D1317-D1323. doi: 10.1093/nar/gkab941; van Santen JA, Jacob G, Singh AL, et al. The Natural Products Atlas: An Open Access Knowledge Base for Microbial Natural Products Discovery. ACS Cent Sci. 2019 Nov 27;5(11):1824-1833. doi: 10.1021/acscentsci.9b00806], Dictionary of Natural Products databases].

В соответствии с точной молекулярной массой (864.842824 Да) был определен атомарный состав и молекулярная формула активного вещества (С₄₄Н₄₈О₁₈), а с помощью открытой базы данных GNPS-LIBRARY проведена его идентификация. Оптический спектр поглощения (Фиг. 5 а) и анализ противомикробной активности использованы в качестве данных, подтверждающих масс-спектрометрическую идентификацию.

Таким образом, установлено, что фракция, полученная экстракцией биомассы штамма Streptomyces sp. YVZ013 ВКМ Ac-3004D 100% ацетоном, представлена антибиотиком поликетомицином.

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Изобретение относится к микробной биотехнологии и микробиологической промышленности. Предложен штамм Streptomyces sp. ВКМ Ас-3004D – продуцент антибиотика поликетомицина. Штамм обладает высокой продуктивностью и позволяет получать не менее 4 г/л поликетомицина в культуральной жидкости. 6 ил., 2 пр.

Штамм Streptomyces sp. YVZ013, депонированный во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ФГБУ «ФИЦ «Пущинский Научный Центр Биологических Исследований Российской Академии Наук» под регистрационным номером ВКМ Ас-3004D, – продуцент антибиотика поликетомицина.