Способ определения уреазной активности почв с применением пенополиуретановых тест-средств Российский патент 2024 года по МПК G01N21/49 

Изобретение относится области к аналитической химии, агрохимии и почвоведению и может быть рекомендовано для определения уреазной активности различных типов почв, а также возможно проводить определение в загрязненных нефтепродуктами почвах.

Уреазную активность, как in vivo, так и in vitro обычно измеряют по кинетике разложения мочевины и, в частности, по количеству аммиака или углекислого газа (Дж.Б. Самнер, Г.Ф. Сомерс, "Химия ферментов и методы их исследований", под ред. В.А. Энгельгардта, Иностранная литература, Москва, 1948, 584 с, с. 178), выделяющихся в результате реакции ферментативного гидролиза.

Известен способ определения уреазной активности, основанный на фотометрическом методе определения количества образующегося аммиака с помощью реактива Несслера (ГОСТ Р 58596-2019 Почвы. Методы определения общего азота). Недостатком данного способа является присутствие в реактиве Несслера двуйодистой или металлической ртути, что ограничивает применение этой реакции в практическом обращении в связи с токсичностью ее реагентов.

Также известен способ определения аммиака, основанный на индофенольном методе. В щелочной среде аммиак при взаимодействии с фенолом в присутствии окислителя гипохлорита натрия образует продукт синего цвета, называемый "индофенольная синь". Недостатком данного способа является, то, что фенол токсичен и неустойчив во времени, его необходимо готовить каждый день перед анализом (Данилина Е.И., Рогулин В.В., Бабичева Е.А. Определение обменного и водорастворимого аммония в почвах модифицированными индофенольными методами // Вестник ЧелГУ. 1996. №1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/opredelenie-obmennogo-i-vodorasivorimogo-ammoniya-v-pochvah-modifitsirovannymi-indofenolnymi-metodami (дата обращения: 12.05.2023)).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является модификация индофенольного способа, в основе которого используются салицилаты натрия, которые в отличие от фенола, малотоксичены и устойчивы на воздухе длительное время. Однако, получаемые комплексы неустойчивы во времени, требуется избыток реагентов, необходимо применение спектрофотометра и экстракционного оборудования (ГОСТ 26489-85 Определение обменного аммония по методу ЦИНАО).

Изобретением решается задача количественного определения уреазной активности почвы, снижения предела обнаружения, увеличения селективности и чувствительности определения уреазной активности почв, снижения времени определения и возможности повторно использовать тест-средства после очистки.

Для достижения технического результата в предлагаемом способе предварительно подготовленный образец тест-средства на основе пенополиуретана (ППУ) выдерживают поочередно в пара-аминосульфосальцилате натрия/ хлорамине по 15 минут, затем высушивают. Подготовленные таким образом, ППУ тест-средства опускают в пробирку на расстоянии 2-5 см от верхнего уровня почвенной пробы и герметизируют. Подготовку пробы осуществляют внесением в почву фиксированного количества мочевины. Фиксацию изменения интенсивности окрашивания тест-средства осуществляют с применением сканера или денситометра. Аналитический сигнал, получаемый от тест-средств (интенсивность окраски) прямо пропорционален уреазной активности почв.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- высокая чувствительность способа;

- проведение измерений в режиме реального времени;

- высокая селективность определения уреазной активности;

- возможность повторно использовать пенополиуретановые тест-средства после очистки.

Это позволяет проводить определение уреазной активности почв в режиме реального времени в линейном диапазоне 0,50 - 300,00 мг аммиака /кг почвы. Высокая селективность тест-средств обеспечивается использованием чувствительной реакцией по определению выделяющегося аммиака, эквивалентному уреазной активности почвы. Матрица тест-средства может многократно использоваться в работе после удаления окрашенного комплекса, что обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания тест-средств используют пенополиуретан (ППУ) со следующими характеристиками: марки ППУ ST2236, ST2336, ST2836, тип стандартный, цвет белый, плотность 22-28 кг/м, жесткость 2,8-3,6 кг/м³. Из ППУ формируют таблетки размером диаметром D=10 мм и высотой h=10 мм, затем смачивают в 20 мл водного раствора пара-аминосульфосальцилата натрия (массовая концентрация 5%) в течение 15 минут, высушивают на воздухе, затем смачивают в 20 мл водного раствора хлорамина (массовая концентрация 3%) в течение 15 минут и опять высушивают.

Навеску почвы 5,0 г помещают в пробирку, добавляют фиксированное количество мочевины 5 мл (массовая концентрация 15%). Затем на расстоянии 2-4 см от верхнего уровня образца почвы размещают тест-средство и закрывают пробирку пробкой. Пробирку помещают в термостат и выдерживают 10-15 мин при температуре 40-42°С. В качестве аналитического сигнала используют изменение интенсивности окраски ППУ вследствие протекания реакции разложения мочевины под действием фермента уреазы, которую выделяют почвенные бактерии. Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:

ΔI=I_i-I₀,

где I_i - интенсивность окрашенного комплекса после взаимодействия ППУ с выделяющимся аммиаком;

I₀ - интенсивность окраски ППУ перед определением аммиака.

