СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И НАБОР РЕАКТИВОВ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к биохимическим методам анализа мочевины в биологических жидкостях, и может быть использовано как в клинико-диагностических, так и в научных целях.

Так как в клинической и научной практике определение мочевины в крови, моче и других биологических жидкостях является актуальной задачей, фармацевтические и научные центры соответствующего профиля разрабатывают не только новые методы определения мочевины, но и специальные наборы готовых форм реактивов для такого определения ("диагностикумы").

Наиболее перспективными методами анализа мочевины в биологических жидкостях являются ферментативные способы, основанные на гидролизе мочевины уреазой до ионов аммония и их дальнейшем определении. Для ряда способов предлагаются и соответствующие диагностикумы.

Так, известен способ определения мочевины в биологических жидкостях, включающий ее гидролиз уреазой и дальнейшее определение образующихся ионов аммония в присутствии катализатора [1].

Определение ионов аммония основывается также на ферментативной реакции, требующей присутствия фермента глутаматдегидрогеназы и кофакторов - НАДН и АТФ, что делает способ и набор реактивов сложными достаточно дорогими. Кроме того, регистрация цветовой реакции происходит в коротковолновой области (при 340 нм), что снижает точность измерений из-за поглощения и рассеяния света при данной длине волны исследуемыми биологическими жидкостями [1].

Наиболее широко распространены уреазно-гипохлоритные методы анализа мочевины, являющиеся более простыми и технологичными по сравнению с описанными выше. Как следует из самого названия этих способов, определение ионов аммония, образующихся в результате гидролиза, основывается на их реакции в щелочных условиях с гипохлоритом натрия в присутствии акцептора аммиака и катализатора.

Для дальнейшего изложения особенностей предлагаемого в качестве изобретения способа особенно следует отметить следующее, что касается всех уреазно-гипохлоритных методов анализа: реальная последовательность добавления реагентов при проведении анализа не совпадает с описанной выше схемой способа и определяется химической совместимостью добавляемых реагентов, так, например, при проведении гидролиза в исследуемой биологической жидкости к уреазе может быть добавлен катализатор, который с ней не взаимодействует и не принимает участия в гидролизе, но необходим для второй стадии в реакции ионов аммония с гипохлоритом и т.д.

На практике в качестве акцептора аммиака используют фенол, а катализатором всегда является нитропруссид натрия (иногда вместе с феррицианидом калия). Способ включает в себя варианты добавления реагентов, описанные в Схеме 1.

Схема 1.

1. Разбавляют биологическую жидкость (например, сыворотку крови - в 10 раз, мочу - в 100 раз).

2. К разбавленной биологической жидкости, содержащей мочевину, добавляют Реагент 1:
а) уреазу или
б) уреазу с катализатором (нитропруссидом натрия).

3. К реакционной среде добавляют Реагент 2:
а) раствор фенола (1б) или
б) раствор фенола с нитропруссидом натрия (1а).

4. После непродолжительной инкубации туда же приливают Реагент 3 - щелочной раствор гипохлорита натрия или щелочной раствор гипохлорита натрия с феррицианидом калия.

В результате химической реакции образуются окрашенные продукты. Оптическая плотность реакционной среды, измеряемая при 500-560 нм, пропорциональна концентрации мочевины, содержащейся в исследуемой пробе.

В настоящее время существует достаточно много наборов готовых форм реактивов, разработанных различными фирмами, которые используются для осуществления данного способа (например, набор, выпускаемый фирмой RANDOX (Ирландия), описанный в [2]). Как правило, все эти наборы включают стандартный набор реагентов: уреазу, нитропруссид натрия, фенол, щелочной раствор гипохлорита натрия, которые используются в стандартных концентрациях, близких к тем, что описаны в [1], и находятся в виде растворов в отдельных флаконах. В большинство наборов входит также флакон с калибратором - раствором мочевины с известной концентрацией.

Существует также другой способ определения мочевины в биологических жидкостях, принятый нами за прототип, включающий ее гидролиз уреазой и определение образующихся ионов аммония в реакции с гипохлоритом натрия в щелочной среде в присутствии акцептора аммиака и катализатора, где в качестве акцептора аммиака используется соединение, являющееся производным фенола - салициловая кислота. Определение мочевины этим способом производится, как описано в Схеме 1, исключая п. 1 для сыворотки крови. Набор реактивов для осуществления этого способа выпускается фирмой "Синтэко" (Россия) [3] принят авторами за прототип. Набор включает уреазу, нитропруссид натрия, щелочь, гипохлорит натрия, причем указанные реагенты находятся в виде растворов в тех же стандартных концентрациях, что и в предыдущем наборе. Салицилат натрия используется в концентрациях, что и в предыдущем наборе. Салицилат натрия используется в концентрации около 20 г на литр рабочего реагента. В состав набора также входит и калибратор.