Концентрацию аммиака определяют по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика берут навески предварительно стерилизованной почвы массой 10,0 г, добавляют раствор фермента уреазы с концентраций 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 100, 500, 1000, 3000 Ед/мл, что эквивалентно 0, 0,10, 0,50, 1,00, 1,50, 2,00, 2,50, 10,00, 50,00, 100,00, 300,00 мг аммиака, добавляют фиксированный объем 5,0 мл мочевины (массовая концентрация 15%), размещают тест-средства на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы, закрывают герметично пробкой и выдерживают в течение 10-15 минут при температуре 40-42°С.

Значение аналитического сигнала прямопропорционально концентрации выделяющегося аммиака. Градуировочный график для определения уреазной активности линеен в диапазоне 0,50 - 300,00 мг /кг: уравнение градуировочного графика ΔI=1,75⋅С+0,05, где ΔI - аналитический сигнал; С - концентрация аммиака в пробе, мг.

Пример 1. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 10-15 мин и при температуре 40-42°С. Затем извлекают окрашенное ППУ тест-средство из пробирки и определяют аналитический отклик по интенсивности окрашивания ППУ. Аналитический отклик прямо пропорционален содержанию аммиака в образце почвы.

Разрушение окрашенного комплекса ППУ осуществляли с применением 3% соляной кислоты. Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,925;

предел обнаружения аммиака - 0,08 мг.

Пример 2. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 25 Ед/мл, что эквивалентно 2,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Далее аналогично примеру 1.

Аналитический сигнал ΔI=4,425;

предел обнаружения аммиака - 0,08 мг.

Пример 3. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 3000 Ед/мл, что эквивалентно 300,00 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Далее аналогично примеру 1.

Аналитический сигнал ΔI=525,05;

предел обнаружения аммиака - 0,08 мг.

Пример 4. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 1 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,945;

предел обнаружения аммиака - 0,09 мг.

Происходит неравномерное окрашивание поверхности тест-средства.

Пример 5. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 1,5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,929;

предел обнаружения аммиака - 0,08 мг.

Происходит неравномерное окрашивание поверхности тест-средства.

Пример 6. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 6 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,855;

предел обнаружения аммиака - 0,12 мг.

Происходит неравномерное окрашивание поверхности тест-средства.

Пример 7. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 8 мин и при температуре 40-42°С. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,755;

предел обнаружения аммиака - 0,09 мг.

Не хватает времени для развития окраски тест-средства.

Пример 8. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 18 мин и при температуре 40-42°С. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,927;

предел обнаружения аммиака - 0,08 мг.

Избыточное время для развития окраски тест-средства.

Пример 9. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 10-15 мин и при температуре 38°С. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,858;

предел обнаружения аммиака - 0,09 мг.

Температура реакции не достаточна для выделения аммиака и развития окраски.

Пример 10. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 10-15 мин и при температуре 50°С. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,865;

предел обнаружения аммиака - 0,09 мг.

Температура реакции избыточна, происходит разрушение окрашенного комплекса, что сказывается негативно на развитие окраски тест-средства.

Пример 11. Исследуемый стерилизованный образец почвы массой 10,0 г с добавкой уреазы 5 Ед/мл, что эквивалентно 0,50 мг аммиака помещают в герметичную пробирку, добавляют фиксированное количество 5 мл 15%-ого раствора мочевины, размещают предварительно подготовленные средства ППУ на уровне 2-5 см от верхнего уровня почвы и закрывают герметично пробкой. Выдерживают 10-15 мин и при температуре 60°С. Далее аналогично примеру 1.

Определение концентрации аммиака осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал ΔI=0,844;

предел обнаружения аммиака - 0,10 мг.

Температура реакции избыточна, происходит разрушение окрашенного комплекса, что сказывается негативно на развитие окраски тест-средства.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения уреазной активности в почвах приведена в таблице.

Изобретение относится к области биотехнологии. Определение уреазной активности осуществляют с помощью пенополиуретановых тест-средств и последующей оцифровкой результатов с применением различных программ и приложений, позволяющих определить изменение интенсивности окраски тест-средства. Пробу почвы, содержащей бактерии, обладающие уреазной активностью, помещают в пробирку и добавляют фиксированное количество мочевины, затем через 10-15 мин в пробирку помещают на расстоянии 2-5 см от почвы полиуретановое тест-средство, пропитанное водным раствором реактива пара-аминосульфосальцилат натрия/хлорамин в соотношении 1:1. Уреазную активность определяют по реакции гидролиза мочевины ферментом уреазой, т.е. количественно по выделяющемуся аммиаку, который окрашивает тест-средства в красно-бурый цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации аммиака, выделенного из пробы, а следовательно, уреазной активности. Использование изобретения позволяет проводить анализ почвы с определением уреазной активности от 0,50 до 300,00 мг аммиака/кг почвы. Тест-средства возможно регенерировать и повторно использовать в анализе. 1 табл., 9 пр.

Способ определения уреазной активности почв, основанный на гидролизе мочевины под действием уреазы, отличающийся тем, что определение осуществляют с применением предварительно подготовленных пенополиуретановых тест-средств, модифицированных пара-аминосульфосальцилатом натрия и хлорамином, которые размещают в пробирке на расстоянии 2-5 см от почвы, выдерживают 10-15 мин в термостате при температуре 40-42°С и регистрируют изменение интенсивности окраски тест-средства, прямо пропорциональное концентрации аммиака и уреазной активности почвы.