Единственным существенным отличием и преимуществом этого способа и набора, его осуществляющего, является использование в них в качестве акцептора аммиака производного фенола - салициловой кислоты (в форме салицилата натрия), которая в отличие от фенола не является токсичным соединением, менее летуча и гигроскопична, что значительно облегчает приготовление реактивов как непосредственно в лабораторных условиях, так и при промышленном производстве наборов реактивов. Надо также отметить, что этот способ не требует разбавления биологических жидкостей (кроме мочи). Общим недостатком этих технических решений является то, что используемые в них акцепторы аммиака (как фенол, так и салициловая кислота), во-первых, легко окисляются кислородом воздуха и другими окислителями, в том числе, используемыми в описанных способах, во-вторых, оказывают дезактивирующее действие на уреазу и, в-третьих, имеют сравнительно низкое сродство в реакции с аммиаком и гипохлоритом натрия. Как следствие этого, наблюдается недостаточная технологичность способа и набора. Так, первый из указанных недостатков не позволяет производить таблетирование акцептора аммиака и объединять его с щелочным раствором гипохлорита натрия, второй приводит к несовместимости акцептора аммиака с уреазой, третий - к необходимости использования акцептора в высоких концентрациях. Все недостатки вместе создают технологические трудности при производстве готовых форм реактивов, а многоступенчатость добавления реагентов усложняет анализ и снижает его точность путем увеличения систематической ошибки.

Предлагаемый способ и набор реактивов направлен на устранение указанных недостатков и, таким образом, позволяет сделать способ и набор более технологичными и удобными для практического применения.

В связи с этим предлагается способ определения мочевины в биологических жидкостях, включающий ее гидролиз уреазой и последующее определение образующихся ионов аммония в реакции с гипохлоритом натрия в щелочной среде в присутствии акцептора аммиака и катализатора, отличительной особенностью которого является то, что в качестве акцептора аммиака используется 4-оксикумарин. Следует подчеркнуть, что во всех известных уреазно-гипохлоритных способах мочевины используется либо фенол, либо его производные. Предлагаемый нами акцептор аммиака не относится к фенольным соединениям.

Разработка нового способа анализа, в том числе предпочтительного варианта осуществления способа и создание на его основе набора готовых форм реактивов, стала возможной в результате обнаружения авторами нового свойства 4-оксикумарина - его высокого сродства к аммиаку в реакции с гипохлоритом натрия. Обычно это соединение используется в качестве антикоагулянта и для измерения Δ pH в клетках из-за его способности проникать через клеточную мембрану.

Даже использование предлагаемого акцептора по описанному выше многостадийному варианту (Схема 1) дает свою выгоду за счет уменьшения стоимости анализа в 1,2-1,5 раза, так как количество используемого акцептора уменьшается с 1,7 г для салициловой кислоты до 30-60 мг для 4-оксикумарина при проведении 200 анализов, а также расширяет арсенал средств того же назначения. Однако высокая стабильность 4 оксикумарина по отношению к окислителям (в данном случае - к гипохлориту натрия и феррицианиду калия в щелочной среде) позволили упростить способ - сделать его не трех-, а двухстадийным, так как определение ионов аммония становится возможным с помощью реагента, объединяющего в себе щелочной раствор гипохлорита натрия, 4-оксикумарин и феррицианид калия в качестве дополнительного катализатора. В данном случае Схема 1 преобразуется в Схему 2.

Схема 2.

1. К неразбавленной биологической жидкости (мочу разбавляют в 10 раз) добавляют Реагент 1:
а) раствор уреазы с нитропруссидом натрия;
б) раствор уреазы с нитропруссидом натрия и 4-оксикумарином.

2. К реакционной среде добавляют Реагент 2:
а) щелочной раствор гипохлорита натрия (1б);
б) щелочной раствор гипохлорита натрия и 4-оксикумарина (1а).

Феррицианид калия был введен в реагент 2 с целью улучшения характеристик способа - интенсивности и стабильности окраски и увеличения диапазона определяемых концентрации мочевины.

Для наиболее технологичного варианта осуществления способа, когда используются два катализатора - нитропруссид натрия и феррицианид калия - был разработан набор готовых форм реактивов, включающий уреазу, нитропруссид натрия, акцептор аммиака, щелочь, гипохлорит натрия, феррицианид калия, отличием которого является то, что в качестве акцептора аммиака он содержит 4-оксикумарин, причем уреаза, нитропруссид натрия и смесь 4-оксикумарина с феррицианидом калия находятся в виде таблеток, а щелочь и гипохлорит натрия - в виде концентрированных растворов. В состав набора также входит калибратор - раствор мочевины с концентрацией 10 ммоль/л. Уреаза, нитропруссид натрия, щелочь и гипохлорит натрия находятся в концентрациях, близких к тем, что используются в вышеописанных наборах реактивов, а 4 оксикумарин - в концентрации на три порядка меньше, чем стандартная концентрация акцептора аммиака.

Для иллюстрации доказательства практической применимости данного набора ниже приведены следующие примеры: Пример 1 показывает осуществление способа по Схеме 1; Пример 2 - по Схеме 2 (1б); Пример 3 посвящен определению по предпочтительному варианту осуществления способа по Схеме 2 (1а); Примеры 4 и 5 - определению по предпочтительному варианту с использованием набора готовых форм реактивов.

Пример 1.

1. Приготовление Реагента 1. В ЭДТА-буфере (0,04 М, pH 6,4 - 7,4) растворяют уреазу (1600 ед./л), нитропруссид натрия (600 мг/л).

2. Приготовление Реагента 2. В дистиллированной воде растворяют 4-оксикумарин (540 мг/л).

3. Приготовление реагента 3. К 150 частям раствора NaOH (2 г/л) приливают 1 часть раствора гипохлорита натрия (16 г активного хлора на литр дистиллированной воды).

Ход определения.

Реагент 1 разливают в пробирке по 250 мкл, затем вносят по 20 мкл исследуемой сыворотки крови, встряхивают и инкубируют 15 минут при температуре 37^oC. Параллельно инкубируют холостую пробу (250 мкл Реагента 1 и 20 мкл дистиллированной воды) и пробу, содержащую 250 мкл Реагента 1 и 20 мкл калибратора (мочевина, 10 ммоль/л). После окончания инкубации во все пробирки добавляют по 250 мкл Реагента 2, встряхивают и инкубируют 1 минуту при комнатной температуре. Затем во все пробирки вносят по 1,5 мл Реагента 3, встряхивают и инкубируют еще 15 минут при 37^oC. Окрашенные пробы фотометрируют при 620-780 нм. Концентрацию мочевины в исследуемых пробах рассчитывают по формуле (1):
C=(E_о/E_к) 10 ммоль/л,
где
E_о и E_к - оптические плотности исследуемых проб и проб с калибратором соответственно, 10 ммоль/л - концентрация мочевины в калибраторе. Результаты для сыворотки с разным содержанием мочевины представлены в табл. 1.

Пример 2.

1. Приготовление Реагента 1. В ЭДТА-буфере (0,02 М, pH 6,4 - 7,4) растворяют уреазу (800 ед./л), нитропруссид натрия (300 мг/л) и 4-оксикумарин (270 мг/л).

2. Приготовление Реагента 2. К 150 частям раствора NaOH (2 г/л) приливают 1 часть раствора гипохлорита натрия (16 г активного хлора на литр дистиллированной воды).

Ход определения.

Реагент 1 разливают в пробирке по 0,5 мкл, затем вносят по 20 мкл исследуемой сыворотки крови, встряхивают и инкубируют 15 минут при температуре 37^oC. Параллельно инкубируют холостую пробу (0,5 мл Реагента 1 и 20 мкл дистиллированной воды) и пробу, содержащую 0,5 Реагента 1 и 20 мкл калибратора (мочевина, 10 ммоль/л). После окончания инкубации во все пробирки добавляют по 1,5 мл Реагента 2, встряхивают и инкубируют еще 15 минут при 37^oC. Далее проводят определение, как описано в Примере 1. Результаты для сывороток с разным содержанием мочевины представлены в табл. 2.

Пример 3.

1. Приготовление Реагента 1. В ЭДТА-буфере (0,02 М, pH 6,4 - 7,4) растворяют уреазу (800 ед./л), нитропруссид натрия (300 мг/л).

2. Приготовление Реагента 2. Растворяют в реагенте 3, приготовленном, как описано в Примере 1, феррицианид калия (300 мг/л) и 4-оксикумарин (400 мг/л). Далее проводят определение, как описано в Примере 2. Результаты представлены в табл. 3.

Пример 4.

Готовят следующие смеси сухих реактивов. 1. Хлористый калий - 400 г, лиофилизированный препарат уреазы с активностью фермента 30,0 ед./мг - 75 мг. 2. Цитратно-фосфатный-натриевый буфер, высушенный при температуре 70^oC, pH 6,7 - 50 г, хлористый калий - 750 г, нитропрусид натрия - 22 г. 3. Хлористый калий - 791 г, 4-оксикумарин - 5 г, феррицианид калия - 4 г. Смеси реактивов перемешивают и перетирают в фарфоровых ступках до гомогенного состояния, после этого таблетируют для получения таблеток весом 400 мг. Готовят раствор гипохлорита натрия, содержащий 16 г/л активного хлора и концентрированный раствор едкого натра 20 г/л. Для выполнения определения готовят рабочие реагенты следующим образом. Реагент 1. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 4 таблетки с уреазой и 8 таблеток с нитропруссидом натрия. Реагент 2. Концентрированный раствор едкого натра разводят в 10 раз дистиллированной водой, в 300 мл разбавленного раствора растворяют 8 таблеток, содержащих 4-оксикумарин и феррицианид калия, приливают туда же 2 мл раствора гипохлорита натрия. Далее проводят определение в исследуемых пробах сыворотки крови, как описано в Примере 1. Результаты представлены в табл. 4.

Пример 5.

Готовят рабочие реагенты, как описано в Примере 3. Пробы мочи перед анализом разводят в 10 раз. Проводят определение, как описано в Примере 2, результат умножают на 10. Результаты представлены в табл. 5.

Список литературы.

1. Балаховский И.С. В кн. Лабораторные методы исследования. Справочник. (Под ред. Мельшикова В.В.), М.: Медицина, 1987.

2. Инструкция по применению наборов для определения мочевины Urease-Berthelot Method Colorimetric (RANDOX).

3. Инструкция по применению набора реактивов для определения мочевины уреазным методом с салицилатно-гипохлоритным реактивом в сыворотке или плазме крови (Диаком М.). Рекомендована к утверждению экспертной комиссией по лабораторным реактивам Комитета по новой Медицинской технике Минздрава РФ. Протокол N 5 от 27.09.93.

Способ предназначен для определения мочевины в биологических жидкостях. В исследуемой пробе биологической жидкости осуществляют гидролиз мочевины уреазой до аммиака. Образующиеся в водном растворе ионы аммония определяют по их реакции со щелочным раствором гипохлорита натрия в присутствии акцептора аммиака и катализатора. В качестве акцептора аммиака используют 4-оксикумарин в виде водного раствора концентрацией 270-540 мг/л. Образующиеся в результате гидролиза ионы аммония могут быть определены по их реакции с реагентом, состоящим из щелочного раствора гипохлорита натрия и 4-оксикумарина, или по их реакции с реагентом, состоящим из щелочного раствора гипохлорита натрия, 4-оксикумарина и феррицианида калия в качестве дополнительного катализатора. Набор готовых форм реактивов для определения мочевины в биологических жидкостях содержит уреазу, нитропруссид натрия в качестве катализатора, щелочь, раствор гипохлорита натрия и дополнительно в качестве акцептора аммиака 4-оксикумарин в виде смеси с феррицианидом калия, являющимся дополнительным катализатором. Уреаза, нитропруссид натрия и смесь 4-оксикумарина и феррицианида калия содержатся в составе набора в таблетированном виде, а щелочь и гипохлорит натрия в виде их концентрированных растворов. Способ позволяет сократить количество стадий определения, более технологичен, удобен для практического применения. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ определения мочевины в биологических жидкостях, включающий ее гидролиз уреазой и определение образующихся ионов аммония по их реакции со щелочным раствором гипохлорита натрия в присутствии акцептора аммиака и катализатора, отличающийся тем, что в качестве акцептора аммиака используют 4-оксикумарин в концентрации 270 - 540 мг/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что образующиеся в результате гидролиза ионы аммония определяют по их реакции с реагентом, состоящим из щелочного раствора гипохлорита натрия и 4-оксикумарина. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что образующиеся в результате гидролиза ионы аммония определяют по их реакции с реагентом, состоящим из щелочного раствора гипохлорита натрия, 4-оксикумарина и феррицианида калия в качестве дополнительного катализатора. 4. Набор готовых форм реактивов для определения мочевины в биологических жидкостях, содержащий уреазу, нитропруссид натрия в качестве катализатора, щелочь, раствор гипохлорита натрия, отличающийся тем, что набор дополнительно содержит в качестве акцептора аммиака 4-оксикумарин в виде смеси с феррицианидом калия, являющимся дополнительным катализатором, при этом указанный набор содержит уреазу, нитропруссид натрия и смесь 4-оксикумарина и феррицианида калия в таблетированном виде, а щелочь и гипохлорит натрия в виде их концентрированных растворов.